專利名稱：培養(yǎng)無形體科細(xì)菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在哺乳動物胚細(xì)胞或胎細(xì)胞(如貓胚細(xì)胞或胎細(xì)胞)中培養(yǎng)屬于無形 體科(Anaplasmataceae)的細(xì)菌生物體的方法。特別地，本發(fā)明涉及屬于無形體科的細(xì)菌 生物體的生長，包括屬于無形體屬(Anaplasma)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、新立克次氏 體屬(Neorickettsia)和沃爾巴克氏體屬(Wolbachieae)的生物體。細(xì)菌生物體可以在哺 乳動物胚細(xì)胞或胎細(xì)胞，如貓胚或胎宿主細(xì)胞中培養(yǎng)。根據(jù)在此所述的方法培養(yǎng)的細(xì)菌材 料可以用作抵抗無形體科細(xì)菌相關(guān)疾病的疫苗的基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
無形體科的細(xì)菌是專性胞內(nèi)寄生物。因此，這些生物體通常難以培養(yǎng)，并且由它們 引起的疾病難以診斷。由于培養(yǎng)這些微生物的困難性，疫苗抗原的大規(guī)模制備是昂貴的，并 且有時是不可能的。無形體科的細(xì)菌是人和動物的媒介傳播疾病的病原體。通常通過無脊 椎動物媒介如壁虱來傳播。在無形體科內(nèi)，無形體屬、埃里希氏體屬、新立克次氏體屬和沃 爾巴克氏體屬的微生物是媒介傳播疾病的病原體并且難以培養(yǎng)，尤其是大規(guī)模。屬于立克 次氏體屬(Rickettsieae)的細(xì)菌種不包括在無形體科內(nèi)。無形體病是美國主要的牛地方病的壁虱攜帶的疾病。病原體，邊緣無形體 (Anaplasma marginale)，侵入牛的紅血球并在其中繁殖，引起中度至嚴(yán)重的貧血。由于每 年影響肉牛群的無形體病引起的死亡率和發(fā)病率已經(jīng)導(dǎo)致數(shù)百萬美元價值的損失，由于， 例如，急性感染過程中的體重減輕和增加的獸醫(yī)成本。參見，例如，Palmer inVeterinary Protozoan and Hemoparasite Vaccine, J. G. Wright (編輯)，CRC Rress Inc. ,Boca Raton, Fla. 1989。嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)引起綿羊、牛和野牛中壁虱攜 帶的發(fā)燒，并通過I. ricinis攜帶。參見美國專利6，284，238，在此將其全部引入作為參考。 與感染紅血球的邊緣無形體相反，嗜吞噬細(xì)胞無形體感染粒細(xì)胞。埃里希氏體屬細(xì)菌與無形體屬種非常相關(guān)。已知其生物媒介的那些物種通過壁虱 傳播，如，犬埃里希氏體(E.canis)。盡管嗜吞噬細(xì)胞無形體優(yōu)選感染其哺乳動物宿主中的 粒細(xì)胞，而犬埃里希氏體優(yōu)選感染單核白細(xì)胞。通常，無形體和埃里希氏體包含在它們各自 宿主細(xì)胞的膜結(jié)合空泡中。識別的第一個埃里希氏體物種是犬埃里希氏體。其存在于媒介壁虱，血紅扇頭蜱 (Rhipicephalus sanguineus)(褐色狗壁虱)生活的世界各地。有時候，將其引起的疾病稱 為犬熱帶全血細(xì)胞缺少癥。這在世界所有的溫?zé)岬貐^(qū)尤其是個問題，例如，美國南部，中美 洲和南美洲，地中海和南亞。可以在狗細(xì)胞系DH82以及人-狗雜交細(xì)胞系中培養(yǎng)犬埃里希 氏體(參見，Rikihisa，Y. 1991, ClinicalMicrobiology Reviews, 4 286)。犬埃里希氏體的 各種菌株列于美國專利申請2006/0188524中，在此將其整體引入作為參考。恰菲埃里希氏 體(Ehrlichia chaffeensis)與人類埃里希氏體病相關(guān)。參見Maeda，K.等，1987，N. Eng. J. Med. 316 853 ；Dawson, J. Ε.等，1991，J. Clin. Microbiol. 29 :2741。也可以在 DH82 細(xì)胞 中培養(yǎng)恰菲埃里希氏體。
新立克次氏體細(xì)菌與埃里希氏體和無形體細(xì)菌密切相關(guān)。新立克次氏體種包括里 氏新立克次氏體(N.risticii)和腺熱新立克次氏體(N. sermetsu)(兩者之前都?xì)w于埃里 希氏體屬)。里氏新立克次氏體是波特麥克馬熱病的病原體。已知這種疾病發(fā)生在北美洲、 法國和印度?？梢栽诰奘杉?xì)胞-單核細(xì)胞細(xì)胞系如P388Di、T-84和U937中培養(yǎng)里氏新立 克次氏體。腺熱新立克次氏體是人類腺熱埃里希氏體病的病原體?？梢栽谑蠛腿思?xì)胞系如 P388D、L929和HeLa中培養(yǎng)腺熱新立克次氏體?？梢酝ㄟ^直接的顯微鏡檢查和/或血清診斷來診斷無形體科細(xì)菌生物體的感染。用抗體的治療是有效的。抵抗里氏新立克次氏體的馬疫苗是可購得的。參見Compendium of Veterinary Products,第 6 版，Aurora Arrioja 編輯，North American Compendiums, Ltd.，PortHuron, MI (2001)。至少一種抵抗無形體病的牛疫苗也是可購得的。參見同上。 然而，對于由如例如犬埃里希氏體的細(xì)菌生物體引起的其他疾病的大規(guī)模預(yù)防，尚未有疫 苗制造和銷售。已經(jīng)進(jìn)行了努力在各種宿主細(xì)胞中培養(yǎng)特定的立克次氏體生物體。美國專利 5，192，679，在此將其整體引入作為參考，涉及在支持DH82細(xì)胞生長的體外培養(yǎng)基中在犬 單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞細(xì)胞系DH82中連續(xù)繁殖犬埃里希氏體。美國公開的申請2005/0202046， 在此將其整體引入作為參考，涉及犬埃里希氏體疫苗，其中在DH82細(xì)胞中培養(yǎng)犬埃里希氏 體。美國專利5，401，656，在此將其整體引入作為參考，涉及在永生化的人內(nèi)皮細(xì)胞系中繁 殖恰菲埃里希氏體和犬埃里希氏體。美國專利5，869，335，在此將其整體引入作為參考，涉 及在黑腳硬蜱(Ixodes scapularis)細(xì)胞系中培養(yǎng)某些立克次氏體目的細(xì)菌。美國專利 5，989，848，在此將其整體引入作為參考，涉及在永生化的人內(nèi)皮細(xì)胞系上培養(yǎng)某些埃里希 氏體種。美國專利3，616，202，在此將其整體引入作為參考，涉及在兔骨髓組織培養(yǎng)物中培 養(yǎng)邊緣無形體。美國公開的專利申請2006/0057699，在此將其整體引入作為參考，涉及在哺 乳動物細(xì)胞中培養(yǎng)某些無形體種。美國公開的專利申請2003/0003508，在此將其整體引入 作為參考，涉及在非洲爪蟾(Xenopus laevis)細(xì)胞系上培養(yǎng)Rickettsia pulicis。美國專 利5，955，359和5，976，860，在此將其整體引入作為參考，涉及在某些哺乳動物細(xì)胞系中培 養(yǎng)屬于立克次氏體目(Rickettsiales)的某些細(xì)菌種。美國專利5，877，159，在此將其整體 引入作為參考，涉及使用某些活的入侵性細(xì)菌載體在動物細(xì)胞中引入并表達(dá)基因的方法。已經(jīng)提交了討論使用滅活的犬埃里希氏體生物體免疫狗以抵抗犬埃里希氏體 病的論文。Sunita Mahan, Immunisation of Germanshepherd doRs against canine ehrlichiosis usinR inactivatedEhr lichia can is or Ran isms,提交給津巴布韋大學(xué)的獸 醫(yī)科學(xué)系的論文(1997年5月)。該論文討論了 丙內(nèi)酯滅活的犬埃里希氏體生物體與 Quill A結(jié)合的用途。因為屬于無形體科的細(xì)菌種在宿主細(xì)胞中的培養(yǎng)只獲得了有限的成功并且顯然 尚未轉(zhuǎn)化成大量的疫苗供應(yīng)，因此對研發(fā)用于培養(yǎng)這樣的細(xì)菌種以促進(jìn)這些致病微生物的 研究和用于研發(fā)疫苗以抵抗其所引起的疾病的培養(yǎng)系統(tǒng)仍然存在著全面的需要。還需要研 發(fā)大規(guī)模的培養(yǎng)系統(tǒng)，用于從這些微生物中制備大量的抗原，用于診斷和疫苗中。發(fā)明概述本發(fā)明廣泛地涉及在哺乳動物胚或胎宿主細(xì)胞中培養(yǎng)屬于無形體科的細(xì)菌生物 體。所培養(yǎng)的細(xì)菌生物體可以用作抵抗由該細(xì)菌生物體引起的疾病的疫苗?？梢詮姆蛛x自哺乳動物宿主細(xì)胞的細(xì)菌生物體中制得用于疫苗中的抗原?；蛘撸梢詮挠杉?xì)菌生物體感染的哺乳動物宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中制得用于疫苗中的抗原?？梢詫⒓?xì)菌生物體(或宿主細(xì) 胞，如果存在)滅活。或者，細(xì)菌生物體可以是減毒存活的，使得它們在給予了一次或多次 的動物體內(nèi)復(fù)制但不引起該細(xì)菌生物體未減毒致病形式典型的病狀。更特別地，本發(fā)明涉及在為哺乳動物胚細(xì)胞的宿主細(xì)胞中培養(yǎng)無形體科的細(xì)菌生物體。在本發(fā)明的一個實施方案中，在非人哺乳動物胚細(xì)胞中培養(yǎng)細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞 可以獲自非人動物胚胎或胎兒的任何部分。宿主胚細(xì)胞可以源自貓、犬、鼠、豬、牛、綿羊、猿 或馬胚胎或胎兒。在本發(fā)明的一個實施方案中，宿主胚細(xì)胞源自貓胚胎或胎兒。在本發(fā)明的一個實施方案中，無形體科的細(xì)菌生物體屬于無形體屬、埃里希氏體 屬或新立克次氏體屬。屬于無形體科的細(xì)菌生物體不包括屬于立克次氏體科的那些細(xì)菌 生物體。(立克次氏體科包括立克次氏體屬，其包括種東方立克次氏體(R.orientia)和 立氏立克次氏體(R.riCkettSia))。屬于無形體屬的特定細(xì)菌生物體可以是牛無形體 (A. bovis)、紅血球內(nèi)生無形體(A. centrale)、邊緣無形體和嗜吞噬細(xì)胞無形體。屬于埃里 希氏體屬的特定細(xì)菌生物體可以是犬埃里希氏體。屬于新立克次氏體屬的特定細(xì)菌生物體 可以是里氏新立克次氏體。本發(fā)明涉及從無形體科培養(yǎng)細(xì)菌種的方法，包括i)獲得來自無形體科的細(xì)菌 種；ii)用所述細(xì)菌種感染非人哺乳動物胚細(xì)胞；和iii)在有助于繁殖非人哺乳動物胚細(xì) 胞的條件下培養(yǎng)所述非人哺乳動物胚細(xì)胞，由此培養(yǎng)細(xì)菌種。可以獲得以無任何宿主細(xì)胞 的純化狀態(tài)、存在于宿主細(xì)胞中的狀態(tài)或存在于受感染動物組織勻漿中的狀態(tài)的細(xì)菌種。 在一個實施方案中，用分離自由無形體科生物體感染的動物的哺乳動物細(xì)胞勻漿感染非人 哺乳動物胚細(xì)胞。在另一個實施方案中，通過將胚細(xì)胞暴露于無形體科生物體來感染非人 哺乳動物胚細(xì)胞。無形體科細(xì)菌種可以來自無形體屬、埃里希氏體屬或新立克次氏體屬。在 一個實施方案中，非人哺乳動物胚細(xì)胞是貓細(xì)胞。貓細(xì)胞可以是貓胚成纖維細(xì)胞、FEA貓胚 細(xì)胞或貓全胎細(xì)胞。非人哺乳動物胚細(xì)胞可以是未分化的和/或永生化的。在另一個實施 方案中，非人哺乳動物胚細(xì)胞是猴胚腎上皮細(xì)胞。本發(fā)明還涉及含有由來自無形體科的細(xì)菌種感染的非人哺乳動物胚細(xì)胞的組合 物。細(xì)菌種可以來自無形體屬、埃里希氏體屬或新立克次氏體屬。無形體科細(xì)菌種可以是 本領(lǐng)域已知的任何種，包括但不限于，牛無形體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、犬埃里希氏體或里氏 新立克次氏體。非人哺乳動物胚細(xì)胞可以是貓胚成纖維細(xì)胞(FEF)、FEA貓胚細(xì)胞或貓全胎 細(xì)胞。非人哺乳動物胚細(xì)胞可以是未分化的和/或永生化的。非人哺乳動物胚細(xì)胞還可以 是猴胚腎上皮細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過將基于根據(jù)在此所述方法培養(yǎng)的材料的疫苗給予哺乳動物來 預(yù)防哺乳動物感染的方法。本發(fā)明還涉及通過將基于根據(jù)在此所述方法培養(yǎng)的材料的疫苗 給予哺乳動物來保護(hù)哺乳動物的方法。本發(fā)明還涉及通過將基于根據(jù)在此所述方法培養(yǎng)的 材料的疫苗給予哺乳動物來治療哺乳動物的方法。特別地，本發(fā)明涉及通過給哺乳動物提 供治療有效量的無形體科細(xì)菌抗原來保護(hù)哺乳動物抵抗由屬于無形體科的生物體引起的 疾病。哺乳動物可以是人、猴、貓、狗、馬、牛、豬、綿羊或山羊。在本發(fā)明的一個實施方案中， 動物是狗。本發(fā)明還涉及將免疫保護(hù)量的根據(jù)在此所述方法培養(yǎng)的材料給予哺乳動物；或?qū)⒂行Я康母鶕?jù)在此所述方法培養(yǎng)的材料給予哺乳動物以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。發(fā)明詳述 除非另外指出，在此所用的所有術(shù)語都具有本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的常規(guī)含 義。以下提供了其顯定義的術(shù)語除了它們的直接含義之外，還具有通常由本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員歸納的含義。本發(fā)明涉及培養(yǎng)微生物的方法。更特別地，本發(fā)明涉及培養(yǎng)屬于無形體科的細(xì)菌 生物體的方法。更特別地，本發(fā)明涉及連續(xù)培養(yǎng)屬于無形體屬、埃里希氏體屬或新立克次氏 體屬的生物體的方法。根據(jù)本發(fā)明可以使用的屬于無形體屬的種的非限制性實例包括牛無形體、紅血球 內(nèi)生無形體、邊緣無形體、綿羊無形體(A. ovis)、血小板無形體(A.platys)和嗜吞噬細(xì)胞 無形體(之前稱為嗜吞噬細(xì)胞埃里希氏體(Ehrlichia phagocytophila)、馬埃里希氏體 (Ehrlichia equi)、人粒細(xì)胞埃里希氏體病物質(zhì)或HGE物質(zhì))。根據(jù)本發(fā)明可以使用的屬 于埃里希氏體屬的種的非限制性實例包括犬埃里希氏體、恰菲埃里希氏體和鼠埃里希氏體 (E.muris)。根據(jù)本發(fā)明可以使用的屬于新立克次氏體屬的種的非限制性實例包括蠕蟲新 立克次氏體(N.helminthoeca)、里氏新立克次氏體(波特麥克馬熱病，之前稱為里氏埃里 希氏體)和腺熱新立克次氏體。根據(jù)本發(fā)明，在哺乳動物胚或胎宿主細(xì)胞種培養(yǎng)無形體科的細(xì)菌生物體。如在此 所用的，“宿主細(xì)胞”是無形體科的細(xì)菌生物體可以感染并且細(xì)菌生物體在其中可以復(fù)制的 細(xì)胞。哺乳動物胚或胎宿主細(xì)胞的非限制性實例包括人、貓、犬、鼠、豬、牛、猿或馬胚或胎細(xì) 胞。如在此所用的，“感染的宿主細(xì)胞”指的是含有一個或多個無形體科細(xì)菌的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以源自分離自哺乳動物胚或胎組織的單個細(xì)胞。例如，該細(xì)胞可以源 自貓、犬、牛、馬、鼠、豬、猿和人的胚組織。在本發(fā)明的一個實施方案中，在源自非人哺乳動物胚或胎組織的宿主細(xì)胞中培養(yǎng) 屬于無形體科的細(xì)菌種。根據(jù)本發(fā)明可以使用的貓胚或胎細(xì)胞的非限制性實例包括貓胚成 纖維細(xì)胞(FEF)細(xì)胞、FEA貓胚細(xì)胞(格拉斯哥大學(xué)，格拉斯哥，蘇格蘭；如描述于Jarrett， 0.等，J. gen. Virol. 20 169-175 (1973))和貓全胎細(xì)胞(FCWF-4，美國典型培養(yǎng)物保藏中 心，P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108，美國(下文中稱為 “ATCC”)保藏 CRL-2787)。根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)菌生物體可以用于疫苗、診斷或進(jìn)一步的研究，包括例如，用 于分離和研究的大量生物分子的生產(chǎn)。因此，根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)菌可以配制于疫苗中，用 于給予哺乳動物以防止感染或緩解由該生物體引起的疾病。例如，宿主細(xì)胞中培養(yǎng)的細(xì)菌 可以是用于疫苗中的犬埃里希氏體，該疫苗將被給予狗以防止或緩解犬埃里希氏體病。因此，本發(fā)明還涉及基于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的免疫組合物或疫苗?？梢杂米?疫苗基礎(chǔ)的治療劑(也稱為抗原、活性劑或免疫組合物)可以是以下的一種或多種a)收集的用無形體科細(xì)菌感染的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物；b)受感染宿主細(xì)胞內(nèi)所含無形體科細(xì)菌濃度提高的(a)的提取物或級分；c)含有宿主細(xì)胞殘余物的(a)的無形體科細(xì)菌濃縮提取物；d)不含宿主細(xì)胞殘余物的(a)的無形體科細(xì)菌提取物；e)分離的無形體科細(xì)菌免疫原。在此使用時，“分離的”意指從其天然產(chǎn)生的環(huán)境中取出。因此，分離的無形體科細(xì)菌細(xì)胞廣義地包括已經(jīng)從其天然產(chǎn)生環(huán)境中取出的那些，該環(huán)境可以包括節(jié)肢動物、昆蟲 或完整的活的或死的受感染哺乳動物。分離的無形體科細(xì)菌細(xì)胞包括已經(jīng)從無形體科細(xì)菌 感染的哺乳動物中取出的哺乳動物組織內(nèi)所含的那些。分裂的無形體科細(xì)菌細(xì)胞還包括從 無形體科細(xì)菌感染的哺乳動物的哺乳動物細(xì)胞中完全或部分分離出來的那些，如來自裂解 宿主細(xì)胞。分離的無形體科細(xì)菌細(xì)胞還包括如在此所述的宿主細(xì)胞內(nèi)所含的那些，或從其 完全或部分分離的。分離的無形體科細(xì)菌細(xì)胞還包括基本上無其他微生物的那些，例如，在 培養(yǎng)物中。 如“分離的無形體科細(xì)菌免疫原”中所用的“分離的”指的是已經(jīng)從其各自的來源 無形體科細(xì)菌完全或部分分離的細(xì)菌免疫原。分離的無形體科細(xì)菌免疫原的組合物可以包 括一些完整的無破壞無形體科細(xì)菌、無形體科細(xì)菌的一部分或成分、完整的無破壞宿主細(xì) 胞和/或宿主細(xì)胞的一部分或成分。分離的無形體科細(xì)菌免疫原還包括一種或多種無形體 科細(xì)菌生物分子富集的組合物。如在此所用的“無形體科細(xì)菌免疫原”包括滅活的或改良的活細(xì)菌的完整無形體 科細(xì)菌。如在此所用的無形體科細(xì)菌免疫原還可以包括源自無形體科細(xì)菌的蛋白(脂蛋 白、膜蛋白、胞漿蛋白)、這些蛋白的致免疫片段、核酸、脂質(zhì)、糖類、脂多糖或其他生物分子。 無形體科細(xì)菌免疫原可以是存在于宿主細(xì)胞中的完整無形體科細(xì)菌細(xì)胞或其一部分，其中 細(xì)菌和宿主細(xì)胞兩者都是被殺滅或滅活的。無形體科細(xì)菌免疫原還可以是存在于宿主細(xì)胞 中的完整無形體科細(xì)菌細(xì)胞或其一部分，其中細(xì)菌或宿主細(xì)胞沒有被殺滅或滅活。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常熟知可以將細(xì)菌或宿主細(xì)胞殺滅或滅活的技術(shù)。這樣的技術(shù) 包括物理、化學(xué)和生物方法。滅活技術(shù)的非限制性實例包括超聲波處理、凍-融技術(shù)、壓力、 用熱、化學(xué)藥品或酶處理?；瘜W(xué)滅活劑的非限制性實例包括用二元乙二胺(BEA)和福爾馬 林(甲醛溶液)處理。如上所述，根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料可以用于制備用于疫苗的抗原。如在此所用的， 術(shù)語“疫苗”意指一種產(chǎn)品，它的給藥是用來引發(fā)可以預(yù)防和/或減輕一種或多種傳染病嚴(yán) 重程度的免疫應(yīng)答。疫苗含有用于刺激動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗原(或“活性劑”、“免疫原”、 “治療劑”或“免疫組合物”)，其是根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料，包括用無形體科細(xì)菌感染的宿主 細(xì)胞、完整的未破壞無形體科細(xì)菌或無形體科細(xì)菌的細(xì)菌級分或一部分或生物分子。抗原 可以是活的減毒或殺滅的無形體科細(xì)菌感染宿主細(xì)胞的制劑、活的輻射過的細(xì)胞、粗制級 分或純化的無形體科細(xì)菌免疫原。因此，疫苗可以包含富集的、分離的或純化的抗原。疫苗 可以從滅活或殺滅的無形體科感染的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物制得，或從滅活或殺滅的無形體科 細(xì)菌制得。疫苗還可以包括來自超過一個無形體科細(xì)菌種或來自以下將進(jìn)一步描述的其他 病原體(例如，病毒、細(xì)菌寄生物或真菌)的抗原的組合。從根據(jù)本發(fā)明所培養(yǎng)材料制得的疫苗含有治療有效量的抗原。在本發(fā)明公開的內(nèi) 容中，“治療有效量”指的是可以誘導(dǎo)接受了抗原或疫苗的哺乳動物體內(nèi)免疫應(yīng)答的抗原或 疫苗的量，其足以防止或緩解由致病無形體科細(xì)菌感染引起的疾病的病征或癥狀，包括不 利的健康影響或其并發(fā)癥?？梢哉T導(dǎo)體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)免疫或體液和細(xì)胞介導(dǎo)免疫兩 者。可以評價動物對疫苗的免疫應(yīng)答，例如，通過抗原滴度測量、通過顯微鏡分析間接評價 或通過監(jiān)控用野生型菌株激發(fā)后的病征和癥狀直接評價?？梢酝ㄟ^測量，例如，患者臨床病征如死亡率、發(fā)病率的降低、體溫和整體身體狀況以及整體健康和性能來評價疫苗給予的保護(hù)性免疫。治療有效的疫苗的量可以根據(jù)所用的特定病毒或患者的狀況而改變，或可以 由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料還可以用于制備刺激給予該組合物的受試哺乳動物體內(nèi) 免疫應(yīng)答的免疫組合物。這樣的組合物可以用于鑒定用作疫苗基礎(chǔ)的抗原。因此，例如，可 以將含有根據(jù)本發(fā)明方法培養(yǎng)的材料的免疫組合物給予受試哺乳動物。此后，可以監(jiān)控受 試哺乳動物的抗體滴度，并且可以選擇候選無形體科細(xì)菌抗原，以在疫苗中使用或進(jìn)行進(jìn) 一步的研究。本發(fā)明的免疫活性組合物包括刺激接受了疫苗的受試者體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答 和/或細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物。如在此所用的，“免疫應(yīng)答”指的是由于已經(jīng)接受了一種或多種基于根據(jù)在此所述 方法培養(yǎng)的材料的疫苗所引起的受試哺乳動物的主動免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括應(yīng)答存 在于疫苗中的抗原或免疫原的一種或多種抗體的產(chǎn)生。患者體內(nèi)的“免疫應(yīng)答”指的是產(chǎn) 生抵抗原的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的 標(biāo)準(zhǔn)免疫測定法和中和測定法來測定免疫應(yīng)答。由根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料制得的疫苗可以用于預(yù)防受試哺乳動物體內(nèi)的感染，保 護(hù)受試哺乳動物或治療受試哺乳動物?！邦A(yù)防感染”和類似的術(shù)語意指防止或抑制引起所述疾病的細(xì)菌復(fù)制，抑制細(xì)菌或 病毒的傳播，或防止細(xì)菌在其宿主動物中建立自身，或緩解由感染引起的疾病的癥狀。如果 存在細(xì)菌載荷的降低，則認(rèn)為處理是治療性的。如在此對于細(xì)菌所用的“保護(hù)”意指疫苗防止或減輕了由生物體引起的疾病的癥 狀，從該生物體產(chǎn)生了用于疫苗中的抗原。術(shù)語“保護(hù)”還表示疫苗可以用于“治療”患者 體內(nèi)已經(jīng)存在的疾病或疾病的一種或多種癥狀?！爸委煛敝傅氖悄孓D(zhuǎn)、緩解、抑制該術(shù)語適用的失調(diào)、病癥或疾病的進(jìn)展，或防止該 術(shù)語適用的失調(diào)、病癥或疾病，或防止這樣的失調(diào)、病癥或疾病的一種或多種癥狀。治療還 指的是加快從一種或多種無形體科生物體感染中恢復(fù)過來?！爸委煛敝傅氖恰爸委煛钡男袨?。因此，由根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料制得的疫苗可以用于預(yù)防受試哺乳動物體內(nèi)的無 形體科細(xì)菌感染，保護(hù)受試哺乳動物抵抗無形體科細(xì)菌和治療受試哺乳動物的無形體科細(xì) 菌感染。這樣的預(yù)防、保護(hù)或治療可以包括(但不限于)降低或消除致病無形體科生物體 感染的風(fēng)險，改善或緩解這種無形體科生物體感染的癥狀，即，無形體科細(xì)菌載荷的下降， 降低無形體科感染的發(fā)病率或持續(xù)時間，降低無形體科細(xì)菌的急性期血清蛋白水平，例如， 降低的直腸溫度和/或食物攝入的增加和/或生長。如在此所用的“藥物學(xué)上可接受的”指的是在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的，適用于接 觸受試者的組織而沒有不當(dāng)?shù)亩拘?、刺激、過敏反應(yīng)等，與合理的利益風(fēng)險比相匹配以及對 于其預(yù)期的用途是有效的物質(zhì)(例如，佐劑、免疫刺激劑、載體、稀釋劑、乳化劑或穩(wěn)定劑)。 藥物學(xué)上可接受的物質(zhì)不干擾治療劑的功效并且對于給予其的受試者是無毒的?！笆茉囌摺被颉笆茉嚥溉閯游铩敝傅氖蔷哂忻庖呦到y(tǒng)的任何動物，包括哺乳動物，如 人、貓、牛、馬、豬和狗。根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料還可以用于診斷應(yīng)用中以診斷由無形體科細(xì)菌引起的疾 病或病癥的存在。這樣的診斷應(yīng)用的非限制性實例包括細(xì)菌級分、蛋白質(zhì)或其他生物分子在抗體結(jié)合測定中的用途。細(xì)菌級分、蛋白質(zhì)或其他生物分子也可以用于產(chǎn)生用于這樣的 測定中的多克隆或單克隆抗體。宿主細(xì)胞生長
在用所需的細(xì)菌生物體感染之前，首先制備用于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)細(xì)菌生物體的宿 主細(xì)胞。將分離的貓胚細(xì)胞系的樣品接種于培養(yǎng)基中，用以懸浮或貼壁生長。如在此所用 的貼壁生長條件，其中細(xì)胞層覆蓋細(xì)胞在其中得到培養(yǎng)的泡囊內(nèi)包含的表面。表面可以包 括泡囊自身的內(nèi)表面，或泡囊內(nèi)所含的用于增加表面積的玻璃或聚合體珠子的表面。微載 體也可以用來增加表面積和宿主細(xì)胞生長。與貼壁生長相反，可以使宿主細(xì)胞在懸浮液中 生長，其中宿主細(xì)胞不需要結(jié)合培養(yǎng)泡囊內(nèi)的表面。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常熟知可以用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的各種培養(yǎng)基。宿主細(xì)胞生長培 養(yǎng)基可以源自動物?；蛘?，宿主細(xì)胞生長培養(yǎng)基可以是基于植物或酵母的，并且可以是無動 物蛋白的。生長培養(yǎng)基可以源自大豆提取物或其他富含蛋白的植物或富含蛋白的植物食 品，包括，例如，豆類。用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的特定培養(yǎng)基的非限制性實例包括Eagle' s最小 必需培養(yǎng)基(MEM)、Glasgow-最小必需培養(yǎng)基、RPMI1640、OptiMEM、AIM V。生長培養(yǎng)基可以含有或補充胎牛血清(FBS)、胰蛋白溶液、乳清蛋白水解產(chǎn)物溶 液、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉；乳清蛋白水解產(chǎn)物，多鏈絲霉素B，丙酮酸鈉，葡萄糖，硫酸鎂?？梢栽谒拗骷?xì)胞感染或暴露于無形體科細(xì)菌之前或之后，將新鮮生長培養(yǎng)基重新 加入或補充至宿主細(xì)胞中。可以使細(xì)胞在36_38°C，5% CO2下生長2-9天。感染宿主細(xì)胞可以通過使宿主細(xì)胞接觸已知用細(xì)菌生物體感染的其他真核細(xì)胞，將宿主細(xì)胞暴 露于無形體科的細(xì)菌生物體或用無形體的細(xì)菌生物體感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知確定例如 是否用這些細(xì)菌生物體感染了這些來自哺乳動物的其他真核細(xì)胞。受感染的哺乳動物細(xì)胞 可以源自任何組織，包括脾、肝、胰腺、肺、心臟或其他肌肉組織、大腦、膽囊、血液、腎臟、淋 巴結(jié)或胃?？梢栽诤线m的等滲溶液中通過攪拌機(jī)均質(zhì)從組織提取物中制得受感染的哺乳動 物細(xì)胞。然后可以將勻漿用于接種(即，感染)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，作為覆蓋宿主細(xì)胞的涂 層來施加或簡單地與它們接觸?；蛘?，可以將宿主細(xì)胞暴露于分離的無形體科的細(xì)菌生物體或用分離的無形體科 的細(xì)菌生物體感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知分離這些細(xì)菌生物體的技術(shù)，或可以從生物保藏 單位獲得分離的細(xì)菌生物體的原種。在接觸無形體科細(xì)菌之前，用于制備宿主細(xì)胞的生長培養(yǎng)基可以與在這樣的接觸 后用于繁殖宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基相同。無形體科細(xì)菌暴露的(或感染的)宿主細(xì)胞可以培養(yǎng) 長達(dá)95天，長達(dá)35天，或約5至10天，以獲得彡1 X IO4TCID50 (組織培養(yǎng)感染劑量)的滴 度，然后可以收集并處理培養(yǎng)物。收集可以通過收集組織細(xì)胞培養(yǎng)物流體和/或細(xì)胞來收集無形體科細(xì)菌感染的宿主 細(xì)胞。可以從含有宿主細(xì)胞壁的無形體科細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)基(和培養(yǎng)泡囊)中收集宿主細(xì) 胞。或者，在收集過程中，可以通過改善感染性細(xì)菌細(xì)胞從生長基質(zhì)中的釋放的技術(shù)來提高 無形體科細(xì)菌的濃度，這些技術(shù)例如為真核宿主細(xì)胞的超聲波處理、凍融、加熱或化學(xué)或選擇性酶促裂解。無形體科細(xì)菌的富集收集可以包括無宿主細(xì)胞的材料或宿主細(xì)胞材料。或 者，無形體科細(xì)菌的富集收集可以包括含有宿主細(xì)胞的材料或宿主細(xì)胞材料。滅活本領(lǐng)域技術(shù)人員通常熟知可以將細(xì)菌或宿主細(xì)胞殺滅或滅活的技術(shù)。這樣的技術(shù) 包括，物理、化學(xué)和生物方法。滅活技術(shù)的非限制性實例包括超聲波處理、凍-融技術(shù)、壓 力、用熱、化學(xué)藥品或酶處理?；瘜W(xué)滅活劑的非限制性實例包括用二元乙二胺(BEI)、福爾馬 林(甲醛溶液)、β-丙內(nèi)酯、硫柳汞、戊二醛、十二烷基硫酸鈉等或其混合物處理。還可以 通過在紫外線存在下的熱或補骨脂素將宿主細(xì)胞滅活。這些化學(xué)滅活劑或物理滅活方法也 可以在將無形體科細(xì)菌從宿主細(xì)胞中提取或分離出來后用于滅活無形體科細(xì)菌細(xì)胞。配制滅活的、感染的宿主細(xì)胞或富集的無形體科細(xì)菌細(xì)胞可以用作抗原和配制成液體 懸浮液或可以將其凍干，用于制備抵抗由無形體科生物體所引起疾病的疫苗。根據(jù)本發(fā)明 培養(yǎng)的材料可以和任何藥物學(xué)上可接受的佐劑、免疫刺激劑、載體、稀釋劑、乳化劑或穩(wěn)定 劑一起配制，以下將討論其非限制性實例。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到其他佐劑、免疫 刺激劑、載體、稀釋劑、乳化劑或穩(wěn)定劑也可以用于配制基于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗 中。佐劑&免疫刺激劑一般而言，佐劑是以非特異性方式增強(qiáng)目標(biāo)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。許多不同的佐劑是 本領(lǐng)域已知的?？梢杂糜谟筛鶕?jù)本發(fā)明所培養(yǎng)材料制得的疫苗配制中的佐劑的非限制性實 例包括鋁鹽(例如，明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、氧化鋁)、膽固醇、單磷酰脂質(zhì)A佐劑、白榴石 (amphigen)、生育酚、單苯膦脂質(zhì)Α、胞壁酰二肽、油乳濁液、葡聚糖、卡波姆、嵌段共聚物、阿 夫立定脂質(zhì)_胺佐劑、來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組的或其他的)、霍亂毒素 或胞壁酰二肽、弗氏完全和不完全佐劑、微生物E、無毒嵌段聚合物和聚胺如硫酸葡聚糖、 聚羰乙烯、吡喃、皂苷和皂苷衍生物、嵌段共聚物以及如美國專利4，578，269,4, 744，983、 5，254，339中鑒定的那些佐劑，在此將其全部引入作為參考。可以用作佐劑的肽的非限制性 實例包括胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸或特夫素?？梢杂米髯魟┑挠偷姆窍拗菩詫嵗ǖV 物油、植物油或其乳濁液。從根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料制得的疫苗可以配制成水包油型乳濁液或油包水型乳 濁液。水包油型乳濁液的非限制性實例包括石蠟水包油型乳濁液或從角鯊烯、環(huán)氧乙烷和 環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物、聚山梨酸酯表面活性劑和/或胞壁酰二肽的蘇氨酰類似物中的一 種或多種制得的乳濁液。用作佐劑的油可以通過接受疫苗的受試者代謝，如植物油或動物油。這樣的油通 常主要由三?；视偷幕旌衔锝M成，也稱為甘油三酯或中性脂肪。這些非極性的、水不溶性 的物質(zhì)是甘油的脂肪酸三酯。三?；视透鶕?jù)其三個脂肪酸殘基的性質(zhì)和位置而有所不 同。佐劑還可以是不可代謝的，由給予了乳濁液的動物受試者身體不能代謝的成分組 成。適用于本發(fā)明乳濁液的不可代謝的油包括烷烴、烯烴、炔烴及其相應(yīng)的酸和醇，其醚和 酯，及其混合物。油單獨的化合物可以是輕質(zhì)烴化合物，例如，具有6至30各碳原子的化合 物。油可以是合成制得的或從石油產(chǎn)品純化的。用于制備基于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗的不可代謝的油的非限制性實例包括，例如，礦物油、石蠟油和環(huán)烷烴。術(shù)語“礦物油”指的是不可代謝的佐劑油，其是通過蒸餾技術(shù)從礦脂獲得的液體烴的混合物。該術(shù)語與“液體 石蠟”、“液體礦脂”和“石蠟油”同義。該術(shù)語還用來包括“輕質(zhì)礦物油”，即，相似地通過礦 脂的蒸餾獲得的油，但其比石蠟油具有略低的比重?？梢杂糜诟鶕?jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗的配制中的能夠提高體液免疫應(yīng)答的其 他化合物包括但不限于乙烯馬來酸酐(EMA)共聚物，苯乙烯與丙烯酸和甲基丙烯酸的混合 物的共聚物的橡膠乳濁液。除了佐劑，基于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗可以包括免疫調(diào)節(jié)劑，如例 如，白細(xì)胞間介素、干擾素或其他細(xì)胞因子(例如，Thi-相關(guān)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞間介 素-12 (IL-12)、白細(xì)胞間介素-18 (IL-18)或γ -干擾素)。加入基于根據(jù)本發(fā)明所培養(yǎng)材料的疫苗制劑中的佐劑或免疫刺激劑的含量取決 于佐劑或免疫刺激劑自身的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇足以增強(qiáng)對無形體科細(xì)菌免疫 劑的免疫應(yīng)答的含量。載體適用于基于根據(jù)本發(fā)明所培養(yǎng)材料配制的疫苗的藥物學(xué)上可接受的載體可以是 任何常規(guī)的適用于獸醫(yī)藥物組合物的液體載體，包括平衡鹽溶液，如適用于組織培養(yǎng)基的 那些?？梢岳斫馑幬飳W(xué)上可接受的載體是沒有不利地影響接種動物健康的化合物，至少沒 有至不利影響比動物未接種時看到的影響更嚴(yán)重的程度。合適的載體還可包括無菌水、鹽 水、含水緩沖液如PBS、溶劑、稀釋劑、等滲劑、緩沖劑、葡萄糖、乙醇、甘露醇、山梨糖醇、乳糖 和甘油等。媒介物從根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料制得的疫苗還可以含有媒介物。媒介物是宿主細(xì)胞、無 形體科細(xì)菌細(xì)胞或其蛋白、蛋白片段、核酸或部分粘附但沒有共價結(jié)合的化合物。這樣的媒 介物的非限制性實例包括生物微膠囊、微-海藻酸鹽、脂質(zhì)體和macrosol。用作佐劑的一些 材料也可以用作介質(zhì)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁或氧化鋁、硅膠、高嶺土和膨潤土，全部 都是本領(lǐng)域已知的。穩(wěn)定劑通常，將疫苗與穩(wěn)定劑混合，例如，以保護(hù)易于降解的成分免于降解，提高疫苗的 貨架期，或提高凍_融效率?？梢约尤牖诟鶕?jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗制劑的穩(wěn)定劑的 非限制性實例包括 SPGA(Bovarnik 等，1950，J. Bacteriology, vol. 59，p. 509)、脫脂奶、明 膠、牛血清白蛋白、碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或 葡萄糖)、蛋白(例如，白蛋白、酪蛋白或其降解產(chǎn)物)、非動物來源穩(wěn)定劑和緩沖劑(例如， 堿金屬磷酸鹽)。在凍干疫苗組合物中，可以加入一種或多種穩(wěn)定劑。多價疫苗可以將從根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料收集的免疫原配入含有一種或多種其他免疫原 的疫苗中。其他免疫活性成分可以是完整的寄生物、細(xì)菌或病毒(滅活或改良的活的)，或 其分級的部分或提取物(例如，蛋白、脂質(zhì)、脂多糖、碳水化合物或核酸)。將從根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料收集的免疫原用于犬疫苗中的情況中，可以將其他 犬病原體的抗原加入制劑中。對于可以加入的其他抗原的其他病原體的非限制性實例是支氣管炎博德特氏菌(Bordetellabronchis印tica)、犬瘟熱病毒(CDV)、1型和2型犬腺 病毒(CAV-1、CAV-2)、犬副流感病毒(CPI)、犬冠狀病毒(CCV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、問號鉤 ilJiE#Λ yR M (Leptospira interrogans serovarcanicola) > ^-^ φ Μ Μ' Φ JtIfiifilTrM (Leptospirainterrogans serovar icterohaemorrhagiae) > fn] ^MlfeiJiE Φ ^iiJjUiTii^ifiliR M (Leptospira interrogans serovar bratislava)、問IiM
體波莫納血清型(Leptospira interrogans serovarpomona)、科氏鉤端螺旋體流感傷寒 ifili青型(Leptospira kirschneriserovar grippotyphosa)、狂犬病病毒、布氏疏 累旋體 (Borreliaburgdorferi)、犬輪狀病毒(CRV)、犬皰疹病毒(CHV)和犬細(xì)小病毒(MVC)、犬巴 倍氏菌(Babesia canis)、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)和利什曼蟲屬(Leishmania)?；蛘?，基于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗可以與其他活的或滅活的疫苗同時或伴隨給予。凍-融/重建出于穩(wěn)定性或經(jīng)濟(jì)的原因，可以將根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗凍干。通常，這使 得可以在超過0°C的溫度下，例如在4°C下延長保存。用于凍干的程序氏本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的；用于不同規(guī)模凍干的設(shè)備是可購得的。為了重建凍干的疫苗，可以將其懸浮于生理上 可接受的稀釋劑中。這樣的稀釋劑可以簡單地如無菌水，或生理鹽溶液或其他上述載體。用量可以將根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗配制成單位劑型，以利于給藥和確保劑量的 均一性。在此，關(guān)于疫苗組合物的劑量單位指的是適于作為用于動物的單位劑量的物理上 分開的單位，每個單位含有計算了以產(chǎn)生所需免疫效果的預(yù)定量的無形體科細(xì)菌免疫原， 并結(jié)合所需的佐劑系統(tǒng)和載體或介質(zhì)。無形體科細(xì)菌免疫原的有效免疫量可以根據(jù)選定的菌株而改變，并且可以是足以 引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的任何量。例如，其中劑量單位含有至少約IX IO4TCID5tl滅活無形體 科細(xì)菌的含量是合適的。給藥將疫苗給予受試者導(dǎo)致刺激了受試哺乳動物體內(nèi)的免疫應(yīng)答?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域 已知的方法將用于基于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的材料的疫苗的給藥途徑給予哺乳動物目標(biāo)。這 樣的方法包括，但不限于，皮內(nèi)、肌內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、口鼻和皮下，以及吸入、 栓劑或經(jīng)皮。給藥途徑包括皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、口鼻和皮下注射?？梢酝ㄟ^任何裝置來給 予疫苗，這些裝置包括但不限于，注射器、噴霧器、彌霧機(jī)、無針注射裝置或微彈轟擊基因槍 (Biolistic 轟擊)ο可行的備選施用途徑是作為滴劑、噴霧、凝膠或膏劑局部施用于眼睛、鼻子、嘴、肛 門或陰道的粘膜上皮，或施用于至身體任何部位的外層皮表皮上；作為氣溶膠或粉末進(jìn)行 噴霧?；蛘?，可以通過飲食途徑來施用，通過結(jié)合食物、飼料或飲用水，例如，作為粉末、液體 或片劑，或通過作為液體、凝膠、片劑或膠囊直接給予口腔，或作為栓劑直接施用肛門。優(yōu)選 的施用途徑是通過肌內(nèi)或通過皮下注射。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以是幾種形式，例如液體、凝膠、膏劑、粉末、片劑或膠囊，這 取決于所需的施用于靶的方法。根據(jù)本發(fā)明的疫苗施用于靶哺乳動物的方案可以是單劑量或多劑量，可以同時或按序給予，以與劑量和制劑相適的方式，并且這樣的量將是免疫有效的。激發(fā)模型為了有效地研究和評價無形體科細(xì)菌的致病機(jī)理和宿主哺乳動物的防御機(jī)制并 因此提升疫苗和改進(jìn)疫苗產(chǎn)品，應(yīng)當(dāng)使用有效的激發(fā)模型。用于犬埃里希氏體病的激發(fā)模型，例如，可以基于測試動物的百分比，以證實通常 與犬埃里希氏體病相關(guān)的持久且嚴(yán)重的臨床癥狀，如發(fā)熱、血小板減少、粘膿性眼分泌物、 脫水等?；蛘撸梢允褂霉_的美國申請2006/0188524(在此將其全部引入作為參考)中 描述的激發(fā)模型。可以通過給予所述測試動物含有活犬埃里希氏體細(xì)菌的毒性培養(yǎng)物的外 周血單核細(xì)胞(PBMC)的激發(fā)儲液在測試動物體內(nèi)獲得這種犬埃里希氏體激發(fā)。通過以下 方法來制得毒性犬埃里希氏體培養(yǎng)物在宿主中重復(fù)繁殖犬埃里希氏體微生物如犬埃里希 氏體Ebony、犬埃里希氏體Broadfoot等；從宿主血液樣品中分離出PBMC ；并將分離的PBMC 與20%胎牛血清和10%二甲亞砜混合。在測試動物中誘發(fā)臨床犬埃里希氏體病的方法包括給予所述動物有效量的犬埃 里希氏體激發(fā)儲液，該儲液主要由外周血單核細(xì)胞中的毒性犬埃里希氏體微生物組成。 犬埃里希氏體Broadfoot (有時候稱為犬埃里希氏體BF，活Broadfoot)和犬埃里希氏體 Ebony (有時候稱為Ebony)的存活培養(yǎng)物已經(jīng)保藏于ATCC(2004年2月11日)，10801 University Boulevard,Manassas, Va. 20110-2209U· S. Α.，并且各自給定了 ATCC保藏號，對 于 Broadfoot 株為 ΡΤΑ-5811，對于 Ebony 菌株為 ΡΤΑ-5812。存在幾種其他的細(xì)胞診斷方法來確定感染的存在。例如，可以通過直接的免疫熒 光來確定感染的存在。檢測感染的其他方法包括染色，例如，GiemSa，Wright/GiemSa。吖啶 橙也可以用于將生物體染色。除非另外限定，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員通常理解的相同含義。因此將在此提及的所有出版物全部引入作為參考。為了更清楚地理解本發(fā)明，以下列出了如下的實施例。這些實施例只是說明性的 并且應(yīng)當(dāng)理解不以任何方式來限制本發(fā)明的范圍或基本原理。實際上，除了在此所示和所 述的那些之外，從以下所示的實施例和之前的描述看，本發(fā)明的各種改變對本領(lǐng)域技術(shù)人 員而言都是顯而易見的。這樣的改變也落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
實施例實施例1 在DH82細(xì)胞存在下在FEF細(xì)胞上培養(yǎng)犬埃里希氏體1. 1未感染DH82的繁殖將一冷凍小瓶的未感染DH82細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏號 CRL-10389,P. 0. Box 1549,Manassas, VA 20108)融化、澄清并用于接種含有DH82生長培養(yǎng) 基的75-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶，在37°C下用5% CO2培養(yǎng)。DH82生長培養(yǎng)基由補充了10%胎牛 血清(TOS)和HEPES的Dulbecco' s MEM基料組成。在形成單層時，將細(xì)胞刮入生長 培養(yǎng)基中，收集，并在1，500rpm下離心10分鐘。將細(xì)胞沉淀物重懸浮于5ml新鮮DH82生 長培養(yǎng)基中并以13至15的比例分流。1. 2用犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞感染未感染的DH82細(xì)胞將一冷凍小瓶的犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞(ATCC保藏號no. CRL-10390)融化、澄清并用于接種在DH82生長培養(yǎng)基中含有大約IO7個未感染DH82細(xì)胞的單層(80-90% 匯合)的175-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶。通過重新給料來維持犬埃里希氏體感染的DH82培養(yǎng)物， 艮口，用如上所述的新鮮DH82培養(yǎng)基替換50%用過的培養(yǎng)基。使用以下方法監(jiān)控犬埃里希氏 體感染培養(yǎng)物根據(jù)制造商的指導(dǎo)(VWR，West Chester, PA#47733-150)在含有丙酮固定的 細(xì)胞的載波片上的Diff-Quik染色方法或標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光抗體(IFA)技術(shù)。簡而言之，用 多克隆犬埃里希氏體狗血清培養(yǎng)含有來自犬埃里希氏體感染的和未感染的DH82培養(yǎng)物的丙酮固定細(xì)胞的平板，用PBS洗滌，用熒光素標(biāo)記的山羊抗-狗IgGY培養(yǎng)(Kirkegaard和 Perry#02-19-02)，用PBS洗滌，并用熒光顯微鏡檢測。1.3未感染FEF細(xì)胞的繁殖將一小瓶冷凍貓胚成纖維細(xì)胞(FEF)融化，澄清并用于接種含有FEF生長培養(yǎng)基 的175-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶，在37°C下用5% CO2培養(yǎng)。FEF生長培養(yǎng)基由M6B8培養(yǎng)基(MEM 基料，Glasgow-MEM基料，胰蛋白磷酸鹽，胰蛋白，乳清蛋白水解產(chǎn)物，L-谷氨酰胺和碳酸氫 鈉)和5%FBS組成。在培養(yǎng)4-5天后，當(dāng)單層為90-95%匯合時，將培養(yǎng)物用于傳代。用 0.25%胰蛋白酶處理后，將細(xì)胞以1 5至1 10的比例分流。1. 4用犬 矣単希氏體感染的DH82細(xì)朐感染未感染的FEF細(xì)朐通過刮入培養(yǎng)基中來收集犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞，在l，500rpm下離心10 分鐘，并以1 X IO6細(xì)胞/ml重懸浮于新鮮DH82生長培養(yǎng)基中。將6X IO6細(xì)胞/175cm2細(xì)胞 培養(yǎng)燒瓶接種于FEF生長培養(yǎng)基中并在37°C下用5% CO2培養(yǎng)18-24小時的未感染FEF培 養(yǎng)物懸浮于培養(yǎng)基中并以1 3的分流比置于75-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中。然后將6ml重懸浮 的犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞用于感染每個在懸浮液中含有未感染FEF細(xì)胞的75-cm2 細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶，并在37°C下用5% CO2培養(yǎng)。通過每三天用新鮮的FEF生長培養(yǎng)基替換用過 的培養(yǎng)基來補給犬埃里希氏體感染的DH82/FEF混合培養(yǎng)物。感染后14天時，將混合物培 養(yǎng)物以1 2分流，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至24-孔細(xì)胞培養(yǎng)平板的孔中，Iml/孔。在37°C 下用5% CO2培養(yǎng)16小時后，將孔中的培養(yǎng)物上清液轉(zhuǎn)移至載波片上，用丙酮固定，并如上 所述使用IFA犬埃里希氏體感染的存在。實施例2 犬埃里希氏體在FEF細(xì)胞的同源群體上的生長用0. 5-2mL如上所述從ATCC獲得的細(xì)胞擴(kuò)大的犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞靜 脈內(nèi)感染狗。這樣的犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞描述于美國專利5，192，679中，在此將 其全部引入作為參考。通過脾臟或血液DNA的PCR將陽性的狗鑒定為受犬埃里希氏體感染 的。使用QIAamp DNA Mini試劑盒(Qiagen，Valencia, CA)根據(jù)制造商的說明從血液和組
織樣品中純化DNA。使用25-μ ι反應(yīng)物在RoboCycler 機(jī)器人熱循環(huán)器(stratagene， Cedar Creek，TX)上的熱循環(huán)實驗方案中進(jìn)行PCR，該反應(yīng)物由2. 5 μ 1 IOX反應(yīng)緩沖 液(GenscriptCorporation, Piscataway, NJ),0. 2μ 1 IOOmM dNTP(InvitrogenCorp., Carlsbad, CA)，1 μ 1 10 μ M 寡核苷酸引物 1 (5' -AGA ACG AACGCT GGC GGC AAG C_3') 和寡核苷酸引物 2(5' -CGT ATT ACC GCG GCTGGC A-3')禾口 0. 2 μ 1 5U/1 Taq 聚合酶 (Genscript Corp.)組成，該熱循環(huán)實驗方案由以下步驟組成94°C初步變性步驟5分鐘， 接著94°C 1分鐘，60°C 1分鐘和72°C 1分鐘的35個循環(huán)，接著為72°C 10分鐘的最終延伸 步驟。從犬埃里希氏體感染的狗獲得的脾臟、淋巴結(jié)或外周血單核細(xì)胞(PBMC)的樣品制備 新鮮生長培養(yǎng)基中的勻漿，并用作感染FEF細(xì)胞的覆蓋層。
將犬埃里希氏體感染的脾臟勻漿接種兩個分開的75-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的為感 染FEF細(xì)胞，燒瓶中含有30ml以2 X IO5細(xì)胞/ml/燒瓶接種的FEF細(xì)胞懸浮液，使勻漿至最 終1 10至1 100的稀釋度。在37°C下用5% CO2培養(yǎng)18-24小時后，用30mL新鮮FEF 生長培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)5-7天后，將細(xì)胞單層用胰蛋白酶處理并重懸浮于5-10ml 新鮮FEF生長培養(yǎng)基中。然后將5ml該懸浮液接種于兩個含有50mL FEF生長培養(yǎng)基的 175-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中。然后將細(xì)胞在37°C下用5% CO2培養(yǎng)7-10天。為了維持存活力， 培養(yǎng)物需要“喂養(yǎng)”，這通過用新鮮的FEF培養(yǎng)基替換50%用過的培養(yǎng)基來實現(xiàn)。在37°C下 用5% CO2再培養(yǎng)10-14天后，如上所述將細(xì)胞用胰蛋白酶處理并重懸浮。為了維持連續(xù)繁 殖，將1至2mL感染的FEF細(xì)胞懸浮液流過未感染的FEF細(xì)胞上并在37°C下用5% CO2培 養(yǎng)。使用4至14天的培養(yǎng)時間，將感染的培養(yǎng)物傳代7至13次。如上所述通過使用IFA 和PCR來證實培養(yǎng)的FEF細(xì)胞中犬埃里希氏體的存在。矣g.EU本SFCWF-4M胞,白句同本卜長3. 1 來感染 FCTF-4 細(xì)胞(ATCC#CRL_2787)的繁殖將一冷凍小瓶的未感染貓全肽-4(FCWF-4)細(xì)胞(ATCC登錄號no. CRL-2787)，澄 清并用于接種含有FCWF生長培養(yǎng)基的75-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶，并在37°C下用5% CO2培養(yǎng)。 FCWF生長培養(yǎng)基由E-MEM (Eagle' s最小必需培養(yǎng)基，含有Earle ‘ s平衡鹽溶液和2mM L-谷氨酰胺)、l.OmM丙酮酸鈉、0. ImM非必需氨基酸、1.5g/升碳酸氫鈉和10% FBS組成。 4-5天培養(yǎng)后，用0.25%胰蛋白酶處理90-95%匯合的單層，并以1 4至1 6的比例分 流。3. 2犬埃里希氏體FCWF-4細(xì)胞的同源群體的制備在用犬埃里希氏體感染之前，將未感染的FCWF-4細(xì)胞以6 X IO6細(xì)胞/燒瓶接種 于175-cm2燒瓶中并培養(yǎng)18-24小時。按照對于FEF細(xì)胞所述的將犬埃里希氏體感染的脾 臟勻漿用于感染FCWF-4細(xì)胞，不同的是替代FEF生長培養(yǎng)基使用了 FCWF生長培養(yǎng)基。如 上所述通過使用IFA和PCR來證實培養(yǎng)的FCWF-4細(xì)胞中犬埃里希氏體的存在。實施例4 =鼠埃里希氏體在FEA細(xì)胞的同源群體上的生長4. 1未感染FEA貓胚細(xì)胞的繁殖將一小瓶冷凍的未感染FEA貓胚細(xì)胞融化，澄清并用于接種含有FEA生長培養(yǎng)基 的75cm2燒瓶，并37°C下用5% CO2培養(yǎng)。FEA生長培養(yǎng)基由Dulbeccos MEM、2mM L-谷氨 酰胺、1. OmM丙酮酸鈉和10% FBS組成。在培養(yǎng)7天后，用0. 25%胰蛋白酶處理匯合的單層 并以1 2的分流比傳代。4. 2鼠埃里希氏體感染的FEA貓胚細(xì)胞的同源群體的制備如上所述將未感染的DH82細(xì)胞進(jìn)行繁殖，并使用鼠埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞 (ATCC保藏號VR-1411-Asuke菌株)用鼠埃里希氏體來感染。用于材料的繁殖和感染的實 驗方案基本上按照如上對于犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞所述的實驗方案，不同的是用 鼠埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞替代犬埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞。給小鼠腹膜內(nèi)注射 0. 5mL鼠埃里希氏體感染的DH82細(xì)胞。通過脾臟和血液DNA的PCR將陽性小鼠鑒定為受鼠埃里希氏體感染的。使 用Qiagen QIAamp DNA Mini試劑盒根據(jù)制造商的說明從血液和組織樣品中純化DNA。
使用25-μ1反應(yīng)物在RoboCycler 機(jī)器人熱循環(huán)器(Stratagene)上的熱循環(huán)實驗方案中進(jìn)行PCR，該反應(yīng)物由2. 5μ 1 IOX反應(yīng)緩沖液(Genscript)，0. 2μ 1 IOOmM dNTP (Invitrogen)，1 μ 1 10 μ M 寡核苷酸引物 1 (5 ‘ -AGA ACG AAC GCTGGC GGC AAG C-3')和寡核苷酸引物 2(5' -CGT ATT ACC GCG GCT GCTGGC Α-3')禾口 0. 2 μ 1 5U/μ 1 Taq聚合酶(Genscript)組成，該熱循環(huán)實驗方案由以下步驟組成94°C初步變性步驟5分 鐘，接著94°C 1分鐘，60°C 1分鐘和72°C 1分鐘的35個循環(huán)，接著為72°C 10分鐘的最終延 伸步驟。
從鼠埃里希氏體感染的小鼠獲得的脾臟樣品制備新鮮生長培養(yǎng)基中的勻漿并用 于FEA貓胚細(xì)胞中。將Iml鼠埃里希氏體感染的小鼠脾臟勻漿接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶 中的未感染FEA貓胚細(xì)胞中，燒瓶中含有24小時FEA貓胚細(xì)胞單層( 80%匯合)和8ml FEA生長培養(yǎng)基，使得最終的勻漿稀釋為1 9。在37°C下用5% CO2培養(yǎng)5-24小時后，用 8ml新鮮FEA生長培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。在5_7天培養(yǎng)后，將細(xì)胞單層進(jìn)行胰蛋白酶處理并重 懸浮于2ml新鮮FEA生長培養(yǎng)基中。將Iml這樣的鼠埃里希氏體感染的細(xì)胞懸浮液接種于 含有24小時FEA貓胚細(xì)胞單層和30ml FEA生長培養(yǎng)基的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中。將細(xì)胞 在37°C下用5% CO2培養(yǎng)4-7天。在37°C下用5% CO2，使用4_9天的培養(yǎng)時間，將感染的 培養(yǎng)物傳代5次。為了進(jìn)一步傳代，將1至2ml用胰蛋白酶處理的并重懸浮于4至8ml生 長培養(yǎng)基中的受感染細(xì)胞用于感染其他的未感染FEA貓胚細(xì)胞。將感染的細(xì)胞接種于含有 24-小時大的FEA貓胚細(xì)胞單層的燒瓶中，并37°C下用5% CO2培養(yǎng)5_48小時，重新供給新 鮮培養(yǎng)基，并37°C下用5% CO2再培養(yǎng)4-9天。如上所述，通過使用IFA和PCR來證實FEA 貓胚細(xì)胞培養(yǎng)物中鼠埃里希氏體的存在。實施例5 鼠埃里希氏體在FEF細(xì)胞的同源群體上的生長如上所述，從鼠埃里希氏體感染的小鼠獲得的脾臟樣品制備生長培養(yǎng)基中的勻漿 并用于感染FEF細(xì)胞，并如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。用0. 5ml鼠埃里希氏體感染的脾臟勻漿/25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶接種每個未受感染的細(xì)胞系，燒瓶中含有24小時單層和8ml生長培養(yǎng)基。這 使得最終的勻漿稀釋度為1 17。在37°C下用5% CO2培養(yǎng)24小時后，用8ml合適的新鮮 培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。7天培養(yǎng)后，將細(xì)胞單層用胰蛋白酶處理并將25cm2燒瓶的全部感染細(xì) 胞內(nèi)含物接種于含有30ml新鮮培養(yǎng)基的75cm2燒瓶中(這是1 3. 75的分流)。在37°C 下用5% CO2，使用7-8天的培養(yǎng)時間，將感染的培養(yǎng)物傳代2次。如上所述，通過使用IFA 和PCR來證實細(xì)胞培養(yǎng)物中鼠埃里希氏體的存在。實施例6 鼠埃里希氏體在FCWF-4細(xì)胞同源群體上的生長如上所述，從鼠埃里希氏體感染的小鼠獲得的脾臟樣品制備生長培養(yǎng)基中的勻漿 并用于感染FCWF-4細(xì)胞，并如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。用0.5ml鼠埃里希氏體感染的脾臟勻漿 /25cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶接種每個未受感染的細(xì)胞系，燒瓶中含有24小時單層和8ml生長培養(yǎng) 基。這使得最終的勻漿稀釋度為1 17。在37°C下用5%0)2培養(yǎng)24小時后，用8!111合適 的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。7天培養(yǎng)后，將細(xì)胞單層用胰蛋白酶處理并將25cm2燒瓶的全部 感染細(xì)胞內(nèi)含物接種于含有30ml新鮮培養(yǎng)基的75cm2燒瓶中(這是1 3. 75的分流)。在 37°C下用5% CO2，使用7-8天的培養(yǎng)時間，將感染的培養(yǎng)物傳代2次。如上所述，通過使用 IFA和PCR來證實細(xì)胞培養(yǎng)物中鼠埃里希氏體的存在。實施例7 用里氏新立克次氏體感染的P388D1細(xì)胞感染FEF如上所述制備用來自里氏新立克次氏體感染的P388D1細(xì)胞的里氏新立克次氏體感染FEF細(xì)胞的材料，或按照之前Vemulapalli，R.等中所述的，J. Clin. Micro. 33(11) 2987-2993 (1995)，或按照之前美國專利4，759,927中所述的，在此將其全部引入作為參考。將用里氏新立克次氏體90-12株感染的P388D1細(xì)胞(ATCC保藏號CC1-46)以 0.0006至0. 0028的感染復(fù)數(shù)(MOI)加入含有3_4天大的FEF細(xì)胞單層的850-cm2轉(zhuǎn)瓶中。 在感染之前，用300ml用于感染的培養(yǎng)基更換轉(zhuǎn)瓶中用過的培養(yǎng)基。在所示的MOI下接種 后，將轉(zhuǎn)瓶在37°C培養(yǎng)，未用C02。所測試的培養(yǎng)基包括但不限于D-MEM、MEMEarleS和M6B8 ； 使用了 0至5% FBS0當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)達(dá)到75%至85%時(這根據(jù)所用的MOI需要 8-16天)，收集感染的培養(yǎng)物。所觀察的CPE包括感染細(xì)胞的膨脹、圓形形狀和剝離。通過 輕敲轉(zhuǎn)瓶的側(cè)壁將細(xì)胞移入培養(yǎng)基中來收集培養(yǎng)物。使用標(biāo)準(zhǔn)IFA實驗方案對細(xì)胞證實 了感染的存在，這些細(xì)胞在96-孔平板中已經(jīng)用70%丙酮和30%甲醇固定了，該平板中含 有里氏新立克次氏體單克隆抗體和熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(Bethyl Laboratories, Inc. , Montgomery, TX)。實施例8 用鼠埃里希氏體感染MA-1048. 1未感染MA-104細(xì)胞的繁殖將一小瓶冷凍的MA-104細(xì)胞(猴胚腎上皮細(xì)胞，ATCC保藏號CRL-2378. 1)融化， 澄清并用于接種含有MA-104生長培養(yǎng)基的75-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶，并在37°C下用5% CO2培 養(yǎng)。MA-104生長培養(yǎng)基由含有Earles BSS和2mM L-谷氨酰胺(EMEM)的Eagles最小必 需培養(yǎng)基組成，其補充了 l.OmM丙酮酸鈉，0. ImM非必需氨基酸，1.5g/l碳酸氫鈉和另外的 1% L-谷氨酰胺和10% FBS0培養(yǎng)5-7天后，當(dāng)單層為90-95%匯合時，即可將培養(yǎng)物用于 傳代。用0.25%胰蛋白酶處理后，以1 5至1 10的分流比將細(xì)胞傳代。8. 2鼠埃里希氏體感染的MA-104細(xì)胞的同源群體的繁殖從鼠埃里希氏體感染的小鼠獲得的脾臟樣品制備勻漿并用于感染MA-104細(xì)胞。 將鼠埃里希氏體感染的小鼠脾勻漿用于覆蓋25-cm2細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的MA-104細(xì)胞。用 1 91稀釋度的脾勻漿(9ml現(xiàn)有的24小時燒瓶培養(yǎng)基中0. Iml脾勻漿)接種 85%匯 合的二十四小時大的MA-104單層。MA-104生長培養(yǎng)基由含有Earles BSS和2mM L-谷氨酰胺(EMEM)的Eagles最小 必需培養(yǎng)基組成，其補充了 l.OmM丙酮酸鈉，0. ImM非必需氨基酸，1.5g/l碳酸氫鈉和另外 的L-谷氨酰胺和10% FBS0在37°C下用5% CO2培養(yǎng)5天后，用胰蛋白酶處理細(xì)胞并 將所有細(xì)胞重懸浮于30ml新鮮MA-104生長培養(yǎng)基中；然后將該30ml分配至75cm2細(xì)胞培 養(yǎng)燒瓶中。在37°C下用5 % CO2培養(yǎng)8天后，用胰蛋白酶處理這些細(xì)胞并將所有細(xì)胞重懸浮 于50ml新鮮MA-104生長培養(yǎng)基中；然后將該50ml分配至175cm2培養(yǎng)燒瓶中。為了進(jìn)一 步傳代，將3ml胰蛋白酶處理的且重懸浮于9-10ml生長培養(yǎng)基中的感染細(xì)胞接種到175cm2 細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中的50ml新鮮生長培養(yǎng)基中。當(dāng)受感染細(xì)胞中細(xì)胞病變效應(yīng)顯現(xiàn)出進(jìn)展時， 在傳代過程中加入未感染的MA-104細(xì)胞，感染細(xì)胞變稀少，或感染細(xì)胞顯示出虛弱。對于 感染細(xì)胞在37°C下用5% CO2的培養(yǎng)范圍為5-8天。通過使用IFA來證實所培養(yǎng)的MA-104 細(xì)胞中鼠埃里希氏體的存在。氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺在此將所有專利、公開的專利申請和其他出版物以其整體引入作為參考。
權(quán)利要求
培養(yǎng)來自無形體(Anaplasmataceae)科的細(xì)菌種的方法，包括i)獲得來自無形體科的細(xì)菌種；ii)用所述細(xì)菌種感染非人哺乳動物胚細(xì)胞；和iii)在有助于繁殖非人哺乳動物胚細(xì)胞的條件下培養(yǎng)所述非人哺乳動物胚細(xì)胞，由此培養(yǎng)細(xì)菌種。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌種來自無形體(Anaplasma)屬。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)菌種是嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophiIum)禾中。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌種來自埃里希氏體屬(Ehrlichia)的種。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)菌種是犬埃里希氏體(Ehrlichiacanis)種。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌種來自新立克次氏體屬(Neorickettsia)的種。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述細(xì)菌種是里氏新立克次氏體(Neorickettsia risticii)禾中。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌種是引起波特麥克馬熱病的傳染源。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是貓細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述貓細(xì)胞是貓胚成纖維細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述貓細(xì)胞是FEA貓胚細(xì)胞。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述貓細(xì)胞是貓全胎細(xì)胞。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是未分化的。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是永生化的。
15.含有用來自無形體科的細(xì)菌種感染的非人哺乳動物胚細(xì)胞的組合物。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述細(xì)菌種來自無形體屬。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述細(xì)菌種是牛無形體(Anaplasmabovis)種。
18.權(quán)利要求15的組合物，其中所述細(xì)菌種來自埃里希氏體屬的種。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述細(xì)菌種是犬埃里希氏體(Ehrlichiacanis)種。
20.權(quán)利要求15的組合物，其中所述細(xì)菌種來自新立克次氏體屬(Neorickettsia)的種。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述細(xì)菌種是里氏新立克次氏體種。
22.權(quán)利要求15的組合物，其中所述細(xì)菌種是引起波特麥克馬熱病的傳染源。
23.權(quán)利要求15的組合物，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是貓胚成纖維細(xì)胞。
24.權(quán)利要求15的組合物，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是FEA貓胚細(xì)胞。
25.權(quán)利要求15的組合物，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是貓全胎細(xì)胞。
26.權(quán)利要求15的組合物，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是未分化的。
27.權(quán)利要求15的組合物，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是永生化的。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是猴胚腎上皮細(xì)胞。
29.權(quán)利要求15的組合物，其中所述非人哺乳動物胚細(xì)胞是猴胚腎上皮細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及在哺乳動物胚細(xì)胞或胎細(xì)胞中培養(yǎng)屬于無形體科(Anaplasmataceae)的細(xì)菌生物體的方法。特別地，本發(fā)明涉及屬于無形體科的細(xì)菌生物體的生長，包括屬于無形體屬(Anaplasma)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)和新立克次氏體屬(Neorickettsia)的生物體。細(xì)菌生物體可以在哺乳動物胚或胎宿主細(xì)胞中培養(yǎng)，包括貓胚宿主細(xì)胞。根據(jù)在此所述的方法培養(yǎng)的細(xì)菌材料可以用作抵抗無形體科細(xì)菌相關(guān)疾病的疫苗的基礎(chǔ)，或作為診斷應(yīng)用的基礎(chǔ)，可用于診斷與無形體科細(xì)菌相關(guān)的疾病。
文檔編號C12R1/00GK101802176SQ200880106797
公開日2010年8月11日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者B·L·梅丁, J·K-L·巴特雷斯, K·D·普羅德福特, P·G·方克, R·M·瓦爾森 申請人:英特威國際有限公司