[0065] 在一些實(shí)施方案中，巴斯德畢赤酵母菌株的染色體上的0CH1基因座上的野生型 0CH1等位基因已被修飾或突變以提供突變0CH1等位基因（如本文下述實(shí)施例中所顯示 的），或已被突變0CH1等位基因取代（例如通過同源重組）。修飾應(yīng)當(dāng)是這樣的以使得所 得的菌株對(duì)于突變0CH1等位基因是穩(wěn)定的。即是說，突變等位基因經(jīng)世代（例如至少10、 20、30、40、50代或更多代的細(xì)胞分裂）維持在菌株中適合用于小體積玻瓶培養(yǎng)和工業(yè)規(guī)模 的生物反應(yīng)器培養(yǎng)，而不恢復(fù)為編碼功能性0CH1蛋白的0CH1等位基因。
[0066] 在其它實(shí)施方案中，突變0CH1等位基因通過表達(dá)載體被引入其野生型0CH1等位 基因（如果是單倍體則一個(gè)野生型0CH1等位基因，如果是二倍體則兩個(gè)野生型0CH1等位 基因）已被破壞的巴斯德畢赤酵母菌株中從而沒有功能性0CH1蛋白從天然0CH1等位基因 或天然0CH1基因座產(chǎn)生。表達(dá)載體可以是被設(shè)計(jì)來將突變0CH1等位基因整合至宿主基因 組中的整合性載體；或者是在菌株中獨(dú)立于染色體復(fù)制的復(fù)制性載體（例如質(zhì)粒）。
[0067] 無論是通過突變或替換野生型0CH1等位基因來在天然0CH1基因座產(chǎn)生突變0CH1 等位基因還是通過表達(dá)載體在其野生型0CH1等位基因（如果是單倍體則一個(gè)野生型0CH1 等位基因，如果是二倍體則兩個(gè)野生型0CH1等位基因）已被破壞的菌株中提供突變0CH1 等位基因，重要的是所得的突變菌株不世代（例如至少10、20、30、40、50代或更多代的細(xì)胞 分裂）產(chǎn)生功能性0CH1蛋白。"功能性0CH1蛋白"意指野生型0CH1蛋白或野生型0CH1蛋 白的功能性等同物即靶向至高爾基體并且基本上保留野生型0CH1蛋白的催化活性（即野 生型0011蛋白的（1-1，6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性的至少約80%、85%、90%、95%或更多）的 蛋白。為了避免逆轉(zhuǎn)，菌株中的同源序列應(yīng)當(dāng)被去除以避免發(fā)生產(chǎn)生野生型0CH1等位基因 的同源重組。
[0068] 突變0CH1等位基因無論是存在于宿主染色體上還是存在于染色體外的載體上， 都被轉(zhuǎn)錄為mRNA。換句話說，所述菌株被工程化以使得突變0CH1等位基因的編碼序列有效 連接至啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以是內(nèi)源啟動(dòng)子例如內(nèi)源0CH1啟動(dòng)子、不同于0CH1 等位基因的啟動(dòng)子（例如A0X1啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子）等；或可以是在巴斯德畢赤酵母中具 有功能的外源啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄水平可與野生型0CH1等位基因在未經(jīng)修飾的巴斯德畢赤酵母 菌株（例如GS115)中的轉(zhuǎn)錄水平是相同的、可比其更高或更低。
[0069] 具有如上所述的對(duì)0CH1等位基因的遺傳修飾的巴斯德畢赤酵母菌株包括單倍體 菌株和雙倍體菌株。對(duì)于具有整合至宿主染色體中的0CH1突變等位基因的雙倍體菌株，所 述菌株可對(duì)于0CH1突變等位基因是純合的或雜合的。
[0070] 具有如上所述的對(duì)0CH1等位基因的遺傳修飾的巴斯德畢赤酵母菌株是健全和穩(wěn) 定的，并且產(chǎn)生具有基本上均質(zhì)的以Man8GlcNAc2為主要的N-聚糖的N-聚糖結(jié)構(gòu)的蛋白。
[0071]遺傳工稈化一編碼和表汰a-1, 2-甘露糖苷酶的核酸
[0072] 除了如上所述的對(duì)0CH1等位基因的遺傳修飾以外，所述菌株還可被工程化以包 含編碼且能夠表達(dá)a-1，2-甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸分子，所述a-1，2-甘露糖 苷酶將Man8GlcNAe2轉(zhuǎn)化為Man5GlcNAe2，從而將Man5GlcNAe2提供為主要的N-聚糖形式。
[0073]a-1，2_甘露糖苷酶（MS-I)是已被良好表征的酶家族。已知大多數(shù)MS-I酶定 位于高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，雖然一些被分泌并具有細(xì)胞外活性。參見Gonzalez等人，Mol BiolEvolution17:292-300(2000)。定位于ER和高爾基體的那些酶的拓?fù)鋵W(xué)通常包含 內(nèi)腔催化結(jié)構(gòu)域和N-末端跨膜區(qū)。參見Herscovics，Biochimie8:757-62(2001)。N-末 端區(qū)由干區(qū)（最靠近于內(nèi)腔催化結(jié)構(gòu)域）、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)組成。在分泌的MS-I 酶中，外-催化跨膜區(qū)也被稱作為引導(dǎo)序列，用作酶分泌的信號(hào)。多種a-1，2-甘露糖 苷酶的詳細(xì)表征可見于Becker等人（EuropeanJ.CellBiol79:986-992(2000))，其研 宄了來自小鼠和釀酒酵母（S.cerevisiae)的MS-I酶及其催化結(jié)構(gòu)域；Schneikertand Herscovics(Glycobiology4:445-450 (1994))，其表征了鼠MS-I的催化活性及其催化結(jié) 構(gòu)域；Gonzalez等人（J.BiolChem274:21375-86 (1999))，其檢查了幾種MS-I酶（包括來 自秀麗隱桿線蟲（C.elegan)的兩種酶、人MS-I和釀酒酵母MS-I(來自ER))的活性和結(jié)構(gòu) 域；和Maras等人（J.Biotechnology77:255-263(2000))，其表征了屬于分泌性MS-I類別 的里氏木霉（T.reesei)a-l，2_甘露糖苷酶，其由催化結(jié)構(gòu)域和N-末端引導(dǎo)序列組成。
[0074] 編碼a-l，2_甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸分子可來源于用于本 發(fā)明的任何物種，包括但不限于編碼例如鼠a-1，2-甘露糖苷酶（Herscovics等 人J.Biol.Chem. 269:9864-9871，1994)、兔a-1，2-甘露糖苷酶（Lai等人上81〇1. Chem. 269:9872-9881，1994)或人a-1，2-甘露糖苷酶（Tremblay等人Glycobiology 8:585-595,1998)的哺乳動(dòng)物基因，編碼例如曲霉菌屬（Aspergillus)a-1，2-甘露糖苷 酶（msdS基因）、里氏木霉（Trichodermareesei)a-1，2_甘露糖苷酶（Maras等人，J. Biotechnol. 77:255-263, 2000)或釀酒酵母a-1，2-甘露糖苷酶的真菌基因，以及其 它基因例如來自秀麗隱桿線蟲（GenBank登錄號(hào)CAA98114和CAB01415)和黑腹果蠅 (Drosophilamelanogaster)(GenBank登錄號(hào)AAF46570)的那些基因（參見例如Nett等 人，Yeast28:237-252,2011，將其通過引用并入本文）。
[0075]a-1，2-甘露糖苷酶的"功能性部分"或"酶活性片段"意指天然存在的或野生型 a-1，2-甘露糖苷酶的基本上保留全長蛋白的酶活性的多肽片段。此背景中的"基本上"意 指至少約75%、80%、85%、90%、95%或更多的全長蛋白酶活性得到保留。例如（1-1，2-甘 露糖苷酶的催化結(jié)構(gòu)域（不存在任何N-末端跨膜或信號(hào)序列）構(gòu)成a-1，2-甘露糖苷酶 的"功能性片段"。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于本領(lǐng)域中可獲得的信息和本領(lǐng)域中已知的技術(shù)的 組合容易地鑒定和制做a-1，2-甘露糖苷酶的功能性片段。還可使用本領(lǐng)域中已知的體外 或體內(nèi)測定來驗(yàn)證特定多肽片段的活性。
[0076] 在一些實(shí)施方案中，編碼a-1，2-甘露糖苷酶或功能性片段的核苷酸序列來源于 里氏木霉a-1，2_甘露糖苷酶編碼序列。在具體實(shí)施方案中，核苷酸序列編碼由Maras等 人J.Biotechnol. 77:255-63 (2000)描述的里氏木霉a-1,2-甘露糖苷酶或其功能性片段 (例如全長蛋白的C-末端催化結(jié)構(gòu)域）。
[0077] 在大多數(shù)實(shí)施方案中，所述菌株被工程化以使得a-1，2-甘露糖苷酶或功能性片 段被靶向至ER。在具體的實(shí)施方案中，ER-靶向通過在a-1，2_甘露糖苷酶或功能性片段 中包含ER-靶向序列來實(shí)現(xiàn)。ER-靶向序列即是將蛋白靶向至ER以使得所述蛋白定位于 或保持在ER中的序列的實(shí)例包括釀酒酵母SEC12的N-末端片段、由GLS1編碼的釀酒酵母a_葡糖苷酶I的N-末端序列和由MNS1編碼的釀酒酵母a-1，2-甘露糖苷酶的N-末端片 段。參見例如Nett等人（2011)(同上）。在具體的實(shí)施方案中，通過在a-l，2_甘露糖苷 酶或其功能性片段的〇末端上包含￡1?-滯留信號(hào)冊￡1(5￡0 10勵(lì):91)來將€[-1，2-甘露 糖苷酶或功能性片段靶向至ER。
[0078] 可通過表達(dá)載體將編碼a-1，2-甘露糖苷酶或功能性片段的核酸引入巴斯德畢 赤酵母菌株中。表達(dá)載體可以是被設(shè)計(jì)來將a-1，2-甘露糖苷酶編碼序列整合至宿主基因 組中的整合性載體；或者是在菌株中獨(dú)立于染色體進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制性載體（例如質(zhì)粒）。在 整合性載體的情況下，載體可被設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)核酸至野生型0CH1等位基因中的整合（例如通 過單或雙交叉互換同源重組）和同時(shí)的所述野生型0CH1等位基因的破壞。
[0079] SuperM5菌株
[0080] 本公開內(nèi)容提供了健全的、穩(wěn)定的和可轉(zhuǎn)化的并且產(chǎn)生具有基本上均質(zhì)的 Man5GlcNAc2N-聚糖的蛋白的巴斯德畢赤酵母菌株。這些菌株在本文中也被稱作為 SuperM5 或SuperMan5 菌株。
[0081] SuperM5菌株被遺傳工程化以包含被轉(zhuǎn)錄為編碼突變型0CH1蛋白的mRNA的突變 0CH1等位基因，所述突變型0CH1蛋白包含與野生型0CH1蛋白的催化結(jié)構(gòu)域基本上相同的 催化結(jié)構(gòu)域，但缺乏將0CH1蛋白靶向至高爾基體所必需的N-末端序列。所述菌株不包含 任何其它的產(chǎn)生編碼功能性0CH1蛋白的mRNA的0CH1等位基因。所述菌株被另外地遺傳 工程化以包含編碼和表達(dá)a-1，2-甘露糖苷酶或其功能性片段的核酸，所述a-1，2-甘露 糖苷酶或其功能性片段被靶向至ER并將Man8GlcNAc2轉(zhuǎn)化為Man5GlcNAc2。
[0082]SuperM5菌株的實(shí)例描述于實(shí)施例1中。該菌株的0CH1基因座的核苷酸序列示 于表1