和SEQIDN0:1中。通過使用Jacobs等人（2009)描述的M5_Blast菌株來構(gòu)建， SuperM5菌株在健全的生長、穩(wěn)定性和所產(chǎn)生的M5聚糖的均質(zhì)性方面優(yōu)良于M5-Blast。
[0083] 遺傳工稈化-引入另外的酶
[0084] 所述菌株可被另外地修飾以表達(dá)糖基化途徑中其它的下游酶（或其功能性片段） 從而產(chǎn)生雜種-和復(fù)合-型的N-聚糖。這樣的另外的酶包括尤其例如GlcNAc轉(zhuǎn)移酶 I(GnT-I)、0-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1 (GalT)、甘露糖苷酶II(Man-II)和GnT-II中的一 種或多種。參見Jacobs等人（2009) ;Gerngross的美國專利7, 029, 872。
[0085]GnT-I催化0 -1，2-連接的GlcNAc殘基至Man5GlcNAc2中三甘露糖基核心的 a-1，3-甘露糖的添加。GnT-I活性的引入可通過用包含編碼用于本發(fā)明的GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶 I(GnT-I)的核酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。這樣的核酸序列可來源于任何物種，例如兔、 大鼠、人、植物、昆蟲、線蟲和原生動(dòng)物例如蜥蜴利什曼原蟲（Leishmaniatarentolae)。在 具體的實(shí)施方案中，核苷酸序列編碼人GnT-I。GnT-I或其功能性部分被靶向至高爾基體， 這可通過在GnT-I蛋白或其功能性部分中包含酵母高爾基體定位信號(hào)來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施 方案中，將人GnT-I的催化結(jié)構(gòu)域融合至釀酒酵母Kre2p(具有已知的順面/內(nèi)側(cè)高爾基體 定位的糖基轉(zhuǎn)移酶）的N-末端結(jié)構(gòu)域。
[0086]GalT催化0 -1，4-連接的半乳糖殘基至0 -1，2-GlcNAc的添加，其使用UDP-Gal 作為供體底物。GalT活性的引入可通過用包含編碼GalT或其功能性片段的核酸序列 的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)，所述核酸序列可來源于人、植物（例如鼠耳芥（Arabidopsis thaliana))、昆蟲（例如黑腹果蠅）。GalT或其功能性部分被遺傳工程化以包含高爾基體 滯留信號(hào)并被靶向至高爾基體。示例性高爾基體滯留信號(hào)由釀酒酵母Kre2蛋白的前100 個(gè)氨基酸組成。
[0087]Man-II用于從GlcNAcMan5GlcNAc2N_ 聚糖去除末端a-1，3-和a-1，6-甘露糖。末 端0 -1，2-連接的GlcNAc殘基在a-1，3-臂上的存在對(duì)于此活性是必需的。Man-II活性 的引入可通過用編碼經(jīng)工程化以包含高爾基體定位信號(hào)的Man-II蛋白或其功能性片段的 核酸載體轉(zhuǎn)化菌株來實(shí)現(xiàn)。作為實(shí)例，適當(dāng)?shù)暮怂峥删幋a在閱讀框內(nèi)融合至釀酒酵母Mnn2p 的高爾基體定位結(jié)構(gòu)域的黑腹果蠅Man-II的催化結(jié)構(gòu)域。
[0088]GnT-II催化第二0 -1，2-連接的GlcNAc殘基至三甘露糖基核心的游離的 a-1，6-甘露糖的添加。GnT-II活性的引入可通過用包含編碼GnT-II蛋白或其功能性片 段的核苷酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。已從許多物種包括哺乳動(dòng)物物種克隆了GnT-II 基因并可將其用于本發(fā)明。作為實(shí)例，適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄芯幋a融合至釀酒酵母Mnn2p的 N-末端部分的大鼠GnT-II的催化結(jié)構(gòu)域。
[0089] 對(duì)所述菌株的其它操作
[0090] 本文中公開的菌株可包含通過多種適當(dāng)?shù)牟僮鳎ɡ缃徊婊蛑亟M工程化）來實(shí)現(xiàn) 的另外的特征，包括例如具有突變的營養(yǎng)缺陷型基因（例如his-)以促進(jìn)克隆和選擇，具有 蛋白酶缺陷用于限制產(chǎn)物降解（例如pep4-、prbl-和/或sub2_)，具有緩慢的甲醇利用表 型（例如mutS)〇
[0091] 在具體的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了下列菌株：
[0092]SuperMan5,巴斯德畢赤酵母，ochl-，殺稻瘟菌素抗性，來自里氏木霉的甘露糖苷 酶I( =His+);
[0093]SuperMan5 (his_)，巴斯德畢赤酵母，ochl-，his4_，殺稻瘟菌素抗性，里氏木霉的 甘露糖苷酶I;
[0094]SuperMan5(mutS)，巴斯德畢赤酵母，ochl-，殺稻瘟菌素抗性，來自里氏木霉的甘 露糖苷酶1(緩慢甲醇利用）；
[0095]SuperMan5(pep4_)，巴斯德畢赤酵母，ochl-，殺稻瘟菌素抗性，來自里氏木霉的甘 露糖苷酶1(蛋白酶缺陷）；
[0096]SuperMan5(prbl_)，巴斯德畢赤酵母，ochl-，殺稻瘟菌素抗性，來自里氏木霉的甘 露糖苷酶1(蛋白酶缺陷）；
[0097]SuperMan5(pep4_，sub2_)，巴斯德畢赤酵母，ochl-，殺稻瘟菌素抗性，來自里氏木 霉的甘露糖苷酶I(蛋白酶缺陷）；
[0098]SuperMan5 (pep4_，prbl_)，巴斯德畢赤酵母，ochl-，殺稻瘟菌素抗性，里氏木霉的 甘露糖苷酶1(蛋白酶缺陷）。
[0099]菌株的用涂
[0100] 具有一個(gè)或多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的異源蛋白可通過用編碼所述異源蛋白的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化本發(fā)明的菌株而在本發(fā)明的菌株中表達(dá)，以獲得在其N-聚糖結(jié)構(gòu)上為基本上均質(zhì) 的異源蛋白的制劑。
[0101] 實(shí)施例l_SuperM5菌株的產(chǎn)生
[0102]本實(shí)施例描述從描述于Jacobs等人（2009)，NatureProtocols4:58-70 (通過引 用并入本文）中的M5-Blast菌株產(chǎn)生SuperM5菌株。
[0103]M5_Blast菌株是改良的巴斯德畢赤酵母GS115菌株，其中通過單交叉互換同源重 組插入包含a-l，2甘露糖苷酶基因的載體（pGlyC〇SWitChM5-Blast載體）來破壞內(nèi)源甘 露糖基轉(zhuǎn)移酶基因0CH1。由于單交叉互換同源重組，整合的甘露糖苷酶表達(dá)盒側(cè)接了約 450bp的來自0CH10RF的同源序列。該M5-Blast菌株的0CH1基因組基因座的序列示于SEQ IDN0:53中。測序顯示在pGlycoSwitchM5-Blast載體序列與0CH1 0RF3'片段之間的接 合處上有l(wèi)〇bp的丟失，從而導(dǎo)致來自0CH1C-末端片段上游的pGlycoSwitchM5-Blast載 體的3個(gè)期望的終止密碼子中的一個(gè)的丟失，并且將第二和第三終止密碼子移碼至與該片 段不同的閱讀框。因此，實(shí)際的0RF向上游延伸了 28bp至載體主鏈中的框內(nèi)ATG密碼子。 野生型蛋白的Phe27變成了新0RF的Phell，并且新的預(yù)測信號(hào)序列部分地由原來的信號(hào)錨 定序列和來自載體主鏈的新的融合序列組成。該新的0RF的氨基酸序列示于SEQIDN0:3 中（其中前25個(gè)氨基酸是預(yù)測的新信號(hào)序列）。
[0104] 0CH1基因組基因座在單交叉互換同源重組事件后的N-末端區(qū)與用于通過雙 交叉互換同源重組去除此N-末端區(qū)的構(gòu)建體一起圖示于圖1中。所述構(gòu)建體包含由 lox71-lox66對(duì)側(cè)接的選擇和反選擇標(biāo)記，從而允許隨后的通過ere介導(dǎo)的重組去除選擇/ 反選擇盒。具有同源臂雙交叉互換選擇/反選擇盒的序列示于SEQIDN0:58中，并且其產(chǎn) 生描述于本實(shí)施例的下文中。
[0105] 為了在產(chǎn)生交叉互換構(gòu)建體之前確認(rèn)靶向區(qū)的序列，設(shè)計(jì)了PCR引物來擴(kuò)增包含 甘露糖苷酶0RF的上游區(qū)域的~1650bp的DNA。通過使用Phusion聚合酶（NEB)，PCR引 物80670918和80670919從M5-Blast基因組DNA擴(kuò)增適當(dāng)大小的片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行 T0P0克隆并驗(yàn)證了序列。DNA序列顯示甘露糖苷酶表達(dá)載體已在此插入末端成功地整合至 GS115基因組中。
[0106] 設(shè)計(jì)了側(cè)翼PCR引物來擴(kuò)增圖1中顯示的來自M5-Blast基因組DNA的同源區(qū)。這 些PCR引物的比對(duì)顯示于圖2中。Phusion聚合酶的使用導(dǎo)致從M5-Blast基因組DNA的成 功PCR反應(yīng)。
[0107] 將下列引物對(duì)組合的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠分離并用作用于添加lox71和lox66重組 位點(diǎn)的模板：
[0108] 80765855-80765856 (642bp，圖 2A)
[0109] 80765857-80765858 (658bp，圖 2A)
[0110] 80765852-80765854 (910bp，圖 2B)
[0111] 80765853-80765854 (956bp，圖 2B)
[0112] 設(shè)計(jì)了錯(cuò)配PCR引物來在兩個(gè)同源臂的適當(dāng)末端上添加lox位點(diǎn)。這些錯(cuò)配引物 圖示于圖3中。利用Phusion聚合酶的PCR反應(yīng)成功地從3個(gè)反應(yīng)的每一個(gè)產(chǎn)生正確大小 的DNA產(chǎn)物：
[0113] 80765855-80984794 (670bp，圖 3A)
[0114] 80765857-80984794 (681bp，圖 3A)
[0115] 80984795-80765854 (850bp，圖 3B)
[0116] 除了將lox位點(diǎn)添加至所述臂以外，還設(shè)計(jì)了PCR引物來將適當(dāng)?shù)腗5_Blast畢赤 酵母基因組DNA延伸物添加在現(xiàn)有的lox71-MazF_NatR-lox66盒上。同樣地，將Phusion聚 合酶用于產(chǎn)生正確的PCR產(chǎn)物，如圖4中所顯示的。所使用的引物對(duì)：
[0117] 80984793-80984796 (2941bp,圖 4)
[0118] 將選擇/反選擇盒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并進(jìn)行三片段重疊PCR來將同源臂連 接至所述盒。簡而言之，將所述三片段在不存在引物的情況下循環(huán)20X以退火并在片段的 末端延伸重疊序列。隨后將經(jīng)循環(huán)的混合物稀釋并在圖5中圖示的引物存在的情況下循環(huán) 35X〇
[0119] 利用Phusion聚合酶使用3分鐘的延伸時(shí)間來進(jìn)行PCR反應(yīng)。弓丨物詳述如下：