一種豬腸道上皮細胞系及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬腸道上皮細胞系及其應用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]豬流行性腹灣(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹灣病毒(PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，各種年齡的豬均易感。豬流行性腹瀉病毒(PH)V)為冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員。病毒形態(tài)略呈球形，有囊膜，囊膜上有花瓣狀纖突，呈皇冠狀。PEDV核酸為線性單股正鏈RNA，長為27000?33000個核苷酸(nt)。該病毒不能凝集人、兔、豬、鼠、犬、馬、羊、牛的紅細胞。對外界抵抗力弱，對乙醚、氯仿敏感，一般消毒藥物都可將其殺滅。病毒在60°C 30min，可失去感染力，但在50°C條件下相對穩(wěn)定。病毒在4°C，pH 5.0?9.0或在37°(3，？11 6.5?7.5時穩(wěn)定。
[0003]2010年以來，全國大部分地區(qū)的豬場開始大規(guī)模爆發(fā)PED，這次爆發(fā)中初生仔豬死亡率達90%，全國仔豬死亡估計有上千萬頭。給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失們，已經(jīng)引起政府和社會的高度關(guān)注。當前PEDV的研究主要在猴源的Vero細胞上開展，利用非豬源細胞進行研究，得到的研究結(jié)果不能夠真實的反映自然宿主細胞的感染狀況。豬腸道上皮細胞為PEDV的靶細胞，國內(nèi)外尚無豬腸道上皮細胞系細胞，因此每次實驗均需從腸道重新分離培養(yǎng)，制備過程繁瑣，代價高，且不能保證不同批次之間的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于彌補現(xiàn)有技術(shù)中的空白，建立一種穩(wěn)定傳代的豬腸道上皮細胞系(Porcine small intestinal epithelial cell line，PIEC)及其應用。
[0005]技術(shù)方案
一種豬腸道上皮細胞系，其保藏號為:CGMCC N0.11496。該豬腸道上皮細胞系能用于PEDV的分離和培養(yǎng)。PEDV感染的毒價可以達到104'9TCID5Q/mL以上。
[0006]本發(fā)明的豬上皮細胞系是通過下述方式獲得的:
在人源293細胞中擴增全長的Tert分子cDNA。將擴增產(chǎn)物連入PLV-puro慢病毒表達載體，構(gòu)建重組表達載體P-TERT。將構(gòu)建好的重組表達載體P-TERT與包裝輔助質(zhì)粒pSPAX2和PMG2G共轉(zhuǎn)染人源293細胞，獲得重組慢病毒。將該重組慢病毒侵染原代豬上皮細胞，通過嘌呤霉素加壓篩選，從而獲得了一株可穩(wěn)定傳代的豬腸道上皮細胞系。
[0007]通過PEDV流行毒株MY1401感染實驗，證實本發(fā)明的豬腸道上皮細胞系對PEDV高度敏感、PEDV感染的毒價可以達到104.9TCID5Q/mL以上，在流行毒株培養(yǎng)方面優(yōu)于Vero細胞。所以，本發(fā)明的豬腸道上皮細胞系能夠用于PEDV的分離和培養(yǎng)，也可以用于PEDV細胞受體和致病機制的研究。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明構(gòu)建的能穩(wěn)定傳代的豬腸道上皮細胞系可以用于PEDV的分離和培養(yǎng)，也可以用于PEDV細胞受體和致病機制的研究。PEDV易感的豬腸道上皮細胞系的建立，避免了原代豬腸道上皮細胞制備繁瑣、穩(wěn)定性差、難于培養(yǎng)的一系列缺點，為PEDV的培養(yǎng)提供了一個備選細胞系，為PEDV的深入研究提供了靶細胞，對PEDV疫苗生產(chǎn)具有重要意義。
【附圖說明】
[0009]圖1為PEDV病毒感染PIEC細胞系后免疫熒光圖，一抗:PEDVS蛋白單抗;二抗:FITC標記兔抗鼠抗體；
圖2為PEDV滴度測定免疫熒光圖，其中A、B、C、D，分別是PEDV MY01病毒液10、100、1000和10000倍稀釋后，感染PIEC細胞系的免疫熒光圖；一抗:PEDV S蛋白單抗;二抗:FITC標記兔抗鼠。
[0010]保藏信息
保藏時間:2015年11月11日;
保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏編號:CGMCC N0.11496 ；
保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；
分類命名:仔豬腸道上皮細胞。
【具體實施方式】
[0011]準備培養(yǎng)基:
(1)細胞培養(yǎng)基
10%(體積百分數(shù))新生牛血清的DMEM:取500ml液體DMEM培養(yǎng)基，按照10%的體積加入新生牛血清，充分混勻后備用；
(2)選擇性培養(yǎng)基
嘌呤霉素含量為含800ng/mL的細胞培養(yǎng)基:向細胞培養(yǎng)基添加嘌呤霉素而成;其中，每mL細胞培養(yǎng)基添加800ng嘌呤霉素；
(3)病毒培養(yǎng)用培養(yǎng)基
2%(體積百分數(shù))新生牛血清的DMEM:取500ml液體DMEM培養(yǎng)基，按照2%的體積加入新生牛血清，充分混勻后備用。
[0012]實施例1
人TERT cDNA全長的克隆
提取293細胞總RNA，利用TERT特異性引物進行RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物的序列如SEQ IDN0.1所示，全長為3363bp ；經(jīng)對比，與GenBank中的序列(ID: BC172541.1)同源性為100%。
[0013]所述TERT特異性引物:
F:aagtctagaatgccgcgcgctccccgctgc;(如SEQ ID N0.2所不)
R: tcagaattcttagtccaggatggtcttgaagtc;(如SEQ ID 勵.3所不)0
[0014]實施例2
重組表達載體P-TERT的構(gòu)建及重組慢病毒的包裝
根據(jù)PLV-puro(慢病毒表達載體)載體的多克隆酶切位點序列，選用Xbal和EcoRI將PLV-puro載體線性化，將實施例1的擴增產(chǎn)物插入PLV-puro載體，獲得重組表達載體;將該重組表達載體命名為P_TERT(重組慢病毒表達載體)。將構(gòu)建好的重組表達載體P-TERT與包裝輔助質(zhì)粒PSPAX2和pMG2G(購自Addgene，并由本實驗室保存)共轉(zhuǎn)染293細胞。于轉(zhuǎn)染后24和48小時收取含有重組慢病毒的細胞培養(yǎng)上清，-80°C保存(所述含有重組慢病毒的細胞培養(yǎng)上清是指，被重組表達載體P-TERT成功轉(zhuǎn)染的293細胞培養(yǎng)上清)。轉(zhuǎn)染后24小時或48小時所收取的樣品，無任何差異。
[0015]實施例3
原代豬腸道上皮細胞的制備
按照腸絨毛消化法制備原代豬腸道上皮細胞。具體步驟簡述如下:取1日齡未哺乳的仔豬腸道，經(jīng)反復沖洗后縱向剪開，是腔面朝上，用玻璃片輕輕掛下腸粘膜;收取刮取液，用
0.1%的膠原酶II 37°C消化15min，期間不時反復吹吸;終止消化后過200目細胞篩網(wǎng)，收集濾液中的細胞，置于37°C、5%(體積分數(shù)，下同)C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)或凍存。
[0016]實施例4
穩(wěn)定傳代豬腸道上皮細胞系的建立
將實施例2得到的含有重組慢病毒的細胞培養(yǎng)上清在助轉(zhuǎn)劑polybreneGyg/ml)幫助下侵染原代豬腸道上皮細胞;侵染后48小時，用選擇性培養(yǎng)基加壓篩選轉(zhuǎn)染的細胞，每24小時更換一次。經(jīng)過14天左右的篩選，未被嘌呤霉素殺死的細胞，獲得具有嘌呤霉素抗性的腸道細胞。然后利用有限稀釋法進一步對具有嘌呤霉素抗性的腸道細胞進行亞克隆(本發(fā)明的亞克隆操作及試劑是細胞培養(yǎng)方面的常規(guī)操作及常規(guī)試劑)，即可得到穩(wěn)定傳代的豬腸道上皮細胞系。
[0017]實施例5
豬腸道穩(wěn)定傳代上皮細胞系的體外傳代培養(yǎng)
待穩(wěn)定傳代的豬腸道上皮細胞長滿培養(yǎng)器皿底部后，使用PBS磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，而后加入適量0.25%的胰蛋白酶消化，待細胞變圓回縮時，加入細胞培養(yǎng)基終止消化，反復吹打使細胞懸浮并解離，然后轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中，置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0018]實施例6
PEDV分離及傳代實驗
將可穩(wěn)定傳代的豬腸道上皮細胞系(以下簡稱“細胞”)接種至六孔板中，待細胞生長至80-90%融合時，接種PEDV陽性病料，37°C感作2h后，棄感作液(感作液是指含有病料的培養(yǎng)基，其成分屬于公知)，然后加入病毒培養(yǎng)基并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞出現(xiàn)明顯病變(約36h)后，反復凍融2次收取病毒液。
[0019]將收取的病毒液按照Μ0Ι=0.01接種80-90%融合度的豬腸道上皮細胞，感作2h后，更換為病毒培養(yǎng)基并培養(yǎng)36h，而后反復凍融兩次收取病毒液。檢測病毒含量(檢測細胞培養(yǎng)基中病毒粒子的數(shù)量，由此判定病毒增殖情況)，病毒液按照10倍進行連續(xù)稀釋后接種豬腸道上皮細胞，接種后24h使用質(zhì)量含量為4%多聚甲醛溶液固定，利用PEDV S蛋白特異性單抗檢測細胞中病毒含量(如圖2所示)，并按照Reed & Muench法計算病毒含量。當PEDV病毒傳至第10代時，病毒滴度達到104'9TCID5()/mL以上，解決了 PEDV流行毒株難以分離的難題。
【主權(quán)項】
1.一種豬腸道上皮細胞系，其保藏號為:CGMCC N0.11496。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬上皮細胞系，PEDV感染的毒價能達到104'9TCID5Q/mL以上。3.—種權(quán)利要求1或2所述的豬上皮細胞系用于PEDV的分離和培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬腸道上皮細胞系及其應用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的豬上皮細胞系，其保藏號為：CGMCC？NO.11496。本發(fā)明構(gòu)建的能穩(wěn)定傳代的豬腸道上皮細胞系對PEDV高度敏感、PEDV感染的毒價可以達到104.9TCID50/mL以上，在流行毒株培養(yǎng)方面優(yōu)于Vero細胞。能用于PEDV的分離和培養(yǎng)，也能用于PEDV細胞受體和致病機制的研究。PEDV易感的豬腸道上皮細胞系的建立，避免了原代豬腸道上皮細胞制備繁瑣、穩(wěn)定性差、難于培養(yǎng)的一系列缺點，為PEDV的培養(yǎng)提供了一個備選細胞系，為PEDV的深入研究提供了靶細胞，對PEDV疫苗生產(chǎn)具有重要意義。CGMCC NO.1149620151111
【IPC分類】C12N7/00, C12N5/10, C12R1/93
【公開號】CN105462931
【申請?zhí)枴緾N201510941318
【發(fā)明人】陳智, 劉少寧, 吳家強, 杜以軍, 郭立輝, 陳蕾, 孫文博, 叢曉燕, 任素芳, 張玉玉, 于江, 李加飛, 王淞
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月16日