專利名稱：具有核定位信號的噬菌體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，尤其是通過病毒顆粒進(jìn)行外源物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
將外源基因人工導(dǎo)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種重要的技術(shù)，不僅僅因為它是一種分析各種生物現(xiàn)象的基本技術(shù)，而且因為其在諸如基因治療和有益動物生產(chǎn)方面的應(yīng)用。一般而言，轉(zhuǎn)基因有兩種方法。一種是利用具有外源基因的病毒的生物學(xué)方法，另一種用物理學(xué)方法將外源基因?qū)爰?xì)胞的物理學(xué)方法。
利用病毒的方法的原理是用摻入目的基因的重組病毒感染細(xì)胞，并將整個重組病毒基因組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。這種方法目前正受到很大的關(guān)注，因為它是作為例如Lesch-Nyhan綜合癥和腺苷脫氨酶(ADA)缺陷這一類疾病的基因治療的技術(shù)基礎(chǔ)。然而，有人指出該方法存在一些問題，例如病毒的致病性，這是由于利用了病毒本身的生物學(xué)特性而引起的。因此，目前正在開發(fā)改良的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它們沒有與病毒致病性和復(fù)制相關(guān)的區(qū)域。但是，這些改良的載體仍然具有許多問題，因為它們?nèi)匀豢赡軐?xì)胞產(chǎn)生一些不良影響，而且它們僅僅感染正在分裂的細(xì)胞。
所以，除了上述利用病毒的方法之外，目前也在使用導(dǎo)入非病毒載體的物理學(xué)方法。在一種成熟的物理學(xué)方法中，將非病毒載體與化學(xué)物質(zhì)例如磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、聚陽離子或脂質(zhì)體一起導(dǎo)入細(xì)胞中。不過，這些物理學(xué)有這些問題，將基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的效率低，在許多情況下如此轉(zhuǎn)染的非病毒載體上的外源基因并未到達(dá)細(xì)胞核。因此，要應(yīng)用于基因治療，該方法有許多困難需要克服。
最近，有報道說被轉(zhuǎn)送到真核細(xì)胞核中并在那里起作用的蛋白質(zhì)具有一特定的氨基酸序列，其作用是作為將該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入核中的信號(NLS核定位信號)(G.Garcia-Bustos等，生物化學(xué)與生物物理(Biochem.Biophys.Acta)1071:83-101(1991))。而且，還有報道說將核定位信號結(jié)合到正常情況下并不轉(zhuǎn)運(yùn)到核中的蛋白質(zhì)上將會使該蛋白質(zhì)具有核轉(zhuǎn)運(yùn)活性(R.E.Lanford等，細(xì)胞(Cell)46:575-582(1986),Y.Yoneda等，實(shí)驗細(xì)胞研究(Exp.Cell.Res.) 170:439-452(1987),D.Chelsky等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)9:2487-2492(1989))。根據(jù)這種知識，已用核定位信號進(jìn)行了研究，從而以物理學(xué)方法導(dǎo)入的基因就非常有可能到達(dá)細(xì)胞核。也就是說，進(jìn)行了技術(shù)研究就使DNA盡可能緊密地濃縮至40納米(即核膜孔的大小)，以及使核定位信號結(jié)合到該濃縮物上，并因此可以積極地將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核中。例如，通過利用蛋白質(zhì)進(jìn)行了使DNA更緊密的研究，這些蛋白質(zhì)例如HMG-1和組蛋白，以及聚-L-賴氨酸(Jose C.Perales等，E.J.B.266:255-266(1994)),和陽離子脂質(zhì)體(J.Zabner等，J.B.C.270:18997-19007(1995))。
但是，這種合成化學(xué)方法存在與DNA復(fù)合物的溶解性和均一性的問題，以及依賴于鹽濃度的DNA的濃縮的不同程度問題。而且，復(fù)合物的構(gòu)建僅在高堿條件下才有可能，而在生理條件下是不可能的，這在實(shí)際運(yùn)用中是一個需要解決的問題。
有人建議可在感染動物的病毒例如腺病毒和SV40中，核定位信號存在于其衣殼蛋白質(zhì)中，它們能在感染早期使其DNA積極地進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)(Urs.F.Greber和Harumi Kasamatsu，細(xì)胞生物學(xué)動態(tài)(Trends in Cell Biology)6:189-195(1996))。還有人建議將直徑為45納米的SV40顆粒以病毒顆粒的形式侵入核中(K.Hummeler等，J.Virol.6:87-93(1970))。而且，據(jù)報道，MS-2噬菌體有轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其中外源物質(zhì)被衣殼包裹(日本公開國際申請No.Hei-508168)。但是，還未報道過任何可利用長鏈DNA并將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核中的利用病毒顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。
本發(fā)明的目的之一是提供一個系統(tǒng)，該系統(tǒng)可將導(dǎo)入細(xì)胞中的基因送入核中。更具體地，本發(fā)明的目的是提供一種λ噬菌體，其帶有暴露于頭部的外表面的核定位信號，并能包裝長鏈DNA。
為了將長鏈DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核中，有必要將DNA濃縮至約40納米，即核膜孔的大小。本發(fā)明者注意到了λ噬菌體的頭部，其頭部在體外可對目的長鏈DNA進(jìn)行緊密包裝而且可使DNA免于遭受外部DNA酶的攻擊，并作為該DNA的載體。而且，我們還注意到一個現(xiàn)象，即感染動物的病毒可以利用其衣殼蛋白內(nèi)核定位信號而以病毒顆粒的形式侵入到核中，并嘗試通過制備和利用結(jié)合有核定位信號的λ噬菌體頭部將DNA積極地轉(zhuǎn)運(yùn)至核中。更具體地，我們利用以下步驟。
首先，我們構(gòu)建了表達(dá)gpD蛋白質(zhì)和核定位信號序列的融合蛋白的載體，其中的gpD蛋白質(zhì)是組成λ噬菌體頭部的蛋白質(zhì)之一；以此載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia Coli)，接著再以在大腸桿菌細(xì)胞中不能表達(dá)gpD的突變噬菌體(此后稱之為“D琥珀噬菌體”)來對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行感染。通過噬菌斑形成分析及利用抗-gpD抗體的Westem印跡分析，我們證實(shí)了載體表達(dá)的gpD蛋白和核定位信號序列之間的融合蛋白可以對突變噬菌體進(jìn)行補(bǔ)充，而且還得到了其頭部結(jié)合有核定位信號的λ噬菌體。也就是說，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白已被補(bǔ)充地整合到了其本身并不表達(dá)該蛋白的噬菌體頭部。
接著，我們通過將表達(dá)gpD蛋白和核定位信號序列之間的融合蛋白的載體導(dǎo)入到以突變λ噬菌體溶源化的大腸桿菌中，然后熱誘導(dǎo)該溶源化噬菌體而得到了類似的結(jié)果。更具體地，我們將表達(dá)上述融合蛋白的載體導(dǎo)入到以D琥珀噬菌體溶源化的大腸桿菌中，并以熱誘導(dǎo)該轉(zhuǎn)化體。結(jié)果是其頭部未摻入該融合蛋白并由gpE蛋白組成的噬菌體對EDTA敏感，而摻入有該融合蛋白的噬菌體對EDTA具有抗性。然后，我們以EDTA處理所得噬菌體并計算其滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建了包裝有80％基因組大小的DNA的噬菌體，而且融合蛋白摻入到了其噬菌體頭部之中。而且我們已證明確實(shí)存在有暴露于噬菌體頭部的外表面的核定位信號。我們還證實(shí)甚至我們使用100％基因組大小DNA時，仍然以相同的方式形成摻入該融合蛋白的噬菌體。而且，我們將有核定位信號暴露于其頭部外表面的噬菌體通過微注射導(dǎo)入到屬于人胎兒肺細(xì)胞的HEL-R66細(xì)胞中并證實(shí)該噬菌體具核轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及能夠包裝大分子例如長鏈DNA并具有核轉(zhuǎn)運(yùn)活性的λ噬菌體。
更具體地，其涉及(1)具有作為其頭部一個組分的核定位信號的包含蛋白質(zhì)的噬菌體或其頭部，(2)(1)的噬菌體或其頭部，其中所說的核定位信號包含SEQ ID NO:1到SEQID NO:4中的任何一段序列。(3)(1)的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體是λ噬菌體，(4)(3)的噬菌體或其頭部，其中所說的含有核定位信號的蛋白質(zhì)是在核定位信號和噬菌體頭部蛋白質(zhì)之間的融合蛋白。(5)(4)的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體頭部蛋白質(zhì)是λ噬菌體的D蛋白。(6)核定位信號和形成噬菌體頭部的蛋白質(zhì)之間的融合蛋白。(7)(6)的融合蛋白，其中所說的核定位信號包括SEQ ID NO:1到SEQ IDNO:4中的任何一段序列。(8)(6)的融合蛋白，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。(9)(6)的融合蛋白，其中所說的噬菌體頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白，(10)編碼(6)到(9)中任一個蛋白質(zhì)的DNA，(11)含有(10)的DNA的載體，(12)攜帶(11)的載體的細(xì)菌宿主，(13)(12)的細(xì)菌宿主，其中所說的宿主是大腸桿菌，(14)用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的試劑盒，其中所說試劑盒含有(12)或(13)的細(xì)菌宿主，和(b)從其上已衍生出包含于在所說宿主中表達(dá)的融合蛋白中的頭部蛋白的噬菌體，其中所說噬菌體在所說細(xì)菌宿主中不能表達(dá)所說的頭部蛋白，(15)(14)的試劑盒，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。(16)(14)的試劑盒，其中所說的包含于在細(xì)菌宿主中表達(dá)的融合蛋白的頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白。(17)將所需物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到目的細(xì)胞的核中的方法，其中所說方法包括(a)將要被轉(zhuǎn)位至核中的目的物質(zhì)包裝到(1)的噬菌體或其頭部中，和(b)將所說噬菌體或其頭部導(dǎo)入所需細(xì)胞中，(18)(17)的方法，其中所說的目的物質(zhì)是核酸，(19)(17)的方法，其中所說的噬菌體是λ噬菌體，(20)(17)的方法，其中所說的細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明涉及將外源物質(zhì)包裝到結(jié)合有核定位信號的噬菌體頭部，將該噬菌體導(dǎo)入外源物質(zhì)要在其中發(fā)揮功能的目的細(xì)胞內(nèi)，以及將外源物質(zhì)與噬菌體顆粒一同轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞核中的技術(shù)。
對本發(fā)明所使用的核定位信號并無特別限制，只要它具有將結(jié)合于該信號序列的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到核中的活性即可。例如，在將λ噬菌體顆粒轉(zhuǎn)位到核內(nèi)的情況下，優(yōu)選使用SV40 VP1。SV40大T抗原，或丁型肝炎病毒δ抗原的核定位信號，或者含有在SV40大T抗原核定位信號內(nèi)具核轉(zhuǎn)位活性的最小單位的“PKKKRKV的序列(生物化學(xué)百科全書(Encyclopedia ofBiochemistry)第二版中的氨基酸單字母表示法)”。
只要外源物質(zhì)能包裝到其頭部，對本發(fā)明所使用的噬菌體并無特定限制?？梢允褂美缛胧删w和M13噬菌體的噬菌體。
可以采用多種方法來制備其頭部由含有核定位信號的蛋白質(zhì)組成的噬菌體。例如，可將核定位信號序列以化學(xué)方法結(jié)合到噬菌體頭部蛋白上，或者可將編碼核定位信號序列的DNA與編碼噬菌體頭部蛋白質(zhì)的基因結(jié)合在一起并摻入到載體中，在細(xì)菌宿主中將其作為融合蛋白表達(dá)，并在宿主中使不能表達(dá)該頭部蛋白的突變噬菌體進(jìn)行增殖，從而構(gòu)建了該噬菌體頭部。對上述方法中所使用的載體并無限制，可使用各種載體。只要本方法中所用的噬菌體在宿主中可以增殖，對細(xì)菌宿主沒有特定的限制。例如，當(dāng)使用λ噬菌體時，可以使用噬菌體可在其中增殖的各種大腸桿菌株。核定位信號可以通過直接地或者通過交聯(lián)劑或間隔肽而化學(xué)方法結(jié)合到噬菌體頭部蛋白上。編碼核定位信號序列的DNA和編碼噬菌體頭部蛋白的基因可以直接或者通過間隔核苷酸而結(jié)合在一起。
對上述方法中使用的頭部蛋白是沒有限制的，當(dāng)噬菌體是λ噬菌體時，蛋白質(zhì)可使用gpD蛋白或gpE蛋白，噬菌體是M13時使用基因3蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，在外源物質(zhì)包裝好之后將噬菌體導(dǎo)入細(xì)胞中。對包裝而言，可以使用Ishiura等(基因(Gene)82:281-289(1989))的方法，也可以使用Sternberg等(日本專利No.Hei 59-500042)的方法。對外源物質(zhì)而言，可以使用基因、基因片段、核酶、反義基因或任何其它能在核內(nèi)發(fā)揮功能的物質(zhì)。例如，當(dāng)進(jìn)行基因治療時，使用缺陷基因的正常的對應(yīng)物是有效的。當(dāng)進(jìn)行特定基因的功能分析時，用該基因的反義基因?qū)⑹怯行У?。而且，如果希望?chuàng)造轉(zhuǎn)基因動物，在其中導(dǎo)入一個與要賦予的表型相關(guān)的基因是有效的。應(yīng)該注意到的是本發(fā)明使得有可能包裝長鏈核酸，例如帶有其上游區(qū)的基因。
將包裝有外源物質(zhì)的噬菌體導(dǎo)入的方法，包括微注射法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、HVJ-脂質(zhì)體法、免疫-脂質(zhì)體法、pH敏感脂質(zhì)體法、紅細(xì)胞血影法、DEAE-葡聚糖法、利用細(xì)胞表面的受體的胞吞作用的方法、利用細(xì)胞表面特異抗原的方法、利用合成的大分子載體的方法、利用微粒槍的方法等等。對導(dǎo)入包裝有外源物質(zhì)的噬菌體的細(xì)胞并沒有特定的限制，根據(jù)目的可以采用各種細(xì)胞。


圖1表明的是各種核定位信號和作為λ噬菌體頭部蛋白的gpD蛋白質(zhì)之間的融合蛋白的圖解。
圖2表明的是顯示通過交聯(lián)劑將核定位信號結(jié)合到其上的λ噬菌體的核轉(zhuǎn)位活性的顯微攝影。
圖3顯示的是描述在其頭部表面暴露有核定位信號的λ噬菌體的核轉(zhuǎn)位活性的顯微攝影。
下面將以實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1構(gòu)建帶有核定位信號的λ噬菌體用野生型λ噬菌體基因作模板通過PCR克隆了編碼gpD蛋白質(zhì)的cDNA，該gpD蛋白質(zhì)是組成λ噬菌體頭部的一種蛋白質(zhì)。根據(jù)Stemberg等人的方法(Sternberg等，PNAS 92:1609-1613(1995))進(jìn)行PCR。更具體地，用5′-GTAAGCCATGGTTATGACGAGCAAAG-3＇(其含有從5′端的第6到第11位核苷酸殘基的NcoⅠ位點(diǎn))(SEQ ID NO:5)和5′-GTTCGAATTCCTATTAAACG ATGCTGATTGCC-3′(其含有從5′端的第5到第10位核苷酸殘基的EcoRⅠ位點(diǎn))(SEQ ID NO:6)作為引物，將含有該gPD基因的約4kb的片段作為模板，此片段通過用ApaⅠ和ApaLⅠ消化20微克的λ噬菌體基因組(TOYOBO,7.9OD/毫升)而產(chǎn)生。PCR反應(yīng)中，使用0.2微克模板，10×反應(yīng)緩沖液(Pharmacia；500毫摩爾/升KCl,15毫摩爾/升MgCl2,100毫摩爾/升Tris-HCl(pH9.0)),1微摩爾/升各種引物，50微摩爾/升dNTP,100微升的5U Taq DNA聚合酶(Pharmacia)，進(jìn)行的25個循環(huán)，包括90℃變性3分鐘，55℃退火2分鐘，72℃延伸3分鐘，最后的一個循環(huán)90℃熱變性3分鐘55℃退火2分鐘，72℃延伸10分鐘。將通過上述PCR擴(kuò)增的DNA片段導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)載體pTrcHisA(Invitrogen)的NcoⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)，所得載體被稱之為“pTrcHisA-gpD”。通過循環(huán)測序法確證DNA的序列之后，將載體導(dǎo)入大腸桿菌TOP10(Seth G.N.Grant等，PNAS 87:4645-4649(1990))中，并在大腸桿菌中高水平地表達(dá)gPD蛋白質(zhì)。通過SDS聚丙烯酰胺膠凝膠電泳(SDS-PAGE)測定蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果，在以1毫摩爾/升IPTG誘導(dǎo)6小時之后在11.6kDa的位置處檢測到強(qiáng)帶，它就是該蛋白質(zhì)的分子量。
接著，用D琥珀噬菌體感染大腸桿菌TOP10(pTrcHisA-gpD)和大腸桿菌594(pTrcHisA-gpD)，這兩個菌株都因為導(dǎo)入了“pTrc HisA-gpD”而正表達(dá)gpD蛋白而且不含有抑制突變(sup°)，然后測定其噬斑形成活性及滴度。結(jié)果表明在兩種情況下都形成了噬菌斑，滴度相當(dāng)于帶有含有對D琥珀抑制突變的LE392的情況。因此，證明了甚至在gpD基因以反式存在時，通過功能互補(bǔ)也形成了該噬菌體。
然后，通過在大腸桿菌中表達(dá)核定位信號和gpD之間融合蛋白質(zhì)而構(gòu)建了具有核定位信號的噬菌體。核定位信號可以使用除三種類型的被本發(fā)明人證實(shí)是有效的來自于SV40VP1、SV40大T抗原和丁型肝炎病毒δ抗原的核定位信號(分別為SEQ ID NOs:1,2,3)之外的其它兩種核定位信號，一種是(1)核定位信號最小單位“PKKKRKV(SEQID NO:4)”和間隔蛋白質(zhì)之間的融合蛋白，以及(2)單獨(dú)的核定位信號最小單位“PKKKRKV”。而且，為了確證噬菌體形成能力，使用了來自Sternberg等在PNAS 92:1609-1613(1995)中所述的血管緊張肽Ⅱ(并非核定位信號)的8個多肽和間隔蛋白質(zhì)之間的融合蛋白，總共6種類型(圖1)。接著，合成相應(yīng)于這些核定位信號的寡核苷酸并導(dǎo)入到上述的“pTrcHisA-gpD”的NcoⅠ位點(diǎn)上。在通過循環(huán)測序法證實(shí)已正確地構(gòu)建了質(zhì)粒之后，將載體導(dǎo)入到了大腸桿菌TOP10中，并在大腸桿菌中高水平地表達(dá)核定位信號和gpD蛋白質(zhì)之間的融合蛋白質(zhì)。以SDS聚丙烯酰胺膠電泳(SDS-PAGE)測定融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果，在以1毫摩爾/升IPTG誘導(dǎo)6小時之后，在所期望的蛋白質(zhì)的分子量的預(yù)期位置檢測到了強(qiáng)的帶。而且，通過用D琥珀噬菌體感染細(xì)菌細(xì)胞來檢測噬菌斑形成能力，并在使用三類肽，SV40大T抗原，丁型肝炎病毒δ抗原，和來自血管緊張素Ⅱ的8個多肽與間隔蛋白質(zhì)之間的融合蛋白質(zhì)時，檢測了噬斑形成。滴度測試表明所有噬菌體滴度的數(shù)量級為1010，但噬菌斑形成時間對SV40大T抗原而言是10小時，對丁型肝炎病毒δ抗原而言是18小時，與正常的噬菌斑形成時間的6小時相比延遲了(表1)。
表1
還通過Westem印跡法證實(shí)如此所得的噬菌體顆粒含有核定位信號和gpD之間的融合蛋白。實(shí)施例2用具有核定位信號的λ噬菌體包裝λ噬菌體基因組代替通過大腸桿菌TOP 10感染形成噬菌體的上述方法不同，在下面將使用其中的溶源性噬菌體(大腸桿菌594)或者80％基因組噬菌體在熱誘導(dǎo)下期望能提供更好的噬菌體形成能力的方法。用100％基因組噬菌體使大腸桿菌594(λDam15 cIts 857 Sam7)溶源化，而且具有一個在42℃處理15分鐘可使之失活的溫度敏感型阻遏物cI。但由于D琥珀突變，在此大腸桿菌Sup0菌株中不能產(chǎn)生頭部而僅能產(chǎn)生尾部。在大腸桿菌菌株中導(dǎo)入“pTrcHisA-gpD”以表達(dá)該融合蛋白，并用熱誘導(dǎo)檢測噬菌體形成。結(jié)果，使用上述6種肽中的任何一種都形成了噬菌體。結(jié)果表明在通過100％基因組噬菌體溶源化的該大腸桿菌菌株中，融合蛋白被摻入到了噬菌體頭部。所得噬菌體的滴度見表2所示。
表2
接著，以通過80％基因組D琥珀噬菌體溶源化的大腸桿菌(E.coli 594)進(jìn)行另一套實(shí)驗。噬菌體本身所編碼的并作為該噬菌體的阻遏物的cI是溫度敏感的，它在42℃處理15分鐘后可失活，導(dǎo)致該細(xì)菌被噬菌體所裂解。另外，既然該噬菌體包含D琥珀突變，在這個Sup°宿主中，其不能表達(dá)gpD，其頭部一般僅由gPE形成。(λ噬菌體頭部蛋白質(zhì)有兩種-gpD和gpE.)僅由gpE形成的噬菌體對EDTA極其敏感。另一方面，如果允許大腸桿菌表達(dá)該融合蛋白并經(jīng)熱誘導(dǎo)噬菌體摻入融合蛋白，則其將表現(xiàn)出EDTA抗性。將“pTrcHisA-gpD”導(dǎo)入大腸桿菌菌株中，在8毫升的規(guī)模上制備噬菌體并以10mMEDTA進(jìn)行處理。并以其感染大腸桿菌LE392，測定其滴度。結(jié)果證實(shí)用實(shí)施例1中6種肽中任何一種都有EDTA抗性。該結(jié)果表明80％基因組噬菌體比100％基因組噬菌體有更高的滴度，表明在前一種情況下頭部結(jié)構(gòu)被穩(wěn)定(表3)。
表3
實(shí)施例3其上有通過交聯(lián)劑結(jié)合的核定位信號的λ噬菌體的核轉(zhuǎn)位活性(1)從λ噬菌體溶源化細(xì)菌中制備噬菌體顆粒于32℃在LB(thy)培養(yǎng)基上培養(yǎng)以λ噬菌體溶源化的大腸桿菌w3550thy-(λcI847 Sam7)，于45℃振搖處于對數(shù)生長期(2×108個細(xì)胞/毫升)的菌體25分鐘以誘導(dǎo)噬菌體產(chǎn)生。然后，將培養(yǎng)物在39℃振蕩3小時，于5000rpm離心10分鐘，將沉淀的大腸桿菌重新懸浮于SM緩沖液中(0.1摩爾/升NaCl,8毫摩爾/升MgSO4、0.01％明膠、50毫摩爾/升Tris-HCl(pH7.5))加入37℃的氯仿并攪拌使?jié)饪s的菌體裂解。而且，在溶液中加入DNase，在8000rpm離心30分鐘以除去不溶物，并將上清于23000rpm離心60分鐘沉淀噬菌體，并將噬菌體重新懸浮于SM緩沖液。以氯化銫密度梯度離心純化所回收得到的噬菌體顆粒。(2)交聯(lián)核定位信號與λ噬菌體用交聯(lián)劑(SMPB；Pierce)將核定位信號與λ噬菌體交聯(lián)起來。用SV40大T抗原(SEQ ID NO:2)作為核定位信號。以1.1毫克/毫升在緩沖液(0.1摩爾/升NaCl,8毫摩爾/升MgSO4,20毫摩爾/升Hepes.NaOH(pH7.0))中制備λ噬菌體。將溶于無水DMSO中的10毫摩爾/升SMPB加入其中，其摩爾比為噬菌體顆粒的5000倍，并將混合物在25℃溫育1個小時。然后在緩沖液(0.1摩爾/升NaCl、8毫摩爾/升MgSO4、20毫摩爾/升Tris-HCl(pH7.5))中透析過夜，除去未反應(yīng)的SMPB就得到了SMPD修飾的λ噬菌體。以與SMPB等摩爾的量在含0.1摩爾/升的NaCl的20毫摩爾/升Tris-HCl(pH8.0)中溶解合成的核定位信號肽(Sawady Technology)，并在溶液中將DTT加至50毫摩爾/升，在37℃進(jìn)行還原反應(yīng)1小時。在緩沖溶液(0.1摩爾/升NaCl、8毫摩爾/升MgSO4、20毫摩爾/升Heps.NaOH(pH7.0))中進(jìn)行凝膠過濾除去DTT之后，將洗脫物加到SMPB修飾的噬菌體上，并在25℃下反應(yīng)3小時。將反應(yīng)溶液置于離心管中以在預(yù)先置于管中的1毫升10％蔗糖溶液(含0.1摩爾/升NaCl、8毫摩爾/升MgSO4、20毫摩爾/升Hepes.NaOH(pH7.0))層上的分層，于4℃在20000rpm(Beckman TLS-55轉(zhuǎn)頭)離心1小時。在緩沖液(0.1摩爾/升NaCl,8毫摩爾/升MgSO4,20毫摩爾/升Hepes.NaOH(pH7.0))中重新懸浮沉淀物以回收其上結(jié)合有核定位信號的噬菌體。(3)通過微注射及間接熒光抗體法檢測核轉(zhuǎn)位活性將具有核定位信號的λ噬菌體通過微注射注入以文獻(xiàn)(Y.Yoneda等，Exp.Cell.Res.170:439-452(1987),T.Tachibana等，J.Biol.Chem.269:24542-24545(1994))所述方法在蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞的胞質(zhì)中。將細(xì)胞在37℃孵育5分鐘到4小時之后，加入含3.7％甲醛的PBS(-)在室溫下將細(xì)胞進(jìn)行固定20分鐘。固定前的“5分鐘到4小時”孵育時間范圍的設(shè)定是為了測定具核定位信號的噬菌體在注射后要到達(dá)核所需的時間。固定后在室溫下以0.5％TritonⅩ-100將細(xì)胞處理5分鐘，在室溫下浸入10％BlockAce(Dainippon Pharmaceutical)中阻斷1小時。接著，將細(xì)胞在室溫下與作為一級抗體的稀釋500倍的兔抗-λ噬菌體血清(得自Dr.Hideyuki Ogawa,Osaka University)進(jìn)行反應(yīng)1小時，然后與作為二級抗體的FITC-標(biāo)記的抗免IgG(6微克/毫升)在室溫下反應(yīng)1小時，用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞中具核定位信號的λ噬菌體的定位。結(jié)果證實(shí)具核定位信號的噬菌體在微注射之后立刻轉(zhuǎn)位到了細(xì)胞核(圖2，左上)，在微注射30分鐘之后仍然保留在細(xì)胞核周圍(圖2，右上)。在本實(shí)驗中對照使用的是未修飾的λ噬菌體(該噬菌體不具有核定位信號)，在微注射后噬菌體立刻分散于細(xì)胞質(zhì)中(圖2，左下)，在30分鐘之內(nèi)均勻彌散(圖2，右下)。實(shí)施例4核定位信號在噬菌體頭部的表面暴露的分析將合成SV40大T抗原的N末端的半胱氨酸殘基與SulfoLink Gel(Pierce)進(jìn)行交聯(lián)以制備固定柱(2毫升，5厘米)。用飽和硫酸銨對10毫升的抗-SV40LT-兔血清進(jìn)行處理，并在偶聯(lián)緩沖液(50毫摩爾/升Tris-HCl(pH8.5)，5毫摩爾/升EDTA-Na)中通過透析進(jìn)行平衡。并將其置于柱上，結(jié)合抗體以0.1摩爾/升Gly-HCl(pH2.5)洗脫，并以0.5毫升每份分餾，洗脫的餾分用0.5毫升的2摩爾/升Tris-HCl(pH8.0)中和。將如此所得的10毫克親和純化抗體與3×108分子的表達(dá)SV40大T抗原的80％基因組噬菌體(此后被稱為“LT-噬菌體”)于4℃反應(yīng)過夜。在其中加入100毫升的蛋白質(zhì)A-Sepharose4B(Pharmacia,50％懸浮液)，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)吸收1小時，于5000rpm離心5分鐘，用大腸桿菌LE 392在上清中測定未吸收性噬菌體的滴度。作為對照，用相似的方法對僅表達(dá)gpD蛋白的噬菌體進(jìn)行了分析。此外，用兔γ球蛋白取代抗-SV40LT兔血清進(jìn)行了相似的分析，同樣也未使用這些抗體(表4)。
表4
結(jié)果表明絕大部分“LT-噬菌體”都有暴露于其頭部表面的NLS，其滴度大約下降1/10證實(shí)了這一點(diǎn)(從3×108到2.4×107)。實(shí)施例5其頭部表面暴露有核定位信號的λ噬菌體的核轉(zhuǎn)位活性將可以表達(dá)SV40大T抗原和gpD之間的融合蛋白的質(zhì)粒導(dǎo)入以80％基因組D琥珀噬菌體溶源化的大腸桿菌TOP10中。于32℃下將細(xì)菌在LB培養(yǎng)基(10毫摩爾/升MgSO4、100微克/毫升氨芐青霉素)中進(jìn)行培養(yǎng)，對數(shù)生長期(2×108細(xì)胞/毫升)時在45℃振搖20分鐘以誘導(dǎo)噬菌體產(chǎn)生。然后將培養(yǎng)物在有1毫摩爾/升IPTG存在的情況下在39℃振搖3小時，于5000rpm離心10分鐘，并將沉淀的大腸桿菌細(xì)胞重新懸浮于λ緩沖液(10毫摩爾/升Tris-HCl(pH7.5),10毫摩爾/升MgSO4,0.01％明膠，10毫摩爾/升腐胺)中。在37℃時加入氯仿并攪拌以使?jié)饪s的細(xì)菌裂解。而且，在溶液中加入了DNase，并在8000rpm離心30分以除去不溶物。在上清中加入10％的聚乙二醇#6000和1摩爾/升NaCl，在0℃處理2小時，并于8000rpm離心30分以沉淀噬菌體。將該噬菌體重新懸浮于λ-緩沖液中，所回收到的噬菌體粒子通過氯化銫密度梯度超離心進(jìn)行純化。
將噬菌體粒子溶于λ緩沖液中直至2毫克/毫升，并以與實(shí)施例3(3)相同的方式進(jìn)行微注射。將以野生型λ噬菌體與弗倫德(Freund′s)佐劑敏化的兔子制備的血清作為一級抗體用于檢測。結(jié)果證實(shí)雖然作為對照的野生型λ噬菌體未表現(xiàn)出核轉(zhuǎn)位活性(圖3，上)，具核定位信號的λ噬菌體在30分鐘之內(nèi)在細(xì)胞核中積累(圖3，下)。工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了能夠包裝大分子例如長鏈DNA并具有核轉(zhuǎn)位活性的具有核定位信號的λ噬菌體。該噬菌體例如能夠?qū)⑺Ｍ耐庠椿?，如包括上游區(qū)的長鏈DNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中，因此其可望能在例如闡明生物學(xué)現(xiàn)象和基因治療的各個領(lǐng)域中有效地應(yīng)用。
序列表序列編號1序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述序列編號1Lys Met Ala Pro Thr Lys Arg Lys Gly Ser Ala pro Gly Ala Ala Pro Lys Lys1 5 10 15Pro Lys20序列編號2序列長度33序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述序列編號2Tyr Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr pro pro Lys Lys Lys1 5 10 15Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Asp phe Glu Ser Glu Leu Leu Ser20 25 30序列編號3序列長度30序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述序列編號3Lys Lys Asp Lys Asp Gly Glu Gly Ala Pro pro Ala Lys Lys Leu Arg Met Asp1 5 10 15Gln Met Glu Ile Asp Ala Gly pro Arg Lys Arg Pro序列編號4序列長度7序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述序列編號4pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 5序列編號5序列長度26序列類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型其它核酸，合成DNA序列描述序列編號5GTAAGCCATG GTTATGACGA GCAAAG 26序列編號6序列長度32序列類型核酸鏈型雙鏈拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型其它核酸，合成DNA序列描述序列編號6GTTCGAATTC CTATTAAACG ATGCTGATTG CC 3權(quán)利要求
1．噬菌體或其頭部，具有作為其頭部一個組分的包含核定位信號的蛋白質(zhì)。
2．權(quán)利要求1的噬菌體或其頭部，其中所說的核定位信號包含SEQ IDNO:1到SEQ ID NO:4中的任何一段序列。
3．權(quán)利要求1的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
4．權(quán)利要求3的噬菌體或其頭部，其中所說的含有核定位信號的蛋白質(zhì)是核定位信號和噬菌體頭部蛋白質(zhì)的融合蛋白。
5．權(quán)利要求4的噬菌體或其頭部，其中所說的噬菌體頭部蛋白質(zhì)是λ噬菌體的D蛋白。
6．核定位信號和形成噬菌體頭部的蛋白質(zhì)的融合蛋白。
7．權(quán)利要求6的融合蛋白，其中所說的核定位信號包括SEQ ID NO:1到SEO ID NO:4中的任何一段序列。
8．權(quán)利要求6的融合蛋白，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
9．權(quán)利要求6的融合蛋白，其中所說的噬菌體頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白。
10．編碼權(quán)利要求的6到9中任一個蛋白質(zhì)的DNA。
11．含有權(quán)利要求10的DNA的載體。
12．?dāng)y帶權(quán)利要求11的載體的細(xì)菌宿主。
13．權(quán)利要求12的細(xì)菌宿主，其中所說的宿主是大腸桿菌。
14．用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的試劑盒，其中所說試劑盒含有(a)(12)或(13)的細(xì)菌宿主，和(b)從其上已衍生出包含于在所說宿主中表達(dá)的融合蛋白中的頭部蛋白的噬菌體，其中所說噬菌體在所說細(xì)菌宿主中不能表達(dá)所說的頭部蛋白。
15．權(quán)利要求14的試劑盒，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
16．權(quán)利要求14的試劑盒，其中所說的包含于在細(xì)菌宿主中表達(dá)的融合蛋白中的頭部蛋白是λ噬菌體的D蛋白。
17．將所需物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到目的細(xì)胞的核中的方法，所說方法包括(a)將要被轉(zhuǎn)位至核中的目的物質(zhì)包裝到權(quán)利要求1的噬菌體或其頭部中，和(b)將所說噬菌體或其頭部導(dǎo)入所需細(xì)胞中。
18．權(quán)利要求17的方法，其中所說的目的物質(zhì)是核酸。
19．權(quán)利要求17的方法，其中所說的噬菌體是λ噬菌體。
20．權(quán)利要求17的方法，其中所說的細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
全文摘要
通過構(gòu)建能表達(dá)組成λ噬菌體頭部的gpD蛋白和核定位信號序列的融合蛋白的載體,并用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌,并且在此轉(zhuǎn)化體中對在不能在大腸桿菌中表達(dá)gpD蛋白的突變λ噬菌體進(jìn)行增殖而得到具核定位信號的λ噬菌體。已證明所得的λ噬菌體能夠包裝80%到100%基因組的λ噬菌體DNA。在進(jìn)一步確證了核定位信號暴露于該噬菌體頭部的外面之后,將該噬菌體微注射到細(xì)胞中以分析其核定位活性。因此已闡明該噬菌體具有核定位活性。
文檔編號C12N7/01GK1234832SQ96180464
公開日1999年11月10日 申請日期1996年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月9日
發(fā)明者中西真人, 名越繪美, 芥照夫, 武田勝男, 長谷川護(hù) 申請人:株式會社載體研究所