專利名稱：一種肺靶向性的免疫納米脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種肺靶向性的免疫脂質(zhì)體，尤其涉及一種具有肺靶向性的地塞米松免疫納米脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開了糖皮質(zhì)激素類藥物具有很強(qiáng)的抗炎作用與免疫抑制作用，已被廣泛應(yīng)用于全身各系統(tǒng)炎癥性和免疫性疾病的治療。此類藥物也廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺疾病、肺血管炎、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征等。許多疾病，如支氣管哮喘、結(jié)節(jié)病等，需長期應(yīng)用激素治療。但糖皮質(zhì)激素類藥物又是一類不良反應(yīng)十分明顯的藥物，長期應(yīng)用或大劑量應(yīng)用?？蓪?dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如高血壓、血糖升高、消化性潰瘍、胃腸道出血、Cushing綜合征、骨質(zhì)疏松、骨無菌性壞死、骨折、傷口愈合延遲、誘發(fā)或加重感染、兒童生長遲緩等，嚴(yán)重時可致殘或危及生命。正是由于這種“雙刃劍”效應(yīng)嚴(yán)重影響了糖皮質(zhì)激素類藥物的臨床療效及治療的依從性。因此，如何揚(yáng)長避短，趨利避害，最大限度地發(fā)揮此類藥物的治療效應(yīng)，同時盡可能地減少其不良反應(yīng)，已成為臨床及基礎(chǔ)研究中亟待解決的重要課題。近年來，納米靶向技術(shù)的發(fā)展為這一醫(yī)學(xué)難題的解決帶來了希望。納米技術(shù)已廣泛應(yīng)用于材料學(xué)、電子學(xué)、生物醫(yī)藥等多個領(lǐng)域并獲得突破性進(jìn)展。研究顯示，當(dāng)微粒尺寸進(jìn)入納米量級時，由于量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，納米粒子呈現(xiàn)出新奇的物理化學(xué)和生物學(xué)特性，如納米技術(shù)可增加藥物的溶解度，提高其生物利用度，增加藥物的靶向作用，從而達(dá)到減少藥物用量、增強(qiáng)療效、減少副作用的目的。納米靶向載體正成為納米技術(shù)與藥物控釋技術(shù)研究的熱點，其具有根據(jù)生理和智能需要來調(diào)控藥物的釋放，在納米尺寸形成釋藥系統(tǒng)的特征。根據(jù)刺激信號的不同，釋藥系統(tǒng)可分為化學(xué)、物理和生物信號刺激響應(yīng)性藥物釋放系統(tǒng)。生物靶向是利用抗體、細(xì)胞膜表面受體或特定基因片段的專一性作用，將配位子結(jié)合在納米載體上，與目標(biāo)細(xì)胞表面的抗原性識別器發(fā)生特異性結(jié)合，使藥物或目的基因能準(zhǔn)確送到病變組織細(xì)胞，在對病變組織細(xì)胞取得療效的同時，又避免對正常細(xì)胞的傷害。研究還表明，II型肺泡上皮細(xì)胞是肺臟藥物遞送的重要靶點之一。II型肺泡上皮細(xì)胞是肺組織所特有的具有增殖和分泌功能的細(xì)胞，約占肺實質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的16%。II型細(xì)胞能合成表面活性物質(zhì)，儲存在板層小體中，再分泌至肺泡表面發(fā)揮生理作用。肺泡表面活性物質(zhì)主要成份是約90 %的脂質(zhì)和10 %的蛋白，其中蛋白成份為特異性肺表面活性蛋白 (surfactant protein，SP)，按其發(fā)現(xiàn)先后命名為 SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。其中 SP-A 是由 248個氨基酸組成的親水性糖蛋白，是最早發(fā)現(xiàn)且在II型肺泡上皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)、信號最為豐富的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，II型上皮細(xì)胞除具有合成和分泌SP-A的功能以外，其細(xì)胞表面同時還具有高親和力、特異性的SP-A受體。SP-A在肺外表達(dá)量極少，在肺內(nèi)則為高濃度表達(dá)，表現(xiàn)為肺特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種具有肺靶向性的免疫脂質(zhì)體，尤其涉及一種具有肺靶向性的地塞米松免疫脂質(zhì)體。本發(fā)明的另一目的是提供所述免疫脂質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明提供的一種具有肺靶向性的地塞米松免疫脂質(zhì)體，由肺表面活性蛋白A多抗、治療藥物和納米脂質(zhì)體組成。本發(fā)明基于所述的肺表面活性蛋白A的特性，以地塞米松磷酸鈉(DXM)為治療藥物，以納米脂質(zhì)體為載體，以肺表面活性蛋白A多克隆抗體為特異性肺組織靶向劑，制備一種高效、穩(wěn)定、具有明確肺靶向性的免疫納米脂質(zhì)體。本發(fā)明中，所述的納米脂質(zhì)體以磷脂、膽固醇和脂質(zhì)體輔料等為材料制成。本發(fā)明中，所述的磷脂可以是大豆卵磷脂(SPC)、蛋黃卵磷脂(EPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)等。本發(fā)明中，所述的脂質(zhì)體輔料包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000 )、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯 (DSPE-PEG2000-PDP)等。本發(fā)明中，肺表面活性蛋白A多抗與磷脂比例為1 IOyg多抗1μπι01 磷脂。磷脂與膽固醇的摩爾比為1.5 4:1 ； 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000)占脂質(zhì)摩爾量的4% 15%。本發(fā)明中，所述的治療藥物還可以選自氫化可的松、潑尼松龍或甲潑尼龍。治療藥物與納米脂質(zhì)體中磷脂的比值為Img (治療藥物)1 20 μ mol (磷脂)。本發(fā)明中，地塞米松納米脂質(zhì)體形態(tài)呈球形，大小基本均一(如

圖1所示)。本發(fā)明中，地塞米松納米脂質(zhì)體平均粒徑為1 士 38nm。本發(fā)明中，地塞米松納米脂質(zhì)體對地塞米松磷酸鈉的包封率為92. 23 士 3. 34%。本發(fā)明中，地塞米松納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示脂質(zhì)體混懸液于4°C放置4 周后，脂質(zhì)體對地塞米松磷酸鈉的包封率無顯著性變化(P > 0.05)，樣品放置穩(wěn)定(如表1 所示)。本發(fā)明的肺靶向性的地塞米松免疫納米脂質(zhì)體能通過藥物的靶向輸送，減少用藥劑量，提高對肺部疾病的療效，同時又減少全身不良反應(yīng)，具有新的臨床實用價值。本發(fā)明提供了肺靶向性的地塞米松免疫納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，其包括步驟
1、制備地塞米松納米脂質(zhì)體(NLP )
采用薄膜分散法制備地塞米松納米脂質(zhì)體。稱取磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000 )(磷脂與膽固醇的摩爾比為1.5 4:1 ； DSPE-PEG2000占脂質(zhì)摩爾量的4% 15% )，以三氯甲烷(或三氯甲烷/甲醇)溶解，置于圓底燒瓶水浴(溫度應(yīng)高于磷脂的相變溫度)，80 120r ^irT1 減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，燒瓶壁上形成一層均勻透明薄膜。37 真空干燥過夜。稱取處方量地塞米松磷酸鈉(或氫化可的松、潑尼松龍、甲潑尼龍等)，DXM與磷脂的比值為Img DXM: 1 20 μ mol磷脂。以與有機(jī)溶劑等容積的生理鹽水溶解，置于成膜圓底燒瓶中，水浴，80 120r .min-1旋轉(zhuǎn)池水化干燥脂質(zhì)膜。將制備的懸液室溫靜置池。使用脂質(zhì)體擠出器將懸液依次經(jīng)400nm、200nm、100nm聚碳酸脂膜擠出，經(jīng)每個層級濾膜往返10 15次擠出，即得地塞米松納米脂質(zhì)體懸液；取脂質(zhì)體懸液，置于截留分子量為IOKD的超濾管中， 5000 IOOOOr · mirT1離心30min以上，去除未包封的游離地塞米松磷酸鈉。2、地塞米松納米脂質(zhì)體的表征
地塞米松納米脂質(zhì)體形態(tài)呈球形，大小基本均一(如圖1所示)； 地塞米松納米脂質(zhì)體平均粒徑為1 士 38nm;
地塞米松納米脂質(zhì)體包封率地塞米松納米脂質(zhì)體對地塞米松磷酸鈉的包封率為 92. 23 士 3. 34% ；
地塞米松納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，脂質(zhì)體混懸液于4 放置4周后，脂質(zhì)體對地塞米松磷酸鈉的包封率無顯著性變化(/7 > 0.05)，樣品放置穩(wěn)定(如表1所示)。表1 地塞米松納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性試驗
放置時間/周包封率(%)092. 23 ±3. 34189. 35 ± 4. 93287.19 ± 5. 24485. 58 ± 4. 23
3、制備肺表面活性蛋白A多抗偶聯(lián)地塞米松免疫納米脂質(zhì)體(SPA -NLP) 選用N-琥珀酰亞胺-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯(SPDP)為交聯(lián)劑，將抗體與脂質(zhì)體交聯(lián)，制備免疫納米脂質(zhì)體。(如圖2所示)。采用薄膜分散法制備含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯(DSPE-PEG2000-PDP)的地塞米松納米脂質(zhì)體。配方為磷脂(大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿等)、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-PDP (DSPE-PEG2000 與 DSPE-PEG2000-PDP 的摩爾比為 2 5:1)。向 SP-A 多抗溶液(SC-7699, Santa Cruz Biotechnology) (SP-A 多抗與磷脂比例為1 10 μ g多抗1 μ mol磷脂)中緩慢加入濃度為20 μ mol · ml—1的SPDP乙醇溶液 (SPDP與Ab的摩爾比約為15 20:1 ；乙醇濃度不超過5% )，混勻，室溫下反應(yīng)30min。將混合物移入截留分子量為10KD的超濾管中，3500 5000r · mirT1離心lOmin。加入適量 0. 2mol .L—1的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5. 5)。向混合物中加入過量的2. 5mol .L—1的二硫蘇糖醇溶液(以0. 2mol · Γ1，ρΗ5. 5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)?；靹颍覝叵蚂o置30min。 加入pH7. 0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，3500 5000r · mirT1離心超濾5min ；共3次以去除游離二硫蘇糖醇。移取超濾管內(nèi)抗體溶液，與含DSPE-PEG2000-PDP的地塞米松納米脂質(zhì)體懸液混合，室溫，攪拌放置過夜。4、肺表面活性蛋白A多抗偶聯(lián)地塞米松免疫納米脂質(zhì)體的組織靶向性實驗
健康雄性SD大鼠105只，體重(98士 12) g，隨機(jī)分為3組肺表面活性蛋白A多抗偶聯(lián)地塞米松免疫納米脂質(zhì)體(SPA - NLP)組、地塞米松納米脂質(zhì)體(NLP)組和地塞米松 (DXM)組。(1) SPA - NLP組經(jīng)鼠尾靜脈注射SPA - NLP (按地塞米松磷酸鈉ang/Kg體重計)；(2)地塞米松納米脂質(zhì)體組經(jīng)鼠尾靜脈注射NLP (按地塞米松磷酸鈉ang/Kg體重計)； (3)地塞米松組經(jīng)鼠尾靜脈注射地塞米松磷酸鈉ang/Kg。以給藥后15min、30min、lh、2h、 4h、8h、12h為時間點。在每個時間點三組各取大鼠5只，乙醚麻醉后眼眶取血，EDTA抗凝， 離心后分離血漿。抽血后迅速處死大鼠，取心、肝、脾、肺、腎等組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸8112.5611. 96361.031.838312. 2710. 27452.191.60711.280.63600.810.53
注:AUC0_12h 12h藥-時曲線下面積表3 NLP與SPA-NLP的組織靶向性評價
干，精密稱重。血漿及各組織-20 保存?zhèn)錅y。使用高效液相色譜儀，外標(biāo)法測定血漿及組織中地塞米松磷酸鈉濃度。結(jié)果顯示，注射地塞米松納米脂質(zhì)體與SPA-NLP的血液循環(huán)時間較地塞米松磷酸鈉注射液延長，血藥濃度提高。注射后30min、l、2、4、8、12h，SPA-NLP組的血藥濃度均顯著高于地塞米松組ip < 0.05)。在各取樣時間點上NLP組、SPA-NLP組肺臟中地塞米松磷酸鈉濃度均顯著高于地塞米松組(P < 0.05)，而SPA-NLP組升高更為明顯。NLP組、SPA-NLP 組在肝、脾中地塞米松磷酸鈉濃度有增高的趨勢，但以NLP組增高更明顯。在30min、l、2h 時間點上，SPA-NLP組在腎臟中的藥物分布顯著低于的地塞米松組(/7 < 0.01)，但在他則高于地塞米松組(/7 < 0.01)。三組制劑在心臟中的地塞米松磷酸鈉濃度無明顯差異(/7 > 0.05)(如圖3所示)。采用峰濃度比(Ce)和相對攝取率(Re)兩個指標(biāo)來考察SPA- NLP與NLP在大鼠體內(nèi)各組織器官的靶向情況。
_]Ce =(Cp)c/(Cp)s
式中Cp為藥物峰值；c表示注射SPA-NLP或NLP后某一器官組織內(nèi)的藥物分布情況；s 表示注射地塞米松磷酸鈉后在上述相同器官組織內(nèi)的藥物分布情況。每個器官或組織的Cei 值表明藥物分布的差異性，C；值愈大，表明藥物分布差別越大。Re=(AUCi)cZ(AUCi)s
式中AUCi是采用3P87藥動學(xué)計算軟件由濃度-時間曲線計算得第i個器官或組織的藥時曲線下面積。民> 1表示在該器官或組織具有靶向性，民越大靶向效果越好；民< 1表示在該器官或組織無靶向性。結(jié)果顯示(如表2、3所示)，SPA-NLP在肺表現(xiàn)出明顯的靶向性。以峰濃度比(Ce) 和相對攝取率( )兩個指標(biāo)來考察，注射SPA-NLP后肺臟地塞米松磷酸鈉的峰濃度為注射 DXM注射液的5. 08倍(Ce=5. 08);12h藥時曲線下面積(AUCV12h)為注射DXM注射液的後21 倍( =40.21)。由于肝脾的吞噬作用，SPA-NLP、NLP在肝脾中亦有一定程度的富集，但 SPA-NLP組地塞米松磷酸鈉在肝脾的聚集較NLP組減少。在心臟、腎臟SPA-NLP組Re、Ce均小于1，無靶向性。
表2血漿和組織中地塞米松磷酸鈉的AUCch121i、峰濃度(Cmax)
AUCd-e/ y g · mL 1 · hCmax/μ g ■ mL 1
血漿/SL 織(MC,yEt/ u g ■ g'1 ‘ h)(Caax/U g ■ g'1)
DXM NLP SPA-HLP MM NIP SPA-NLP
72 26 98
47 04 97
？
1 2 6 4 1
58. 36
93
43
57
67
28
76
20 0. 20
2. 05
血肺肝脾腎心
權(quán)利要求
1.一種肺靶向性的免疫納米脂質(zhì)體，其特征在于，由肺表面活性蛋白A多抗、治療藥物和納米脂質(zhì)體組成；其中，以納米脂質(zhì)體為載體，以肺表面活性蛋白A多抗為特異性肺組織靶向劑；所述的治療藥物為地塞米松磷酸鈉，其與納米脂質(zhì)體中磷脂的比值為lmg:l 20 μ mol ；所述的納米脂質(zhì)體由磷脂、膽固醇和脂質(zhì)體輔料為材料制成；脂質(zhì)體輔料選自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯；所述的肺表面活性蛋白A多抗與磷脂比例為1 10 μ g :1 μ mol ；磷脂與膽固醇的摩爾比為1. 5 4:1 ；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000占脂質(zhì)摩爾量的4% 15%。
2.按權(quán)利要求1所述的肺靶向性的免疫納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述的治療藥物還選自氫化可的松、潑尼松龍或甲潑尼龍。
3.按權(quán)利要求1所述的肺靶向性的地塞米松免疫納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述的磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酰膽堿。
4.按權(quán)利要求1所述的肺靶向性的免疫納米脂質(zhì)體，其特征在于，所述的納米脂質(zhì)體形態(tài)呈球形，大小基本均一；平均粒徑為1 士38nm;納米脂質(zhì)體對藥物活性成分的包封率為 92. 23 士 3. 34%。
5.權(quán)利要求1所述的肺靶向性的免疫納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，其包括步驟1)制備地塞米松納米脂質(zhì)體；以磷脂、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂或二棕櫚酰磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯為原料，采用薄膜分散法制備地塞米松納米脂質(zhì)體；2)地塞米松納米脂質(zhì)體的表征形態(tài)、粒徑、包封率和穩(wěn)定性；3)制備肺表面活性蛋白A多抗偶聯(lián)地塞米松免疫納米脂質(zhì)體。
6.按權(quán)利要求5的方法，其特征在于，步驟幻中通過下述步驟制備肺表面活性蛋白A 多抗偶聯(lián)地塞米松免疫納米脂質(zhì)體用薄膜分散法制備含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯的地塞米松納米脂質(zhì)體；向肺表面活性蛋白A多抗溶液中加入N-琥珀酰亞胺-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯乙醇溶液，實現(xiàn)抗體的巰基化，通過二硫蘇糖醇使衍生化抗體還原；超濾去除游離二硫蘇糖醇；移取超濾管內(nèi)抗體溶液，與含二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-吡啶基-聯(lián)巰基-丙酸酯的地塞米松納米脂質(zhì)體懸液混合，室溫，攪拌放置過夜，制得肺表面活性蛋白A多抗偶聯(lián)地塞米松免疫納米脂質(zhì)體；所述的肺表面活性蛋白A多抗與磷脂比例為1 10 μ g :1 μ mol。
7.權(quán)利要求1的肺靶向性的免疫納米脂質(zhì)體在制備治療肺部疾病的藥物中的用途。
8.按權(quán)利要求7的用途，其特征在于，所述的肺部疾病是支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺疾病、肺血管炎、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征或結(jié)節(jié)病。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種具有肺靶向性的免疫脂質(zhì)體及其制備方法。本發(fā)明的免疫脂質(zhì)體，由肺表面活性蛋白A多克隆抗體、藥物活性成分和納米脂質(zhì)體組成，以地塞米松磷酸鈉等糖皮質(zhì)激素為藥物活性成分，以納米脂質(zhì)體為載體，以SP-A多抗為特異性肺組織靶向劑。本發(fā)明的免疫納米脂質(zhì)體具有明確肺靶向性，且高效、穩(wěn)定的實現(xiàn)藥物活性成分對肺部的靶向輸送，使肺臟中DXM峰濃度較常規(guī)制劑提高5.08倍，12h藥時曲線下面積提高40.21倍。能減少糖皮質(zhì)激素用藥劑量、提高對肺部疾病的療效，同時減少全身不良反應(yīng)，具有新的臨床實用價值。
文檔編號A61P9/00GK102370620SQ201010263760
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者李惠萍, 陳學(xué)遠(yuǎn) 申請人:同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院