專利名稱：一種乙型腦炎疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型腦炎疫苗的生產(chǎn)方法，具體涉及一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)滅活病毒乙型腦炎疫苗的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的滅活病毒疫苗，例如乙型腦炎疫苗的生產(chǎn)工藝多采用轉(zhuǎn)瓶、固定床和多臺(tái)小型反應(yīng)器并聯(lián)工藝來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞和病毒，該工藝存在著生產(chǎn)能力不足、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等諸多缺陷，限制了病毒疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。目前，采用生物反應(yīng)器技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)已經(jīng)成為國(guó)際上病毒疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)，法國(guó)巴斯德研究所應(yīng)用500L生物反應(yīng)器已經(jīng)成功地工業(yè)化生產(chǎn)出Vero細(xì)胞狂犬疫苗和小兒麻痹疫苗，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。因此，對(duì)利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)乙腦疫苗的工藝進(jìn)行深入的研究，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)具有廣闊的前景和積極的意義。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)滅活病毒乙型腦炎疫苗的方法，該方法的生產(chǎn)能力顯著提高且產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定均一。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種乙型腦炎疫苗的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括以下步驟(1)將Vero種子細(xì)胞加入300升生物反應(yīng)器中，與微載體一起進(jìn)行灌流培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基包含9. 55g/L的M199 (M199干粉培養(yǎng)基組成成分見(jiàn)GIBCO培養(yǎng)基手冊(cè))、2. 2g/L的 NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (體積/體積)的胎牛血清；培養(yǎng)條件包括攪拌速度為35 40轉(zhuǎn)/分，pH為7. 2 7. 4，溶解氧為40 50%飽和度，溫度為 36. 5 37. 5°C，培養(yǎng)基的灌流速度為315升/天；(2)灌流培養(yǎng)5 6天后，沉降微載體和細(xì)胞，以維持液替換培養(yǎng)基，接種乙型腦炎病毒繼續(xù)進(jìn)行灌流培養(yǎng)，其中維持液包含9. 55g/L的M199培養(yǎng)基，2. 2g/L的NaHCO3,1. Og/L 的蔗糖以及0. lg/L的人血白蛋白；培養(yǎng)條件包括攪拌速度為35 40轉(zhuǎn)/分，pH為7. 5 7. 6，溶解氧為40 50%飽和度，溫度為33. 5 34. 5°C，維持液的灌流速度為315升/天；(3)收集病毒培養(yǎng)液，過(guò)濾、滅活并純化。在上述生產(chǎn)方法中，優(yōu)選地，乙型腦炎病毒按照感染復(fù)數(shù)(MOI)為0. 01接種。在上述生產(chǎn)方法中，Vero種子細(xì)胞的制備方法可以包括以下步驟將復(fù)蘇的Vero 細(xì)胞依次在175cm2方瓶、2升轉(zhuǎn)瓶、14升生物反應(yīng)器以及75升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。優(yōu)選地，175cm2方瓶中的培養(yǎng)基為包含10% (體積/體積)的胎牛血清的M199 培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件包括溫度為37°C，通入5% (體積/體積)的C02。更優(yōu)選地，175cm2方瓶中的培養(yǎng)方法為將液氮保存的細(xì)胞迅速融化后，按lX105/cm2的接種密度轉(zhuǎn)入175cm2方瓶中，滴加培養(yǎng)基并在37°C和5% (體積/體積)的CO2下培養(yǎng)，長(zhǎng)至致密單層后消化，再以1 4(體積/體積)的接種比例將經(jīng)消化得到的細(xì)胞懸液加到新的培養(yǎng)基中，在37°C和5% (體積/體積)的CO2下培養(yǎng)3 4天后，再以1 4(體積/體積)接種比例加到新的培養(yǎng)基中，在37°C和5% (體積/體積)的CO2下培養(yǎng)3 4天。優(yōu)選地，2升轉(zhuǎn)瓶中的培養(yǎng)基包括9. 55g/L的M199培養(yǎng)基、1. 8g/L的NaHC03、1. 5g/ L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (體積/體積)的胎牛血清；培養(yǎng)條件包括溫度為37V，轉(zhuǎn)速為1/8轉(zhuǎn)/分。更優(yōu)選地，2升轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)的接種密度為1. 0 2. 0 X 105/cm2， 培養(yǎng)時(shí)間為3 4天。優(yōu)選地，14升和75生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基包括9. 55g/L的M199培養(yǎng)基、2. 2g/L 的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (體積/體積)的胎牛血清；培養(yǎng)條件包括攪拌速度為35 40轉(zhuǎn)/分，pH為7. 2 7. 4，溶解氧為40 50%飽和度，溫度為36. 5 37. 5°C，培養(yǎng)基的灌流速度為315升/天，并且加入微載體。在上述生產(chǎn)方法中，優(yōu)選地，過(guò)濾包括依次經(jīng)過(guò)孔徑為1 μ m和0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)截留分子量為300KD的濾膜超濾。在上述生產(chǎn)方法中，優(yōu)選地，滅活的滅活劑為β-丙內(nèi)酯。β-丙內(nèi)酯(BPL)現(xiàn)已廣泛地在多種人和動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)中作為滅活劑使用。它能在機(jī)體內(nèi)完全分解為無(wú)毒的 β-羥丙酸，這是一種人體內(nèi)脂肪代謝后的產(chǎn)物，對(duì)人體和動(dòng)物無(wú)毒。BPL是一種無(wú)毒性的液體，在37°C下2小時(shí)后能自行水解為一種無(wú)毒的物質(zhì)，也可以加入亞硫酸鈉停止其反應(yīng)。 BPL對(duì)病毒的滅活能力很強(qiáng)，同時(shí)還可以保持病毒良好的免疫原性，加上其水解產(chǎn)物丙酮酸對(duì)人體無(wú)害，故早在1984年就被選作狂犬滅活疫苗的滅活劑投入正式使用。在上述生產(chǎn)方法中，優(yōu)選地，純化的方法為分子篩層析和/或離子交換膜層析。在上述生產(chǎn)方法中，微載體的用量為每升培養(yǎng)基5. 0g。本發(fā)明的方法中的微載體優(yōu)選為GE公司的Cytodex 1。目前，Cytodex 1已經(jīng)廣泛用于疫苗生產(chǎn)，如狂犬疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等都采用Cytodex 1進(jìn)行大規(guī)模貼壁培養(yǎng)，其安全性已得到充分證明。該微載體使用前經(jīng)磷酸緩沖溶液浸泡處理，詳細(xì)使用方法參照微載體Cytodex 1的使用說(shuō)明。與傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明的生產(chǎn)方法因成功采用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng) VERO細(xì)胞和病毒而具有以下明顯優(yōu)勢(shì)1、用于生產(chǎn)的細(xì)胞密度提高，大大提高了生產(chǎn)能力，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模、高密度培養(yǎng)。由于生物反應(yīng)器中的條件完全可控，且采用低剪切力攪拌和無(wú)泡通氣裝置，有利于保證細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒繁殖一直處于最佳環(huán)境中。生物反應(yīng)器培養(yǎng)VERO細(xì)胞，使用5g/L 的微載體(密度可以達(dá)到4X IO6個(gè)/ml)，IOL工作體積的生物反應(yīng)器中的細(xì)胞總數(shù)可達(dá)到 4X 101(1，相當(dāng)于400個(gè)2L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞總數(shù)。300L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞總數(shù)相當(dāng)于300個(gè)15L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量。2、本發(fā)明的生產(chǎn)工藝消除了產(chǎn)品批次間差異和培養(yǎng)周期的不穩(wěn)定性，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定均一，也提高了產(chǎn)品質(zhì)量。轉(zhuǎn)瓶、固定床和多臺(tái)生物反應(yīng)器并聯(lián)生產(chǎn)病毒疫苗的工藝都不可避免的存在批次間差異大，穩(wěn)定性差的問(wèn)題，很難保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器培養(yǎng)的乙腦P3株在補(bǔ)結(jié)抗原和病毒滴度都存在明顯的差異，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的病毒滴度和補(bǔ)結(jié)抗原明顯高于轉(zhuǎn)瓶，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的補(bǔ)結(jié)抗原僅為生物反應(yīng)器培養(yǎng)的補(bǔ)結(jié)抗原量的1/2。
3、解決了生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)工藝的難題，實(shí)現(xiàn)了生物反應(yīng)器高密度、大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。利用生物反應(yīng)器高密度、大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞歷來(lái)都是疫苗研究和生產(chǎn)的瓶頸，尤其是轉(zhuǎn)瓶和固定床培養(yǎng)方式無(wú)法實(shí)現(xiàn)工藝放大，近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外一直致力于這方面的研究。本發(fā)明經(jīng)過(guò)已經(jīng)從轉(zhuǎn)瓶、14L、75L到300L生物反應(yīng)器的逐級(jí)放大摸索，確定了大型生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞和繁殖病毒的優(yōu)化生產(chǎn)條件，真正實(shí)現(xiàn)了利用生物反應(yīng)器高密度、大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。4、連續(xù)的灌流培養(yǎng)保證了病毒原液的均一性和穩(wěn)定性。目前國(guó)外多采用分批培養(yǎng)病毒和分批收獲的方式，國(guó)內(nèi)多采用轉(zhuǎn)瓶或多臺(tái)小型生物反應(yīng)器并聯(lián)培養(yǎng)病毒，然后合并收獲病毒液的方式，這很難解決批次間差異大、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的問(wèn)題。本研究采用連續(xù)灌流、連續(xù)收獲的方式，既保證了產(chǎn)品的均一性，收獲的病毒原液在4°C下保存又有利于保持抗原的穩(wěn)定。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1 :300升生物反應(yīng)器中不同培養(yǎng)時(shí)間的病毒滴度曲線；圖2 2升轉(zhuǎn)瓶中不同培養(yǎng)時(shí)間的病毒滴度曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11、VERO細(xì)胞種子的復(fù)蘇1. 1VER0細(xì)胞株的來(lái)源VERO細(xì)胞的原始來(lái)源為ATCC (編號(hào)為F-12313)，經(jīng)傳代擴(kuò)增建立了主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)，并保存于液氮中。主細(xì)胞為129代；工作細(xì)胞為133代，凍存密度為4X106/ml。1. 2VERO種子細(xì)胞的復(fù)蘇取液氮罐內(nèi)保存的工作庫(kù)細(xì)胞一支，39 °C溫水迅速融化后，將細(xì)胞懸液按約 IX 105/cm2接種密度轉(zhuǎn)入175cm2方瓶中，逐步滴加培養(yǎng)基(含10% (體積/體積)胎牛血清的M199 (M199干粉培養(yǎng)基組成成分見(jiàn)GIBCO培養(yǎng)基手冊(cè))至60mL，37°C和5% CO2培養(yǎng)才苜中培養(yǎng)。2、在175cm2方瓶中培養(yǎng)一級(jí)種子細(xì)胞復(fù)蘇的細(xì)胞培養(yǎng)3 4天生長(zhǎng)至致密單層，使用0.25% (g/ml)胰酶消化液消化分散，再以1 4(體積/體積)的接種比例將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶中，加入適當(dāng)量的培養(yǎng)基(601111)，371、5(%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4天后以1 4(體積/體積)的比例再放大培
養(yǎng)一次。3、在2L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)二級(jí)種子細(xì)胞3. 1培養(yǎng)基M199 培養(yǎng)基 9. 55g/L,NaHCO3 1. 8g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。3. 2轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)選擇2L轉(zhuǎn)瓶和四層轉(zhuǎn)瓶機(jī)，保持接種密度為1.0 2.0X105/cm2，加入500 600ml的培養(yǎng)基，設(shè)置溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為1/8轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)3 4天。4、在14L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)三級(jí)種子細(xì)胞4. 1培養(yǎng)基M199 培養(yǎng)基 9. 55g/L,NaHCO3 2. 2g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。4. 2反應(yīng)器的選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，罐體積為14L，工作體積10L。4. 3微載體選擇Cytodex 1 微載體(GE 公司)，用量為 5. Og/L。4. 4上罐接種將轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)3 4天的VERO細(xì)胞經(jīng)消化后，轉(zhuǎn)移至藍(lán)蓋瓶中，吹打分散均勻，一并接入14L生物反應(yīng)器中，添加培養(yǎng)基至10L。4. 5參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40-50%飽和度；溫度 36. 5 37. 5°C。4. 6灌流控制接種12小時(shí)后開(kāi)啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。5、在75L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)四級(jí)種子細(xì)胞5. 1 培養(yǎng)基同 4. 1.5. 2反應(yīng)器選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，罐體積為75L，工作體積50L。5. 3微載體使用方法及用量同4. 35. 4轉(zhuǎn)罐接種將14L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5 6天的細(xì)胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應(yīng)后，通過(guò)管道將細(xì)胞連同微載體一并轉(zhuǎn)入75L生物反應(yīng)器，定容至50L。5. 5參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40 50%飽和度；溫度 36. 5 37. 5°C。5. 6灌流控制接種12小時(shí)后開(kāi)啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。6、在300L生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)VERO細(xì)胞和病毒6. 1培養(yǎng)基和維持液配方培養(yǎng)基同4. 1.維持液:M199培養(yǎng)基 9. 55g/L，NaHCO3 2. 2g/L，蔗糖 1. Og/L，人血白蛋白 0. lg/L。6. 2反應(yīng)器選擇
7
選擇比歐或Sartorius哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，罐體積為300L，工作體積210L。6. 3微載體用量同4. 36. 4 轉(zhuǎn)罐將75L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5 6天的細(xì)胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應(yīng)后，通過(guò)管道將細(xì)胞連同微載體一并轉(zhuǎn)入300L生物反應(yīng)器，定容至210L。6. 5培養(yǎng)參數(shù)同4. 5。6. 6灌流控制接種M小時(shí)后開(kāi)啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。7、接種乙腦P3株病毒培養(yǎng)7.1接毒方法暫?？刂茀?shù)，沉降微載體和細(xì)胞，抽掉上清培養(yǎng)基，更換為維持液，待參數(shù)穩(wěn)定后按照MOI為0.01接種病毒。7. 2參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40RPM ；pH :7· 5 7. 6 ；DO 40 50 %飽和度；溫度33. 5 34. 5"C。7. 3以連續(xù)灌流的方式收獲病毒培養(yǎng)液接毒12小時(shí)后開(kāi)始灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，從接毒48小時(shí)起開(kāi)始收獲病毒液，連續(xù)收獲8天。8、病毒收獲液的澄清過(guò)濾和超濾濃縮8. 1澄清過(guò)濾選擇膜面積為1平方米(20英寸)的Iym和0.5 μπι的聚醚砜濾芯串聯(lián)，先經(jīng)Iym 濾膜、再經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾。8. 2超濾濃縮8. 2.1緩沖液選擇選擇(pH7. 2-8. 0無(wú)菌磷酸)緩沖液沖洗平衡好的超濾系統(tǒng)。8. 2. 2設(shè)備選擇使用Millipore公司的0. 5平方米PELLIC0N 2超濾系統(tǒng)，安裝2塊PELLIC0N 2 超濾膜包，截留分子量為300KD的濾膜。8. 2. 3操作參數(shù)設(shè)定進(jìn)液口壓力為10 20psi，回流口壓力為5 10psi，2 4小時(shí)內(nèi)完成80 120L病毒收獲液的超濾；樣品濃縮20 40倍，得到2 6L濃縮液。9、病毒滅活9. 1滅活試劑的準(zhǔn)備先將β -丙內(nèi)酯用注射用水稀釋成40倍的母液，經(jīng)0. 22 μ m膜過(guò)濾除菌。9. 2滅活操作將預(yù)稀釋的β-丙內(nèi)酯母液加入濃縮液中至終濃度為1/4000，2 8°C下放置滅活，24小時(shí)后在37°C下水解2小時(shí)。10、分子篩層析
10. 1緩沖液的選擇pH 7. 5 8. 5的磷酸緩沖液。10. 2填料選擇GE公司的S^hacryl S-300層析填料，裝柱高度為20 60cm。10. 3層析操作首先使用2倍柱體積的緩沖液平衡層析柱，流速為20 50cm/h，上樣的樣品體積為8% 12%柱體積，收獲第一峰(波長(zhǎng)^Onm的紫外檢測(cè)器)。11、離子交換膜層析11. 1緩沖液的選擇緩沖液A:pH 7. 5 8. 5磷酸緩沖液，緩沖液B :pH 7. 5 8. 0磷酸緩沖液加 500mMol/L 氯化鈉。11. 2離子交換膜的選擇Sartorius公司的Sartobind Q離子交換層析膜。11. 3層析操作先用10倍體積的緩沖液A平衡層析膜，上樣經(jīng)分子篩層析純化后的抗原樣品，用緩沖液A(體積比100^-0%)和緩沖液B(體積比0^-100%)形成的線性梯度洗脫，收集70mM至250mM之間的洗脫液為純化后原液。12、鋁佐劑原位吸附抗原12. 1 試劑lmol/L NaOH 溶液，lmol/L pH8. 5 的磷酸鹽緩沖溶液，0. 2mol/L 的 AlCl3 溶液， lmol/L的NaCl溶液，過(guò)濾除菌。12. 2吸附方法將純化后的抗原過(guò)濾除菌后，加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度為0. 05mol/L,然后攪拌加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3溶液，反應(yīng)過(guò)程中保持體系的pH為7. 0左右，反應(yīng)體系中的Al (OH)3量為2. 0 2. 5mg/ml時(shí)止。12. 3 稀釋用lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋補(bǔ)至接抗原量為1 2 1 4，Al (OH)3 含量為 0. 5 0. 75mg/ml, NaCl 濃度為 0. 14 0. 16mol/L。12. 4加入添加劑1% (g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。12. 5半成品檢測(cè)無(wú)菌試驗(yàn)。實(shí)施例21.本發(fā)明生產(chǎn)方法制備的產(chǎn)品的批次間穩(wěn)定性研究對(duì)040801、040802和040901三批中試培養(yǎng)原液的檢測(cè)結(jié)果顯示，三批樣品收獲液的病毒滴度、補(bǔ)結(jié)抗原、蛋白殘留、無(wú)菌試驗(yàn)和效力均無(wú)顯著差異(見(jiàn)表1)。表1三批中試培養(yǎng)收獲液的檢定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種乙型腦炎疫苗的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括以下步驟(1)將Vero種子細(xì)胞加入300升生物反應(yīng)器中，與微載體一起進(jìn)行灌流培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基包含9. 55g/L的M199培養(yǎng)基、2. 2g/L的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (體積/體積)的胎牛血清；培養(yǎng)條件包括攪拌速度為35 40轉(zhuǎn)/分，pH為 7. 2 7. 4，溶解氧為40 50%飽和度，溫度為36. 5 37. 5 °C，培養(yǎng)基的灌流速度為315 升/天；(2)灌流培養(yǎng)5 6天后，沉降微載體和細(xì)胞，以維持液替換培養(yǎng)基，接種乙型腦炎病毒繼續(xù)進(jìn)行灌流培養(yǎng)，其中維持液包含9. 55g/L的M199培養(yǎng)基，2. 2g/L的NaHCO3,1. Og/L的蔗糖以及0. lg/L的人血白蛋白；培養(yǎng)條件包括攪拌速度為35 40轉(zhuǎn)/分，pH為7. 5 7. 6，溶解氧為40-50%飽和度，溫度為33. 5-34. 5°C，維持液的灌流速度為315升/天；(3)收集病毒培養(yǎng)液，過(guò)濾、滅活并純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述乙型腦炎病毒按照感染復(fù)數(shù)為 0.01接種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述Vero種子細(xì)胞的制備方法包括以下步驟將復(fù)蘇的Vero細(xì)胞依次在175cm2方瓶、2升轉(zhuǎn)瓶、14升生物反應(yīng)器以及75 升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述175cm2方瓶中的培養(yǎng)基為包含 10% (體積/體積)的胎牛血清的M199培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件包括溫度為37°C，通入5% (體積/體積)的CO2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述175cm2方瓶中的培養(yǎng)方法為將液氮保存的細(xì)胞迅速融化后，按IX 105/cm2的接種密度轉(zhuǎn)入175cm2方瓶中，滴加培養(yǎng)基并在37°C和5% (體積/體積)的CO2下培養(yǎng)，長(zhǎng)至致密單層后消化，再以1 4(體積/ 體積)的接種比例將經(jīng)消化得到的細(xì)胞懸液加到新的培養(yǎng)基中，在37°C和5% (體積/體積)的CO2下培養(yǎng)3 4天后，再以1 4(體積/體積)接種比例加到新的培養(yǎng)基中，在 37°C和5% (體積/體積)的(X)2下培養(yǎng)3 4天。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述2升轉(zhuǎn)瓶中的培養(yǎng)基包括9. 55g/L的M199培養(yǎng)基、1. 8g/L的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L的谷氨酰胺以及10% (體積/體積)的胎牛血清；培養(yǎng)條件包括溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為1/8轉(zhuǎn)/分。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述2升轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)的接種密度為1. 0 2. OX 105/cm2，培養(yǎng)時(shí)間為3 4天。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述14升和75生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基包括9. 55g/L的M199培養(yǎng)基、2. 2g/L的NaHCO3U. 5g/L的葡萄糖、0. 2g/L 的谷氨酰胺以及10% (體積/體積)的胎牛血清；培養(yǎng)條件包括攪拌速度為35 40轉(zhuǎn) /分，PH為7. 2 7. 4，溶解氧為40 50%飽和度，溫度為36. 5 37. 5°C，培養(yǎng)基的灌流速度為315升/天，并且加入微載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述過(guò)濾包括依次經(jīng)過(guò)孔徑為1 μ m和0. 45 μ m的濾膜過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)截留分子量為300KD的濾膜超濾。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述滅活的滅活劑為 β-丙內(nèi)酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述純化的方法為分子篩層析和/或離子交換膜層析。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述微載體的用量為每升培養(yǎng)基5. 0g。
全文摘要
本發(fā)明提供一種乙型腦炎疫苗的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法包括以下步驟將Vero種子細(xì)胞加入300升生物反應(yīng)器中，與微載體一起進(jìn)行灌流培養(yǎng)；灌流培養(yǎng)5～6天后，沉降微載體和細(xì)胞，以維持液替換培養(yǎng)基，接種乙型腦炎病毒繼續(xù)進(jìn)行灌流培養(yǎng)；收集病毒培養(yǎng)液，過(guò)濾、滅活并純化。上述方法使得用于生產(chǎn)的細(xì)胞密度提高，大大提高了生產(chǎn)能力，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、高密度培養(yǎng)；消除了產(chǎn)品批次間差異和培養(yǎng)周期的不穩(wěn)定性，保證產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定均一，提高了產(chǎn)品質(zhì)量；解決了生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)工藝的難題，實(shí)現(xiàn)了生物反應(yīng)器高密度、大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102327609SQ201010264218
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者劉丹, 劉鈿蓮, 艾文 申請(qǐng)人:麗珠集團(tuán)疫苗工程股份有限公司