產(chǎn)生顯著均質(zhì)的聚糖結(jié)構(gòu)的巴斯德畢赤酵母菌株的制作方法
【專利說明】產(chǎn)生顯著均質(zhì)的聚糖結(jié)構(gòu)的巴斯德畢赤酵母菌株
[0001] 交叉參考相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2012年10月23日提交的美國臨時申請?zhí)?1/717, 423的優(yōu)先權(quán)利益， 該臨時申請的整個內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)是用于產(chǎn)生廣泛多樣的重組蛋白的非常成功 的系統(tǒng)。若干個因素促成了其迅速的認(rèn)可，包括：（1)來源于巴斯德畢赤酵母（P.pastoris) 的醇氧化酶I(A0X1)基因的啟動子，其獨特地適合用于異種基因的受控表達(dá)；（2)巴斯德畢 赤酵母的分子遺傳操作所需的技術(shù)與釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)的技術(shù)的相 似性；和（3)巴斯德畢赤酵母對呼吸性生長的強烈偏好，這是相對于發(fā)酵性酵母促進(jìn)其在 高細(xì)胞密度下的培養(yǎng)的生理性狀。
[0005] 作為酵母，巴斯德畢赤酵母是容易操作和培養(yǎng)的單細(xì)胞微生物。然而，其還是真核 生物并能夠發(fā)生由較高等真核細(xì)胞進(jìn)行的翻譯后修飾例如蛋白水解加工、折疊、二硫鍵形 成和糖基化。因此，在細(xì)菌系統(tǒng)中會終止為無活性包涵體的許多蛋白質(zhì)在巴斯德畢赤酵母 中被產(chǎn)生為生物活性分子。巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)還通常被認(rèn)為比來源于較高等真核生物例 如昆蟲和哺乳動物組織培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)更快速、更簡化和較不昂貴地使用，并且 通常產(chǎn)生更高的表達(dá)水平。
[0006] 巴斯德畢赤酵母具有進(jìn)行許多通常與較高等真核生物相關(guān)的翻譯后修飾的潛能。 這些包括信號序列（前-和前原-型兩者）加工、折疊、二硫鍵形成以及0-和N-連接的糖 基化。巴斯德畢赤酵母和其它真菌對分泌的異種（較高等）真核生物蛋白質(zhì)的糖基化可以 是成問題的。在哺乳動物中，0-連接的寡糖由多種糖包括N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液 酸組成。相反，較低等的真核生物包括巴斯德畢赤酵母，可添加僅由甘露糖（Man)殘基組成 的〇-寡糖。
[0007] 巴斯德畢赤酵母中的N-糖基化也與較高等真核生物中的不同。在所有的真核生 物中，N-糖基化起始于ER中，將脂質(zhì)連接的寡糖單元即Glc3Man9GlcNAc2(Glc=葡萄糖； GlcNAc=N-乙酰葡糖胺）轉(zhuǎn)移至識別序列Asn-X-Ser/Thr上的天冬酰胺。該寡糖核心單 元隨后被修剪為Man8GlcNAc2。正是在這一點上較低等和較高等真核生物糖基化模式開始 不同。哺乳動物高爾基體進(jìn)行一系列修剪和添加反應(yīng)來產(chǎn)生包含Man5-6GlcNAc2(高甘露 糖類型）、幾種不同糖類的混合物（復(fù)合型）或兩者的組合（雜種型）的寡糖。在由巴斯德 畢赤酵母分泌的異種蛋白上已觀察到兩種不同的N-糖基化模式。一些蛋白被分泌為具有 在大小和結(jié)構(gòu)上與核心單元（Man8-llGlcNAc2)相似的碳水化合物結(jié)構(gòu)。其它從巴斯德畢 赤酵母分泌的異種蛋白接受遠(yuǎn)更多的碳水化合物并顯得是過度糖基化的。
[0008] 由酵母添加至蛋白質(zhì)的N-連接的高甘露糖寡糖代表了制藥工業(yè)對異種分泌蛋白 的使用中的問題。例如，當(dāng)被靜脈內(nèi)引入哺乳動物中時，它們可以是非常抗原性的并且還可 引起蛋白質(zhì)通過肝臟從血液的快速清除。
[0009] 在嘗試修飾巴斯德畢赤酵母的N-糖基化途徑的過程中，產(chǎn)生了一種菌株（此后 被稱作為"M5_Blast"），如Jacobs等人，2009,NatureProtocols4:58-70 中所描述的。 M5-Blast是改良的巴斯德畢赤酵母GS115菌株，其中內(nèi)源甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因0CH1被引入 包含a-1，2_甘露糖苷酶基因的盒破壞。然而，M5_Blast菌株經(jīng)歷基因組重排，其在冷凍 和解凍循環(huán)、于不同溫度和條件下的生長之后并從利用其它質(zhì)粒的隨后轉(zhuǎn)化中引入外源基 因之后，重新產(chǎn)生內(nèi)源0CH1基因并且同時去除a-1，2-甘露糖苷酶基因。
[0010] 公開內(nèi)容概述
[0011] 本文公開了用于表達(dá)具有基本上均質(zhì)的N-聚糖的外源蛋白的新型巴斯德畢赤酵 母菌株。更具體地，所述菌株經(jīng)遺傳工程化以包含被轉(zhuǎn)錄為編碼突變0CH1基因產(chǎn)物（即 a-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或"0CH1蛋白"）的mRNA的突變0CH1等位基因。突變型0CH1蛋 白包含與野生型0CH1蛋白的催化結(jié)構(gòu)域基本上相同的催化結(jié)構(gòu)域，但具有改變0CH1蛋白 至高爾基體或在高爾基體中的定位的N-末端序列。所述菌株不包含任何其它的產(chǎn)生編碼 功能性0CH1蛋白的mRNA的0CH1等位基因。這樣的菌株是健全的、穩(wěn)定的和可轉(zhuǎn)化的，并 且突變0CH1等位基因和相關(guān)的表型（即產(chǎn)生基本上均質(zhì)的N-聚糖的能力）在冷凍和解凍 循環(huán)后且在隨后的轉(zhuǎn)化后得到世代維持。
[0012] 本公開內(nèi)容還表征了構(gòu)建所述菌株的方法以及通過該菌株表達(dá)蛋白的方法。
[0013] 本文中描述的任何特征或特征的組合均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，條件是任何這 樣的組合中包括的特征不是相互矛盾的，如根據(jù)上下文、本說明書和本領(lǐng)域技術(shù)人員的知 識將是明顯的。本發(fā)明的另外的優(yōu)勢和方面在下文的詳細(xì)描述和權(quán)利要求中是明顯的。
[0014] 附圖簡述
[0015] 圖1.用于從M5-Blast畢赤酵母基因組去除0CH1N-末端片段同源性的刪除策略 圖。側(cè)接0CH1N-末端片段的同源臂被用于產(chǎn)生包含l〇x71-l〇x66重組位點的雙交叉互換 構(gòu)建體。間插序列可通過ere介導(dǎo)的重組來去除。
[0016] 圖2.用于從M5-Blast基因組DNA擴增雙交叉互換構(gòu)建體的側(cè)接臂的PCR引物。
[0017] 圖3.用于將lox位點添加至同源臂的末端的PCR反應(yīng)。
[0018] 圖4.M5_Blast基因組DNA延伸物在現(xiàn)有的lox71-MazF-NatK_lox66盒上的添加。
[0019] 圖5.用于產(chǎn)生用于M5_Blast畢赤酵母轉(zhuǎn)化的雙交叉互換片段的最終序列的重疊 組裝和擴增。該最終的構(gòu)建體具有側(cè)接選擇/反選擇盒的>500bp的同源臂。
[0020] 圖6.用來產(chǎn)生用于雙交叉互換重組事件的DNA片段的PCR引物對。
[0021] 圖7.M5-Blast基因組的LEU5-甘露糖苷酶HDEL區(qū)在雙交叉互換重組事件后的理 論排列。
[0022] 圖8.LEU5與甘露糖苷酶HDEL之間的基因組DNA在ere重組之后的理論排列。
[0023] 圖9.用于驗證可已來源于轉(zhuǎn)化至M5_Blast菌株中的PCR產(chǎn)物的區(qū)域的DNA序列 的PCR引物 81487118-80765854。
[0024] 圖10.在不同巴斯德畢赤酵母菌株中表達(dá)的重組蛋白的N-聚糖分析。
[0025] 圖11.在實施例6中描述的研宄1中獲得的曲妥珠單抗的N-聚糖分析。
[0026] 圖12.通過ELISA比較Man5_型曲妥珠單抗（研宄1)與商購赫賽汀的Her2結(jié)合 親和力。
[0027] 圖13.來自'Trans'菌株的培養(yǎng)基蛋白上的總N-聚糖庫的DSA-FACE分析。A.麥 芽-葡萄糖參照的結(jié)果。圖B至F顯示N-聚糖的結(jié)果，如下所示：B.微量級的GSTrans菌 株；C.微量級的M5Trans菌株；D.生物反應(yīng)器中的GSTrans菌株；E.生物反應(yīng)器中的M5 Trans菌株；F.來自牛RNA酶B的參照N-聚糖。
[0028] 圖14.來自'CalB'菌株的培養(yǎng)基蛋白上的總N-聚糖庫的DSA-FACE分析。A.麥 芽-葡萄糖參照的結(jié)果。圖B至F顯示N-聚糖的結(jié)果，如下所示：B.微量級的GSCalB菌 株；C.微量級的M5CalB菌株；D.生物反應(yīng)器中的GSCalB菌株；E.生物反應(yīng)器中的M5 CalB菌株；F.來自牛RNA酶B的參照N-聚糖。
[0029] 圖15.來自'CalA'菌株的培養(yǎng)基蛋白上的總N-聚糖庫的DSA-FACE分析。A.麥 芽-葡萄糖參照的結(jié)果。圖B至F顯示N-聚糖的結(jié)果，如下所示：B.微量級的GSCalA菌 株；C.微量級的M5CalA菌株；D.生物反應(yīng)器中的GSCalA菌株；E.生物反應(yīng)器中的M5 CalA菌株；F.來自牛RNA酶B的參照N-聚糖。
[0030] 表1-6示于第34-45頁。表7-8見于第30頁（實施例7)。
[0031] 表1列出了描述于實施例1的SuperM5菌株中的0CH1基因座的DNA序列（SEQID N0:1)〇
[0032] 表2列出了巴斯德畢赤酵母中野生型0CH1的氨基酸序列（SEQIDNO:2)。
[0033] 表3列出了可從上游0CH1區(qū)段刪除的核苷酸。
[0034] 表4列出了M5_Blast巴斯德畢赤酵母菌株的0CH1基因座（+/_2kb)的DNA序列。
[0035] 表5列出了上游0CH1區(qū)段的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0036] 表6列出了下游0CH1區(qū)段的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0037] 表7.從研宄2獲得的曲妥珠單抗的N-聚糖分析（實施例6)。
[0038] 表8?在BIAcore上分析的曲妥珠單抗的動力學(xué)參數(shù)（實施例6)。
[0039] 詳述
[0040] 經(jīng)遺傳工稈化的巴斯德畢赤酵母菌株
[0041] 本公開內(nèi)容表征了新型的經(jīng)遺傳工程化的巴斯德畢赤酵母菌株，其是健全的、穩(wěn) 定的和可轉(zhuǎn)化的，并且其產(chǎn)生具有基本上均質(zhì)的N-聚糖結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。
[0042] 如本文中進(jìn)一步描述的，所述菌株被遺傳工程化以包含被轉(zhuǎn)錄為編碼突變0CH1 基因產(chǎn)物（即a-l，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶或"0CH1蛋白"）的mRNA的突變0CH1等位基因。突 變型0CH1蛋白包含與野生型0CH1蛋白的催化結(jié)構(gòu)域基本上相同的催化結(jié)