專利名稱：一種懸浮的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，尤其涉及一種可懸浮的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系及 其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，在1965年第一株昆蟲細(xì)胞系成功建立后至今，近40年的時(shí)間內(nèi)， 已經(jīng)建立的昆蟲細(xì)胞系超過500種。它們分別來源于鱗翅目、雙翅目、同翅目、 膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多種昆蟲，其中大部分來源于鱗翅目和雙翅目 昆蟲。昆蟲細(xì)胞系作為研究材料， 一直是生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、 分子生物學(xué)和生物化學(xué)等科學(xué)研究的重要工具，而且昆蟲細(xì)胞作為桿狀病毒表 達(dá)載體系統(tǒng)的重要組成部分，表達(dá)了大量的具有重大經(jīng)濟(jì)意義或科學(xué)意義的外 源蛋白質(zhì)；同時(shí)作為生物反應(yīng)器，擴(kuò)增昆蟲桿狀病毒用作生物殺蟲劑，特別是 擴(kuò)增含有外源基因的重組桿狀病毒殺蟲劑，昆蟲細(xì)胞也發(fā)揮了重要的作用。
大量的來源于鱗翅目昆蟲商品化的細(xì)胞系已得到人們廣泛的應(yīng)用，比如， 來源于草地貪夜蛾(5"po女/^ara /r收i/ e^/s)的Sf-21和其克隆株Sf-9，來 源于粉紋夜蛾(7Vic力o/^"Ws/ji)的Tn-368和其克隆株Tn-5B1-4 (商品名為 High Five)等，己經(jīng)成功的應(yīng)用于表達(dá)和生產(chǎn)重組蛋白。
鱗翅目的細(xì)胞系來源于很多組織，包括卵巢、胚胎、血細(xì)胞、脂肪體等。 然而，值得一提的是，由于昆蟲細(xì)胞不完全的去分化，有的已經(jīng)建立的昆蟲細(xì) 胞系仍然保持一定原始組織和器官的特征。來源于不同種類昆蟲的細(xì)胞系或來 源于同一種昆蟲不同組織部位的細(xì)胞系擴(kuò)增病毒或重組蛋白的表達(dá)能力各有 不同。因此建立和篩選新的、更多的桿狀病毒敏感細(xì)胞系(株)是一項(xiàng)非常有 必要而且有理論和實(shí)踐意義的工作。然而，到目前為止還沒有來自楊扇舟蛾的細(xì)胞系的報(bào)道。 楊扇舟蛾(C/o^era a"ac/zo"a Fabricius)是一種危害嚴(yán)重的林業(yè)害蟲，大 量的實(shí)驗(yàn)證明楊扇舟蛾顆粒體病毒可有效控制這種害蟲，且對環(huán)境友好。目前， 主要是用楊扇舟蛾幼蟲來復(fù)制生產(chǎn)這種病毒，成本高，產(chǎn)量小。已經(jīng)在600多 種昆蟲中發(fā)現(xiàn)了桿狀病毒(Martignoni and Iwai,1986),但是，還是有些昆蟲病 毒因?yàn)槿狈ο鄳?yīng)的昆蟲細(xì)胞系從而限制了對它們的研究。例如對顆粒體病毒 敏感的細(xì)胞系就較少(Winstanley and Crook， 1993)。到目前為止，也還沒有對 楊扇舟蛾顆粒體病毒(ClanGV)敏感的細(xì)胞系的報(bào)道。
楊扇舟蛾作為一種重要的食葉害蟲，其人工飼養(yǎng)技術(shù)還沒完全解決，所以 建立新的細(xì)胞系對楊扇舟蛾顆粒體病毒的復(fù)制生產(chǎn)和更加高效的桿狀病毒表 達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建都十分有意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可懸浮的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系，該細(xì)胞系名稱為 Clanl，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號為 CGMCC No.2579 。
本發(fā)明的另 一 目的在于提供該細(xì)胞系的構(gòu)建方法，方法步驟如下
1) 將產(chǎn)下90— 100小時(shí)(為了提供范圍，改成小時(shí)計(jì)算。這個(gè)時(shí)間非常 關(guān)鍵，此時(shí)胚胎內(nèi)未分化的細(xì)胞多，便于成系，而且胚胎大小便于操作。胚胎 太小時(shí)不容易解剖，太大時(shí)胚胎表面有一層蠟質(zhì)，在培養(yǎng)液中容易浮起不利細(xì) 胞增殖。)的楊扇舟蛾受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡后用無菌水清 洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水(如Ringer' s)清洗；
2) 將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，逐一擠壓卵粒釋放 出胚胎；
3) 將步驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉(zhuǎn)入密閉培養(yǎng)瓶中，放入25 3(TC無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 30小時(shí)；
4) 加入細(xì)胞培養(yǎng)液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養(yǎng)液中，在與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)；
5) 每7—15天更換培養(yǎng)液，直至觀察到不斷擴(kuò)展并開始增殖的細(xì)胞充滿 了整個(gè)培養(yǎng)瓶；
6) 從培養(yǎng)瓶中吸出半量的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞， 放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量的新細(xì)胞培養(yǎng)液；而原培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同 樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液；將兩個(gè)培養(yǎng)瓶再放回培養(yǎng)箱中與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)；
7) 周期重復(fù)步驟5)及步驟6)，細(xì)胞開始傳代，細(xì)胞系建立成功； 整個(gè)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的。
本發(fā)明所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液是常規(guī)采用的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉 素和胎牛血清的混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH在6.2-6.6之間。昆蟲細(xì)胞培 養(yǎng)液可以是各種商品化的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液，如T畫-FH， Grace' s， TC-100, IPL-41， Ex-Cell 405等等。
本發(fā)明所使用的細(xì)胞培養(yǎng)液中青霉素與鏈霉素的含量各為50 100 U/mL; 動(dòng)物血清含量為細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為5 % 15 % 。
本發(fā)明楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系來源于楊扇舟蛾胚胎并可懸浮培養(yǎng)。
本發(fā)明楊扇舟蛾胚胎Clan I細(xì)胞系不僅對楊扇舟蛾顆粒體病毒敏感，還對 其他多種桿狀病毒敏感。
本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明提供的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系可以用來復(fù)制這 類病毒，用于桿狀病毒殺蟲劑的規(guī)?；a(chǎn)，以及構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)， 表達(dá)具商業(yè)及科學(xué)價(jià)值的蛋白質(zhì)。而且，懸浮生長的細(xì)胞有很多優(yōu)點(diǎn)不需要 胰蛋白酶消化，傳代過程較快，對細(xì)胞的創(chuàng)傷更小，更易擴(kuò)大培養(yǎng)等。因而本 發(fā)明具有極高的商業(yè)和科研價(jià)值。


圖1為本發(fā)明楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞Clan I的培養(yǎng)形態(tài)圖 圖2為本發(fā)明楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞Clan I的核型圖 圖3 為DAF-PCR鑒定Clan I的DNA指紋擴(kuò)增圖譜圖4為感染AcMNPV的Clan I的細(xì)胞(標(biāo)尺10u m) 圖5為感染EoNPV的Clan I的細(xì)胞(標(biāo)尺10" m) 圖6為感染ClanGV的Clan I的細(xì)胞(標(biāo)尺10u m)
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系已于2008年7月9日保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，以下是觀察和測定到的其生物學(xué)特征
1. 經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，該細(xì)胞系懸浮于培養(yǎng)液中。細(xì)胞的形狀有3種類型大 部分細(xì)胞圓形、少部分梭形，較少似巨噬細(xì)胞形(如圖l所示)。
2. 按照Mcintosh and Ignoffo， 1989(Mcintosh, A. H. and C. M. Ignoffo /. //7KerteZ^.1989， 54:97 102)的方法，測定第15代細(xì)胞生長 曲線和群體倍增時(shí)間。以1.8X105細(xì)胞/mL的濃度接種到24孔板中，每孔lmL， 27。C培養(yǎng)，每24h測定細(xì)胞濃度，繪制生長曲線，并按公式T=tlg2/[lg(N/N())] 計(jì)算，第15代的細(xì)胞群體倍增時(shí)間為108. 8小時(shí)。
其中T二在對數(shù)期平均增長一倍所需的時(shí)間 t—妾種到測定細(xì)胞數(shù)的時(shí)間 N^接種時(shí)的細(xì)胞數(shù) N4寸刻t所測定的細(xì)胞總數(shù)
3. 按照Takahashi et al. (Takahashi， Mitsuhashi and 0htaki (1980) "eK^oA "i//er. 22:11-19)的方法，測定了第15代細(xì)胞的核 型，ClanI的染色體數(shù)目在80-200之間(圖2)。
4. 使用DAF-PCR的方法(Mcintosh, Grasela and Matteri (1996), //^e" U. 5:187 195)鑒定了細(xì)胞系Clan I確是來源于楊扇舟蛾， 而非其它細(xì)胞系的污染(圖3)。由ClanI提取的DNA與楊扇舟蛾卵DNA擴(kuò)增 后主要的帶型相同，而與對照來源于果蠅的SL2細(xì)胞帶型明顯不同。
5. 使用傳統(tǒng)細(xì)胞凍存的方法對一定代次的部分細(xì)胞進(jìn)行凍存處理，保存 細(xì)胞的種資，并成功復(fù)蘇。本發(fā)明建立楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系的具體方法如下
1) 將產(chǎn)下90—100小時(shí)的楊扇舟蛾受精卵片放入試管中，然后用10%次
氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘或用0. 2%—1%的甲醛溶液浸泡10-30分鐘并輕振 蕩，倒掉次氯酸鈉溶液或甲醛溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75 %乙醇溶液消毒卵粒10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer' s 清洗卵粒；
2) 將卵粒倒入或用移液器移入裝有l(wèi)-2ml的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，在解剖 鏡下用工具逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；
3) 用移液器輕輕轉(zhuǎn)移胚胎入另一裝有0. 5mL昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中， 用剪將胚胎剪碎，長度約l-2mm (該長度的選擇可以便于未分化的細(xì)胞游離出 來，這些未分化細(xì)胞增殖的潛力比較大，因而容易建立成系)。用移液器將胚 胎組織塊轉(zhuǎn)入含有0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入 25 3(TC無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 30小時(shí)；
4) 加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中， 在與步驟(3)同樣條件下培養(yǎng)；
5) 每7—15天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時(shí)換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液，直 至觀察到不斷擴(kuò)展并開始增殖的細(xì)胞充滿了整個(gè)培養(yǎng)瓶；
6) 從培養(yǎng)瓶中吸出半量的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞， 放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量的新細(xì)胞培養(yǎng)液；而原培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量 同樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液；兩個(gè)培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
7) 周期重復(fù)步驟5)及步驟6),細(xì)胞開始傳代，細(xì)胞系建立成功；
整個(gè)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的。
下面以具體實(shí)施例詳細(xì)說明
實(shí)施例1:第一傳代細(xì)胞系的實(shí)現(xiàn) 采用如下步驟(1) 將產(chǎn)下約四天的楊扇舟蛾受精卵片放入10ml試管中，然后用10%次氯 酸鈉溶液浸沒約4分鐘并輕振蕩，倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒 掉無菌水后用75%乙醇溶液消毒卵粒15分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇 后用Rmger' s清洗卵粒；
(2) 將卵粒倒入或用移液器移入裝有2ml的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，在解剖鏡 下用彎頭眼科鑷逐 一 輕擠卵粒釋放出胚胎；
(:3)用移液器輕輕轉(zhuǎn)移胚胎入另一裝有0. 5mL昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿 中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度均在l-2mm之間。用移液器將胚胎組織塊轉(zhuǎn)入 含有O. 5mL細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27'C無光照的
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
(4) 加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養(yǎng)液中，
在與歩驟(3)同樣條件下培養(yǎng)；
(5) 每15天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時(shí)換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至觀 察到不斷擴(kuò)展并開始增殖的細(xì)胞充滿了整個(gè)培養(yǎng)瓶；
(6) 把含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞吸出，得到第一傳代楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞。
整個(gè)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的，且使用的細(xì)胞培養(yǎng)液是采用T函-ra
昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液與占總體積含量各為50—100U/mL的青霉素、鏈霉素和占總體 積量10%的胎牛血清混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH為6. 5。
實(shí)施例2:第15傳代細(xì)胞系的實(shí)現(xiàn) 采用的具體步驟如下
1) 從原培養(yǎng)瓶中把含有新增殖出的第14傳代單個(gè)細(xì)胞連同全部的細(xì)胞培 養(yǎng)液吸出放入新培養(yǎng)瓶中，并加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液；
2) 每7天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時(shí)換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液，直至觀察 到不斷擴(kuò)展并開始增殖的細(xì)胞充滿了整個(gè)培養(yǎng)瓶；
3) 把含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞吸出，得到第15傳代楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞。 同樣需保證整個(gè)過程在無菌條件下進(jìn)行。實(shí)施例3:第一傳代細(xì)胞系中對楊扇舟蛾受精卵的消毒的又一實(shí)施方法 采用如下步驟
1) 將產(chǎn)下約四天的楊扇舟蛾受精卵片放入10ml試管中，然后用用1%的甲 醛溶液浸泡30分鐘；
2) 倒掉甲醛溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75%乙醇溶液消
毒卵粒15分鐘，期間不斷輕輕振蕩；
3) 倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒;
4) 將卵粒倒入或用移液器移入裝有2ml的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，開始原代培養(yǎng)操作。 整個(gè)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的。
上述各實(shí)施例可在不脫離本發(fā)明的范圍下加以若干變化，而非用以限制本 發(fā)明的申請專利范圍。
以下是本發(fā)明Clan I細(xì)胞系對桿狀病毒敏感性試驗(yàn)的說明 材料與方法
1、 原代病毒種子液——出芽型病毒(ClanBV、HcBV、 EoBV)的制備 將濃度為lX107PIB/mL的楊扇舟蛾顆粒體病毒懸液涂在人工詞料上，稍干
后飼喂3齡末楊扇舟蛾幼蟲，放入26。C培養(yǎng)箱中14小時(shí)光照10小時(shí)黑暗飼養(yǎng) 四天。蟲體用75%酒精消毒后剪斷腹足收集幼蟲血淋巴于10倍(含有10%苯 基硫脲飽和液)的TNM-FH培養(yǎng)液中，200g離心5min，取上清液經(jīng)0. 22 u m微 孔濾膜過濾，濾液即為原代病毒種子液(ClanBV)，保存于一 20°C冰箱備用。 美國白蛾使用三齡幼蟲接種，五天后收取血淋巴，濾液即為原代病毒種子 液(HcBV);茶尺蠖使用四齡幼蟲接種，四天后收集血淋巴，濾液即為原代病
毒種子液(EoBV)。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒種子液(AcBV)由中科院動(dòng) 物所昆蟲病毒研究室提供。
2、 細(xì)胞系接毒及多角體產(chǎn)量的測定
取對數(shù)生長期的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞接種于25cnr'的培養(yǎng)瓶中，接種密度為1 XlQ5個(gè)/ml。 24h后加入0. lml的病毒種子液，在27。C培養(yǎng)箱中吸附3h，并每隔15min晃動(dòng)一次，吸掉上浮的培養(yǎng)液，并加入3ml新培養(yǎng)液，置于27。C培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。IO天后收集細(xì)胞及其培養(yǎng)液，加入十分之一體積的10%十二烷基硫 酸鈉(SDS)，劇烈震蕩，5000g離心5分鐘，沉淀用少量1%SDS懸浮，血球計(jì) 數(shù)板計(jì)數(shù)多角體的含量。根據(jù)多角體的濃度與感染細(xì)胞的密度，計(jì)算出平均每 個(gè)感染細(xì)胞中的多角體數(shù)量。
結(jié)果與分析
Clan I細(xì)胞系對楊扇舟蛾顆粒體病毒(ClanGV)、苜蓿銀紋夜蛾核型多 角體病毒(AcMNPV)、美國白蛾核型多角體病毒(HcNPV)、茶尺蠖核型多角 體病毒(EoNPV)均敏感，用Clan I擴(kuò)增ClanGV可達(dá)到每毫升培養(yǎng)液生產(chǎn) 1.5X10: PIB的產(chǎn)量，平均每個(gè)細(xì)胞生產(chǎn)150個(gè)顆粒體。同時(shí)可以觀察到典型 的細(xì)胞病理特征，即細(xì)胞核增大，內(nèi)含大量的顆粒體顆?；蚨嘟求w顆粒(如圖 ■4、 5、 6)。
權(quán)利要求
1、一種可懸浮的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系Clan I，CGMCC No.2579。
2、 一種權(quán)利要求1所述可懸浮的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞的構(gòu)建方法，方法步 驟如下1) 將產(chǎn)下90— 100小時(shí)的楊扇舟蛾受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液 浸泡2 — 30分鐘后用無菌水清洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水 Ringer' s清洗；2) 將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，逐一輕擠壓卵粒釋 放出胚胎；3) 將步驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉(zhuǎn)入密閉培養(yǎng)瓶中，放入25 2『C無光照的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 30小時(shí)；4) 加入細(xì)胞培養(yǎng)液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養(yǎng)液中， 在與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)5) 每7—15天更換培養(yǎng)液，直至觀察到不斷擴(kuò)展并開始增殖的細(xì)胞充滿 了整個(gè)培養(yǎng)瓶；6) 從培養(yǎng)瓶中吸出半量的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞，放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量的新細(xì)胞培養(yǎng)液；而原培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量 同樣多新的細(xì)胞培養(yǎng)液；將兩個(gè)培養(yǎng)瓶再放回培養(yǎng)箱中與步驟3)同樣條件下培 養(yǎng)；得到楊扇舟蛾胚胎第一代傳代細(xì)胞，細(xì)胞系建立成功； 整個(gè)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的。 ；
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于繼續(xù)得到楊扇舟蛾胚胎后 一代傳代細(xì)胞的方法步驟如下周期重復(fù)權(quán)利要求2所述的步驟5)及步驟6)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟l)中用5°/。一20% 的次氯酸鈉溶液楊扇舟蛾受精卵片2-15分鐘，或用0. 2%—1%的甲醛溶液浸泡 10-30分鐘，用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡及用乙醇溶液消毒期間均可不斷 輕輕振蕩。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于胚胎剪碎成1-2mm組織塊， 所述步驟5)中更換培養(yǎng)液的具體方法是每7—15天吸出半量的培養(yǎng)液，并 同時(shí)換入半量新的細(xì)胞培養(yǎng)液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其中所述的細(xì)胞培養(yǎng)液是 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細(xì)胞培養(yǎng)液pH 在6. 2-6. 6之間，其中細(xì)胞培養(yǎng)液中的青霉素與鏈霉素的總含量不超200U/mL; 胎牛血清的體積容量占細(xì)胞培養(yǎng)液體積容量的5%—15。/0。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于其中細(xì)胞培養(yǎng)液中的青霉 素與鏈霉素的含量分別為0 100U/mL;胎牛血清的體積容量占細(xì)胞培養(yǎng)液體積 容量的5% 15%。
8、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的昆蟲細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述 的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液選自商品化的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液T麵-FH， Grace' s， TC-100， IPL-41,或Ex-Cell 405。
9、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的昆蟲細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于對得 到的楊扇舟蛾胚胎后一代傳代細(xì)胞進(jìn)行凍存處理，以保存細(xì)胞的種資供使用時(shí) 再復(fù)蘇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可懸浮的楊扇舟蛾胚胎細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，該細(xì)胞系名稱為Clan I，CGMCC No.2579。構(gòu)建方法如下1)將產(chǎn)下72-96小時(shí)的楊扇舟蛾受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡后再消毒洗；2)將處理后的卵粒倒入昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液中，逐一擠壓卵粒釋放出胚胎；3)將胚胎剪碎成組織塊放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4)加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；5)定時(shí)更換培養(yǎng)液，直至增殖的細(xì)胞充滿了整個(gè)培養(yǎng)瓶；6)吸出半量的細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個(gè)細(xì)胞，放入新培養(yǎng)瓶中并加入等量的新細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7)周期重復(fù)步驟5)及步驟6)，細(xì)胞開始傳代，細(xì)胞系建立成功；整個(gè)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的。
文檔編號C12R1/91GK101423816SQ200810118628
公開日2009年5月6日 申請日期2008年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月20日
發(fā)明者張永安, 曲良建, 溫發(fā)園, 王文歡, 王玉珠 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所