專利名稱：喜樹堿及其衍生物的自乳化藥物前體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種喜樹堿及其衍生物的自 乳化藥物前體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
喜樹堿(筒稱CPT)及其衍生物作用于拓樸異構(gòu)酶，是一種潛在的抗 癌藥物。目前，托泊替康和鹽酸伊立替康(7-乙基-10-哌啶子基羰氧基喜 樹堿，CPT-ll)已經(jīng)通過FDA批準(zhǔn)，同時(shí)一些其它衍生物也進(jìn)入了臨床 前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)階段(Hausheer Frederick H, Haridas Kochat. 11 ，7-Substituted camptothecin derivatives and formulations of 11,7-substituted camptothecin derivatives and methods for uses thereof; US5633260 )。但是, 由于CPT及其衍生物在水中的溶解性差，而且其內(nèi)酯環(huán)在血液中易水解， 臨床應(yīng)用受到纟艮大限制。
藥物緩釋技術(shù)是解決CPT及其衍生物水溶性差、在血液中易水解這 些問題的方法之一。通過將CPT及其衍生物包埋在疏水的脂質(zhì)雙分子層 或高分子微膠嚢中，或?qū)⑵?0-羥基酯化，可以提高其內(nèi)酯環(huán)的穩(wěn)定性。 申請?zhí)枮?00410022041.7的中國專利中公開了 一種提高喜樹堿或其衍生 物的脂質(zhì)體包封率的方法，申請?zhí)枮?00410024795.6的中國專利中公開了 一種羥基喜樹堿脂質(zhì)體及其制備方法，均表明制備具有高包埋率的喜樹 堿或其衍生物的脂質(zhì)體，能使羥基喜樹堿不發(fā)生在堿性條件下內(nèi)酯的開環(huán) 反應(yīng)，從而降低羥基喜樹堿的毒性，也能使抗癌活性成分結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
同時(shí)，藥物緩釋載體還能增加CPT及其衍生物的水溶性，延長其血 液半衰期，并能通過腫瘤組織的EPR效應(yīng)提高其在腫瘤部位的聚集，最 終導(dǎo)致更高的藥物療效和更低的機(jī)體毒性。 一些藥物緩釋載體已經(jīng)進(jìn)入了 臨床試驗(yàn)，如聚乙二醇喜樹堿治療局部晚期和轉(zhuǎn)移性胃癌和胃食管交界處 腺癌已進(jìn)入臨床二期(Scott LC， Yao JC, III ABB, W A phase-II study of pegylated-camptothecin (pegamotecan) in the treatment of locally advanced and metastatic gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinoma;CancerChemother Pharmacol 2009;63:363-70 )。
但是，現(xiàn)有的這些CPT及其衍生物藥物傳輸體系的載藥能力太低， 在納米載體或脂質(zhì)體內(nèi)，CPT及其衍生物的載藥量不超過10。/。，而且載藥 體系不穩(wěn)定，CPT及其衍生物在血液中的釋放速度太快，導(dǎo)致非靶向藥物 釋放，使得它們的藥物效率低且生物毒性高。在聚合物-CPT及其衍生物 的鍵合物中，只有當(dāng)CPT及其衍生物量很少時(shí)才能保證藥物的水溶性。 例如，分子量為40千道爾頓(Kda)的PEG能攜帶CPT的量僅為0.86% (即一個(gè)CPT分子)或者1,76% (即兩個(gè)CPT分子)(Greenwald RB， Choe YH， McGuire J, Conover CD; Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates; Adv Drug Delivery Rev 2003;55(2):217-50 )。為了達(dá)到一定的 CPT及其衍生物所需要的劑量，現(xiàn)有的CPT及其衍生物的藥物傳輸體系 需要使用大量的載體，但是，反復(fù)使用大劑量的載體給藥會(huì)使系統(tǒng)毒性大 大增加。因此，亟需一種載藥量高且系統(tǒng)毒性小的藥物傳輸體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種基于喜樹堿及其衍生物的自乳化藥物前體，以喜樹 堿及其衍生物作為疏水部分來合成自乳化藥物前體，即一個(gè)或者多個(gè)喜樹 堿或其衍生物分子共價(jià)結(jié)合到一個(gè)或者多個(gè)親水的基團(tuán)或者聚合物短鏈 上，形成含有親水部分和疏水部分的類脂質(zhì)體(即與脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)相似) 或類表面活性劑(即與表面活性劑的結(jié)構(gòu)相似)自乳化藥物前體。
一種喜樹堿及其衍生物的自乳化藥物前體，是由喜樹堿分子或喜樹堿
衍生物分子與親水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成的。
所述的自乳化藥物前體可以由一個(gè)喜樹堿分子或喜樹堿衍生物分子 通過其20位的羥基與一個(gè)或者多個(gè)親水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成；也可以由多 個(gè)喜樹堿分子或喜樹堿衍生物分子通過其20位的羥基與一個(gè)或者多個(gè)親 水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成的。
具體地講，喜樹堿或者其衍生物通過其20位的羥基與羧酸或酸酐反 應(yīng)形成羧酸酯，或與取代磷^應(yīng)形成磷酸酯，或者與引入水溶性的鏈段 或聚合物短鏈段的親水基團(tuán)反應(yīng)，來制備得到喜樹堿及其衍生物的自乳化 藥物前體。
作為優(yōu)選，所述的自乳化藥物前體可以具有如下結(jié)構(gòu)式其中，R為親水基團(tuán)，可選用磷酸基、2-氨基乙基磷酸酯基、2(N,N,N-三甲基乙基磷酸酯基)、磷脂酰絲氨酸基、單糖殘基、多糖殘基、聚乙二 醇鏈段、聚(曱基)丙烯酸鏈段、聚曱基丙烯酸p羥丙酯鏈段、聚乙烯醇 鏈段等中的一種；為了使藥物前體能形成穩(wěn)定的自乳化納米結(jié)構(gòu)， 一般優(yōu) 選聚合物短鏈段。上述親水基團(tuán)具有良好的生物相容性、無毒或低毒，適 于引入到藥物前體中。
Ri為氫、羥基或幾基的衍生物，羥基的衍生物為本領(lǐng)域常用的羥基衍 生物基團(tuán)，如酯基、醚基等。
喜樹堿或者其衍生物通過其20位的羥基與引入水溶性的鏈段或聚合 物短鏈段的親水基團(tuán)反應(yīng)時(shí)，所述的自乳化藥物前體可以具有如下結(jié)構(gòu) 式其中，Ri為氫、羥基或羥基的衍生物；n=3~30。
所述的自乳化藥物前體也可以具有如下結(jié)構(gòu)式:
其中，&為氫、羥基或輕基的衍生物。
所述的自乳化藥物前體在水中能形成納米尺寸膠束或者嚢泡，利用本 領(lǐng)域常用的透析等方法即可得到納米尺寸膠束或者嚢泡。
所述的納米尺寸膠束或者嚢泡可以作為藥物載體，用于負(fù)載其它抗癌 藥物如CPT衍生物(7-乙基-10-羥基喜樹堿，SN-38)、紫杉醇、姜黃素、 甲氨蝶呤、伊立替康、丹酚酸、苦參堿、阿霉素(DOX)等中的一種或多 種，形成攜帶多種藥物的納米藥物。負(fù)載藥物的方法可以是通過疏水相互 作用，也可以是本領(lǐng)域常用的其他相互作用，如靜電作用等。
本發(fā)明的自乳化藥物前體選用本領(lǐng)域常規(guī)的化學(xué)合成方法合成即可。
本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明通過在疏水藥物中引入親水基團(tuán)或在親水藥物中引入疏水基 團(tuán)制備以藥物分子為結(jié)構(gòu)單元的自乳化藥物前體，該藥物前體具有雙親類 脂質(zhì)體或類表面活性劑結(jié)構(gòu)，親水部分和疏水部分之間通過特定條件下可 斷裂的化學(xué)鍵連接，從而可在特定條件下釋放藥物分子。例如，酯鍵可在 細(xì)胞內(nèi)溶酶體的酸性pH下水解，也可在細(xì)胞中被酯分解酶降解。
本發(fā)明的自乳化藥物前體同時(shí)具有兩種功能 一、自乳化藥物前體自 身可作為一種前體藥物， 一旦進(jìn)入癌細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下導(dǎo)致CPT及其衍生物的快速釋放，且載藥量高(CPT的負(fù)載量一般可超過50%(重 量百分比))、藥物輸送能力好、血液半衰期較長、生物相容性和生物可降 解性較好、生物利用度高、毒性低，可以明顯提高藥物的藥學(xué)作用。二、 該自乳化藥物前體能在水溶液中通過自乳化形成納米尺寸的膠束或者嚢 泡(見圖1)，這種納米尺寸的膠束或者嚢泡可通過腫瘤組織的超通透和蓄 積作用(EPR effect)而有效地在腫瘤組織中積累，而使藥物耙向腫瘤組 織。三、該納米膠束或者嚢泡可以作為其他抗癌藥物如CPT衍生物(7-乙基-10-羥基喜樹堿，SN-38)、紫杉醇、姜黃素、曱氨蝶呤、伊立替康、 丹酚酸、苦參^ 咸、阿霉素等的載體，從而達(dá)到兩種或兩種以上抗癌藥物協(xié) 同治療的目的。
本發(fā)明的自乳化藥物前體的制備方法操作簡單，采用本領(lǐng)域常規(guī)的合 成方法即可。


圖1為本發(fā)明自乳化藥物前體形成納米膠束或嚢泡的示意圖2為應(yīng)用例1中制備的PEG-diCPT嚢泡狀納米顆粒的動(dòng)態(tài)光散射
圖3為實(shí)施例1制備的自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT與小分子 CPT對SKOV-3卵巢癌細(xì)胞的毒性效果圖4為實(shí)施例1制備的自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT與小分子 CPT對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的毒性效果圖5為沒有經(jīng)過治療的SKOV-3卵巢癌細(xì)胞分布圖6為經(jīng)濃度為0.5ng/ml實(shí)施例1制備的PEG-diCPT治療的SKOV-3 卵巢癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
圖7為經(jīng)濃度為2fig/ml實(shí)施例1制備的PEG-diCPT治療的SKOV-3 卵巢癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
圖8為實(shí)施例1制備的PEG-diCPT負(fù)載抗癌藥物DOX后對MCF乳 腺癌細(xì)胞的毒性效果圖9為實(shí)施例1制備的PEG-diCPT對SKOV-3人卵巢癌細(xì)胞荷瘤棵 鼠腫瘤的抑制作用效果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 一個(gè)PEG連接兩個(gè)CPT的自乳化藥物前體(PEG-diCPT)的合 成
(1) PEG-SH的合成
將4.54g( 10mmol)聚(乙二醇)曱醚丙烯酸酯(PEGMEA)溶解于20mL 干燥的二氯甲烷中，加入1.92g (2mmo1)質(zhì)量百分濃度為98%的1，2-巰基 乙醇，以O(shè).lmL (0.72mmo1)三乙胺作為催化劑，室溫下攪4半反應(yīng)24h。 反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物用水透析除去小分子和有機(jī)溶劑，水相用二氯曱烷洗 滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后真空干燥，得到4.61g產(chǎn)物PEG-SH,產(chǎn) 率為83.64%。 PEG-SH的結(jié)構(gòu)式如下
其中，n=3~30。 (2 )末端帶二酸的PEG的合成
將2.2g ( 4mmo1) PEG-SH和0.52g (4.5mmol)富馬酸溶于5mL干燥 的N,N-二曱基曱酰胺(DMF)中，以O(shè).OlmL ( 0.36mmol)三乙胺作為催 化劑，7(TC反應(yīng)12h后，將反應(yīng)物透析除去未反應(yīng)的富馬酸、三乙胺和 DMF，經(jīng)真空干燥得到2.1g末端帶二酸的PEG,產(chǎn)率為77%。末端帶二 酸的PEG的結(jié)構(gòu)式如下
其中，n=3~30。
(3 )末端帶二酰氯的PEG的合成 取1.32g ( 2mmo1)末端帶二酸的PEG溶于5mL干燥的二氯甲烷中， 加入0.47g (4mmo1)亞碌u酰二氯和一滴DMF作為催4t劑，室溫下反應(yīng)過 夜，真空除去溶劑和亞辟b酰二氯，得到1.27 g末端帶二酰氯的PEG,產(chǎn)率 91%。末端帶二酰氯的PEG的結(jié)構(gòu)式如下
9<formula>formula see original document page 10</formula>
其中，n=3~30。 (4) PEG-diCPT的合成
將87mg ( 0.25mmol) CPT懸浮于5mL干燥的氯仿并冷卻到0°C 。將 70mg (O.lmmol)末端帶二酰氯的PEG和16mg ( 0.2mmol)吡咬溶于2mL 干燥的氯仿中并逐滴加入到含CPT的氯仿溶液中，混合溶液于室溫下攪 拌反應(yīng)24h。將反應(yīng)物過濾除去未反應(yīng)的CPT，再用無水乙醚沉淀，經(jīng)真 空干燥得到產(chǎn)物PEG-diCPT 98mg，產(chǎn)率71%，該類脂質(zhì)體自乳化藥物前 體PEG-diCPT中CPT的攜帶量為50% (重量百分比)。PEG-diCPT的結(jié) 構(gòu)式如下
其中，n=3~30。
實(shí)施例2 基于聚丙烯酸短鏈的自乳化藥物前體的合成
(1 )取1 g (2.87 mmol)CPT和0.34 g(3.44 mmol)丁二酸酐溶于5 mL DMSO中，加熱至60°C,反應(yīng)6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液倒入50 mL 丙酮中沉淀，通過過濾收集固體產(chǎn)物，干燥后4尋到1.09 g產(chǎn)物I ，產(chǎn)率為 85%。
產(chǎn)物I的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formula see original document page 11</formula>
(2)將0.5g ( l.llmmol)上述產(chǎn)物I和0,154 g ( 1.34 mmol) N-羥 基琥珀酰亞胺溶于在DMSO中，加入0.276 g ( 1.34 mmol) N，N' -二環(huán)己 基碳二亞胺(DCC )和0.163 g (1.34 mmol)4-二曱氨基必定(DMAP，反應(yīng) 過夜，過濾除去副產(chǎn)物。濾液在乙醚中沉淀，得到0.56g產(chǎn)物I1，產(chǎn)率為 89%。產(chǎn)物II的結(jié)構(gòu)式如下
<formula>formula see original document page 11</formula>
(3)將0.5g(0.89 mmol)上述產(chǎn)物II和與氨基封端的聚丙烯酸0.5 g(0.89mmol)在DMSO中室溫下反應(yīng)3小時(shí)，然后將反應(yīng)液倒入丙酮中沉 淀，得到0.9g基于聚丙烯酸短鏈的自乳化藥物前體(即產(chǎn)物III ),產(chǎn)率為 90%。產(chǎn)物III的結(jié)構(gòu)式如下<formula>formula see original document page 11</formula>
其中，n=2~20。 上述反應(yīng)的合成路線如下所示其中，n=2~20。
實(shí)施例3葡萄糖CPT自乳化藥物前體的合成。
(1) 取lg (5.12mrno1)葡萄酸和3.7g (61.6mmol)乙二胺溶于 10 mL水中，加入0.99 g ( 5.12 mmol) l-乙基-(3-二曱基氨基丙基)-碳二 亞胺(EDC)催化反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液倒入100 mL丙 酮中沉淀，通過過濾收集固體產(chǎn)物，干燥后，得到1.11 g產(chǎn)物IV，產(chǎn)率為 85%。
(2 )將0.3 g ( 1.17 mmol)上述產(chǎn)物IV、 0.66 g ( 1.17 mmol)實(shí)施例 2第二步中的產(chǎn)物II與10mlDMSO混合，反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液 倒入丙酮中沉淀，過濾收集固體產(chǎn)物V。
12Ol OH
ohonh 0
產(chǎn)物v
應(yīng)用例1PEG-diCPT嚢泡狀納米顆粒的制備
將5mg實(shí)施例1制備的PEG-diCPT溶解于lmL 二曱基亞砜 (DMSO),并在室溫下攪拌lh制成溶液，在攪拌狀態(tài)下將上述溶液逐 滴加入到5mL pH7.4的PBS緩沖液或水中，透析除去DMSO，得到 PEG-diCPT嚢泡狀納米顆粒。
應(yīng)用例2PEG-diCPT脂質(zhì)體載藥體系的制備
將0.5mg DOX和2.5mg實(shí)施例1制備的PEG-diCPT溶于lmL DMSO
中，并于黑暗條件下攪拌2h制成溶液，再將該溶液逐滴加入到5mL去離 子水中，黑暗條件下攪拌過夜，用去離子水透析除去DMSO和過量的 DOX，即制得PEG-diCPT脂質(zhì)體載藥體系。
以實(shí)施例1制備的自乳化藥物前體PEG-diCPT為例進(jìn)行檢測，檢測 方法均采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT在水中形成平均尺寸為132 nm的納 米顆粒，其動(dòng)態(tài)光散射圖如圖2所示。
將自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT與小分子CPT進(jìn)4亍體外抗肺瘤效果的對比實(shí)驗(yàn)，其體外抗腫瘤效果分別如圖3和圖4所示。從圖3和圖4 中可以看出，PEG-diCPT與CPT具有相同的細(xì)胞毒性，PEG-diCPT對 SKOV-3卵巢癌細(xì)胞的半致死量為0.1微克/毫升，對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的 半致死量為0.8微克/毫升，這一結(jié)果表明，自乳化CPT前體藥物 PEG-diCPT可以用來做為抗癌藥物。
考察不同劑量的自乳化CPT前體藥物PEG-diCPT引起SKOV-3卵 巢癌細(xì)胞凋亡的情況，并采用未經(jīng)過任何治療的SKOV-3卵巢癌細(xì)胞作為 對照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5、圖6和圖7所示。經(jīng)過72h的治療，SKOV-3卵 巢癌細(xì)胞細(xì)胞核的形狀發(fā)現(xiàn)明顯的變化，如圖6和圖7所示；另外，與未 使用藥物治療的對照組相比(圖5),經(jīng)PEG-diCPT治療后的SKOV-3卵 巢癌細(xì)胞的數(shù)量大大減少，表明自乳化CPT前體藥物PEG-diCPT能引起 癌細(xì)胞的明顯凋亡。
負(fù)載抗癌藥物DOX的自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT對MCF乳腺 癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如圖8所示)表明負(fù)載抗癌藥物DOX的 自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT對MCF乳腺癌細(xì)胞，具有比單純的CPT 和DOX更高的細(xì)月包毒性。
考察自乳化CPT藥物前體PEG-diCPT對SKOV-3人卵巢癌細(xì)胞荷瘤 棵鼠腫瘤的抑制作用，BALB/c-nu/nu棵鼠腹腔移植腫瘤細(xì)胞4星期后尾 靜脈注射O.lmL含PEG-diCPT的磷酸鹽緩沖溶液(PBS ),其等同CPT-劑量為lmg/mL溶液，并用尾靜脈注射O.lmL磷酸鹽緩沖溶液的 BALB/c-nu/nu棵鼠作為對照；48小時(shí)后處死棵鼠，分離所有的腫瘤后得 到每只棵鼠的平均腫瘤的總濕重，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。
權(quán)利要求
1、一種喜樹堿及其衍生物的自乳化藥物前體，是由喜樹堿分子或喜樹堿衍生物分子與親水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成的。
2、 如權(quán)利要求1所述的自乳化藥物前體，其特征在于所述的自乳 化藥物前體是由一個(gè)喜樹堿分子或喜樹堿衍生物分子通過其20位的羥基 與一個(gè)或多個(gè)親水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成的。
3、 如權(quán)利要求1所述的自乳化藥物前體，其特征在于所述的自乳 化藥物前體是由多個(gè)喜樹堿分子或喜樹堿衍生物分子通過其20位的羥基 與一個(gè)或者多個(gè)親水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成的。
4、 如權(quán)利要求1所述的自乳化藥物前體，其特征在于具有如下結(jié) 構(gòu)式0— .其中，R為親水基團(tuán)；R,為氫、羥基或羥基的衍生物。
5、 如權(quán)利要求2所述的自乳化藥物前體，其特征在于所述的R為 磷酸基、2-氨基乙基磷酸酯基、2 (N,N,N-三曱基乙基磷酸酯基)、磷脂酰 絲氨酸基、單糖殘基、多糖殘基、聚乙二醇鏈段、聚丙烯酸鏈段、聚曱基 丙烯酸鏈段、聚曱基丙烯酸p羥丙酯鏈段或聚乙烯醇鏈段。
6、 如權(quán)利要求1所述的自乳化藥物前體，其特征在于具有如下結(jié)構(gòu)式:<formula>formula see original document page 3</formula>其中，&為氫、羥基或羥基的衍生物；n=3~30。
7、如權(quán)利要求1所述的自乳化藥物前體，其特征在于具有如下結(jié) 構(gòu)式
8.其中，R!為氫、羥基或羥基的衍生物。
9、 一種用如權(quán)利要求1 ~ 8任一所述的自乳化藥物前體制備的納米尺 寸膠束或者嚢泡。
10、 如權(quán)利要求9所述的納米尺寸膠束或者嚢泡在作為藥物載體中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種喜樹堿及其衍生物的自乳化藥物前體，其是由藥物分子與親水基團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成的；其中，所述的藥物分子為喜樹堿分子或喜樹堿衍生物分子，該前體的攜藥量可高達(dá)50％以上。本發(fā)明還公開了該自乳化藥物前體的應(yīng)用，其在水中能形成納米尺寸膠束或者囊泡，可以作為藥物載體，用于負(fù)載其它抗癌藥物如CPT衍生物、紫杉醇、姜黃素、甲氨蝶呤、伊立替康、丹酚酸、苦參堿、阿霉素等中的一種或多種，形成攜帶多種藥物的納米藥物，實(shí)現(xiàn)了藥物的協(xié)同治療。
文檔編號(hào)C07F9/00GK101628919SQ20091010214
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者唐建斌, 徐春紅, 申有青, 隋梅花 申請人:浙江大學(xué)