專利名稱：包含噬菌體納米顆粒的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含噬菌體的新方法和組合物。更具體地，本發(fā)明包括為有效的抗原和外來顆粒呈遞獨特設計的新的和定制的T4噬菌體。本發(fā)明的方法和組合物可以用于有效的疫苗送遞系統(tǒng)。
背景技術：
在噬菌體展示中，將外來肽、結(jié)構(gòu)域或蛋白融合到結(jié)構(gòu)蛋白上，并暴露于噬菌體殼體的外表面(Smith，1985)。絲狀噬菌體的外殼蛋白(M13，fd，和fl)、小外殼蛋白pIII(4-5拷貝)，和大外殼蛋白pVIII(2700拷貝)，已經(jīng)被廣泛地用于產(chǎn)生長度為6-8個氨基酸的肽的組合文庫(Smith和Petrenko，1997；Manoutcharian等，2001)。還已經(jīng)開發(fā)了使用二十面體噬菌體λ和T7的其它展示系統(tǒng)(Maruyama等，1994；Danner和Belasco，2001)。這些系統(tǒng)可以展示更大的肽和結(jié)構(gòu)域，甚至源自靶克隆或cDNA文庫的全長蛋白(Hoess，2002)。外殼體蛋白gpD(420拷貝)(Sternberg和Hoess，1995)和噬菌體λ的尾蛋白gpV(Maruyama等，1994)，和噬菌體T3/T7的大殼體蛋白gp10，已經(jīng)被用于展示外來序列。通過″生物淘選″和隨后的擴增(Scott和Smith，1990；Smith andPetrenko，1997)，可以將極少數(shù)具有特定生物功能的肽從這些文庫中“釣出”。表型和基因型之間的關聯(lián)，即在噬菌體外展示的肽和在相同噬菌體內(nèi)編碼它的DNA之間的物理關聯(lián)，允許快速描繪生物學上令人感興趣的肽序列。
盡管這些展示系統(tǒng)可用，這些系統(tǒng)的應用中存在明顯限制。例如，使用絲狀噬菌體，某些肽的展示會受到限制，或不可行，因為融合的肽必須經(jīng)大腸桿菌膜分泌，作為噬菌體組裝裝置的一部分。由于pIII和pVIII都是噬菌體組裝所必需的，難以展示大結(jié)構(gòu)域或全長蛋白，且不妨礙它們的基本生物功能。在展示大肽序列的情況下，它們的單位噬菌體殼體的拷貝數(shù)顯著減少，且不可預知。噬菌體λ和T3展示系統(tǒng)遇到了類似的大小和拷貝數(shù)問題。經(jīng)常必須使用輔助噬菌體或琥珀型突變體的部分遺傳阻遏，整合野生型蛋白分子和重組體，以產(chǎn)生有活力的噬菌體(Hoess，2002；Manoutcharian等，2001；Maruyama等，1994)。
現(xiàn)有噬菌體展示系統(tǒng)的另一個嚴重限制是，它們是基于體內(nèi)的，因為重組分子組裝到殼體上，作為噬菌體感染循環(huán)的一部分。在這些系統(tǒng)中，細胞環(huán)境中的許多變量會影響組裝過程，導致產(chǎn)生的噬菌體顆粒的質(zhì)量的極大變異性。非常少的控制可以施加到組裝過程上，不同制備物之間的拷貝數(shù)可以以使這些系統(tǒng)高度不可預知的量級變化。
展示的抗原的大小和拷貝數(shù)對于疫苗開發(fā)是特別關鍵的變量；因而，使用噬菌體展示來建立實用疫苗的努力已經(jīng)受到很大的限制。理想的噬菌體疫苗應當能高密度地展示全長抗原或抗原的所需表位，無需明顯限制大小。它也允許以確定的方式操作展示平臺，以產(chǎn)生可再現(xiàn)質(zhì)量的顆粒。需要第一個噬菌體系統(tǒng)，其允許使用噬菌體T4顆粒，有效地和控制地展示全長抗原或靶抗原的表位。也需要噬菌體系統(tǒng)，其可以定制得到特異性的免疫應答，例如能產(chǎn)生對超過一種抗原或外來顆粒的免疫應答的噬菌體系統(tǒng)。
噬菌體T4已經(jīng)用于開發(fā)多組分疫苗。噬菌體T4的殼體是扁長的(伸長的)二十面體(Eiserling，1983；Black等，1994)，其直徑約86nm，長約119.5nm(Foldne等，2004；

圖1)。它包含930拷貝單個的大殼體蛋白gp23*(46kDa；圖1中的藍色結(jié))。殼體也包含2個位于頂角的小殼體蛋白。12個頂角中的11個包含約55拷貝(在每個頂角有一個五鄰體)的小殼體蛋白gp24*(42kDa；圖1中的洋紅色結(jié))。第12個頂角包含約12個相同拷貝(十二面體)的小殼體蛋白gp20(61kDa；圖1未顯示)。該頂角也稱作門頂角，因為它用作T4 DNA的進入點和出口點。
結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證實，2種額外的蛋白，即Hoc(高抗原性外殼體蛋白，40kDa)和Soc(小外殼體蛋白，9kDa)(圖1)，在完成殼體組裝后添加到殼體上(Steven等，1976；Yanagida，1977；Ishii和Yanagida，1975和1977；Ishii等，1978，Iwasaki等，2000)。根據(jù)Fokine等(2004)報道的最新的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，Hoc以最高達155拷貝/殼體顆粒存在，而Soc以最高達810拷貝/殼體顆粒存在。最重要的是，這些蛋白不是必需的。在正常實驗條件下，任一個基因或兩個基因的突變，不會影響噬菌體生產(chǎn)，噬菌體成活力，噬菌體感染性，或噬菌體穩(wěn)定性。但是，在極端環(huán)境條件下(例如，pH＞10.6，滲透壓休克)，Hoc和Soc能為殼體提供額外的穩(wěn)定性。
當其它人首次報道Hoc和Soc時，認為這些蛋白代表新的且令人感興趣的類別的外殼體蛋白，其能形成外“罩/盔甲”，以保護處在生命周期的細胞外階段的病毒。然而，從它們的發(fā)現(xiàn)以后，沒有證實其它的噬菌體/病毒系統(tǒng)具有這樣的非必需的、高拷貝數(shù)的、高抗原性的、相對容易操作的外殼體基因。
Hoc和Soc蛋白的一個有用的特征是，人們可以將外來蛋白或蛋白片段融合到Hoc和Soc的N-和C-末端，而不影響T4噬菌體功能。實際上，Hoc和Soc融合蛋白的展示不會影響噬菌成活力或感染性(Jiang等，1997；Ren等，1996；Ren和Black，1998)。大多肽鏈和全長蛋白已經(jīng)被融合到Hoc和Soc，且在T4殼體表面上成功地展示。它們包括Por-A環(huán)-4肽(4kDa)，HIV-gp120 V3環(huán)(5kDa)，可溶的CD4-受體(20kDa)，抗-卵清溶菌酶結(jié)構(gòu)域(32kDa)，和脊髓灰質(zhì)炎病毒VP1(35kDa)，(Jiang等，1997；Ren等，1996；Ren和Black，1998)。此外，外來蛋白可以穩(wěn)定地在殼體上展示，且可以在4℃或在高鹽濃度存在下保存數(shù)周(Jiang等，1997；Ren等，1996)。T4重組納米顆粒能在小鼠中引起針對展示的抗原的高滴度抗體。
以前的策略已經(jīng)使用不可預知的體內(nèi)裝載外來蛋白到噬菌體殼體上。這已經(jīng)成為使用噬菌體M13，λ，T7和T4的噬菌體展示領域的流行范例。在一個體內(nèi)策略中，蛋白首先在大腸桿菌中表達，然后隨著hoe-soc-病毒的感染，裝載到T4上(Jiang等，1997)。在第二個體內(nèi)策略中，通過重組交換，將融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進T4噬菌體基因組中，在T4感染的過程中，表達融合蛋白，并裝載到噬菌體T4上；在該策略中，重組基因和基因產(chǎn)物變成噬菌體T4生命周期的一部分(Jiang等，1997；Ren等，1996)。體內(nèi)裝載系統(tǒng)的一個主要缺點是，展示的抗原的拷貝數(shù)的變異性。這主要是由于抗原體內(nèi)組裝的變化，對其幾乎難以控制。例如，感染的細胞中的重組抗原的表達水平隨營養(yǎng)和環(huán)境條件極大地變化。另外，組裝過程對非特異性的細胞內(nèi)蛋白水解是敏感的。另外，細胞內(nèi)環(huán)境的許多組分之間的相互作用，使它成為不太明確的生產(chǎn)具有一致質(zhì)量的均勻顆粒的過程。
已經(jīng)概念化了多種基于Hoc和Soc的組裝平臺。例如，在授予Mattson的美國專利號6,500,611中，發(fā)明人描述了將報道基團連接到病毒殼體上的一般概念，其中報告部分能通過連接分子識別分析物。但是，Mattson不能實現(xiàn)將外來蛋白裝載到T4噬菌體殼體上的特異性的方法。另外，Mattson沒有證實或提出，大全長殼體蛋白可以以高密度裝載到殼體表面上。而且，Mattson沒有教導或提出T4納米顆粒疫苗組合物，或任意的這樣的組合物可以用作引起免疫原應答的多組分平臺。
在Ren等，Protein Science，Sep；5(9)，1833-43(1996)的研究中，作者討論了Soc融合蛋白向稱作聚合頭部的基于殼體的聚合物的結(jié)合。該聚合頭部模型特別不適用于開發(fā)確定的組裝平臺和疫苗組合物。最重要的是，聚合頭部不是確定的顆粒。然而，這些聚合物起因于噬菌體T4大殼體蛋白gp23的失控生長，并在它們制備后作為顆粒的非均質(zhì)混合物存在。例如，為了均勻地具有Hoc和Soc結(jié)合位點，必須在含有噬菌體T4前頭部蛋白酶的粗提物存在下，體外切割聚合頭部聚合物，以打開Hoc和Soc的結(jié)合位點。后者也需要“聚合頭部擴充”，即能識別殼體蛋白聚合物和建立Hoc和Soc結(jié)合位點的急劇構(gòu)象變化。得到的切割的、擴充的聚合頭部，會在聚合頭部的結(jié)構(gòu)上非均質(zhì)的混合物上，具有不明確數(shù)目的Hoc和Soc結(jié)合位點，所述聚合頭部的長度可以任意變化，從數(shù)納米至數(shù)微米。與T4噬菌體顆粒不同，這些聚合頭部包含平坦的二維結(jié)構(gòu)；它們含有不同大小和尺寸的gp23聚合物的片、密閉片(管)和破裂片等。鑒于聚合頭部模型的這種變異性，使用過度的實驗，不能準確地確定在顆粒上可得到的結(jié)合位點的數(shù)目。因而，如果可能，控制聚合頭部上的外來抗原的拷貝數(shù)會非常困難。另外，因為它們的形狀，聚合頭部不能包裝DNA，因而不能用于本領域已知的激發(fā)-加強策略。
需要用于定制噬菌體的有效的組合物和方法。定制的噬菌體可以用于建立包含定制的噬菌體顆粒的疫苗系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)能設計特異性的噬菌體顆粒，其能引起針對一種或多種抗原或外來顆粒的免疫應答。優(yōu)選地，這樣的系統(tǒng)應當容易生產(chǎn)和施用。
還需要能將特異性的抗原或顆粒靶向暴露或送遞給靶細胞的組合物和方法。
還普遍需要用于生產(chǎn)抗體的組合物和改良的方法。這些組合物和方法應當能以適用于治療和診斷制劑的方式容易地且經(jīng)濟地生產(chǎn)。
發(fā)明簡述本發(fā)明包含用于生產(chǎn)定制的噬菌體顆粒的有效的組合物和方法。這樣的系統(tǒng)能設計特異性的噬菌體顆粒，后者能引起針對一種或多種抗原或外來顆粒的免疫應答，且可以用于建立新的疫苗送遞系統(tǒng)。另外，這樣的系統(tǒng)容易生產(chǎn)和施用。
本發(fā)明的獨特的組合物和方法能實現(xiàn)噬菌體顆粒的定制，從而可以特異性地控制在噬菌體上展示的一個抗原(或多個抗原)的數(shù)目和選擇。這樣，根據(jù)要處理的狀況，可以定制根據(jù)本文所述的方法構(gòu)建的噬菌體，且可以含有特定數(shù)目的抗原，和/或一個特定抗原(或多個抗原)的特定表位。在某些實施方案中，可以將標記整合到噬菌體上。在某些其它的實施方案中，可以定制噬菌體以便產(chǎn)生針對超過一種疾病的免疫應答，其中這樣的疾病可以在時間上臨近地出現(xiàn)(例如，可以定制噬菌體用于治療人免疫缺陷病毒感染以及分支桿菌感染，因為AIDs和結(jié)核病經(jīng)常幾乎同時發(fā)生)。
本發(fā)明的疫苗系統(tǒng)也能將特異性的抗原或顆粒暴露或送遞給靶細胞。
本發(fā)明也包含改良的生產(chǎn)抗體的方法。
本發(fā)明包含定制的噬菌體顆粒和制備它們的方法，其中這樣的方法能以適用于治療和診斷用途的方式容易地且經(jīng)濟地生產(chǎn)。
本發(fā)明通過允許可預測地和大規(guī)模地體外構(gòu)建確定的T4噬菌體納米顆粒，克服了與噬菌體顆粒的生產(chǎn)有關的以前的體內(nèi)限制。
與以前的聚合頭部模型不同，本體外裝載系統(tǒng)使用特別確定的T4噬菌體顆粒。更具體地，本發(fā)明允許以特異的和確定的方式，將Hoc和/或Soc融合蛋白裝載到T4噬菌體顆粒上，以建立許多種T4噬菌體納米顆粒，其可以用于多種不同的用途。
本發(fā)明提供了新的體外系統(tǒng)，其能實現(xiàn)T4殼體表面的全身實驗和定制。本文所述的體外系統(tǒng)能制備具有可再現(xiàn)的生物活性的確定的顆粒。重要的是，本文所述的噬菌體構(gòu)建方法能達到以流水線形式構(gòu)建多組分疫苗的特定目的實現(xiàn)基因在短時間段內(nèi)(例如，1-2周)向展示的納米顆粒的轉(zhuǎn)換。
在某些實施方案中，可以制備沒有任何DNA的噬菌體或納米顆粒(空殼體)，或在T4基因組中具有克隆的相同外來DNA(激發(fā)-加強策略)。
本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)允許定制的T4噬菌體納米顆粒的迄今為止不可得到的可靠的和大規(guī)模的生產(chǎn)。
本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)也允許生產(chǎn)T4納米顆粒，其能將大分子呈遞到T4噬菌體表面上。這些分子可以引起強烈的體液的和/或細胞介導的應答。
通過組合展示表面抗原和在噬菌體基因組內(nèi)具有編碼抗原蛋白的DNA構(gòu)建體的本發(fā)明的T4納米顆粒，本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)提供了激發(fā)-加強免疫的方法。
因此，本發(fā)明的一個目的是，提供用于新的和定制的噬菌體的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個目的是，提供包含定制的噬菌體的疫苗送遞系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個目的是，提供包含噬菌體的疫苗送遞系統(tǒng)，其中用特異性的抗原、抗原表位、標志物、標記、蛋白、外來顆粒等，定制這樣的噬菌體。
本發(fā)明的另一個目的是，提供疫苗送遞系統(tǒng)，其包含納米顆粒，后者具有特別確定的尺寸和裝載融合蛋白等實體的能力。
本發(fā)明的另一個目的是，提供疫苗送遞系統(tǒng)，其包含納米顆粒，后者進行了定制，用于引起一種或多種特異性的免疫應答。
本發(fā)明的另一個目的是，提供定制的送遞載體，其能將特定抗原或其它分子呈遞、暴露或送遞給需要的靶。
本發(fā)明的另一個目的是，提供新的疫苗送遞系統(tǒng)，其可以肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、透皮、口服或皮下施用。
本發(fā)明的另一個目的是，提供單個的T4納米顆粒，其能提供針對單一或多種疾病的基于免疫的保護。
本發(fā)明的另一個目的是，提供單個的疫苗組合物，其能提供針對許多不同疾病的基于免疫的保護。
本發(fā)明的另一個目的是，提供T4納米顆粒組合物，其能展示大的抗原性分子和引起對這些分子的免疫應答。
本發(fā)明的另一個目的是，提供激發(fā)-加強免疫的方法，其中T4噬菌體顆粒能送遞展示在噬菌體顆粒表面上的抗原以及編碼各種抗原分子的DNA構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個目的是，提供T4噬菌體組裝平臺，許多分子可以依靠它進行相互作用，以暴露不同的抗原結(jié)構(gòu)域，或生成其它的抗原性分子。
閱讀下面公開的實施方案的詳細描述和所附權利要求書后，可以明白本發(fā)明的這些和其它目的，特征和優(yōu)點。
附圖簡述圖1簡要描述了噬菌體T4殼體的冷凍-EM重構(gòu)的顏色編碼的表面圖示(a)垂直于5-折疊軸的視圖。gp23*顯示為藍色，gp24*為洋紅色，Soc為白色，Hoc為黃色，尾為綠色；(b)門頂角朝向觀察者，沿著5-折疊軸的視圖；重構(gòu)的尾部分顯示為綠色。該圖從Fokine等，2004[現(xiàn)有技術]重新制作。
圖2簡要描述了本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)和得到的展示重組抗原的T4噬菌體納米顆粒。
圖3(A)提供了如正文所述的HIV-p24-Hoc融合構(gòu)建體的示意圖。P24是HIV殼的大殼體亞基，該HIV殼包圍著感染必需的HIV基因組的2個分子和其它蛋白(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶)和核酸(例如，色氨酸t(yī)RNA引物)組分。(B)顯示了p24-Hoc蛋白的表達和純化。
圖4顯示了HIV-p24-Hoc在hoc-soc-T4噬菌體顆粒上的體外組裝，以建立p24T4納米顆粒。
圖5顯示了p24-Hoc結(jié)合hoc-soc-T4納米顆粒的特異性。
圖6解釋了在hoc-soc-T4納米顆粒上展示的p24-Hoc的穩(wěn)定性。
圖7(A)Hoc-p24融合構(gòu)建體的示意圖。(B)Hoc-p24蛋白的表達和純化。
圖8解釋了(A)HIVtat-Hoc和(B)HIVnef-Hoc(箭頭)在hoc-soc-噬菌體T4納米顆粒上的體外組裝。
圖9顯示了炭疽PA-Hoc在T4噬菌體納米顆粒上的體外組裝。
圖10顯示了多種抗原在hoc-soc-T4納米顆粒上的體外組裝(A)tat-Hoc和p24-Hoc；(B)nef-Hoc和p24-Hoc；(C)tat-Hoc，nef-Hoc，和p24-Hoc。
圖11顯示了在免疫后不同的時間點展示在T4納米顆粒上的p24的免疫原性。
圖12顯示了T4-展示的PA-Hoc的免疫原性。
圖13證實，p24-T4納米顆粒能引起強烈的細胞應答。
詳細描述參考下面詳細描述的本文包含的特定具體實施方案，可以更容易地理解本發(fā)明。盡管已經(jīng)參考其某些實施方案的特定細節(jié)，描述了本發(fā)明，并不意味著這些細節(jié)應當視作對本發(fā)明的范圍的限制。在本文中提及的參考文獻的完整文本，在此整體引作參考，包括2003年12月17日提交的美國臨時申請系列號60/530,527。
目前可得到的基于噬菌體的疫苗系統(tǒng)是有限的，因為它們不能根據(jù)展示的抗原的體積或特性被定制。本發(fā)明是第一個噬菌體系統(tǒng)，其能使用噬菌體T4顆粒，實現(xiàn)多種抗原(包括全長重組抗原)的有效且控制的展示。本文所述的生產(chǎn)定制的T4噬菌體納米顆粒的組合物和方法，能生產(chǎn)獨特的特異性的疫苗。另外，本發(fā)明的T4噬菌體納米顆粒是特別合乎需要的，因為它們能促進免疫應答，而單個的蛋白或其它分子不能。
本發(fā)明包含定制的T4噬菌體納米顆粒和體外制備T4噬菌體納米顆粒的方法。更具體地，制備T4噬菌體納米顆粒的方法包含體外組裝系統(tǒng)，其使用融合到另一種分子上的hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒和Hoc和/或Soc蛋白或其片段。該分子可以包含具有化學和/或生物活性的任何分子，包括但不限于蛋白，蛋白片段，氨基酸，抗原，脂類，抗體，碳水化合物，酶，細胞因子或趨化因子或其它炎癥介質(zhì)。通過本領域的技術人員已知的任何方法，可以將分子融合到Hoc和/或Soc上。當該分子融合到Hoc和/或Soc蛋白或其片段上時，得到的產(chǎn)物包含Hoc和/或Soc融合分子。在本發(fā)明的一個實施方案中，融合到Hoc和/或Soc上的分子是蛋白，例如外來蛋白，從而建立Hoc和/或Soc融合蛋白。圖2解釋了體外組裝系統(tǒng)的一個實施方案和得到的T4納米顆粒。在圖2中，建立了Hoc和/或Soc融合蛋白，其包含外來抗原(顯示為紅色)和Hoc和/或Soc蛋白(顯示為藍色)。純化后，這些Hoc和/或Soc融合蛋白與純化的hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒相組合。得到的T4納米顆粒能展示，例如，融合到Hoc(在T4納米顆粒中顯示為黃色結(jié))上的外來抗原(紅色結(jié))。在該圖中解釋的T4納米顆粒源自soc-T噬菌體(Andrei Fouine和Michael Rossmann博士，Purdue University贈送)的冷凍-EM重構(gòu)。
為了建立本發(fā)明的Hoc和/或Soc融合蛋白實施方案，將Hoc和/或Soc蛋白或其片段的N-或C-末端融合到蛋白等外來分子或?qū)嶓w。在本發(fā)明的某些實施方案中，將六組氨酸標志序列添加到融合蛋白的N-末端，以允許通過Ni-瓊脂糖柱色譜單步純化蛋白-Hoc和/或Soc重組蛋白。本領域的技術人員能認識到，代替六組氨酸-標志，可以使用許多其它的本領域已知用于純化重組蛋白的標志，包括但不限于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，F(xiàn)LAG，血凝素(HA)，和綠熒光蛋白(GFP)。本發(fā)明還包含外來蛋白和Hoc或Soc蛋白之間的通用連接序列。在某些實施方案中，連接物是無結(jié)構(gòu)的連接物。盡管不希望受下面理論的約束，認為連接序列能使外來蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)oc或Soc折疊或向殼體表面的組裝的干擾最小化，反之亦然。在某些實施方案中，無結(jié)構(gòu)的連接物優(yōu)選地包含聚甘氨酸連接物(pro-gly-gly)，但是許多本領域已知的具有不同長度和序列的連接物(有結(jié)構(gòu)的和無結(jié)構(gòu)的)可以與本發(fā)明相容。
使用許多方法，可以構(gòu)建本發(fā)明的Hoc和/或Soc融合蛋白實施方案。本領域的技術人員能明白，多種遺傳和蛋白工程方法可用于構(gòu)建Hoc和/或Soc融合蛋白。例如，通過重疊延伸(SOE)策略，可以使用PCR-指導的剪接，以構(gòu)建編碼需要的融合蛋白的基因構(gòu)建體(Kuebler和Rao，1998；Rao和Mitchell，2001)。該策略需要4種寡核苷酸(引物1-4)和3個連續(xù)的PCR，且是構(gòu)建重組構(gòu)建體的快速、有力的策略。使用該策略，可以構(gòu)建相當復雜的基因構(gòu)建體，并在一天中完成多個基因融合。為了包含根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案的六組氨酸標志序列，可以將基因構(gòu)建體框架內(nèi)插入T7表達載體的六組氨酸標志。
本發(fā)明的T4噬菌體顆粒包含確定的扁長的(伸長的)二十面體，其直徑約70-140nm，長約90-150nm。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明包含T4噬菌體顆粒，其包含確定的扁長的(伸長的)二十面體，其直徑約86nm，長約119.5nm。為了允許Hoc和/或Soc結(jié)合T4噬菌體顆粒的殼體，本發(fā)明使用hoc-和/或soc-T4噬菌體突變體，其不能表達Hoc和/或Soc蛋白；因而，該突變體在它的殼體表面不含有Hoc和/或Soc蛋白。通過本領域已知的多種方法(Karam，J.D.(編)，MolecularBiology of Bacteriophage T4.ASM Press，Washington，D.C中的附錄)，可以實現(xiàn)建立hoc-和/或soc-T4噬菌體突變體的方法。為了用于本發(fā)明的體外系統(tǒng)，需要分離hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒，且應當是基本上純的。通過本領域已知的任何方法，可以分離這些T4噬菌體顆粒，但是通過例如如Aebi等，1976，和Mooney，D.T.，等(1987)J Virol.61，2828-2834所述的蔗糖梯度純化，可以達到足夠的分離和純化。
純化根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案的Hoc和/或Soc融合蛋白和分離hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒后，通過新的體外組裝系統(tǒng)，將純化的Hoc和/或Soc融合蛋白組裝或“裝載”到純化的hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒上，以建立T4納米顆粒。裝載包含將Hoc和/或Soc融合蛋白置于hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒附近，以便Hoc和/或Soc蛋白結(jié)合T4噬菌體殼體表面。為了促進Hoc和/或Soc融合蛋白向hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒的裝載，將純化的組分在反應緩沖液中溫育約1-120min，優(yōu)選約20-90min，更優(yōu)選約40-70min，更優(yōu)選約30-60min。在該溫育階段中，反應緩沖液溫度可以變化，但是優(yōu)選地是約25-45℃，更優(yōu)選約32-42℃，更優(yōu)選約37℃。關于反應緩沖液，本領域已知的許多緩沖液可以與本發(fā)明相容。例如，合適的反應緩沖液可以包含Tris緩沖鹽水，其pH為7-8，或優(yōu)選地，pH為7.2-7.8，更優(yōu)選地，pH為7.3-7.5，更優(yōu)選地，pH為約7.4。其它合適的反應緩沖液可以包括本領域的技術人員已知的那些，例如，磷酸鹽緩沖鹽水，hepes緩沖液等，其在許多鹽濃度，和/或在有許多緩沖組分，例如甘油，蔗糖，離子和非離子型去污劑。
將Hoc和/或Soc融合蛋白與hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒在反應緩沖液中溫育后，通過本領域的技術人員已知的方法，從反應緩沖液取出Hoc和/或Soc融合蛋白-hoc-和/或soc-T4噬菌體納米顆粒。例如，可以在5,000-40,000rpm離心反應混合物(其包含純化的Hoc和/或Soc融合蛋白，純化的hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒，反應緩沖液，和新形成的T4納米顆粒)20-100min，優(yōu)選地在約10,000-20,000rpm離心40-80min，更優(yōu)選地在約13,000-16,000rpm離心55-65min。也可以通過柱色譜或梯度離心技術，回收顆粒。在離心或回收步驟后，拋棄含有未結(jié)合的Hoc和/或Soc融合蛋白的上清液，用反應緩沖液或其它合適的緩沖液，洗滌含有新形成的T4納米顆粒的沉淀，以去除所有未結(jié)合的融合蛋白。
本發(fā)明的T4噬菌體具有下述優(yōu)點具有確定的拷貝數(shù)的Hoc和Soc結(jié)合位點(每個顆粒結(jié)合了共約965個拷貝)。利用這樣大數(shù)量的確定的結(jié)合位點，T4噬菌體能提供獨特的平臺，依靠它，可以定制特定分子或多個分子的展示。如圖4，7，和9所示，通過在上述溫育階段之前或過程中，操縱體外組裝反應中各組分的比例(即，操縱Hoc和/或Soc融合蛋白與T4噬菌體顆粒的比例)，可以控制結(jié)合到T4噬菌體顆粒上的融合蛋白的拷貝數(shù)。實施例7解釋了該實例。類似地，通過在體外組裝系統(tǒng)中使用2種或多種Hoc和/或Soc融合蛋白，和通過調(diào)節(jié)不同的融合蛋白與T4噬菌體顆粒的摩爾比，可以控制結(jié)合到T4噬菌體顆粒上的融合蛋白的比例，以建立確定的T4納米顆粒。例如，給定的T4納米顆?？梢哉故境鯤IV抗原tat和nef以及其它融合蛋白的組合。通過在溫育階段之前或過程中，改變tat-Hoc和nef-Hoc融合蛋白與噬菌體顆粒的比例，可以相應地改變展示的融合蛋白的比例。實施例8提供了這樣的蛋白的其它細節(jié)。
使用體外組裝系統(tǒng)，可以構(gòu)建許多不同的T4納米顆粒組合物，其可以用于多種用途。例如，本發(fā)明的某些實施方案能產(chǎn)生體液的和細胞介導的免疫應答，因而可以用作單或多組分疫苗制劑。在這些不同的疫苗制劑中，Hoc和/或Soc融合蛋白的外來蛋白可以包含能在T4噬菌體顆粒表面上展示的抗原性蛋白。各種抗原包括，但不限于，白介素-1(″IL-1″)，白介素-2(″IL-2″)，白介素-3(″IL-3″)，白介素-4(″IL-4″)，白介素-5(″IL-5″)，白介素-6(″IL-6″)，白介素-7(″IL-7″)，白介素-8(″IL-8″)，白介素-10(″IL-10″)，白介素-11(″IL-11″)，白介素-12(″IL-12″)，白介素-13(″IL-13″)，脂質(zhì)A，磷脂酶A2，內(nèi)毒素，葡萄球菌腸毒素B和其它毒素，I型干擾素，II型干擾素，腫瘤壞死因子(TNF-α或β)，轉(zhuǎn)化生長因子-(″TGF-β″)，淋巴毒素，遷移抑制因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(″CSF″)，單核細胞-巨噬細胞CSF，粒細胞CSF，血管上皮生長因子(″VEGF″)，血管生成素，轉(zhuǎn)化生長因子(″TGF-α″)，熱休克蛋白，血型的碳水化合物部分，Rh因子，成纖維細胞生長因子，和其它炎癥和免疫調(diào)節(jié)蛋白，核苷酸，DNA，RNA，mRNA，有義物，反義物，癌細胞特異性的抗原；例如MART，MAGE，BAGE，和熱休克蛋白(HSP)；突變的p53；酪氨酸酶；粘蛋白，例如Muc-1，PSA，TSH，自身免疫抗原；免疫治療藥物，例如AZT；和血管發(fā)生和抗-血管發(fā)生的藥物，例如制管張素，內(nèi)皮抑制素，和堿性成纖維細胞生長因子，和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，前列腺特異性的抗原和甲狀腺刺激激素，或其片段。如上所述，通過在溫育階段之前或過程中，調(diào)節(jié)Hoc和/或Soc-抗原融合蛋白與Hoc-和/或Soc-T4噬菌體顆粒的摩爾比，可以調(diào)整T4納米顆粒，以在T4噬菌體顆粒殼體上展示單個抗原，多個抗原，和/或確定比例的抗原。見圖9和10。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使用體外組裝系統(tǒng)來建立T4納米顆粒，其能同時展示與一種或幾種傳染病相對應的多種抗原。更具體地，通過使用本文所述的體外組裝系統(tǒng)，可以在同一殼體表面上同時展示例如HIV和炭疽抗原，允許配制針對HIV和炭疽的疫苗。在另一個實施方案中，可以針對在時間上同時或臨近地表現(xiàn)的疾病和障礙，定制納米顆粒。例如，許多AIDS患者患有許多其它的疾病，例如結(jié)核病。定制的納米顆?？梢院腥嗣庖呷毕莶《疽约胺种U菌的抗原(或抗原的多種表位)。在一個替代實施方案中，可以使用體外組裝系統(tǒng)來建立T4納米顆粒，其能在同一殼體上同時展示一種或多種抗原的多個表位。
在另一個實施方案中，可以在構(gòu)建Hoc和/或Soc基因融合構(gòu)建體的過程中，在靶序列導入定點組合突變(關于組合誘變策略，見Rao和Mitchell(2001))。使用該策略，抗原突變體集合的表達和它們在T4納米顆?；蚨鄠€T4納米顆粒上的組合展示，能允許構(gòu)建多變異疫苗，其對幾種傳染性病原體株或能對宿主選擇壓力產(chǎn)生突變體的傳染性病原體(例如，HIV)是有效的。
在另一個實施方案中，可以構(gòu)建T4納米顆粒組合物，其能在它的表面上展示相互作用的分子。例如，使用本領域的技術人員已知的方法，可以構(gòu)建第一種Hoc和/或Soc融合蛋白，其包含融合到第一種外來蛋白上的Hoc和/或Soc。類似地，可以構(gòu)建第二種Hoc和/或Soc融合蛋白，其包含融合到第二種外來蛋白上的Hoc和/或Soc。通過使用本文公開的體外組裝系統(tǒng)，可以將第一種和第二種Hoc和/或Soc融合蛋白裝載到T4噬菌體顆粒表面上。在某些實施方案中，第一種和第二種外來蛋白可以分別地存在各種免疫表位。另外，第一種和第二種外來蛋白可以直接地或通過可以加入組裝反應混合物中的另一種蛋白或分子組分間接地相互作用。該實施方案的T4納米顆粒組合物可以例如為本發(fā)明的各種T4納米顆粒組合物賦予其它的免疫原性。不希望受下述理論的約束，第一種和第二種外來蛋白之間的相互作用可以例如暴露其它表位，從而增強免疫應答。在一個有關的實施方案中，第一種外來蛋白可以具有酶活性，而第二種外來蛋白可以用作第一種外來蛋白的底物或配體。在該實施方案中，第二種蛋白的切割，可以導致許多生物效應，包括但不限于在T4納米顆粒表面上展示其它的表位。另外，在這樣的實施方案中，切割的蛋白可以是例如細胞因子或趨化因子，其可以進一步調(diào)控免疫應答。盡管上面的實施方案提及第一種和第二種外來蛋白，本發(fā)明也包括類似的實施方案，其依賴于多種不同的外來蛋白。例如，第三種外來蛋白和第四種外來蛋白也可以分別地展示其它表位，和/或在T4噬菌體顆粒表面上相互作用。本領域的技術人員已知的蛋白工程技術，允許操縱用于多種特定用途的在這些實施方案中展示的分子組分的結(jié)構(gòu)和之間的距離。這是特別重要的，因為考慮的復合物能模擬或等于通過特異性的相互作用后發(fā)生的構(gòu)象轉(zhuǎn)換而體內(nèi)形成的天然復合物。這樣的復合物可能產(chǎn)生特異性的免疫應答，后者會干擾傳染性病原體和宿主細胞之間的相互作用(例如，靶宿主細胞的HIV感染)，干擾多組分毒素分子產(chǎn)生致死毒性(例如，炭疽致死毒素和水腫毒素的形成)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，T4納米顆?？梢园诙臃肿樱湔故驹诘谝粚诱故镜牡鞍咨?。在該實施方案中，Hoc和/或Soc融合蛋白可以包含第一層，和用作組裝第二層分子組分的連接的Hoc和/或Soc融合蛋白的外來蛋白。這樣，展示的第一層蛋白可以用作展示第二層蛋白的結(jié)合位點，所述第二層蛋白能與這些第一層結(jié)合位點相互作用。例如，T4納米顆粒結(jié)合的炭疽PA63可以用于捕獲炭疽致死毒素和水腫毒素(未融合到Hoc或Soc)，或融合到LF或EF的N-末端PA63結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的外來蛋白。在另一個實施方案中，可以設計靶向特定細胞或組織類型的T4納米顆粒。更具體地，通過展示Hoc和/或Soc-配體融合體，其中配體是對細胞和/或組織類型特異性的，人們可以將本發(fā)明的T4納米顆粒靶向某些細胞或組織，以引起許多選擇性的細胞或組織反應。通過本領域的技術人員已知的任意方法，可以開發(fā)這樣的Hoc和/或Soc-配體融合體分子。一旦被開發(fā)出來，可以使用本文公開的體外組裝系統(tǒng)，將Hoc和/或Soc-配體融合體分子裝載到hoc-和/或soc-T4噬菌體顆粒上，以建立能展示配體的T4納米顆粒。各種配體包括但不限于能結(jié)合CD4，趨化因子受體，GM-1受體，Toll-樣/病原體識別受體，DC-記號受體，細胞因子受體，F(xiàn)c受體，或互補受體或其片段的配體。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以使用重組DNA技術和T4遺傳學，以將外來DNA包裝進T4納米顆粒的基因組中(Rao等，1992；Clark等FEMS Immunology and Medical Microbiology 40(2004)21-26；March等Facets22(2004)1666-1671)。因而，除了在T4納米顆粒表面上展示Hoc和/或Soc融合蛋白外，編碼抗原或Hoc和/或Soc融合蛋白的外來DNA構(gòu)建體存在于T4納米顆粒中。在某些實施方案中，這種獨特的T4納米顆粒平臺技術可以用作激發(fā)-加強送遞系統(tǒng)。通常，通過質(zhì)粒DNA接種得到的免疫應答較差且不一致；因而，需要多次注射和大量的DNA和蛋白來增強免疫應答。相反地，該實施方案的T4納米顆?？梢詫⒌鞍缀虳NA組分同時送遞到同一抗原呈遞細胞，從而潛在地誘導更強烈的免疫應答。例如，使用本領域已知的噬菌體遺傳學和分子生物學技術，可以將DNA構(gòu)建體插入在強哺乳動物啟動子例如CMV(巨細胞病毒)啟動子控制下的T4噬菌體的基因組中，后者能表達包含HIV抗原nef的融合蛋白(即，該DNA構(gòu)建體能表達nef-Hoc融合蛋白)?；蛘?，通過使用特化的T4包裝系統(tǒng)(Leffers，G.和Rao，V.B.(1996)，A discontinuous headful packaging model for packaging lessthan headful length DNA molecules by bacteriophage T4.J.Mol.Biol.258，839-850)，可以用多個拷貝的連環(huán)外來DNA構(gòu)建體替代整個噬菌體T4基因組。通過在本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)中，將這些遺傳修飾的T4噬菌體與例如融合蛋白(其包含融合到HIV抗原nef上的Hoc)一起溫育，可以建立新的T4納米顆粒，其內(nèi)部包含編碼特定抗原的DNA，且對應的抗原展示在殼體表面的外面。如本領域的技術人員能明白的，可以預見該實施方案的許多組合，包括在內(nèi)部克隆且在外部表達的多個基因。
在另一個實施方案中，可以使用本發(fā)明的T4納米顆粒來實現(xiàn)免疫應答的進一步調(diào)控。例如，可以將多種炎癥介質(zhì)整合到T4納米顆粒平臺上，其能擴大免疫應答。這樣的炎癥介質(zhì)包括，但不限于，各種細胞因子，例如白介素，淋巴因子，腫瘤壞死因子，和干擾素，以及其它炎癥介質(zhì)例如趨化因子。使用本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)，可以在T4納米顆粒表面上展示這些炎癥介質(zhì)，其是全長或功能基序和結(jié)構(gòu)域，或者，在其它實施方案中，可以將編碼炎癥介質(zhì)的DNA構(gòu)建體整合進T4噬菌體的基因組中。
本發(fā)明的另一個實施方案包含缺乏包裝的DNA的T4納米顆粒。例如，通過本領域的技術人員已知的方法操縱T4遺傳學(例如，基因16和17中的包裝缺陷性突變)，可以生產(chǎn)缺乏包裝的DNA的hoc-和/或soc-T4噬菌體突變體(Rao和Black，1985)。使用本發(fā)明的體外裝載系統(tǒng)，然后可以將Hoc和/或Soc融合蛋白裝載到hoc-和/或soc-T4噬菌體突變體上，以建立缺乏DNA的T4納米顆粒。當DNA的存在是生物安全所關注的時，可以使用該實施方案的T4納米顆粒作為含有DNA的T4納米顆粒的替代物。因為該實施方案不會影響T4噬菌體殼體表面的分子成分，可以將該策略與許多本文公開的實施方案組合使用。
本發(fā)明的另一個實施方案包含多種T4納米顆粒的混合物。在該實施方案中，可以將根據(jù)本文所述的任一個實施方案的T4納米顆粒與本發(fā)明的其它的不同的T4納米顆粒相混合。例如，針對炭疽和HIV的疫苗組合物可以包含在一組T4納米顆粒上分開展示的HIV-抗原和在另一組T4納米顆粒上分開展示的炭疽抗原，每組納米顆粒都使用本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)建立。使用該方案，可以例如建立單個的多組分疫苗制劑，后者針對多種感染不同的疾病。
在另一個實施方案中，通過特異性的相互作用，采用展示的分子來檢測病原體/組分，也可以將本發(fā)明的T4納米顆粒系統(tǒng)開發(fā)成獨特的分子診斷系統(tǒng)。
在另一個實施方案中，展示的抗原可以產(chǎn)生額外的(協(xié)同的)應答，例如抗毒素效應+免疫應答。例如，展示的抗原可以同時用作抗毒素以及有效的疫苗。在炭疽孢子攻擊的情況下，抗生素治療以及疫苗施用是必需的?？股氐牧⒓词褂脮种?消除)正在發(fā)生的炭疽芽胞桿菌細菌感染的發(fā)展。但是，一部分孢子可以保留在身體內(nèi)數(shù)周(或數(shù)月)，并造成后續(xù)感染。因而，為了中和后面的感染，接種疫苗也是必需的。用展示抗毒素(例如，LF和/或EF的PA63-結(jié)合N-末端結(jié)構(gòu)域)的噬菌體T4免疫，通過妨礙致死毒素和水腫毒素的形成，可以立即中和初步感染的毒性作用。結(jié)構(gòu)域的高密度展示(在Soc-LF結(jié)構(gòu)域融合體的情況下，810個拷貝/殼體)可以用作多價毒素抑制劑，從而極大地增強結(jié)合PA63的親合力，并中和毒素形成(Nourez，M.，Kane，R.S.，Mogridge，J.，Metallo，S.，Deschatelets，P.，Sellman，B.R.，Whitesides，G.M.和Collier，R.J.(2001)Designing a polyvalent inhibitor of anthraxtoxin.Nature Biotech.19，958-961)。單獨的或與其它T4納米顆粒(例如，PA-Hoc-T4)相組合(同時施用)的相同T4顆粒，也可以用作疫苗，其能產(chǎn)生中和免疫應答，并消除由延遲的孢子萌發(fā)造成的后續(xù)感染。
制劑使用已知的技術，可以將本發(fā)明的疫苗送遞系統(tǒng)制備在生理上可接受的制劑中，例如藥學上可接受的載體中。例如，定制的噬菌體顆?？梢耘c藥學上可接受的賦形劑相組合，以形成免疫原組合物。
或者，可以在介質(zhì)中施用噬菌體顆粒，所述介質(zhì)具有對靶位點，例如腫瘤或感染的特異性。
可以以固體、液體或氣霧劑的形式施用本發(fā)明的疫苗送遞介質(zhì)。固體組合物的實例包括丸劑，乳膏，和可植入的劑量單位?？梢越?jīng)口服施用丸劑?？梢员砻娴厥┯弥委熑楦??？梢跃植康厥┯每芍踩氲膭┝繂挝唬?，在腫瘤部位，或可以植入，用于全身釋放治療組合物，例如，皮下施用。液體組合物的實例包括適于肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)注射的制劑，和適于表面和眼內(nèi)施用的制劑。氣霧劑制劑的實例包括施用到肺部的吸入制劑。
通過標準的施用途徑，可以施用噬菌體組合物。通常，通過表面、口服、直腸、鼻或腸胃外(例如，靜脈內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi))途徑，可以施用組合物。另外，可以將組合物摻入持續(xù)釋放基質(zhì)，例如可生物降解的聚合物，該聚合物植入在需要送遞的地方附近，例如，在腫瘤的部位。該方法包括施用單劑，以預定的時間間隔施用重復的劑量，和持續(xù)施用預定的時間段。
如本文使用的，持續(xù)釋放基質(zhì)是由材料制成的基質(zhì)，所述材料通常是能通過酶或酸/堿水解或通過溶解降解的聚合物。一旦插入身體，酶和體液會作用于基質(zhì)。需要的持續(xù)釋放基質(zhì)選自生物相容的材料，例如脂質(zhì)體，聚交酯(聚交酯酸)，聚乙醇酸交酯(乙醇酸的聚合物)，聚交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)，聚酐，聚(正)酯，多肽，透明質(zhì)酸，膠原，硫酸軟骨素，羧酸，脂肪酸，磷酯，多糖，核酸，多氨基酸，氨基酸例如苯丙氨酸，酪氨酸，異亮氨酸，多核苷酸，聚乙烯基丙烯，聚乙烯吡咯酮和硅酮。優(yōu)選的可生物降解的基質(zhì)是聚交酯、聚乙醇酸交酯或聚交酯共乙交酯(乳酸和乙醇酸的共聚物)之一的基質(zhì)。
疫苗組合物的劑量依賴于待治療的狀況，使用的具體組合物，和其它臨床因素，例如患者的體重和狀況，和施用途徑。
待治療的疾病和狀況本文所述的方法和組合物可以用于治療人和動物疾病和過程，包括但不限于細菌性疾病，真菌性疾病，立克次氏體病，衣原體病，病毒性疾病，寄生蟲感染，性傳播疾病，結(jié)節(jié)病，和朊病毒病。本文所述的方法和組合物也可以用于治療需要免疫應答的任何疾病或障礙。
下面的實施例解釋了本發(fā)明的各種實施方案和方面，但不應當理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。盡管下面的實施例采用Hoc融合構(gòu)建體，本發(fā)明也可以容易地延伸到展示Soc融合體。更具體地，T4納米顆?？梢栽跉んw表面上容納約810個拷貝的Soc分子，使用體外組裝系統(tǒng)，可以將它們都替換為融合到Soc上的抗原。另外，T4納米顆粒主題可以延伸到包括對大殼體蛋白自身(930個拷貝)、大尾蛋白gpl8(144個拷貝)的修飾，使它成為疫苗開發(fā)的高度通用的系統(tǒng)。
實施例1p24-Hoc的構(gòu)建、過表達和純化通過編碼pro-gly-gly連接序列的DNA序列，將與全長p24多肽(225個氨基酸，24kDa)相對應的DNA片段連接到hoc基因的5′-末端。如上所述，p24是HIV殼的大殼體亞基，其包裹HIV基因組的2個分子和其它蛋白(例如，逆轉(zhuǎn)錄酶，整合酶)和核酸(例如，色氨酸t(yī)RNA引物)組分，其對感染是必需的。這可以通過Kuebler和Rao，1998公開的SOE策略來實現(xiàn)。構(gòu)建體向T7表達載體pET15b的BamHI位點的框內(nèi)插入(Novagen Inc.Madison，WI，USA)，會導致由六組氨酸標志組成的26氨基酸序列向p24-Hoc蛋白序列的N-末端的結(jié)合(圖3(A))。通過IPTG誘導，能使表達的66kDa六His-p24-Hoc融合蛋白占總大腸桿菌細胞蛋白的約10％(圖3b)，且80％表達的蛋白歸入可溶級分。通過Ni-瓊脂糖柱上的色譜，可以將蛋白純化至90％純度(圖3(B))。從1升培養(yǎng)物，得到約8-10mg純化的p24-Hoc。在圖3(B)中，在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳樣品，并用考馬斯藍染色；泳道1和2對應著p24-Hoc的IPTG誘導之前(0小時)或之后(3小時)的大腸桿菌樣品。注意到IPTG誘導(箭頭)后66kDa p24-Hoc條帶的出現(xiàn)。泳道3和4顯示了Ni-瓊脂糖柱色譜后純化的蛋白級分。
實施例2T4納米顆粒的體外組裝為了將重組抗原組裝或“裝載”到T4噬菌體顆粒表面上，將約2xlO10蔗糖梯度-純化的hoc-soc-T4納米顆粒與在TMG緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，75mM NaCl和1mMMgSO4)中的遞增量的純化的HIV-p24-Hoc一起在37℃溫育約60min。然后，將得到的T4納米顆粒在14,000rpm沉淀60min，棄去未結(jié)合的上清液級分。用過量的緩沖液洗滌顆粒沉淀2次，以去除所有未結(jié)合的或非特異性地捕獲的蛋白。通過4-20％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯藍染色，分析所有樣品，原料，未結(jié)合的和結(jié)合的級分，和對照品。參考圖4，HIV-p24-Hoc和Hoc結(jié)合位點的比例標示在圖的頂部。泳道如下St，起始p24-Hoc；Su，結(jié)合后在上清液中的p24-Hoc；Ph，噬菌體納米顆粒。圖左側(cè)的第一個C-Ph泳道代表組裝前的對照噬菌體納米顆粒。剩下的″Ph″泳道對應著以標示的比例組裝重組抗原后的噬菌體納米顆粒。在其它實施例中維持該凝膠裝載次序。St和Su泳道中的條帶是更微弱的，因為僅僅約1/lO樣品體積可以裝載到凝膠上，這是由于每個孔的有限容量(20ul)。如圖4所示，p24-Hoc被有效地組裝到hoc-soc-顆粒上，形成體外系統(tǒng)中的T4納米顆粒。當與對照hoc-soc-T4顆粒(圖左側(cè)的第一個c-Ph泳道)相比較時，在與p24-Hoc溫育后，出現(xiàn)了與p24-Hoc多肽相對應的新條帶(箭頭)(對應著箭頭，Ph泳道在比例1∶5.1∶10，1∶25，和1∶50)。條帶的強度隨著p24-Hoc∶Hoc結(jié)合位點的比例的增加而增加，表明通過控制p24-Hoc∶Hoc結(jié)合位點的比例，可以控制裝載程度。
實施例3體外組裝系統(tǒng)的特異性和穩(wěn)定性p24-Hoc和hoc-soc-T4納米顆粒之間的結(jié)合相互作用是高度特異性的。圖5解釋了該特異性。使用實施例2的實驗設計，將T4納米顆粒與單獨的p24(泳道2-4)或p24和p24-Hoc的混合物(泳道5-7)一起溫育。當與對照噬菌體(泳道1，C-Ph)相比較時，p24僅僅在與Hoc融合時結(jié)合顆粒(泳道5-7)。注意到，沒有發(fā)生明顯的p24結(jié)合。p24-Hoc的位置標有箭頭。這些結(jié)果表明，與Hoc多肽或其片段的融合，是結(jié)合T4顆粒所必需的。無論是對照蛋白BSA(66kDa)還是炭疽PA(89kDa)，都沒有顯示出向T4顆粒的明顯結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。
通過用pH2.0緩沖液或6M尿素處理p24-T4納米顆粒，評價展示的p24-Hoc和T4噬菌體顆粒之間的相互作用的穩(wěn)定性，并檢測任一種結(jié)合的抗原是否解離。更具體地，用TMG緩沖液(泳道2)或pH2緩沖液(泳道3)或3M尿素(泳道4)洗滌p24-Hoc結(jié)合的T4納米顆粒(圖6)。顆粒的SDS-PAGE表明，結(jié)合的p24-Hoc對兩種處理都是穩(wěn)定的。泳道C-Ph展示了對照hoc-soc-噬菌體。p24-Hoc的位置標有箭頭。因為在這些實驗中沒有明顯的解離，這些數(shù)據(jù)表明，展示的抗原能牢固地結(jié)合T4噬菌體顆粒(圖6)。
實施例4Hoc的N-或C-末端在展示p24中的應用Hoc的N-和C-末端都可以用于展示p24。例如，除了實施例1所述的N-末端融合蛋白外，構(gòu)建了反向C-末端融合蛋白。為了建立C-末端融合蛋白，通過編碼pro-gly-gly連接序列的C-末端-連接的DNA序列，將與全長p24多肽相對應的DNA框內(nèi)連接到hoc基因的3′-末端。hoc基因的5′-末端連接到編碼六組氨酸標志蛋白序列的序列(圖7(A))。以與N-末端融合相同的方式，表達和純化六His-Hoc-p24(圖7B；泳道1和2分別對應著p24-Hoc的IPTG誘導之前(0小時)或之后(3小時)的大腸桿菌樣品。注意到IPTG誘導(箭頭)后66kDa p24-Hoc條帶的出現(xiàn)。泳道3和4顯示了Ni-瓊脂糖柱色譜后純化的蛋白級分)。
體外組裝實驗證實，Hoc-p24能有效地組裝到殼體表面上(圖7(C))，表明N-和C-末端融合都不能損害Hoc向殼體的結(jié)合。參考圖7(C)，實驗細節(jié)與實施例2相同，例外是，純化的Hoc-p24用于結(jié)合實驗。Hoc-p24與Hoc結(jié)合位點的比例，標示在圖的頂部。注意到納米顆粒中的新p24-Hoc條帶的出現(xiàn)(箭頭)。泳道如下St，起始p24-Hoc；Su，結(jié)合后在上清液中的p24-Hoc；c-ph，對照噬菌體納米顆粒；Ph，在頂部標示的不同比例的噬菌體納米顆粒。在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳圖(B)和圖(C)的樣品，并用考馬斯藍染色。
實施例5展示的抗原的拷貝數(shù)如通過激光密度測定(Molecular Dynamics Inc.)所定量的，p24-Hoc或Hoc-p24的最大拷貝數(shù)是約900p24-Hoc分子/T4納米顆粒。這與凝膠過濾實驗一致(數(shù)據(jù)未顯示)，表明過表達的Hoc蛋白在溶液中以六聚體存在。因而，對于每個gp23六聚體，可能存在1個結(jié)合的抗原的六聚體。用許多HIV抗原和炭疽保護抗原，也已經(jīng)觀察到了相同的行為(見下面的實施例)。鑒于重組抗原在T4納米顆粒上的高密度展示和通過改變體外組裝反應中的組分的比例控制拷貝數(shù)的能力(圖4-7)，可以構(gòu)建用于多種用途的多種T4納米顆粒。
實施例6tat和nef在T4納米顆粒上的展示通過用其它HIV抗原tat(10kDa)-Hoc和nef(30kDa)-Hoc構(gòu)建融合體，評價了體外系統(tǒng)對抗原展示的廣泛適用性。認為tat和nef都是針對HIV的疫苗開發(fā)的重要靶物。使用如實施例2所述的體外組裝系統(tǒng)，進行了T4納米顆粒的組裝。參考圖8，泳道如下st，起始tat/nef-Hoc；su，結(jié)合后在上清液中的tat/nef-Hoc；ph，噬菌體納米顆粒；″c-″代表對照。這些數(shù)據(jù)清楚地證實，兩種抗原都能以與p24-Hoc相同的拷貝數(shù)，有效地展示在T4納米顆粒上(圖(A)tat；圖(B)nef)。
實施例7炭疽保護抗原的展示來自炭疽芽胞桿菌的83kDa保護抗原(PA)是三組分炭疽毒素的關鍵組分。它已經(jīng)成為開發(fā)針對潛在的生物恐怖分子炭疽攻擊的有效重組疫苗的主要靶。本文所述的T4納米顆粒平臺適用于展示125kDaPA-Hoc融合蛋白。
使用本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)，過表達PA-Hoc融合蛋白，最多至約15％的總大腸桿菌蛋白，并通過Ni-瓊脂糖色譜純化。參考圖9，以凝膠頂部所示的比例，將約1010個hoc-soc-T4噬菌體顆粒(泳道1)與PA-Hoc(箭頭)一起溫育。組裝后，在4-20％SDS-PAG上電泳樣品，并用考馬斯藍染色。上清液(未結(jié)合的)(泳道5，7，9，11，13，15，17，19，21，23)和噬菌體結(jié)合的(泳道6，8，10，12，14，16，18，20，22，24)PA-Hoc證實了PA-Hoc向T4納米顆粒上的有效裝載。泳道1-3，標準品；泳道1，hoc-soc-噬菌體；泳道2，純化的PA-Hoc；泳道3，純化的PA。象83kDa PA一樣大的多肽以與p24相同的高密度展示的事實暗示，對T4納米顆粒上展示的蛋白的大小，沒有基本的顯示。其它的噬菌體展示系統(tǒng)都沒有表現(xiàn)出與本文所述的體外T4系統(tǒng)一樣的強烈。
實施例8多種抗原的展示在有2種抗原(tat-Hoc和p24-Hoc，或nef-Hoc和p24-Hoc)或3種抗原(p24-Hoc，tat-Hoc，和nef-Hoc)存在下，實現(xiàn)了本發(fā)明的體外組裝系統(tǒng)。參考圖10，泳道如下st，起始蛋白；su，結(jié)合后剩余在上清液中的蛋白；ph，噬菌體；c-，對照。箭頭表明結(jié)合的抗原的位置。這些數(shù)據(jù)證實，多種抗原可以象用單個抗原獨立地進行一樣容易地裝載到殼體表面上(圖10(A)，(B)，和(C))。改變添加的抗原的比例，可以相應地改變殼體表面上的抗原的拷貝數(shù)(圖10(C)，數(shù)據(jù)未顯示)。定量數(shù)據(jù)表明，測試的所有蛋白都表現(xiàn)出相似的結(jié)合親合力，表明融合的抗原不能明顯地影響Hoc向納米顆粒的結(jié)合。
實施例9
p24-HocT4納米顆粒的免疫原性為了測試T4納米顆粒的免疫原性，在第0，3，和6周，用在噬菌體T4上展示的＜1μgp24-Hoc免疫BALB/C小鼠。使用桿狀病毒-表達的p24作為包被抗原，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，對各血清樣品，一式三份地分析p24-特異性的IgG抗體。將數(shù)據(jù)表示為終點滴度，滴度定義為能產(chǎn)生超過背景值2倍的OD讀數(shù)的最高稀釋度。在每個血清稀釋度，從含有抗原的三個孔的吸光度減去缺少抗原的三個孔的平均吸光度后，計算滴度。圖11顯示了幾何平均終點抗體滴度，符號代表各小鼠血清滴度。
如圖11所示，p24-Hoc-T4納米顆粒在小鼠中是高免疫原的。單獨用10μg可溶的p24免疫的小鼠，誘導了較差的抗體應答(在第6周，滴度小于800，數(shù)據(jù)未顯示)。但是，當它在T4納米顆粒上展示時，用＜1μg展示的抗原，得到了p24-特異性的抗體滴度的100-倍增加，從而證實了p24-T4納米顆粒的強免疫原性。如圖11所示，用Hoc-p24-T4納米顆粒，得到了最高達200,000的終點滴度。而且，誘導的抗體更持久，且甚至在免疫后37周，得到了50,000的滴度。用p24-HocT4顆粒(數(shù)據(jù)未顯示)和PA-HocT4顆粒(見下面)，得到了類似的結(jié)果。重要的是，注意到直接注射重組納米顆粒，沒有添加任何佐劑。因而，T4納米顆粒，除了它們作為疫苗送遞介質(zhì)的作用外，顯然提供了佐劑作用，從而產(chǎn)生對展示的抗原的強抗體滴度。
實施例10PA-HocT4納米顆粒的免疫原性用展示的炭疽PA-HocT4納米顆粒的獨立免疫原性實驗，證實了T4納米顆粒確實能引起強抗體應答。參考圖12，該圖顯示了在免疫后8周的CBA/J小鼠中的PA-特異性的IgG血清抗體。條柱代表幾何平均滴度。(注誤差條指示著數(shù)據(jù)范圍，N＝10)。給小鼠肌肉內(nèi)注射PA-Hoc-T4，PA-明礬，和許多對照品(每組10小鼠)。在每種情況下，給每只小鼠注射相當于1.2μg的抗原。展示在T4納米顆粒上的PA-Hoc，產(chǎn)生了最好的抗體滴度。T4-展示的PA的幾何平均終點抗體滴度是450,000，而用PA和作為佐劑的氫氧化鋁免疫的小鼠具有156,000的幾何平均終點滴度。因而，沒有添加任何佐劑的T4納米顆粒產(chǎn)生了比用明礬作為佐劑高約3-倍的抗體滴度。這些數(shù)據(jù)表明，T4納米顆粒是高免疫原的，可以用作測試炭疽抗原制劑的有價值的平臺。
實施例11細胞應答為了檢查對T4納米顆粒的細胞應答，在第二次加強后4周，收集脾和淋巴結(jié)細胞，并制備單細胞制品。通過氚化胸苷(3H-Tdr)摻入，分析細胞的T細胞增殖反應。將細胞與不同濃度的桿狀病毒-表達的p24(實心圓圈)或不同濃度的無關抗原卵清蛋白(空心圓圈)一起溫育72小時。在培養(yǎng)階段的最后16小時，用3H-Tdr脈沖處理細胞。然后，將細胞收獲到玻璃纖維過濾器上。處理過濾器，并在β平板計數(shù)器上計數(shù)。將數(shù)據(jù)表示為刺激指數(shù)，其代表用抗原脈沖處理的淋巴細胞培養(yǎng)物中的3H-Tdr與單獨用培養(yǎng)基脈沖處理的淋巴細胞培養(yǎng)物中的3H-Tdr的比例。認為3或更大的刺激指數(shù)是陽性反應。
如圖13所示，本發(fā)明的T4納米顆粒引起了強細胞應答。關于抗體應答，單獨用p24免疫的小鼠沒有誘導任何增殖反應。相反地，在有1-10μg桿狀病毒表達的p24存在下，來自用在T4上展示的p24-Hoc或Hoc-p24免疫的小鼠的脾細胞誘導了強烈的T細胞應答(圖13)。在10μg/ml的抗原濃度，得到了80-100的刺激指數(shù)。用淋巴結(jié)細胞得到了類似的增殖反應(數(shù)據(jù)未顯示)。未接觸過抗原的小鼠沒有誘導任何p24-特異性的增殖T細胞應答，從而證實得到的應答是特異性的。在所有情況下，陰性對照抗原卵清蛋白沒有誘導任何增殖反應(圖13)。僅僅來自用p24-Hoc-T4或Hoc-p24-T4免疫的小鼠的脾和淋巴結(jié)細胞，誘導了IL-4和IFN-γ(數(shù)據(jù)未顯示)。鉻釋放測定證實，從用p24-Hoc-T4或Hoc-p24-T4免疫的小鼠得到的脾細胞表現(xiàn)出了大約18-22％抗原-特異性的裂解(數(shù)據(jù)未顯示)。綜合考慮上面的實施例，這些結(jié)果表明，在噬菌體T4上展示的p24可以誘導強烈的體液和細胞介導的免疫應答，且不需要添加任何外來佐劑來增強它的免疫原性。
權利要求
1.免疫原性組合物，其包含a)Hoc和/或Soc融合蛋白，b)Hoc和/或Soc陰性的T4噬菌體顆粒；其中Hoc和/或Soc融合蛋白體外裝載到Hoc和/或Soc陰性的T4噬菌體顆粒上。
2.權利要求1的組合物，其中融合蛋白包含結(jié)合到蛋白上的Hoc和/或Soc，所述蛋白包含白介素，脂質(zhì)A，磷脂酶A2，內(nèi)毒素，葡萄球菌腸毒素B和其它毒素，I型干擾素，II型干擾素，腫瘤壞死因子(TNF-α或β)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(″TGF-β″)，淋巴毒素，遷移抑制因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(″CSF″)，單核細胞-巨噬細胞CSF，單核細胞-巨噬細胞CSF，粒細胞CSF，血管上皮生長因子(″VEGF″)，血管生成素，轉(zhuǎn)化生長因子(″TGF-α″)，熱休克蛋白，血型的碳水化合物部分，Rh因子，成纖維細胞生長因子，和其它炎癥和免疫調(diào)節(jié)蛋白，核苷酸，DNA，RNA，mRNA，有義物，反義物，癌細胞特異性的抗原；例如MART，MAGE，BAGE，和熱休克蛋白(HSP)；突變的p53；酪氨酸酶；粘蛋白，例如Muc-1，PSA，TSH，自身免疫抗原；免疫治療藥物，例如AZT；和血管發(fā)生和抗-血管發(fā)生的藥物，例如制管張素，內(nèi)皮抑制素，和堿性成纖維細胞生長因子，和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，前列腺特異性的抗原和甲狀腺刺激激素，或其片段。
3.權利要求1的組合物，其中該組合物可以有效地治療細菌性疾病，真菌性疾病，立克次氏體病，衣原體病，病毒性疾病，寄生蟲感染，性傳播疾病，結(jié)節(jié)病，和朊病毒病。
4.權利要求1的組合物，還包含藥物載體。
5.制備疫苗的方法，其包含a)構(gòu)建Hoc和/或Soc融合蛋白，b)分離Hoc和/或Soc陰性的T4噬菌體顆粒，和c)將Hoc和/或Soc融合蛋白體外裝載到T4噬菌體顆粒上。
6.權利要求5的方法，其中將Hoc和/或Soc融合蛋白裝載到T4噬菌體顆粒上包含將Hoc和/或Soc融合蛋白與T4噬菌體顆粒在反應緩沖液中一起溫育。
7.權利要求5的方法，其中所述反應緩沖液包含Tris緩沖鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水，hepes緩沖液。
8.權利要求5的方法，其中所述融合蛋白包含融合到Hoc或Soc蛋白或其片段上的外來蛋白。
9.權利要求8的方法，其中所述外來蛋白是抗原性的。
10.權利要求9的方法，其中所述外來蛋白包含白介素，脂質(zhì)A，磷脂酶A2，內(nèi)毒素，葡萄球菌腸毒素B和其它毒素，I型干擾素，II型干擾素，腫瘤壞死因子(TNF-α或β)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(″TGF-β″)，淋巴毒素，遷移抑制因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(″CSF″)，單核細胞-巨噬細胞CSF，單核細胞-巨噬細胞CSF，粒細胞CSF，血管上皮生長因子(″VEGF″)，血管生成素，轉(zhuǎn)化生長因子(″TGF-α″)，熱休克蛋白，血型的碳水化合物部分，Rh因子，成纖維細胞生長因子，和其它炎癥和免疫調(diào)節(jié)蛋白，核苷酸，DNA，RNA，mRNA，有義物，反義物，癌細胞特異性的抗原；例如MART，MAGE，BAGE，和熱休克蛋白(HSP)；突變的p53；酪氨酸酶；粘蛋白，例如Muc-1，PSA，TSH，自身免疫抗原；免疫治療藥物，例如AZT；和血管發(fā)生和抗-血管發(fā)生的藥物，例如制管張素，內(nèi)皮抑制素，和堿性成纖維細胞生長因子，和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，前列腺特異性的抗原和甲狀腺刺激激素，或其片段。
11.權利要求5的方法，其中所述疫苗是多組分疫苗。
12.權利要求5的方法，其中所述T4噬菌體顆粒缺乏DNA。
13.權利要求5的方法，其中所述T4噬菌體顆粒包含DNA構(gòu)建體。
14.在T4噬菌體顆粒表面上組裝多蛋白復合物的方法，其包含a)構(gòu)建第一種Hoc和/或Soc融合蛋白，其具有第一種外來蛋白，或其活性片段，b)構(gòu)建第二種Hoc和/或Soc融合蛋白，其具有第二種外來蛋白或其活性片段，c)分離Hoc和/或Soc陰性的T4噬菌體顆粒，和d)將第一種Hoc和/或Soc融合蛋白和第二種Hoc和/或Soc融合蛋白體外裝載到Hoc和/或Soc陰性的T4噬菌體顆粒上。
15.權利要求14的方法，其中第一種外來蛋白結(jié)構(gòu)域是抗原性的。
16.權利要求14的方法，其中第二種外來蛋白結(jié)構(gòu)域是抗原性的。
17.權利要求14的方法，其中所述第一種Hoc和/或Soc融合蛋白和第二種Hoc和/或Soc融合蛋白在Hoc和/或Soc陰性的T4噬菌體顆粒上的裝載，促進了第一種外來蛋白結(jié)構(gòu)域和第二種外來蛋白結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。
18.權利要求17的方法，其中所述第一種外來蛋白結(jié)構(gòu)域和第二種外來蛋白結(jié)構(gòu)域之間的相互作用促進了抗體結(jié)合位點的呈遞。
19.權利要求14的方法，其中所述第一種蛋白包含分支桿菌抗原，且其中所述第二種蛋白包含人免疫缺陷病毒抗原。
20.權利要求14的方法，其中所述第一種或第二種蛋白包含白介素，脂質(zhì)A，磷脂酶A2，內(nèi)毒素，葡萄球菌腸毒素β和其它毒素，I型干擾素，II型干擾素，腫瘤壞死因子(TNF-α或β)，轉(zhuǎn)化生長因子-β(″TGF-β″)，淋巴毒素，遷移抑制因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(″CSF″)，單核細胞-巨噬細胞CSF，單核細胞-巨噬細胞CSF，粒細胞CSF，血管上皮生長因子(″VEGF″)，血管生成素，轉(zhuǎn)化生長因子(″TGF-α″)，熱休克蛋白，血型的碳水化合物部分，Rh因子，成纖維細胞生長因子，和其它炎癥和免疫調(diào)節(jié)蛋白，核苷酸，DNA，RNA，mRNA，有義物，反義物，癌細胞特異性的抗原；例如MART，MAGE，BAGE，和熱休克蛋白(HSP)；突變的p53；酪氨酸酶；粘蛋白，例如Muc-1，PSA，TSH，自身免疫抗原；免疫治療藥物，例如AZT；和血管發(fā)生和抗-血管發(fā)生的藥物，例如制管張素，內(nèi)皮抑制素，和堿性成纖維細胞生長因子，和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，前列腺特異性的抗原和甲狀腺刺激激素，或其片段.
全文摘要
提供了包含噬菌體的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明包括為有效的抗原和外來顆粒呈遞獨特設計的新的和定制的T4噬菌體。本發(fā)明也提供了制備定制的T4噬菌體的體外方法。本發(fā)明的組合物和方法可以用于有效的疫苗送遞系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/86GK1972710SQ200480041791
公開日2007年5月30日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權日2003年12月17日
發(fā)明者文尼加拉·巴沙維斯瓦拉·勞 申請人:美國天主教大學