一種用于治療肺癌的協(xié)同藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為一種用于治療肺癌的協(xié)同藥物組合物，其特征在于，本發(fā)明所述的協(xié)同 藥物組合物還包含了具有有益的破壞非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)-549活性的C2 (新異長葉薄荷 醇）、C3 (異蒲勒醇）和C4 (香茅醇）化合物組分。本發(fā)明還涉及活性化合物C2、C3和C4 的組合對(duì)肺癌細(xì)胞的協(xié)同效果的評(píng)價(jià)。重要的是，這些化合物對(duì)如肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨骼 肌細(xì)胞一樣的正常細(xì)胞無有害影響，并且因此被認(rèn)為在治療作用上高度相關(guān)。
【背景技術(shù)】
[0002] 正常細(xì)胞到惡性衍生物的轉(zhuǎn)化是一個(gè)多步驟的過程，它反映基因的改變和正常細(xì) 胞的增殖和平衡的缺失。癌癥的一個(gè)基本性質(zhì)在于不受細(xì)胞周期的控制。與正常細(xì)胞不同， 正常細(xì)胞的增殖僅與發(fā)育或其他組織生長所需的促有絲分裂的信號(hào)有關(guān)，癌細(xì)胞的增殖過 程不受任何控制。惡性細(xì)胞也經(jīng)歷了相同的細(xì)胞周期階段，但細(xì)胞周期的檢查節(jié)點(diǎn)保持無 功能狀態(tài)。癌細(xì)胞增殖是因?yàn)樗鼈儗?duì)抑制增長信號(hào)不敏感，抑制增長信號(hào)來自于基質(zhì)，或者 來自于基因表達(dá)模式轉(zhuǎn)化到隨之而來的"終端"分化，它們也不需要外源性生長因子來保持 其增殖狀態(tài)。癌癥是細(xì)胞生理變化的表現(xiàn)形式，其導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。癌細(xì)胞的特征包括 對(duì)程序性細(xì)胞死亡反應(yīng)遲鈍，對(duì)生長信號(hào)不敏感，獨(dú)立的生長刺激信號(hào)，不受控制的復(fù)制潛 力和持續(xù)的血管生成。
[0003] 癌細(xì)胞在調(diào)節(jié)支配正常細(xì)胞增殖和平衡機(jī)制方面存在缺陷。p53腫瘤抑制基因的 突變是人類癌癥中的普遍現(xiàn)象。在正常細(xì)胞中，低水平的P53是由Mdm2保持的。Mdm2通過 揭露核出口信號(hào)及其隨后在細(xì)胞質(zhì)中的降解直接抑制p53。p53水平的升高發(fā)生在細(xì)胞應(yīng) 激反應(yīng)過程，包括DNA的損傷和由此導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯和凋亡。在檢測(cè)DNA損傷時(shí)，p53 磷酸化并穩(wěn)定化，此處它作為靶基因如P21的細(xì)胞周期蛋白（cyclin)依賴性激酶抑制劑轉(zhuǎn) 錄因子，Bax蛋白為BCL-2家族的促凋亡成員蛋白，DNA修復(fù)蛋白并且也具有它自身的調(diào)節(jié) 因子Mdm2。p53還通過激活Bax和Bak凋亡蛋白觸發(fā)細(xì)胞凋亡[Yee，2005]。
[0004] 正常細(xì)胞需要有絲分裂的生長信號(hào)使其進(jìn)入增殖期，而癌細(xì)胞則表現(xiàn)為增殖 失控。當(dāng)其休眠時(shí)候意味著進(jìn)入細(xì)胞周期，促有絲分裂的信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞周期蛋白 Dl(cyclin Dl)，細(xì)胞周期蛋白Dl (cyclin Dl)和它的催化伴侶CDK4和CDK6在整個(gè)Go期 到Gi期中都存在。細(xì)胞周期蛋白Dl (cyclin Dl)的構(gòu)建的激活在癌細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化中 發(fā)揮作用。P21阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展，通過抑制細(xì)胞周期蛋白-⑶K復(fù)合物（cyclin-⑶K complex)以及調(diào)節(jié)p53依賴的細(xì)胞周期Gi期的阻滯[Sherr，1999]。
[0005] 由于抗癌藥物的主要目的是通過觸發(fā)半胱天冬酶（caspase)活性，一連串事件最 終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，以下是該方面的現(xiàn)有技術(shù)討論。
[0006] 在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變：細(xì)胞萎縮，表現(xiàn)為畸形和失去其鄰近 細(xì)胞的接觸。染色質(zhì)凝聚發(fā)生在靠近核膜的位置，磷脂酰絲氨酸溢出發(fā)生在質(zhì)膜，并且最終 細(xì)胞被分裂成致密的膜封閉結(jié)構(gòu)，被稱為"凋亡小體"。細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生的最重要的機(jī) 制是蛋白水解酶的激活，它最終導(dǎo)致DNA片解化。許多特異性蛋白基體負(fù)責(zé)完整性和形狀 的保持或細(xì)胞器進(jìn)行裂解[Saraste，2000]。
[0007] 半胱天冬酶（caspase)在細(xì)胞凋亡過程中通過退化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)揮著關(guān)鍵作 用，如：通過核纖層的破壞。在細(xì)胞凋亡過程中，核纖層在一個(gè)單點(diǎn)開裂，由于半胱天冬酶 (caspase)導(dǎo)致核膜破裂和染色質(zhì)凝聚。半胱天冬酶（caspase)在細(xì)胞重組過程中，通過 裂解幾種蛋白參與了細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，由此也在細(xì)胞重組間扮演重要的角色。半胱天冬酶 (caspase)最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡以及有助于平衡細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。本研究評(píng)估了不同的草藥化合物 在肺癌細(xì)胞中的抗增殖和凋亡能力，以及確定潛在凋亡細(xì)胞死亡背后的潛在的分子機(jī)制。 一些抗癌化合物有可能抑制細(xì)胞增殖，但在目前全球范圍來看，癌癥成為人類面臨的最大 威脅，需要特定的精準(zhǔn)的靶標(biāo)活性化合物。
[0008] 本發(fā)明是基于草藥源，其具有重要的意義在于被分離的化合物具有揮發(fā)性，并且 也因此具有可吸入性。進(jìn)一步地，令人滿意的地，這些理想分子只會(huì)選擇惡性細(xì)胞，對(duì)正常 細(xì)胞沒有影響。值得注意的是，目前沒有關(guān)于山胡椒屬種子油的多種化合物具有協(xié)同作用 的報(bào)告，特別是本發(fā)明中使用的具有抗癌活性的三種化合物。同時(shí)，這是從山胡椒屬種子油 分離的這三種化合物的蒸汽第一次被證明對(duì)于四種癌細(xì)胞系具有很強(qiáng)的抗癌活性。
[0009] 因此，鑒于迄今報(bào)告的現(xiàn)有技術(shù)，它可以總結(jié)為，在該日期之前最重要的需求是提 供一種具有抗癌活性的不具有對(duì)其他體細(xì)胞產(chǎn)生有害影響的草本藥物組合物。進(jìn)一步的， 至今也沒有報(bào)道認(rèn)為所述的油對(duì)抗癌活性具有協(xié)同關(guān)系。
[0010] 發(fā)明目的
[0011] 本發(fā)明主要的發(fā)明目的在于提供一種具有抗癌活性的協(xié)同藥物組合物，包括 C2 (新異長葉薄荷醇）、C3 (異蒲勒醇）和C4 (香茅醇）。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種對(duì)癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗癌活性的藥物組合物， 其具有蒸汽形式，包括從山胡椒屬種籽油中蒸餾得到的C2(新異長葉薄荷醇），C3(異蒲勒 醇）和C4 (香茅醇）。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供C2 (新異長葉薄荷醇），C3 (異蒲勒醇）和C4 (香茅 醇）三種油化合物，它們組合為蒸汽形式并顯示出了最大的抗癌活性，因此能通過協(xié)同作 用殺死癌細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在不影響正常細(xì)胞的前提下提供能激發(fā)肺癌細(xì)胞周 期阻滯和凋亡死亡的具有藥物重要性的治療性化合物。
【附圖說明】
[0014] 圖1為混合蒸汽（CVp)的效果，提取自山胡椒屬種子，通過MTT法測(cè)定其對(duì)A549 細(xì)胞的活力的影響。
[0015] (A) A549肺癌細(xì)胞暴露在不同稀釋度（IO6-IO2)的原油中處理72小時(shí)。通過MTT 測(cè)定法（3-(4,5-二甲基-2-噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴化鹽）測(cè)定細(xì)胞活力，并且以％ 表示細(xì)胞相對(duì)存活數(shù)。
[0016] (B)對(duì)山胡椒屬種子提取物進(jìn)行了表征，并確定了四個(gè)主要化合物即香茅醛 (C1)，新異長葉薄荷醇（C2)，異蒲勒醇（C3)和香茅醇（C4)。
[0017] (C)細(xì)胞死亡的百分比被觀察，當(dāng)A549細(xì)胞未被暴露（控制）或暴露在粗提取物 中或與稀釋濃度為2 X IO2的單一化合物Cl或C2或C3或C4時(shí)。
[0018] (D)CVp(CVp = C2+C3+C4比例為1 :1 :1)對(duì)細(xì)胞死亡的影響被觀察72小時(shí)，并且 保持沒有任何暴露，通過顯微鏡圖像可視化。
[0019] (E)選擇在不同時(shí)間間隔（24,48,72小時(shí)）對(duì)CVp培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行存活數(shù)測(cè)定。 數(shù)值是指三次獨(dú)立的土 SEM實(shí)驗(yàn)。
[0020] *P〈0. 01 ;#P〈0. 01 相對(duì)于控制，并且 #Ρ〈0· 05 相對(duì)于 C4。
[0021] 圖2代表CVp誘導(dǎo)Α549肺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡周期
[0022] (A)凋亡細(xì)胞死亡采用膜聯(lián)蛋白V_Cy3和CFDA (5 (6)_羧基熒光素）雙染色方法檢 測(cè)。用CVp處理36小時(shí)的A549細(xì)胞呈現(xiàn)綠色和紅色污漬，而對(duì)照細(xì)胞（未處理）只呈現(xiàn) 綠色。
[0023] (B)由CVp處理36小時(shí)的A549細(xì)胞中采用JC-I染色試驗(yàn)觀察其線粒體膜電位損 耗。對(duì)照為未經(jīng)過處理的細(xì)胞。
[0024] (C)凋亡DNA的片斷被觀察，由經(jīng)過CVp處理的A-549細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞（未暴露） 對(duì)比，表明在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳沒有這樣的DNA片段。梯形DNA標(biāo)記物被用于低分子量 的片段的檢測(cè)。此圖為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性圖像。
[0025] 圖3表示CVp通過激活半胱天冬酶（caspase)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0026] (A) A549肺癌細(xì)胞在無菌的22毫米的蓋玻片中培養(yǎng)。線粒體和FITC (異硫氰酸熒 光素）標(biāo)記的細(xì)胞色素 C共同定位在對(duì)照細(xì)胞中，經(jīng)過暴露在CVp中處理36小時(shí)測(cè)定其引 起的從線粒體釋放的細(xì)胞色素 C。
[0027] (B)通過CVp培養(yǎng)的A-549細(xì)胞中抗裂解的半胱天冬酶9 (caspase 9)或半胱天冬 酶3 (caspase 3)的抗體進(jìn)行免疫印跡分析，時(shí)間間隔為0小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)。對(duì)照為 β-肌動(dòng)蛋白的培養(yǎng)。
[0028] (C)同時(shí)，不同培養(yǎng)的Α549細(xì)胞裂解物被用來觀察半胱天冬酶3 (caspase 3)活 性，通過使用proluminescent caspase 3作為底物，隨后利用Iuminometer儀器測(cè)量發(fā)光 強(qiáng)度。。
[0029] (D) PARP (聚（ADP-核糖）聚合酶）的分裂也可以被觀察，通過免疫印跡分析通過 探測(cè)anti-PARP抗體，β肌動(dòng)蛋白用作上樣對(duì)照。
[0030] 圖4 (Α，Β)為Α549細(xì)胞未經(jīng)過（控制）或經(jīng)過CVp處理，并且細(xì)胞在不同時(shí)期被 溶解，并且進(jìn)行細(xì)胞周期蛋白DUcyclin Dl)或pNFkB p65(Ser-536)的免疫印跡分析。（C) pMdm2、p21和p53的蛋白質(zhì)水平也被在相同周期分析。以內(nèi)部填充β -肌動(dòng)蛋白做為對(duì)照。
[0031] (D)細(xì)胞周期蛋白D1-P21 (cyclin D1-P21)的相互作用強(qiáng)度隨CVp的作用時(shí)間增 加而增加，這是通過共免疫沉淀研究得到的結(jié)論。
[0032] (E)將BrdU (5-溴-2' -脫氧尿苷）摻入的控制和CVp處理A-549細(xì)胞被分析，并 且通過熒光顯微圖像被觀察。
[0033] (F)通過FACS (熒光激活細(xì)胞分選儀）分析，發(fā)現(xiàn)未處理的（con)和CVp處理的 A549細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。
[0034] 圖5表示CVp抑制Akt的磷酸化
[0035] (A，B)總Akt和磷酸化-Akt (p-Akt)在Thr308和Ser473在A549細(xì)胞經(jīng)過不同時(shí) 間（