專利名稱：來自多能細(xì)胞的前部前腸內(nèi)胚層的形成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及(至少部分涉及)來自多能細(xì)胞的組織前體細(xì)胞群的形成方法，更具體地涉及來自多能細(xì)胞的前部前腸內(nèi)胚層(anterior foregut endoderm)的形成方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(ES)為衍生自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能細(xì)胞，并在人類和小鼠中均可在特定條件下保持多能狀態(tài)。ES細(xì)胞理論上可分化成一切體細(xì)胞和生殖細(xì)胞類型。因此，將ES細(xì)胞分化成各種細(xì)胞類型和組織的適當(dāng)條件的研發(fā)使得對(duì)于未來細(xì)胞替代療法充滿期許。多能細(xì)胞還可通過將成年體細(xì)胞重編程為多能狀態(tài)(例如，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，或iPS細(xì)胞)，提供患者特異的多能細(xì)胞的形成途徑來獲得，這將克服與ES細(xì)胞來源的組織移植相關(guān)的排斥問題。發(fā)育開始于原腸胚形成過程，在此期間，來自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的未分化細(xì)胞分化成三種胚層，由這三種胚層形成機(jī)體的所有組織。外胚層形成皮膚及其附屬物、神經(jīng)系統(tǒng)和腎上腺組織。中胚層發(fā)育成泌尿生殖系統(tǒng)、結(jié)締組織、肌肉、骨骼、軟骨、血管、血液和心臟。內(nèi)胚層產(chǎn)生腸、肝、胰腺、食管、氣管、肺和衍生自最前部前腸內(nèi)胚層的咀嚼器(pharyngealapparatus)。沿胚胎的背腹側(cè)、前后部和左右軸發(fā)生復(fù)雜的圖式形成(patterning)過程，導(dǎo)致這些胚層中的特定結(jié)構(gòu)域定形，隨后將發(fā)育成特定組織和器官。圖式形成伴隨著復(fù)雜的分子變化。因此獲得富集或純的成熟細(xì)胞功能群顯得至關(guān)重要，需要順次(sequentially)施加發(fā)育信號(hào)(developmental cues),從而引導(dǎo)活體內(nèi)多能細(xì)胞的分化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明至少部分基于發(fā)現(xiàn)了由多能干細(xì)胞，如人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成前部前腸內(nèi)胚層的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集細(xì)胞群。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供咽內(nèi)胚層細(xì)胞(pharyngeal endoderm cell)的富集細(xì)胞群。這些細(xì)胞群可通過本文所述方法獲得。如本文所使用的，術(shù)語“細(xì)胞群”是指分離的細(xì)胞群，而不是存在于動(dòng)物中的正常發(fā)育所產(chǎn)生的細(xì)胞群。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于衍生前部前腸內(nèi)胚層的方法，所述方法包括在無活化素A下用BMP抑制劑或TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑培養(yǎng)定形內(nèi)胚層(definitiveendoderm)。在一些實(shí)施方案中，在無活化素A下用BMP抑制劑和TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑二者培養(yǎng)定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，BMP抑制劑為頭蛋白(Noggin)，TGF-^信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑為SB-431542。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由多能細(xì)胞，如ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞衍生前部前腸內(nèi)胚層的方法，所述方法包括誘導(dǎo)所述多能細(xì)胞形成例如表達(dá)本文所述的標(biāo)記物EPCAM、CXCR4和C-KIT的定形中胚層，然后由本文所述的定形中胚層衍生前部前腸內(nèi)胚層。在某些實(shí)施方案中，通過本文所述方法所衍生的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)F0XA2，并包括與在所述定形內(nèi)胚·層細(xì)胞中S0X2和⑶X2的表達(dá)相比升高的S0X2表達(dá)水平和降低的⑶X2表達(dá)水平。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種由多能細(xì)胞，如ES或iPS細(xì)胞、最優(yōu)選人ES或iPS細(xì)胞來制備前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群的方法,其包括(i)在堿性FGF(bFGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 (BMP4)和活化素A的存在下培養(yǎng)所述多能細(xì)胞從而誘導(dǎo)所述多能細(xì)胞形成定形內(nèi)胚層細(xì)胞；和(ii)在BMP抑制劑如頭蛋白或腱蛋白(Chordin)或卵泡抑素(follistatin)和/或TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑如SB-431542的存在下，和在無活化素A下，培養(yǎng)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞，從而誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞形成前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種影響前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的增殖、分化或存活的試劑的鑒別方法，所述方法包括在要試驗(yàn)試劑的存在和不存在下培養(yǎng)前部前腸內(nèi)胚層富集細(xì)胞群，并比較所述細(xì)胞在所述試劑存在和不存在下的增殖、分化或存活，其中在所述試劑存在下的差異表示鑒別出影響所述細(xì)胞的增殖、分化或存活的試劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種參與細(xì)胞分化的基因的鑒別方法，所述方法包括分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞和前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，并比較所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞和所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的基因表達(dá)譜，其中鑒別出在所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞和所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因表示參與細(xì)胞分化的基因。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抗體的鑒別方法，所述抗體識(shí)別從定形內(nèi)胚層向前部前腸內(nèi)胚層發(fā)展的分子標(biāo)記物，所述方法包括將抗體溫育于前部前腸內(nèi)胚層的富集細(xì)胞群，并篩選出與所述前部前腸內(nèi)胚層的結(jié)合顯著高于與所述定形內(nèi)胚層的結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)前部?jī)?nèi)胚層/咽內(nèi)胚層(anterior/pharyngeal)的腹側(cè)(ventral)細(xì)胞命運(yùn)(fate)或咽囊命運(yùn)的方法,所述方法包括施用選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組成的組中的一種或多種因子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在細(xì)胞中誘導(dǎo)甲狀旁腺命運(yùn)的方法，所述方法包括用音猬因子(Sonic Hedgehog，SHH)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)培養(yǎng)腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在細(xì)胞中誘導(dǎo)肺命運(yùn)的方法，所述方法包括在維甲酸的存在下用FGF和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑培養(yǎng)腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層。另外提供通過本文所述方法生產(chǎn)的細(xì)胞和細(xì)胞群(例如，富集群)。除另外規(guī)定外，本文所使用的所有科技術(shù)語與本發(fā)明所述領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。本文所述的方法和材料用于本發(fā)明；也可使用本領(lǐng)域已知的其他適合的方法和材料。材料、方法和實(shí)施例僅為示例性，并不意于限制。將本文所提及的所有公開物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫條目(database entries)和其他文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容引入以作參考。在沖突的情況下，將調(diào)控本說明書，包括定義。從以下詳細(xì)描述和附圖，以及從權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其他特性和優(yōu)勢(shì)將顯而易見。


圖la-1示出在頭蛋白(NOGGIN)/SB-431542處理的定形內(nèi)胚層中AFE標(biāo)記物的誘導(dǎo)。(la)hES細(xì)胞中活化素A-介導(dǎo)的定形內(nèi)胚層誘導(dǎo)期間F0XA2、MIXL1、S0X17、S0X2和⑶X2mRNA的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為P -肌動(dòng)蛋白(ACTIN)(還稱為ACTB)標(biāo)準(zhǔn)化的mRNA的定量，按比例的最大誘導(dǎo)百分比。如圖(條帶)上方所示添加細(xì)胞因子。(Ib)在活化素A誘導(dǎo)的第5天定形內(nèi)胚層的標(biāo)記物CXCR4、C-KIT和EPCAM的典型的流式細(xì)胞術(shù)分析。示出兩個(gè)生物學(xué)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。(Ic)在用列于左下圖的因子誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層后第5天處理的培養(yǎng)物中F0XA2、S0X2、CDX2、PAX9和TBXl mRNA在第9天的表達(dá)(參見左上圖)(n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；*，顯著不同于所有其他條件，P<0. 0001 ;單因素方差分析(one-way ANOVA))。d0,分化開始前；d5，第5天。(Id)在sFRP存在和不存在下用頭蛋白/SB-431542(SB)誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層后第5天處理的培養(yǎng)物中S0X2和PAX9在第9天的表達(dá)(*，P〈0. 05，n=3個(gè)生物學(xué)重復(fù))。(Ie)在如前所述分化為神經(jīng)外皮層(第I天添加頭蛋白/SB-431542)，或者在內(nèi)胚層誘導(dǎo)后(內(nèi)胚層誘導(dǎo)至第5天，隨后添加頭蛋白/SB-431542)的hE S細(xì)胞中BRACHYURY和PAX6 mRNA在第9天的表達(dá)。對(duì)于BRAYCHURY，將暴露于活化素A并經(jīng)歷原腸胚形成的第
3.5天hES細(xì)胞用作陽性對(duì)照(*，P〈0. 0001, n=3個(gè)實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)由各三個(gè)生物學(xué)重復(fù)組成)。(If)在定形內(nèi)胚層誘導(dǎo)至第5天后用頭蛋白/SB-431542平行處理的或者在肝臟條件(h印atic condition)下培養(yǎng)的培養(yǎng)物中 0DD1、CDX2、EVX1、CREB313、CEBPA、TBX1、PAX9、S0X2和FGFSmRNA在第9天的表達(dá)(n=3個(gè)實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)由各三個(gè)生物學(xué)重復(fù)組成)。(Ig)在HDF2和HDF9 hiPS細(xì)胞中活化素A誘導(dǎo)的第5天定形內(nèi)胚層的標(biāo)記物CXCR4和C-KIT的典型的流式細(xì)胞術(shù)分析。(lh，i)在用無血清分化基質(zhì)(對(duì)照，ctrl)或頭蛋白/SB-431542誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層后，從第5天處理的培養(yǎng)物中HFGD2和HDF9hiPS細(xì)胞中F0XA2、S0X2和PAX9mRNA第9天的表達(dá)(參見左上圖)(n=3個(gè)生物學(xué)三次重復(fù)，*顯著不同于基質(zhì)對(duì)照)。圖2a_c示出頭蛋白/SB-431542誘導(dǎo)的AFE細(xì)胞的功能特性。(2a)在示意性示于圖上方的兩個(gè)條件下形成的HE S2衍生細(xì)胞中S0X2、NKX2.1、NKX2. 5、PAXl和P63的表達(dá)(n=6個(gè)培養(yǎng)孔，來自兩個(gè)獨(dú)立 實(shí)驗(yàn)；*，顯著不同于頭蛋白/SB-431542 ；P<0. 05)，WKFBE WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF。(2b)在示意性示于圖上方的三個(gè)條件下形成的HES2衍生細(xì)胞中NKX2. 1、NKX2. 5和PAXl的表達(dá)(n=4_6個(gè)培養(yǎng)孔，來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；*，顯著不同于其他條件；P〈0. 05)。(2c)腹側(cè)AFE誘導(dǎo)效率的示意性概述圖。WKFBE :WNT3a、KGF、FGFlO,BMP4 和 EGF。
圖2d_e說明由hES和hIPS細(xì)胞形成的AFE的功能。(2d)在示意性示于圖上方的條件下分化成AFE的HDF2 (上)和HFD9 (下)hiPS細(xì)胞中S0X2、NKX2.1和PAXl mRNA的表達(dá)(n=4-6個(gè)培養(yǎng)孔，來自2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，*，顯著不同于頭蛋白/SB-431542條件)。(2e)使用頭蛋白/SB-431542接著用WKFBE分化成推定的腹側(cè)AFE的HES2細(xì)胞中EPCAM的表達(dá)(左側(cè)峰同種型(isotype)對(duì)照，右側(cè)峰EPCAM)。圖3a_b示出來自體外形成的腹側(cè)AFE的肺和咽囊標(biāo)記物的誘導(dǎo)。(3a)在示意性示于圖上方的兩個(gè)條件下形成的HE S2衍生細(xì)胞中PAX1、NKX2.1、F0XP2、GATA6和FOXJl的表達(dá)(n=4-6個(gè)培養(yǎng)孔，來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，*，顯著不同于WKFBE條件；P〈0. 05)。WKFBE WNT3a、KGF、FGF10、BMP4和EGF。(3b)在圖中所示因子的存在下在腹面發(fā)育的AFE中SFTPC和GCM2mRNA的誘導(dǎo)。
具體實(shí)施例方式胚胎形成期間，前部?jī)?nèi)胚層和咽內(nèi)胚層的形成是體平面(body plan)建立和多器官系統(tǒng)如耳部、腭扁桃體、胸腺、甲狀旁腺、甲狀腺、肺、食管和氣管發(fā)育中至關(guān)重要的步驟。繼其形成以后，定形內(nèi)胚層逐漸分化成內(nèi)胚層亞譜系。更后期的內(nèi)胚層形成中腸和后腸。肺野(lung field)前部的咽內(nèi)胚層形成四個(gè)露頭，稱為咽囊。各咽囊發(fā)育成具體器官如咽鼓管和鼓膜的內(nèi)葉(第一囊)、腭扁桃體(第二囊)、胸腺(第三前囊)、甲狀旁腺(第三背囊和第4囊)和甲狀腺的束旁C細(xì)胞(第四囊)。甲狀腺由咽的室底(floor)適當(dāng)?shù)匕l(fā)育。肺、食管和氣管衍生自囊遠(yuǎn)端的前部前腸內(nèi)胚層。產(chǎn)生前部前腸內(nèi)胚層/咽內(nèi)胚層細(xì)胞群的能力在這些組織的細(xì)胞替代療法中、在對(duì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的試劑的分析中和在組織發(fā)育和分化的研究中將會(huì)是有用的。然而，目前還沒有從多能細(xì)胞形成前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞群的方法，而調(diào)控前部前腸內(nèi)胚層形成的分子機(jī)制還并未明確。獲得前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞群將會(huì)是有利的，從而更好的理解它們的形成和組織發(fā)育。迄今為止還不能夠分離或形成前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群。本發(fā)明提供用于獲得前部前腸內(nèi)胚層群的方法其通過誘導(dǎo)多能細(xì)胞分化成定形內(nèi)胚層，隨后使定形內(nèi)胚層 圖式形成(patterning)為前部命運(yùn)。前部前腸內(nèi)胚層可隨后被誘導(dǎo)分化成由其衍生的任何組織。在某些實(shí)施方案中，腹側(cè)前部前腸內(nèi)胚層、甲狀旁腺和肺標(biāo)記物由前部前腸內(nèi)胚層/咽內(nèi)胚層誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明提供由多能細(xì)胞形成前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞群的方法。此類細(xì)胞群對(duì)于鑒別影響細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的試劑、對(duì)于鑒別參與組織發(fā)育的基因以及對(duì)于形成細(xì)胞替代療法用分化細(xì)胞和組織是有用的。如本文所使用的，“前部前腸內(nèi)胚層”是指發(fā)育成肝的內(nèi)胚層前部的內(nèi)胚層。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解“前部前腸內(nèi)胚層”由此包括，例如咽內(nèi)胚層及其他更加高度分化的內(nèi)胚層細(xì)胞群，而由術(shù)語“前部前腸內(nèi)胚層”所包括的各種細(xì)胞類型可呈現(xiàn)分子標(biāo)記物的不同表達(dá)模式。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解“前部前腸內(nèi)胚層”發(fā)育成各種組織，如扁桃體、鼓膜、甲狀腺、甲狀旁腺、胸腺、氣管、食管、胃、肺和喉/咽。多能細(xì)胞如ES細(xì)胞直接分化成定形內(nèi)胚層可通過應(yīng)用高濃度的活化素A來實(shí)現(xiàn)。該策略的科學(xué)基礎(chǔ)為通過成形素結(jié)節(jié)(morphogen nodal)的信號(hào)傳導(dǎo)需要內(nèi)胚層形成。活化素A激活與結(jié)節(jié)相同的受體，但作為可溶性細(xì)胞因子存在。盡管存在促使E S細(xì)胞分化成定形內(nèi)胚層的可用方法，但目前還沒有活體外使定形內(nèi)胚層前部化(anteriorize)和衍生(或分離)前部前腸內(nèi)胚層的可用方法。胚胎組織表達(dá)典型的分子標(biāo)記物組。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子0CT3/4、NANOG和S0X2。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子F0XA2、S0X17和F0XA3。前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子F0XA2和S0X2。咽內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TBXl和S0X2.第三咽囊細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PAX1/9、H0XA3和SIXl。胸腺上皮細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FOXNl。前部前腸內(nèi)胚層的肺野表達(dá)NKX2.1和GATA6。組織中前部前腸內(nèi)胚層標(biāo)記物的檢測(cè)，在其內(nèi)部和其本身，不足以證明衍生自ES細(xì)胞的前部前腸內(nèi)胚層的存在。ES細(xì)胞在特定培養(yǎng)條件下保持在未分化狀態(tài)。除去這些條件導(dǎo)致作為經(jīng)歷自發(fā)原腸胚形成(spontaneous gastrulation)的細(xì)胞范圍的胚狀體(embryoid bodies, EBs)的形成,造成隨機(jī)形成經(jīng)歷隨機(jī)分化的所有胚層的衍生物。經(jīng)歷隨機(jī)分化的EB表達(dá)許多胚胎組織的標(biāo)記物，包括前部前腸內(nèi)胚層的標(biāo)記物。由于前部前腸內(nèi)胚層由此需要該組織具有除僅表達(dá)前部前腸內(nèi)胚層的標(biāo)記物以外的額外特性，從而抑制與前部前腸內(nèi)胚層不相關(guān)的細(xì)胞命運(yùn)，或者耗盡定形內(nèi)胚層的和后部?jī)?nèi)胚層的(posteriorendodermal)信號(hào)，因此需要ES衍生組織的適當(dāng)分類。用于形成衍生自咽和前部前腸內(nèi)胚層的組織的方法可通過如下步驟來進(jìn)行由多能細(xì)胞誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層，誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層從而形成前部前腸內(nèi)胚層，隨后進(jìn)一步分化成例如咽內(nèi)胚層，以及特化為特定的衍生物。定形內(nèi)胚層的形成由人ES或iPS細(xì)胞形成定形內(nèi)胚層可通過調(diào)整用于由鼠ES細(xì)胞發(fā)育成定形內(nèi)胚層的實(shí)驗(yàn)步驟來完成。Kubo 等，Development 131:1651-1662 (2004) ;Gadue 等，Proc NatlAcadSci USA 103:16806-16811(2006) ;Gouon_Evans等，NatBiotechnol, 24:1402-1411(2006)。在非組織處理的塑料上用低濃度BMP4(如約0. 5-10ng/ml、如lng/ml)脈沖(pulse)人ES細(xì)胞，在低濃度BMP4和bFGF (如約5_20ng/ml、如約10ng/ml)下培養(yǎng)，然后在高濃度活化素A(50_500ng/ml、如75_ 150ng/ml、如約100ng/ml)下培養(yǎng)，從而導(dǎo)致胚狀體(EB)的形成。EB幾乎一致地由內(nèi)胚層構(gòu)成。內(nèi)胚層的發(fā)育可通過CXCR4和c-KIT的表達(dá)來證實(shí)。通過5天內(nèi)損失ES標(biāo)記物、S0X2并順次獲得MIXL1、X0X17和F0ZXA2來完成內(nèi)胚層的發(fā)育。在某些實(shí)施方案中，可使用其他多能干細(xì)胞代替ES細(xì)胞。例如，可使用成體干細(xì)胞(如從受試者，如要治療的受試者的內(nèi)耳、骨髓、間質(zhì)、皮膚、脂肪、肝、肌肉或血液中獲得的成體干細(xì)胞)；胚胎干細(xì)胞，或從胎盤或臍帶獲得的干細(xì)胞；祖細(xì)胞(如，衍生自內(nèi)耳、骨髓、間質(zhì)、肝、肌肉或血液的祖細(xì)胞)；和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(如，iP S細(xì)胞)。在某些實(shí)施方案中，使用iP S細(xì)胞(參見，如，Maherali和Hochedlinger, Cell StemCell3:595-605 (2008)) o通常，優(yōu)選人源細(xì)胞。由定形內(nèi)胚層形成前部前腸內(nèi)胚層已發(fā)現(xiàn)，盡管活化素A誘導(dǎo)內(nèi)胚層，但活化素A使該組織后部化(posteriorize)。因此，前部前腸內(nèi)胚層的制備需要在定形內(nèi)胚層形成后減少或除去活化素A。在某些方面，本發(fā)明因而提供形成前部前腸內(nèi)胚層的富集細(xì)胞群，以及耗盡中部?jī)?nèi)胚層和后部?jī)?nèi)胚層信號(hào)的方法。此群表達(dá)存在于前部前腸內(nèi)胚層的分子標(biāo)記物，并耗盡存在不存在于前部前腸內(nèi)胚層的分子標(biāo)記物。內(nèi)胚層細(xì)胞群的特征和區(qū)別在于本領(lǐng)域已知的標(biāo)記物。在定形內(nèi)胚層中，ES標(biāo)記物S0X2作為前部前腸內(nèi)胚層的標(biāo)記物而重現(xiàn)，而⑶X2為后部?jī)?nèi)胚層(后腸)的標(biāo)記物。將通過活化素A誘導(dǎo)4至5天形成內(nèi)胚層的細(xì)胞延長(zhǎng)培養(yǎng)導(dǎo)致CDX2的增加和S0X2的損失，暗示在這些條件下后部化。定形內(nèi)胚層的前部化(anteriorization)可通過除去或阻斷活化素A并添加前部化成形素來完成。優(yōu)選的前部化成形素為BMP和TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)的抑制齊[J。BMP和TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑可單獨(dú)或組合使用。優(yōu)選地，組合使用BMP和TGF-3信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑。BMP抑制劑的實(shí)例為頭蛋白、腱蛋白和卵泡抑素。優(yōu)選的BMP抑制劑為頭蛋白。TGF-P 信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的實(shí)例為 Ly364947(SD208)、SM16、SB-505124、SB-431542和抗TGF-P抗體。優(yōu)選的TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑為SB-431542。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用頭蛋白和SB-431542的組合來誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層的前部化。在某些實(shí)施方案中，在培養(yǎng)的第4-5天添加頭蛋白和SB-431542的組合，從而誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層的前部化。用頭蛋白和SB使定形內(nèi)胚層的前部化可通過例如檢測(cè)如S0X2、TBXl (咽)、PAX9(咽、胸腺)、F0XP2(肺、呼吸道表皮)、DLX3(食管)、F0XA2(定形內(nèi)胚層)和/或S0X7(早期內(nèi)胚層標(biāo)記物)中的一種或多種的表達(dá)；和任選地檢測(cè)PAX6(外胚層)和/或BRACHYURY(中胚層)的表達(dá)缺失·來證實(shí)。細(xì)朐群在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明因此提供前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集細(xì)胞群。前部前腸內(nèi)胚層的富集群包含至少25%、例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、至少99%或至少99. 9%的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供咽內(nèi)胚層細(xì)胞的富集細(xì)胞群。咽內(nèi)胚層的富集群包括至少25%、例如至少50%、至少75%、至少90%、至少95%、至少99%或至少99. 9%的咽內(nèi)胚
層細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供衍生前部前腸內(nèi)胚層的方法，所述方法包括在無活化素A下用BMP抑制劑或TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑培養(yǎng)定形內(nèi)胚層。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在無活化素A下用BMP抑制劑和TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑二者培養(yǎng)定形內(nèi)胚層。在某些實(shí)施方案中，BMP抑制劑為頭蛋白。在本文所述方法的某些實(shí)施方案中，頭蛋白以約 lng/ml MlOu g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，頭蛋白以約 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至 150ng/ml 的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，頭蛋白以約100ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在某些實(shí)施方案中，TGF-^抑制劑為SB-431542。在本文所述方法的某些實(shí)施方案中，SB-431542 以約 0.1 y m至 ImM、I u MM 100 u MU U MM 500 u MU U MM 250 u I u M至IOOii M的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，SB-431542以約5 y M至250 y M、5iiM至100iiM、5iiM至50iiM或5iiM至25iiM的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，SB-431542以約IOiiM的濃度存在于培養(yǎng)物中。另外優(yōu)選的是其中用于本發(fā)明方法的培養(yǎng)物包括濃度約75ng/ml至150ng/ml的頭蛋白和濃度約為5 ii M至25 ii M的SB-431542的實(shí)施方案。腹側(cè)前部前腸內(nèi)胚層的誘導(dǎo)源自最前部前腸內(nèi)胚層的大多數(shù)器官如胸腺、甲狀旁腺、氣管和肺源自于前部前腸內(nèi)胚層的腹側(cè)或腹外側(cè)面。
可通過用Wnt信號(hào)傳導(dǎo)、FGF信號(hào)傳導(dǎo)、BMP信號(hào)傳導(dǎo)和EGF信號(hào)傳導(dǎo)通路的一種或多種激動(dòng)劑處理來進(jìn)一步誘導(dǎo)由頭蛋白/SB-431542所誘導(dǎo)的前部前腸內(nèi)胚層，從而形成腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層。腹側(cè)前部前腸內(nèi)胚層的有效誘導(dǎo)依賴于用頭蛋白/SB-431542的處理。誘導(dǎo)形成腹側(cè)前部前腸內(nèi)胚層的組織可由例如標(biāo)記物NKX21和NKX2. 5來鑒定。在某些實(shí)施方案中，通過Wnt信號(hào)傳導(dǎo)、FGF信號(hào)傳導(dǎo)、BMP信號(hào)傳導(dǎo)和EGF信號(hào)傳導(dǎo)通路的兩種或多種激動(dòng)劑的組合來使前部前腸內(nèi)胚層腹面發(fā)育(即，誘導(dǎo)形成腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層)。另外優(yōu)選的是其中通過fct信號(hào)傳導(dǎo)、FGF信號(hào)傳導(dǎo)、BMP信號(hào)傳導(dǎo)和EGF信號(hào)傳導(dǎo)通路的兩種或多種激動(dòng)劑；Wnt信號(hào)傳導(dǎo)、FGF信號(hào)傳導(dǎo)、BMP信號(hào)傳導(dǎo)和EGF信號(hào)傳導(dǎo)通路的三種或多種激動(dòng)劑；Wnt信號(hào)傳導(dǎo)、FGF信號(hào)傳導(dǎo)、BMP信號(hào)傳導(dǎo)和EGF信號(hào)傳導(dǎo)通路的四種或多種激動(dòng)劑；或者fct信號(hào)傳導(dǎo)、FGF信號(hào)傳導(dǎo)、BMP信號(hào)傳導(dǎo)和EGF信號(hào)傳導(dǎo)通路的五種或多種激動(dòng)劑的組合來使前部前腸內(nèi)胚層腹面發(fā)育的實(shí)施方案。在某些實(shí)施方案中，fct信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑為介導(dǎo)典型Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt3a;可使用典型fct信號(hào)傳導(dǎo)的任何誘導(dǎo)物，例如，Wnt/P-聯(lián)蛋白通路激動(dòng)劑糖原合成酶激酶30 (GSK3b)抑制劑或酪蛋白激酶(CKl)抑制劑。fct激動(dòng)劑的非限制性實(shí)例包括編碼P -聯(lián)蛋白的DNA(如，編碼￠-聯(lián)蛋白的裸DNA、編碼P -聯(lián)蛋白的質(zhì)粒表達(dá)載體、編碼￠-聯(lián)蛋白的病毒表達(dá)載體)、￠-聯(lián)蛋白多肽、一種或多種fct/P-聯(lián)蛋白通路激動(dòng)劑(如，選自由 fct 配體、DSH/DVL-1, -2，-3、LRP6N、WNT3A、WNT5A 和 WNT3A, 5A 組成的組)、一種或多種糖原合成酶激酶3 0 (GSK3b)抑制劑(如，選自由以下物質(zhì)組成的組氯化鋰(LiCl)、Purvalanol A,奧羅莫星(olomoucine)、阿爾斯特保龍(alsterpaullone)、肯保龍(kenpaullone)、節(jié)基 _2_ 甲基-1，2，4_ 噻二唑燒(thiadiazolidine)_3，5_ 二酮(TDZD-8)、2-硫代(3-碘代芐基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-噁二唑(GSK3抑制劑II)、2，4-二芐基-5-氧噻二唑烷-3-硫酮(OTDZT)、(2' Z，3 ' E)_6_ 溴靛紅-3'-肟(BIO)、a -4- 二溴苯乙酮(即，Tau蛋白激酶I (TPK I)抑制劑)、2_氯-1-(4, 5_ 二溴-硫苯-2-基)-乙酮、N-(4-甲氧基芐基)-N' -(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(AR-A014418)、靛紅-5-磺酰胺；靛紅-5-磺酸(2-羥乙基)-酰胺靛紅-3’ -單肟；5-碘-靛紅-3’ -單肟；5_氟靛紅；5，5’ - 二溴靛紅；5_硝基靛紅；5_氯靛紅；5_甲基靛紅、5-溴靛紅、4-芐基-2-甲基-1，2，4-噻二唑烷-3，5- 二酮(TDZD-8)、2-硫代(3-碘代芐基)-5-(1-吡啶基)_[1，3，4]-噁二唑(GSK3抑制劑II) >2, 4- 二芐基_5_氧噻二唑烷_3_硫酮(OTDZT)、(2' Z,3/ E)-6-溴靛紅-3'-肟(BIO)、a-4-二溴苯乙酮(即，Tau蛋白激酶I (TPK I)抑制劑)、2_氯-1-(4,5-二溴-硫苯-2-基)-乙酮、(vi)N-(4-甲氧芐基)-N' _(5_硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(AR-A014418)、H_KEAPPAPPQSpP_NH2 (L803)和 Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2 (L803-mts))、一種或多種與GSK3mRNA特異性結(jié)合的反義RNA或siRNA、一種或多種酪蛋白激酶I (CKl)抑制劑(如，與CKl mRNA特異性結(jié)合的反義RNA或siRNA)、一種或多種蛋白酶抑制劑、一種或多種蛋白酶體抑制劑。當(dāng)將WNT3a用于本文所述方法時(shí)，Wnt3a以約 lng/ml MlOu g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至 250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Wnt3a以約25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，fct3a以約100ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用FGF信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑，例如FGF7、FGF9或FGF10。為了用于本文所述方法，F(xiàn)GF7 或 FGFlO 以約 lng/ml 至 10 y g/ml、10ng/ml 至 I ii g/ml、IOng/ml至500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF7 或FGFlO 以約 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml至150ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF7和FGFlO 二者均以約10ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在某些實(shí)施方案中，可使用FGF信號(hào)傳導(dǎo)的其他激動(dòng)劑，例如 FGF1、2、3、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 或 23。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EGF信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑為EGF。為了用于本文所述方法，EGF以約 lng/ml MlOu g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至 250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EGF以約25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，EGF均以約20ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，BMP信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑為BMP-4，盡管在某些實(shí)施方案中可使用另外的BMP，例如BMP-1至-20中的任一種，如BMP 2-7中的任一種。為了用于本文所述方法,BMP-4 以約 lng/ml 至 10 u g/ml、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、10ng/ml至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，BMP-4以約 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至 150ng/ml 的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，BMP-4均以約10ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，？6 7、？6 1036 、81^-4和1社3&分別以10、10、20、10和100ng/ml的濃度存在。來自腹面發(fā)育的內(nèi)胚層的早期肺標(biāo)記物的誘導(dǎo)可通過用維甲酸(RA)與選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子組成的組的一種或多種因子的組合處理來誘導(dǎo)表達(dá)肺標(biāo)記物GATA6的腹面發(fā)育的前部 前腸內(nèi)胚層。在某些實(shí)施方案中，通過在Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGF和RA的存在下培養(yǎng)定形內(nèi)胚層來促進(jìn)肺標(biāo)記物的誘導(dǎo)(例如，表達(dá)肺標(biāo)記物的細(xì)胞或組織的形成)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，維甲酸為全反式-反式維甲酸(ATRA)。為了用于本文所述方法，ATRA 以約 InM 至 10iiM、lnM 至 100iiM、5nM 至 10iiM、5nM 至 liiM、50nM 至 I y M 和IOOnM至5 ii M的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ATRA以約IOOnM至I y M或Iii M至5 ii M的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，ATRA以約I U M的濃度存在于培養(yǎng)物中。在某些實(shí)施方案中，將ATRA與上述因子組合使用，從而誘導(dǎo)更偏向與咽區(qū)相對(duì)的肺野的腹側(cè)前部前腸。末端肺標(biāo)記物SP-C的誘導(dǎo)繼續(xù)用Wnt3a、FGF10、FGF7、BMP4、EGF和RA處理到第19天，產(chǎn)生低水平的末端肺泡II型細(xì)胞標(biāo)記物SP-C。當(dāng)在第11天時(shí)將這些因子替換為Wnt3a、FGF7和FGFlO時(shí)實(shí)現(xiàn)了 SP-C的最佳表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在RA與兩種或多種fct信號(hào)傳導(dǎo)、FGF信號(hào)傳導(dǎo)和BMP的激動(dòng)劑組合的存在下由腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)末端肺標(biāo)記物SP-C。在某些實(shí)施方案中，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑為Wnt3a ;還可如本文所述使用其他激動(dòng)劑。為了用于本文所述方法，Wnt3a 以約 lng/ml M 10 u g/ml、10ng/ml Mlu g/ml、10ng/ml至500ng/ml、lOng/ml至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Wnt3a 以約 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至150ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，Wnt3a以約100ng/ml的濃
度存在于培養(yǎng)物中。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑為FGF7或FGFlO ;如本文所述還可使用其他激動(dòng)劑。為了用于本文所述方法，F(xiàn)GF7或FGFlO以約lng/ml至10 y g/ml、10ng/ml至I u g/ml> 10ng/ml 至 500ng/ml、10ng/ml 至 250ng/ml 或 10ng/ml 至 100ng/ml 的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF7或FGFlO以約25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF7和FGFlO均以約10ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF7、FGFlO和Wnt3a分別以10、10和100ng/ml的
濃度存在。特異性甲狀旁腺標(biāo)記物GCMB的誘導(dǎo)當(dāng)在Wnt3a、FGF 10、FGF7、BMP4、EGF的存在下使前腸內(nèi)胚層腹面發(fā)育，隨后在第11天除去這些因子并添加SHH、FGF 8或者二者時(shí)實(shí)現(xiàn)了由腹面發(fā)育的前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)特異性甲狀旁腺標(biāo)記物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過SHH和FGF8信號(hào)傳導(dǎo)的一種或多種激動(dòng)劑的組合，由腹面發(fā)育的前腸內(nèi)胚層誘導(dǎo)特異性甲狀旁腺標(biāo)記物SP-C。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，SHH信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑為SHH。為了用于本文所述方法，SHH以約 lng/ml MlOu g/ml 、10ng/ml 至 I u g/ml、10ng/ml 至 500ng/ml、lOng/ml 至 250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，SHH以約25ng/ml至150ng/ml、50ng/ml至150ng/ml或75ng/ml至150ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，fct3a以約100ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF信號(hào)傳導(dǎo)的激動(dòng)劑為FGF8。為了用于本文所述方法，F(xiàn)GF8 以約 lng/ml 至 10u g/ml、10ng/ml 至 I U g/ml>10ng/ml 至 500ng/ml、10ng/ml 至250ng/ml或lOng/ml至lOOng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8以約 25ng/ml 至 150ng/ml、50ng/ml 至 150ng/ml 或 75ng/ml 至 150ng/ml 的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8均以約10ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)物中。在最高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF8和SHH分別以10和100ng/ml的濃度存在。篩詵方法在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種影響前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的增殖、分化或存活的試劑的鑒別方法。所述方法包括在要試驗(yàn)試劑的存在下培養(yǎng)前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群，并比較所述細(xì)胞在所述試劑存在和不存在時(shí)的增殖、分化或存活，其中在所述試劑存在下的差異表示鑒別出影響所述細(xì)胞增殖、分化或存活的試劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種參與細(xì)胞分化的基因的鑒別方法。所述方法包括分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞和前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，并比較所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞和所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的基因表達(dá)譜，其中鑒別出在所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞和所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因表示參與細(xì)胞分化的基因。測(cè)定基因譜的方法是本領(lǐng)域公知的。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種抗體的鑒別方法，所述抗體識(shí)別從定形內(nèi)胚層向前部前腸內(nèi)胚層發(fā)展的分子標(biāo)記物。所述方法包括將抗體溫育于前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群，并篩選出與所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的結(jié)合顯著高于與所述定形內(nèi)胚層的結(jié)合的抗體。溫育和篩選抗體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。優(yōu)選的抗體為單克隆抗體。細(xì)胞替代療法在形成細(xì)胞替代療法用細(xì)胞或組織，從而治療因由其衍生的組織的損害或缺失所引起的病況中，通過本文所述方法由多能細(xì)胞衍生的前部前腸內(nèi)胚層是有用的，所述病況諸如，例如但不限于，由于遺傳突變、自身免疫攻擊或手術(shù)移除(如甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)或甲狀腺癌)所引起的甲狀腺無功能(甲狀腺功能減退)或者由于遺傳因素或者在手術(shù)消融后產(chǎn)生的甲狀旁腺功能減退；肺損傷；如由同種異體造血干細(xì)胞移植(HSCT)所引起的胸腺表皮損傷或由于先天性疾病(迪喬治綜合癥(Digeorgesyndrome)和Nude/SCID綜合癥)而缺失胸腺表皮。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞如通過本文所述方法衍生自ES或Ip sz細(xì)胞的胸腺上皮細(xì)胞(TEC)還可改善人源化小鼠模型(圖l·e)。免疫中的主要挑戰(zhàn)是建立具有人類免疫系統(tǒng)的小鼠模型。目前，最佳模型為由人臍帶血造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞新生移植的免疫缺陷型Ragl+ilr2g+或NOD-SCIDilr2g+小鼠。在該小鼠中，所有主要造血血統(tǒng)(hematopoieticlineage)均被重構(gòu)，甚至次淋巴器官的結(jié)構(gòu)也類似“人類”的。然而，除了同種異體反應(yīng)性以外，人的T細(xì)胞應(yīng)答弱，且外周T細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常(Manz，Immunity. 26:537-541 (2007)；Traggiai 等人，Science. 304:104-107 (2004) ；Legrand 等人，Methods MolBiol. 415:65-82 (2008) ；Gimeno 等人，Blood. 104:3886-3893 (2004))。該具有更強(qiáng) T 細(xì)胞活性的改進(jìn)模型為BLT小鼠(Lan等人，Blood. 2006;108:487-492 ;Melkus等人NatMed. 12:1316-1322(2006)) o 這是NOD—SCIDilrfg+小鼠，其在腎包膜(kidney capsule)下移植有人胎兒胸腺和肝，隨后移植有胎兒肝臟CD34+祖細(xì)胞。在這些小鼠中，觀察到先天以及限于MHC I和II型的T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答。有趣的是，所有T細(xì)胞的發(fā)育均發(fā)生在移植人胸腺中，而不是在內(nèi)源小鼠胸腺中。這些數(shù)據(jù)表明，人胸腺組織的存在對(duì)于開發(fā)人源化小鼠可能是關(guān)鍵的。結(jié)果就是，TEC是胸腺的必要組分，ES或iPS衍生的TEC還可用于構(gòu)建改進(jìn)的人源化小鼠。此外，通過使用患者特異性iPS細(xì)胞，可以在小鼠模型中獲取人的疾病易感性中的某些遺傳多樣性和免疫應(yīng)答。最終，iPS技術(shù)將允許同源人類組織的共移植。在此類小鼠中，可研究在自身免疫或感染時(shí)的器官或組織特異性免疫應(yīng)答，或者可試驗(yàn)疫苗。作為一個(gè)實(shí)例，自身免疫或免疫介導(dǎo)的疾病的小鼠模型可通過向免疫缺陷小鼠移植如本文所述衍生的骨髓干細(xì)胞和TEC(如，來自皮膚細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞)來構(gòu)建，兩種細(xì)胞均來自患有自身免疫或免疫介導(dǎo)的疾病(如，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、牛皮癬或結(jié)腸炎)的人類受試者。在某些實(shí)施方案中，骨髓干細(xì)胞和TEC 二者均來自同一受試者，而在某些實(shí)施方案中，它們來自不同的受試者。骨髓血干細(xì)胞將進(jìn)入人源胸腺，并在此制備T細(xì)胞。這可用于在小鼠中模擬自身免疫性疾病(以及任何其他免疫介導(dǎo)的疾病)。在某些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括移植源自人類自身免疫靶組織(如，糖尿病中的胰島)的iPS。實(shí)施例在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例不限制權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.來自人類胚胎和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的前部前腸內(nèi)胚層的形成將以下材料和方法用于該實(shí)施例。細(xì)胞和培養(yǎng)條件。在以8，000-12, 000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板的鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)hESC(HES2，國(guó)立衛(wèi)生研究院代碼ES02，來自ES細(xì)胞國(guó)際組織；傳代25 - 33)。每日更換DMEM/F12、20%敲除血清替代物(Gibco)、0.1mM 疏基乙醇(Sigma-Aldrich)和 20ng/ml的FGF-2(R&D)的培養(yǎng)基。用胰蛋白酶，洗滌并以1:5至1:10的稀釋度重新鋪板來傳代細(xì)胞。如hES2 —樣培養(yǎng)HDF2和HDF9 (hiPS細(xì)胞系)。將hES和hiPS培養(yǎng)物保持在5%C02/空氣的環(huán)境中，并將hES分化物保持在5%C02/5%02/90%N2的環(huán)境中。內(nèi)胚層誘導(dǎo)。通過在含有Y-27632 (IOiiM)的Matrigel (Gibco)上傳代24h來耗盡小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，并在低粘附盤(low-adherence dishes, Costar)上形成胚狀體。在胚狀體形成和分化期間，以相同濃度(1:1稀釋)重新接種J1ES2細(xì)胞，而HDF和HDF 9需要較高接種(2:1-4:1濃度)以便有效地形成內(nèi)胚層。在補(bǔ)充有N2 (Gibco)、B27 (Gibco)、抗壞血酸(5O u g/ml, Sigma)、Glutamax (2mM, Invitrogen)、單硫代甘油(0. 4 u M, Sigma)的 DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基中進(jìn)行分化。將以下濃度的因子用于初始劃線(primitive streakformation)、內(nèi)胚層誘導(dǎo)、前部?jī)?nèi)胚層/咽內(nèi)胚層誘導(dǎo)和隨后的前后部及背腹模式形成人 BMP-4, lng/ml 和 10ng/ml ; AbFGF, 2. 5ng/ml ;人活化素 A, 100ng/ml ;人頭蛋白，200ng/ml ；Y-27632, I u M ； SB-431542, IOuM ； A FGF10, lOng/ml ；人 FGF7, lOng/ml ；鼠 EGF, 20ng/ml ;和人 WNT3a，100ng/ml。肝臟條件如前所述，并包含 BMP-4，50ng/ml ；bFGF, lOng/ml ；VEGF, lOng/ml ；HGF, lOng/ml ；TGF a , 20ng/ml ;地塞米松，40ng/ml。除了購自 Toc ris 的SB-431542和Y-27632和地塞米松(Sigma)以外所有因子均購自R&D systems。按如下順序添加因子 第I天，Y-27632 ;第1-5天，BMP4、bFGF和活化素A ;第5_9天，頭蛋白和SB-431542 ;第7-19天，WNT3a、FG F10、BMP4、FGF 7和EGF。對(duì)于肝分化，按如下順序添加因子■ 第I天，Y-27632 ;第1-5天，BMP4、bFGF和活化素A ;第5_9天，地塞米松、bFGF、HGF、VEGF, EGF、TGFa和BMP4 。 對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)，將500 u M全反式維甲酸(Sigma)添加到培養(yǎng)物中。在第5天，胰蛋白酶(Gibco)化胚狀體，并以10，000-50，000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板到明膠涂布的組織培養(yǎng)-處理盤(Fisher)上。第11天成形素的篩選(Fig. 2h)包括成對(duì)和較高數(shù)量級(jí)地添加FGF(FGF10+FGF7)(R&D Systems)、SU-5402 (EMDChemicals)、Wnt5a (R&D Systems)、WNT3a (R&D Systems) >sFRPl (R&D Systems)、BMP4、頭蛋白、SHH (R&D Systems)、環(huán)巴胺(EMD Chemicals)、SB-431542, TGF-^ I (R&D Systems)、DAPT (EMD Chemicals)、維甲酸(Sigma)、DEAB (Sigma)、EGF (R&D Systems)、酪氨酸憐酸化抑制劑(tyrophastin) AG-1478 (EMD Chemicals)和WPI066(EMD Chemicals)。定量PCR。使用 Trizol (Invitrogen)，相鎖管(phase lock tubes) (5 '已接觸抗原(Prime))和 RNeasy 試劑盒(Qiagen)提取總 RNA。用 DNase I (Qiagen)處理1-2 y g總RNA,并使用隨機(jī)六聚體和Superscript III (Invitrogen)將其反轉(zhuǎn)錄。使用 SybrGreen(Invitrogen)檢測(cè)擴(kuò)增物。在 ABI 7900HT 熱循環(huán)儀(thermocycler)(Applied Bio systems)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，程序?yàn)?5°C IOmin的步驟，隨后95°C，15s和60°C , lmin,40個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)用SYBR GreenER定量PCR超混合物(quantitativePCRSuperMix) (Invitrogen)進(jìn)行三次。將各基因的變性曲線用于證實(shí)DNA產(chǎn)物的同質(zhì)性(homogeneity)。根據(jù)基因組DNA稀釋系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得絕對(duì)定量。參照通過持家基因GAPDH和￠-肌動(dòng)蛋白測(cè)定的內(nèi)參(input)使目標(biāo)基因的定量值標(biāo)準(zhǔn)化。各培養(yǎng)孔的qPCR進(jìn)行三次。引物序列示于表I。表1.基因正向引物 (5' -3')和反向引物(5' -3')
權(quán)利要求
1.一種前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集細(xì)胞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群，其包括至少約50%的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞群，其中所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞為咽內(nèi)胚層細(xì)胞。
4.一種衍生前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括用BMP抑制劑或TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑培養(yǎng)定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其包括用所述BMP抑制劑和所述TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑培養(yǎng)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中在無活化素A下培養(yǎng)所述定形內(nèi)胚層。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述BMP抑制劑為頭蛋白、腱蛋白或卵泡抑素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述BMP抑制劑為頭蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑為SB431542。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述BMP為頭蛋白，所述TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑為SB-431542。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-10任一項(xiàng)所述的方法，其中所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞為胚狀體細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求4-11任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括在活化素A中培養(yǎng)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求4-12任一項(xiàng)所述的方法，其中在無活化素A下用所述BMP抑制劑和所述TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑培養(yǎng)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求4-13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞為人類細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求4-14任一項(xiàng)所述的方法，其中所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞衍生自多能細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為ES細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為iPS細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為人類細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求4-18任一項(xiàng)所述的方法，其中所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)Foxa2，與在所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞中Sox2和Cdx2的表達(dá)相比，其包括升高的Sox2表達(dá)水平和降低的Cdx2表達(dá)水平。
20.一種由多能細(xì)胞制備前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群的方法，其包括 (i)在誘導(dǎo)所述多能細(xì)胞形成定形內(nèi)胚層細(xì)胞的條件下培養(yǎng)所述多能細(xì)胞；和 (ii)在誘導(dǎo)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞形成所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的條件下培養(yǎng)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞，從而制備所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述多能細(xì)胞在bFGF、BMP4和活化素A的存在下培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)所述多能細(xì)胞形成所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求20-21任一項(xiàng)所述的方法，其中所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞在BMP抑制劑或TGF-^信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的存在下和在無活化素A下培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞形成所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞在所述BMP抑制劑和所述TGF-^信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的存在下和在無活化素A下培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞形成所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述BMP抑制劑為頭蛋白或腱蛋白。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述BMP抑制劑為頭蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25任一項(xiàng)所述的方法，其中所述TGF-P信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的抑制劑為 SB-431542。
27.根據(jù)權(quán)利要求20-26任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述多能細(xì)胞培養(yǎng)1-4天。
28.根據(jù)權(quán)利要求20-27任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞為培養(yǎng)2-6天的細(xì)胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求20-28任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括分離所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求20-29任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為ES細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求20-29任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為iPS細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為人類細(xì)胞。
33.一種前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，其由權(quán)利要求4-19任一項(xiàng)所述的方法衍生。
34.一種前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群，其通過權(quán)利要求20-32任一項(xiàng)所述的方法制備。
35.一種影響前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞增殖、分化或存活的試劑的鑒別方法，其包括在要試驗(yàn)的試劑存在下培養(yǎng)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群，并比較所述細(xì)胞在所述試劑存在和不存在下的增殖、分化或存活，其中在所述試劑存在下的差異表示鑒別出影響所述細(xì)胞增殖、分化或存活的試劑。
36.一種參與細(xì)胞分化的基因的鑒別方法，其包括分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞和前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，并比較所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞和所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的基因表達(dá)譜，其中鑒別出在所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞和所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因表示參與細(xì)胞分化的基因。
37.一種抗體的鑒別方法，所述抗體識(shí)別從定形內(nèi)胚層向前部前腸內(nèi)胚層發(fā)展的分子標(biāo)記物，所述方法包括將抗體溫育于權(quán)利要求1所述的富集細(xì)胞群，并篩選出與所述前部前腸內(nèi)胚層的結(jié)合顯著高于與所述定形內(nèi)胚層的結(jié)合的抗體。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述抗體不能顯著結(jié)合到所述定形內(nèi)胚層。
39.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的細(xì)胞群，其中所述前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞為腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
40.一種誘導(dǎo)前部前腸內(nèi)胚層腹面發(fā)育的方法，其包括用選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)組成的組中的一種或多種因子來培養(yǎng)所述前部前腸內(nèi)胚層。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其包括用選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)組成的組中的兩種或多種因子來培養(yǎng)所述前部前腸內(nèi)胚層。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41所述的方法，其中所述因子選自由FGF7、FGFlO、EGF、BMP-4和Wnt3a組成的組。
43.一種在細(xì)胞中誘導(dǎo)肺命運(yùn)的方法，其包括在維甲酸的存在下用選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)組成的組中的一種或多種因子來培養(yǎng)通過權(quán)利要求4-32任一項(xiàng)所述的方法所產(chǎn)生的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，從而誘導(dǎo)所述腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞呈現(xiàn)所述肺命運(yùn)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述呈現(xiàn)所述肺命運(yùn)細(xì)胞的細(xì)胞表達(dá)一種或多種肺標(biāo)記物。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述一種或多種肺標(biāo)記物為Gata6或表面活性蛋白 C (SP-C)。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中通過用選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)組成的組中的一種或多種因子培養(yǎng)前部前腸內(nèi)胚層來誘導(dǎo)所述腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中通過用選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)組成的組中的兩種或多種因子培養(yǎng)前部前腸內(nèi)胚層來誘導(dǎo)所述腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中通過用選自由Wnt配體、Wnt信號(hào)傳導(dǎo)激活劑、BMP、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)組成的組中的兩種或多種因子培養(yǎng)前部前腸內(nèi)胚層來誘導(dǎo)所述腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
49.一種在細(xì)胞中誘導(dǎo)甲狀旁腺命運(yùn)的方法，其包括用音猬因子(SHH)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)培養(yǎng)腹面發(fā)育的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述呈現(xiàn)所述甲狀旁腺命運(yùn)細(xì)胞的細(xì)胞表達(dá)甲狀旁腺標(biāo)記物。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述甲狀旁腺標(biāo)記物為GCMB。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)前部前腸內(nèi)胚層分化的活體外方法，以及通過該方法生產(chǎn)的前部前腸內(nèi)胚層富集群。此類富集群對(duì)于研究分化期間發(fā)生的分子事件以及對(duì)于產(chǎn)生細(xì)胞替代治療用細(xì)胞是有用的。
文檔編號(hào)C12N5/07GK103068970SQ201180031569
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月25日
發(fā)明者漢斯-威廉·斯諾克, M·格林 申請(qǐng)人:西奈山醫(yī)學(xué)院