[0120] 80765855-80765854 (431lbp，圖 5)
[0121] 將該PCR產物進行凝膠分離和T0P0克隆。T0P0克隆的選擇在LB-Nat板上進行以 確保選擇盒的包含。對多個分離物進行DNA測序以測定同源臂序列。最終的分離物包含功 能性似以表達盒、lox71和lox66重組位點以及正確的同源臂。
[0122] 將圖5中詳述的克隆片段內部的PCR引物用來產生用于巴斯德畢赤酵母轉化的線 性DNA。設計了兩組獨立的引物：
[0123] 81364233-81364234 (4063bp,圖 6)
[0124] 81364235-81364236 (4060bp,圖 6)
[0125] 使用Phusion聚合酶利用100秒的延伸時間來進行PCR反應。
[0126] 將PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳來純化并用水從結合基質洗脫。使用標準DTT/山 梨醇處理來使M5-Blast巴斯德畢赤酵母菌株感受態(tài)化以用于電穿孔。使用包含20y1感 受態(tài)細胞和1-2y1純化的線性DNA的1_比色皿來進行電穿孔。將轉化混合物平板接種 于YPD-Nat瓊脂上。
[0127] 在電穿孔后，使細胞在30°C生長3天。將個體轉化子補綴（patch)至YPD-Nat用 于儲存和分析。圖7顯示0CH1基因座在PCR產物至M5-Blast基因組中的適當雙交叉互換 整合后的理論排列。設計了PCR引物對來核查諾爾絲菌素抗性分離物是同源重組的結果， 而不是PCR產物至基因組中的隨機整合的結果。這些PCR引物對圖示于圖7中。
[0128] 81487116-81487117 (895bp，圖 7)
[0129] 81487118-81487119 (937bp，圖 7)
[0130] 81487120-81487121 (656bp，圖 7)
[0131] 81487122-81487123 (756bp，圖 7)
[0132] 通過PCR篩選了總共24個獨立的分離物并將2個看起來正確的分離物通過PCR 產物的DNA測序來進行進一步的表征。將該兩個分離物在YH)培養(yǎng)基上沖擊成單菌落并在 YPD-Nat上進行再測試。使用苯酚/氯仿玻璃珠裂解來制備小規(guī)模基因組DNA制劑?；?對這些基因組提取物的 81487116-81487117、81487118-81487119、81487120-81487121 和 81487122-81487123引物對的測序結果，所述兩個分離物均在M5-Blast基因組中的適當位 置上包含lox71-l〇x66選擇/反選擇盒。用來產生轉化片段的起始PCR反應沒有引入突變， 兩個末端上的重組接合點與M5-Blast"野生型"DNA序列是相同的，并且lox71和lox66位 點都是完整的。0CH1基因座在雙交叉互換重組后的DNA序列示于SEQIDN0:59中。
[0133]將所述兩個分離物（A1-2和A4-3)用組成性表達ere重組酶的質粒進行轉化。簡 而言之，使用DTT/山梨醇程序將兩種菌株制成電-感受態(tài)，用環(huán)狀質粒進行電穿孔并在 YPD-G418上進行平板接種。在30°C生長轉化子數天并挑選菌落。將菌落直接轉移至甲醇 板以誘導MazF反選擇或補綴至YPD以允許cre-ARS質粒在MazF誘導前的丟失。甲醇誘導 在BMMY(1%甲醇）和CSM(完全的合成培養(yǎng)基，0.5%甲醇）上進行。通過將lOOyl甲醇添 加至倒置的平板蓋來給平板每天補充甲醇。培養(yǎng)在30°C下進行。在所有測試的條件下均有 顯著的菌落形成；在甲醇上的生長似乎是不依賴于轉化子是直接來自于YPD-G418還是經 歷了在無G418的YPD上的中間補綴的。
[0134]Cre重組應當去除lox71和lox66位點之間的DNA序列，從而僅在基因組中留下 缺陷lox位點裂痕。該重組事件的理論結果顯示于圖8中。設計了PCR引物來擴增包含缺 陷lox裂痕的區(qū)域。通過PCR篩選了在甲醇上生長的20個菌落以測定選擇/反選擇盒的 丟失。所使用的PCR引物是：
[0135] 80670916-80670917 (680bp,圖 8)
[0136] 80670918-80670919 (782bp,圖 8)
[0137] 20個分離物中的17個使用第一引物對產生了適當的PCR產物。所述17個中的大 多數但非全部還顯示了使用第二引物對的適當的產物。將所述17個分離物的每一個補綴 至YPD、YPD-Blast、YPD-Nat和YPD-G418以測試藥物選擇標記的存在或不存在。如果cre 質粒已恰當地去除了選擇/反選擇盒并隨后被丟失，那么所得的菌株應當是殺稻瘟菌素抗 性的并且對G418和諾爾絲菌素敏感。所有的分離物都是殺稻瘟菌素抗性和諾爾絲菌素敏 感性的。一些保留了G418抗性（仍然包含cre質粒，可能被整合了）并將其丟棄。在剩余 部分中，挑選出4個用于LEU5-甘露糖苷酶HDEL基因間區(qū)域的DNA測序。
[0138] 將現(xiàn)有的PCR引物用于擴增跨越LEU5和甘露糖苷酶HDEL0RF的基因組區(qū)域。
[0139] 81487118-80765854 (1602bp,圖 9)
[0140] 使用Phusion聚合酶對已通過苯酚/氯仿玻璃珠提取進行制備的基因組DNA進行 PCR擴增。將多種內部測序引物用于驗證1602bpPCR產物的整個序列。所有4個經測序 的PCR產物都是正確的，并且在LEU5基因和甘露糖苷酶HDEL0RF之間的適當位置上包含 缺陷lox位點。驅使甘露糖苷酶HDEL表達的LEU5啟動子和GAP啟動子都是完整的并且與 存在于起始M5-Blast菌株中的啟動子相同。0CH1基因組在雙交叉互換重組和cre重組之 后的DNA序列示于SEQIDN0:1中。
[0141]制備了所述4個分離物的每一個（和cre重組之前的2個親代菌株）的甘油儲備 物。
【主權項】
1. 巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)的經工程化的穩(wěn)定菌株，其包含： 被轉錄為編碼突變型OCHl蛋白的mRNA的突變OCHl等位基因，所述突變型OCHl蛋白包 含與野生型OCHl蛋白的催化結構域基本上相同的催化結構域和相較于野生型OCHl蛋白改 變突變型OCHl蛋白的高爾基體定位的N-末端序列，其中所述菌株產生基本上均質的N-聚 糖。
2. 權利要求1的菌株，其中包含催化結構域的所述突變型OCHl蛋白的C-末端片段與 SEQIDNO:2的氨基酸45-404具有至少95%的同一性。
3. 權利要求1的菌株，其中所述突變型OCHl蛋白缺乏用于將所述突變型OCHl蛋白靶 向至高爾基體的N-末端序列。
4. 權利要求3的菌株，其中所述突變型OCHl蛋白在N-末端區(qū)上缺乏膜錨定結構域。
5. 權利要求1的菌株，其中所述突變型OCHl蛋白中膜錨定結構域的缺乏是OCHl野生 型蛋白的N-末端部分的刪除的結果，其中被刪除的部分包含野生型OCHl蛋白的膜錨定結 構域的一個或多個氨基酸。
6. 權利要求5的菌株，其中所述刪除部分還包含野生型OCHl蛋白的胞質尾區(qū)的一個或 多個氨基酸。
7. 權利要求1的菌株，其中所述突變型OCHl蛋白包含如SEQIDN0:3所示的序列。
8. 權利要求1的菌株，其中所述突變OCHl等位基因存在于染色體上。
9. 權利要求8的菌株，其中所述突變OCHl等位基因取代OCHl基因座上的野生型OCHl 等位基因。
10. 權利要求1的菌株，其中所述突變OCHl等位基因被維持在質粒上，并且其中染色體 上的野生型OCHl等位基因已被破壞。
11. 權利要求1的菌株，其中所述菌株產生基本上均質的以Man8GlcNAc2為主要的 N-聚糖形式的N-聚糖。
12. 權利要求1的菌株，其中所述菌株還包含編碼和表達a-1，2-甘露糖苷酶或其功能 性片段的核酸。
13. 權利要求12的菌株，其中所述編碼和表達所述a-1，2-甘露糖苷酶或其功能性片 段的核酸被整合在所述菌株的OCHl基因座上。
14. 權利要求13的菌株，其中所述OCHl基因座包含如SEQIDNO: 1所示的核苷酸序 列。
15. 權利要求12的菌株，其中所述菌株產生基本上均質的以Man5GlcNAc2為主要的 N-聚糖形式的N-聚糖。
16. 權利要求1或權利要求12的菌株，其還包含編碼和表達異源蛋白的核酸。
【專利摘要】本文公開了用于表達具有基本上均質的N-聚糖的外源蛋白的新型巴斯德畢赤酵母菌株。所述菌株經遺傳工程化以包含被轉錄為編碼突變OCH1基因產物(即α-1,6-甘露糖基轉移酶或“OCH1蛋白”)的mRNA的突變OCH1等位基因。突變型OCH1蛋白包含與野生型OCH1蛋白的催化結構域基本上相同的催化結構域，但缺乏將OCH1蛋白靶向至高爾基體所必需的N-末端序列。本文公開的所述菌株是健全的、穩(wěn)定的和可轉化的，并且突變OCH1等位基因和產生基本上均質的N-聚糖的能力在冷凍和解凍循環(huán)后且在隨后的轉化后得到世代維持。
【IPC分類】C12R1-84, C12N15-09, C12N1-19
【公開號】CN104797703
【申請?zhí)枴緾N201380055395
【發(fā)明人】K·R·戈爾森, T·G·查派爾
【申請人】研究技術股份有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2013年10月23日
【公告號】CA2889202A1, EP2912162A1, US20150267212, WO2014066479A1