納米顆粒-肽組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了納米顆粒和包含這種納米顆粒的組合物，以及肽的細(xì)胞內(nèi)遞送的方法，以及制備所述納米顆粒和相關(guān)產(chǎn)品的方法。所述納米顆粒包含包含金屬和/或半導(dǎo)體原子的核；以及包含共價(jià)連接至核的多個(gè)配體的冠，其中所述多個(gè)中的至少第一配體包含經(jīng)由第一接頭共價(jià)連接至核的碳水化合物部分，并且其中所述多個(gè)中的至少第二配體包含經(jīng)由第二接頭共價(jià)連接至核的所選肽。第二接頭包含肽部分和非肽部分，其中所述第二接頭的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中：X1為選自A和G的氨基酸；X2為選自A和G的氨基酸；且Z1為選自Y和F的氨基酸。
【專利說(shuō)明】納米顆粒-肽組合物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于細(xì)胞內(nèi)肽遞送的物質(zhì)和組合物，特別是肽的納米顆粒-介導(dǎo)的遞送。在特定情況下，本發(fā)明涉及表位肽的細(xì)胞內(nèi)遞送，例如，以誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答?？梢圆捎眉?xì)胞內(nèi)肽遞送用于治療性和/或預(yù)防性處理，特別是腫瘤和/或病原體-介導(dǎo)的疾病，如細(xì)菌、病毒或寄生蟲(chóng)感染。
[0002]發(fā)明背景
[0003]基于肽的療法如免疫療法的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)的顯著挑戰(zhàn)，是向細(xì)胞內(nèi)隔室進(jìn)行肽的細(xì)胞內(nèi)遞送。一個(gè)例子是需要將抗原肽遞送至抗原加工機(jī)制，從而使得所述肽被呈遞結(jié)合至MHC I類分子并且由此刺激CTL應(yīng)答。其他例子包括將基于肽的藥物遞送至細(xì)胞內(nèi)藥物靶點(diǎn)。特別地，游離肽通常顯示為被細(xì)胞弱攝取。
[0004]迄今為止已采用的一種方法是通過(guò)施用例如病毒載體的載體將肽遞送至細(xì)胞內(nèi)位置，所述載體包含編碼所選肽的多聚核苷酸，從而使得所述細(xì)胞能由所述載體轉(zhuǎn)染且所述肽由細(xì)胞翻 譯機(jī)制制造。將肽遞送至細(xì)胞內(nèi)位置的策略的進(jìn)一步例子在Muders etal.，2009，Clin Cancer Res1Vol.15 (12)，pp.4095-4103 中描述，其中 GIPC-PDZ靶向肽被遞送至特定胰腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)。所述肽由N-末端豆蘧?；?myristolation)修飾。
[0005]然而，仍然需要肽的細(xì)胞內(nèi)遞送的其他方法和組合物，例如，為了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或?qū)μ囟ɑ陔牡乃幬锏氖┯?。本發(fā)明解決了這些和其它需要。
[0006]W02006/037979描述了包含抗原和佐劑的納米顆粒，及包含所述納米顆粒的免疫原性結(jié)構(gòu)。
[0007]發(fā)明概述
[0008]廣義而言，本發(fā)明涉及肽的基于納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)遞送。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本文所描述的本發(fā)明的納米顆粒能夠被細(xì)胞攝取并由此將所選肽遞送至細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)中，所述納米顆粒具有包括經(jīng)由特殊接頭共價(jià)附著至納米顆粒核的所選肽的冠。如本文所描述，所述所選肽可以隨后從納米顆粒中釋放，例如通過(guò)特定的裂解過(guò)程，從而釋放所述所選肽用于與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用。這方面的一個(gè)例子是經(jīng)由MHC I類分子將表位肽遞送至APC用于加工和呈遞，從而引起CTL應(yīng)答。
[0009]相應(yīng)地，在第一個(gè)方面本發(fā)明提供了一種納米顆粒，其包含:
[0010](i)包含金屬和/或半導(dǎo)體原子的核；
[0011](ii)包含共價(jià)連接至所述核的多個(gè)配體的冠，其中所述多個(gè)中的至少第一配體包含經(jīng)由第一接頭共價(jià)連接至所述核的碳水化合物部分或其中所述多個(gè)的所述第一配體包含谷胱甘肽，并且其中所述多個(gè)中的至少第二配體包含經(jīng)由第二接頭共價(jià)連接至所述核的所選肽，所述第二接頭包含:
[0012]肽部分和非肽部分，其中所述第二接頭的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中:
[0013]X1為選自A和G的氨基酸；
[0014]X2為選自A和G的氨基酸；和
[0015]Z1為選自Y和F的氨基酸。[0016]在依照本發(fā)明的在一些情況下，第二接頭的非肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇，例如乙硫酯基團(tuán)或硫丙基團(tuán)。
[0017]在依照本發(fā)明的在一些情況下，第一配體和/或所述第二配體經(jīng)由含硫基團(tuán)、含氨基的基團(tuán)、含磷酸基團(tuán)或含氧基團(tuán)共價(jià)連接至核。
[0018]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述第二接頭的所述肽部分包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成:
[0019](i)AAY;和
[0020](ii) FLAAY (SEQ ID NO:1)。
[0021]在特定優(yōu)選的情況下，所述第二接頭選自:
[0022](i) HS- (CH2) 2-C0NH-AAY ；
[0023](ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAY ； [0024](iii)HS- (CH2) 3-CONH-AAY ；
[0025](iv) HS- (CH2) 3-CONH-FLAAY ；
[0026](V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAY ；和
[0027](vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2)「CONH-FLAAY，
[0028]其中所述第二接頭經(jīng)由所述接頭的非肽部分的硫醇基團(tuán)共價(jià)連接至所述核。
[0029]優(yōu)選地，所述所選肽經(jīng)由其N-末端連接至所述第二接頭的所述肽部分。
[0030]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述第二配體選自:
[0031 ] (i) HS- (CH2) 2-C0NH-AAYZ2 ；
[0032](ii)HS-(CH2)2-C0NH-FLAAYZ2 ；
[0033](iii)HS- (CH2) 3-C0NH-AAYZ2 ；
[0034](iv) HS- (CH2) 3-C0NH-FLAAYZ2 ；
[0035](V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAYZ2 ;和
[0036](vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYZ2，
[0037]其中Z2代表所述所選肽。
[0038]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述所選肽是與主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子結(jié)合的表位肽，或者其能夠經(jīng)過(guò)加工與MHCI類分子結(jié)合。
[0039]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述所選肽由8至40個(gè)氨基酸殘基的序列組成。特別地，所述所選肽可以由8至12個(gè)氨基酸殘基的序列組成。
[0040]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述所選肽是能夠被MHC I類分子呈遞從而刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的表位肽。
[0041]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述所選肽形成腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或病毒_、細(xì)菌-或寄生蟲(chóng)相關(guān)抗原的至少一部分或者來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或病毒_、細(xì)菌-或寄生蟲(chóng)相關(guān)抗原。特別地，所述TAA可以是肺癌抗原。所述肺癌在一些情況下可以選自:小細(xì)胞肺癌和任何非小細(xì)胞肺癌，任選地，其中所述非小細(xì)胞肺癌包含腺癌。病原體相關(guān)抗原在一些情況下可以是病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)抗原。
[0042]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述第一配體的碳水化合物部分包含單糖和/或二糖。特別地，所述碳水化合物部分可以包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。[0043]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述多個(gè)配體包含選自下述的一個(gè)或多個(gè)配體:葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，另外還包含所述所選肽的一個(gè)或多個(gè)配體。
[0044]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述多個(gè)配體包含:
[0045](a)葡萄糖；
[0046](b)N-乙酰氨基葡萄糖；
[0047](c)谷胱甘肽；
[0048](d)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖；
[0049](e)葡萄糖和谷胱甘肽；
[0050](f) N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽；或
[0051](g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，
[0052]除了所述配體包含所述所選肽。
[0053]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述第一接頭包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇。
[0054]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述第一配體包含經(jīng)由硫醇硫原子共價(jià)附著至核的2’ -硫乙基_β-D-吡喃葡萄糖苷或2’ -硫乙基-a-D-吡喃葡萄糖苷。
[0055]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述納米顆粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50個(gè)含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體。
[0056]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述納米顆粒包含至少1、至少2、至少3、至少4或至少5個(gè)含肽的配體。
[0057]在依照本發(fā)明的在一些情況下，含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體與含肽的配體的摩爾比的范圍為5:1至100:1，例如的范圍為10:1至30:1。
[0058]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述納米顆粒的核的直徑的范圍為Inm至5nm。
[0059]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述納米顆粒包括其配體的直徑的范圍為5nm至20nm,任選地 5nm 至 15nm 或 8nm 至 10nm。
[0060]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述核包含選自下述的金屬:Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn或其任何組合。
[0061]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述核是磁性的。
[0062]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述核包含半導(dǎo)體。特別地，所述半導(dǎo)體在一些情況下可以選自:硒化鎘、硫化鎘、碲化鎘和硫化鋅。
[0063]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述核能夠作為量子點(diǎn)。
[0064]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述納米顆粒包含至少兩個(gè)含所選肽的配體，并且其中至少兩個(gè)含所選肽的配體各自的所選肽不同。
[0065]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述至少兩個(gè)含所選肽的配體的所選肽各自形成一種或多種抗原的至少一部分或各自來(lái)自一種或多種抗原，所述抗原例如TAA。在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述至少兩個(gè)含所選肽的配體的所選肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自來(lái)自不同的肺癌TAA。
[0066]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包含依照本發(fā)明的第一方面的多個(gè)納米顆粒的組合物。該組合物可以進(jìn)一步包含至少一種藥學(xué)可接受的載體、鹽和/或稀釋劑。
[0067]在依照本發(fā)明的在一些情況下，所述組合物包含具有第一含所選肽的配體的第一種類納米顆粒和具有第二含所選肽的配體的第二種類納米顆粒，其中所述第一和第二種類的所選肽不同。所述第一和第二種類納米顆粒各自的所選肽在一些情況下可以形成一種或多種抗原的至少一部分或者各自來(lái)自一種或多種抗原，所述抗原例如TAA。
[0068]在依照本發(fā)明的在一些情況下，本發(fā)明的組合物可以包含至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少10個(gè)不同種類的納米顆粒的庫(kù)，各種類具有不同的所選肽。
[0069]所述組合物可以進(jìn)一步包含至少一種佐劑，所述佐劑可任選地共價(jià)附著至至少一個(gè)納米顆粒的核。備選地，本發(fā)明的組合物可以基本上不含佐劑或可以由納米顆粒提供唯一的佐劑功效。
[0070]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的組合物的疫苗。所述疫苗可以用于癌癥包括肺癌的治療性或預(yù)防性處理。
[0071]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了在醫(yī)學(xué)中使用的本發(fā)明的納米顆粒、組合物或疫苗。
[0072]所述納米顆粒、組合物或疫苗可以在處理哺乳動(dòng)物受試者中的癌癥或病原體感染的方法中使用。
[0073]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的納米顆粒、組合物或疫苗在制備用于處理哺乳動(dòng)物受試者中的癌癥或病原體感染的藥物中的用途。
[0074]本發(fā)明的納米顆粒、組合物或疫苗可以經(jīng)由淋巴攝取的施用。
[0075]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了癌癥或病原體感染的預(yù)防性或治療性處理的方法，其包含對(duì)此需要的哺乳動(dòng)物受試者施用預(yù)防或治療足夠量的納米顆粒、組合物或疫苗。在依照本發(fā)明的所述方法方面的一些情況下，所述納米顆粒、組合物或疫苗經(jīng)由選自下述的途徑施用:
[0076]在淋巴攝取的位點(diǎn)或其附近向哺乳動(dòng)物受試者的器官或組織中注射；
[0077]經(jīng)由噴霧或凝膠的鼻腔遞送；
[0078]經(jīng)由噴霧或凝膠或口服可溶解薄膜的頰遞送；
[0079] 經(jīng)由可溶解薄膜的口腔遞送；
[0080]經(jīng)由摻入納米顆粒的貼片的透皮遞送；和
[0081]包含納米顆粒的組合物的吸入遞送。
[0082]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的體外或體內(nèi)方法，其包含:
[0083](i)使至少一種抗原呈遞細(xì)胞(APC)與本發(fā)明的至少一種納米顆粒接觸，從而使得所述所選肽被呈遞到所述APC的MHC I類分子上；和
[0084](ii)使(i)中的所述至少一種APC與至少一種CTL細(xì)胞接觸，從而使得所述CTL細(xì)胞由所述APC激活以產(chǎn)生對(duì)所述所選肽特異性的CTL應(yīng)答，其中所述所選肽是表位肽。
[0085]在依照本發(fā)明的一些情況下，所述APC在所述納米顆粒的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，并且同時(shí)或相繼地，與所述CTL細(xì)胞共培養(yǎng)。任選地，所述APC在與納米顆粒接觸后、與所述CTL細(xì)胞共培養(yǎng)前接受洗滌步驟。在一些情況下，所述方法可以進(jìn)一步包含對(duì)哺乳動(dòng)物受試者施用所述CTL細(xì)胞。
[0086]在依照本發(fā)明的一些情況下，所述納米顆粒可以通過(guò)選自下述的施用途徑遞送:
[0087]在淋巴攝取的位點(diǎn)或其附近向哺乳動(dòng)物受試者的器官或組織中注射；
[0088]經(jīng)由噴霧或凝膠的鼻腔遞送；[0089]經(jīng)由噴霧或凝膠或口服可溶解薄膜的頰遞送；
[0090]經(jīng)由 可溶解薄膜的口腔遞送；
[0091]經(jīng)由摻入納米顆粒的貼片的透皮遞送；和
[0092]包含納米顆粒的組合物的吸入遞送。
[0093]在一些情況下，所述至少一種納米顆粒包含具有不同所選肽的納米顆粒的庫(kù)。
[0094]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了制造依照本發(fā)明的納米顆粒的方法，其包含:
[0095]衍生具有第一接頭的碳水化合物；
[0096]衍生具有第二接頭的所選肽；和
[0097]使第一接頭-衍生的碳水化合物和第二接頭-衍生的所選肽與反應(yīng)物反應(yīng)，以制造納米顆粒的核，使得在納米顆粒的自組裝過(guò)程中，所述納米顆粒核經(jīng)由它們各自的接頭附著碳水化合物和所選肽。在一些情況下，所述反應(yīng)混合物包含衍生的碳水化合物、衍生的所選肽、金屬和/或半導(dǎo)體原子的鹽以及還原劑以制造納米顆粒。另外地或備選地，所述碳水化合物可以由谷胱甘肽取代或補(bǔ)充。
[0098]在依照本發(fā)明的這個(gè)或其他方面的特定情況下，包括納米顆粒的所述反應(yīng)產(chǎn)物，接受純化步驟以除去未反應(yīng)的游離肽，任選地，其中所述純化步驟包含使所述反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò) G-50Sephadex? 柱。
[0099]在依照本發(fā)明的這個(gè)或其他方面的特定情況下，所述方法可以進(jìn)一步包含以至少一種藥學(xué)可接受的載體、鹽或稀釋劑將所述納米顆粒配制成組合物的步驟。
[0100]在依照本發(fā)明的這個(gè)或其他方面的特定情況下，所述方法用于將所述所選肽經(jīng)由所述第二接頭附著至所述納米顆粒，從而使得具有所附著的所選肽的納米顆粒能夠被細(xì)胞內(nèi)化。
[0101]在依照本發(fā)明的這個(gè)或其他方面的特定情況下，所述方法用于將所述所選肽經(jīng)由所述第二接頭附著至所述納米顆粒，從而使得具有所附著的所選肽的納米顆粒能夠被抗原呈遞細(xì)胞(APC)內(nèi)化。
[0102]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于所選肽的細(xì)胞內(nèi)遞送的方法，其包含使細(xì)胞與本發(fā)明的納米顆粒或組合物接觸。
[0103]在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的納米顆粒或組合物在用于所選肽的細(xì)胞內(nèi)遞送中的用途。
[0104]本發(fā)明包括所述方面和優(yōu)選特征的組合，除了其中此類組合明顯不允許或陳述為特別避免之外。本發(fā)明的這些和進(jìn)一步方面和實(shí)施方案在下文且就伴隨實(shí)施例和附圖而言進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0105]附圖簡(jiǎn)述
[0106]圖1顯示了來(lái)自GNP的SIINFEKL (SEQ ID NO:2)呈遞:將LKb細(xì)胞接種到24孔板中，并使其附著過(guò)夜。接著，GNP被脈沖到lug/mL (綠色)、0.lug/mL (藍(lán)色)或0.01ug/mL(紅色)當(dāng)量的肽。兩小時(shí)后，洗滌細(xì)胞，并用25.Dl.16 (Angel)的抗體標(biāo)簽而進(jìn)行(A-D)流式細(xì)胞儀，或(E)結(jié)合B3Z CTL過(guò)夜共培養(yǎng)。第二天，裂解細(xì)胞并測(cè)量半乳糖苷酶的活性。
[0107]圖2 =GNP呈遞對(duì)比游離肽呈遞:(A_B)GNP8和9用S^hadex柱分離成15個(gè)級(jí)分，接著用UV吸收就蛋白質(zhì)水平對(duì)其分析。圖2A中的紅線(用圓圈表示)僅代表游離肽。(C-H)以標(biāo)注的GNP或相應(yīng)的標(biāo)注濃度的游離肽脈沖LKb細(xì)胞2小時(shí)(lug/mL肽(綠色)，0.1ug/mL(藍(lán)色)，或0.01ug/mL(紅色))。用(C-F)流式細(xì)胞儀或(G_H)B3Z測(cè)定法讀數(shù)。(1-N)以標(biāo)注的游離肽在冰上(1-K)或在37°C (L-N)脈沖LKb2小時(shí)。接著，用流式細(xì)胞儀就SIINFEKL(SEQ ID NO:2)的呈遞分析細(xì)胞。直方圖的紅色部分代表對(duì)比非脈沖細(xì)胞的陽(yáng)性染色。
[0108]圖3:來(lái)自缺乏游離肽的制備物的GNP呈遞:(A_B)GNP8和9的新制備物用Sephadex G_50柱分離成15個(gè)級(jí)分,接著用UV吸收就蛋白質(zhì)水平對(duì)其分析。箭頭表示哪些級(jí)分合并以供進(jìn)一步使用。(C-E，F(xiàn))以標(biāo)注濃度(lug/mL肽(綠色)，或0.lug/mL(紅色))的標(biāo)注的GNP先前制備物(舊GNP)或來(lái)自(A和B)的較新制備物(新GNP)脈沖LKb細(xì)胞2小時(shí)。用(C-E)流式細(xì)胞儀或(F)B3Z測(cè)定法讀數(shù)。
[0109]發(fā)明詳述
[0110]在描述本發(fā)明中，將采用下述術(shù)語(yǔ)并且意在如下所示定義。
[0111]如本文使用的，“納米顆?！敝妇哂屑{米級(jí)別的顆粒，并且不意于表達(dá)任何特別形狀限制。特別地，“納米顆粒”包含納米球、納米管、納米盒、納米簇、納米棒等。在特定實(shí)施方案中，本文考慮的納米顆粒和/或納米顆粒核一般具有多面體或球體幾何學(xué)。
[0112]包含多個(gè)含碳水化合物的配體的納米顆粒已在例如W02002/032404、W02004/108165, W 02005/116226, W02006/037979, W02007/015105, W02007/122388,W02005/091704 (其各自的完整內(nèi)容特別通過(guò)引用合并入本文)中描述，并且此類納米顆?？梢砸勒毡景l(fā)明使用。此外，包含由有機(jī)化合物官能化(例如經(jīng)由硫醇-金鍵)的氧化鐵鐵氧體(具有式XFe2O4，其中X=Fe、Mn或Co)的磁核的金涂布納米顆粒在EP2305310 (其完整內(nèi)容特別通過(guò)引用合并入本文)中描述，并且特別考慮作為納米顆粒/納米顆粒核依照本發(fā)明使用。
[0113]如本文使用的，“冠”指層或涂層，其可以部分或完全覆蓋納米顆粒核的暴露表面。冠包括多個(gè)配體，其包括至少一個(gè)碳水化合物部分、一個(gè)表面活性劑部分和/或一個(gè)谷胱甘肽部分。因此，冠可以視為圍繞或部分圍繞金屬性核的有機(jī)層。在特定實(shí)施方案中，冠提供和/或參與納米顆粒的核的鈍化。因此，在特定情況下，冠可以包括基本上穩(wěn)定化含金屬核的足夠完全的涂布層。然而，本文特別考慮具有核的特定納米顆粒，例如那些包括由貴金屬涂布的含金屬氧化物的內(nèi)核的，其可以包括僅部分涂布核表面的冠。在特定情況下，冠促進(jìn)本發(fā)明的納米顆粒的溶解性，如水溶性。
[0114]納米顆粒
[0115]納米顆粒是例如金屬或半導(dǎo)體原子的簇的小顆粒，其可以用作固定化配體的底物。
[0116]優(yōu)選地，所述納米顆粒具有的核具有0.5-50nm之間的平均直徑，更優(yōu)選0.5-10nm之間，更優(yōu)選0.5-5nm之間，還更優(yōu)選0.5_3nm之間且仍然更優(yōu)選0.5-2.5nm之間。除核之外還考慮配體時(shí)，優(yōu)選地所述顆粒的總平均直徑在5.0-1OOnm之間，更優(yōu)選5_50nm之間且最優(yōu)選5-10nm之間。平均直徑可以使用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)例如透射電子顯微鏡測(cè)量。
[0117]核材料可以是金屬或半導(dǎo)體且可以由多于一種類型的原子形成。優(yōu)選地，所述核材料是選自Au、Fe或Cu的金屬。納米顆粒核也可由包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd的合金形成，并且可以在本發(fā)明中使用。優(yōu)選的核材料是Au和Fe，而最優(yōu)選的金屬為Au。納米顆粒的核優(yōu)選地包含約100 - 500個(gè)的原子(例如金原子)以提供在納米范圍內(nèi)的核直徑。其他特別有用的核材料摻入一種或多種NMR活性的原子，其允許使用NMR在體外和體內(nèi)檢測(cè)所述納米顆粒。NMR活性原子的例子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和鑭系元素+3，或本申請(qǐng)別處所描述的量子點(diǎn)。
[0118]包含半導(dǎo)體原子的納米顆粒核可被檢測(cè)為能夠充當(dāng)量子點(diǎn)的納米級(jí)別的半導(dǎo)體晶體，即它們可以吸收光從而激發(fā)材料中的電子至更高的能量水平，隨后在材料的頻率特性釋放光的光子。半導(dǎo)體核材料的一個(gè)例子是硒化鎘、硫化鎘和碲化鎘。另外還包括鋅化合物，如硫化鋅。
[0119]在一些實(shí)施方案中，所述納米顆粒核可以是磁性的和包含磁性金屬原子，任選地與鈍態(tài)金屬原子組合。舉例，所述鈍態(tài)金屬可以是金、鉬、銀或銅，所述磁性金屬可以是鐵或釓。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鈍態(tài)金屬是金而磁性金屬是鐵。在這種情況下，方便起見(jiàn)核中鈍態(tài)金屬原子與磁性金屬原子的比例在約5:0.1-約2:5之間。更優(yōu)選地，該比例在約5:0.1-約5:1之間。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“鈍態(tài)金屬”指不顯示磁性質(zhì)并且對(duì)氧化化學(xué)穩(wěn)定的金屬。鈍態(tài)金屬可以是反磁性或超順磁性。優(yōu)選地，此類納米顆粒是超順磁性的。
[0120]具有包含順磁性金屬的核的納米顆粒的例子包括包含Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和鑭系元素+3的那些。
[0121]其他磁性納米顆粒可由例如MnFe (尖晶石鐵素體)的金屬形成或者CoFe (鈷鐵素體)可以形成納米顆粒(磁性流體，其加入或不加入以上定義的核材料)。用于制造此類納米顆粒的自組裝附著化學(xué)的例子在Biotechnol.Prog., 19:1095-100 (2003)、J.Am.Chem.Soc.125:9828-33(2003)和 J.Colloid Interface Sc1.255:293-8 (2002)中給出。
[0122]在一些實(shí)施方案中，所述納米顆?；蚱渑潴w包含可檢測(cè)標(biāo)簽。該標(biāo)簽可以是納米顆?；蚺潴w的核的元素。該標(biāo)簽可被檢測(cè)，是因?yàn)榧{米顆粒的那個(gè)元素的固有屬性或可通過(guò)與其他可被檢測(cè)的部分連接、綴合或關(guān)聯(lián)。標(biāo)簽的優(yōu)選例子包括的標(biāo)簽為:熒光基團(tuán)、放射性核素、磁性標(biāo)簽或染料。熒光基團(tuán)包括熒光素、若丹明或四甲基若丹明、德克薩斯-紅、Cy3, Cy5等，并且可以使用Raman散射光譜法通過(guò)熒光標(biāo)簽的激發(fā)和發(fā)射光的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)(Y.C.Cao, R.Jin, C.A.Mirkin, Science2002, 297:1536-1539)。
[0123]在一些實(shí)施方案中，納米顆?？梢园跈z測(cè)納米顆粒中使用的放射性核素，其使用由該放射性核素發(fā)射的放射性活度，例如通過(guò)使用PET、SPECT、或用于療法，例如用于殺死靶細(xì)胞?？扇菀椎剡m應(yīng)在本發(fā)明中使用的本領(lǐng)域中常用的放射性核素例子包括"mTc，其存在多種氧化態(tài)，盡管最穩(wěn)定的是TcO4- ；32P或33P ；57Co; 59Fe;通常用作Cu2+鹽的67Cu ;常用作Ga3+鹽的67Ga,例如檸檬酸鎵；68Ge; 82Sr; "Mo; ltl3Pd; —般用作In3+鹽的111In 般用作碘化鈉的 125I 或 131I ；137Cs;153Gd;153Sm;158Au;186Re; 一般用作 Tl+鹽例如氯化鉈的 2tllTl ；39Y3+ ；71LU3+ ;和24&2+。放射性核素作為標(biāo)簽和示蹤物的一般用途是本領(lǐng)域熟知的且技術(shù)人員可容易地使其適應(yīng)在本發(fā)明的各方面中使用。所述放射性核素可以這樣最容易地采用，即通過(guò)摻入所述納米顆粒核或?qū)⑺鼈儼ㄔ谧鳛楣潭ㄔ诩{米顆粒上的配體部分而存在的標(biāo)簽。
[0124]另外地或備選地，本發(fā)明的納米顆粒，或它們與其他種類相互作用的結(jié)果可使用許多本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)檢測(cè)，所述技術(shù)使用上述與納米顆粒相關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽或通過(guò)采用它們的屬性。檢測(cè)納 米顆粒的這些方法的范圍可以從檢測(cè)納米顆粒結(jié)合到其他種類時(shí)導(dǎo)致的聚集，例如通過(guò)簡(jiǎn)單的目視檢查或通過(guò)使用光散射(含納米顆粒溶液的透射率)，到使用復(fù)雜的技術(shù)如透射電子顯微鏡(TEM)或原子力顯微鏡(AFM)以可視化所述納米顆粒。檢測(cè)金屬顆粒的進(jìn)一步方法是采用等離子共振，該等離子共振是在金屬表面上電子的激發(fā)，其通常由光輻射引起。表面等離子共振(SPR)的現(xiàn)象存在于金屬(例如Ag或Au)與介電材料例如空氣或水的界面。與固定在納米顆粒表面上的配體結(jié)合的分析物改變所述界面的折射率時(shí)，發(fā)生SPR中的變化。SPR的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)是它可以用于監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)相互作用。如上所述，如果納米顆粒包括或摻入有NMR活性的原子，那么此項(xiàng)技術(shù)可以在體外或體內(nèi)檢測(cè)顆粒時(shí)使用，其中使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)。對(duì)納米顆粒的檢測(cè)也可以使用基于定量信號(hào)放大的系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用納米顆粒促進(jìn)的對(duì)銀的還原(I)。如果所述納米顆粒包括作為熒光探針的配體，則可使用熒光光譜法。同樣，對(duì)碳水化合物的同位素標(biāo)簽可以用來(lái)方便它們的檢測(cè)。
[0125]所詵狀
[0126]本發(fā)明的納米顆粒包含經(jīng)由接頭(“所述第二接頭”)共價(jià)連接至納米顆粒核的含肽的配體(“所述第二配體”)。所述第二配體包含適用于細(xì)胞內(nèi)遞送的肽。此“所選肽”可以是任何合適的肽。特別地，所述肽可以是能夠在遞送至細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)時(shí)發(fā)揮作用的較大多肽的片段。在特定情況下，所述所選肽可以是基于肽的藥物。在特定情況下，所述所選肽可包含在遞送至例如APC的細(xì)胞內(nèi)室時(shí)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的表位(“表位肽”)。在特定優(yōu)選的情況下，所述所選肽可以是結(jié)合于主要組織相容性復(fù)合體(MHC) I類分子或能夠被加工從而結(jié)合于MHCI類分子的肽。在依照本發(fā)明一些情況下，所述所選肽可以由8至40個(gè)氨基酸殘基的序列組成，例如8至12個(gè)氨基酸殘基的序列。在特定情況下，所述所選肽可以能夠被MHC I類分子呈遞從而刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。此種表位肽可形成腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或病原體相關(guān)抗原(例如病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)抗原)的至少一部分或者來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或 病原體相關(guān)抗原(例如病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)抗原)。在一些情況下，所述所選肽可以是肽藥物，例如靶向細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的一種肽。此種細(xì)胞內(nèi)靶向肽的一個(gè)例子是 GIPC-PDZ 域抑制劑，其描述于 Muders et al.，2009，Clin Cancer Res, Vol.15(12),PP.4095-4103(其完整內(nèi)容特別通過(guò)引用合并入本).[0127]施用和處理
[0128]本發(fā)明的納米顆粒和組合物可以通過(guò)任意數(shù)量的不同途徑施用于患者，其包括腸內(nèi)或腸胃外途徑。腸胃外施用包括通過(guò)下述途徑的施用:靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、鼻、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)上皮、腹膜內(nèi)和局部(包括皮膚、眼、直腸、鼻、吸入和氣霧劑)，以及直腸全身性途徑。
[0129]施用的執(zhí)行通過(guò)例如注射或沖擊地使用遞送槍以加速它們的透皮通道穿過(guò)表皮的外層。所述納米顆粒接著可以被例如樹(shù)突狀細(xì)胞攝取，所述納米顆粒當(dāng)它們通過(guò)淋巴系統(tǒng)遷移時(shí)成熟，導(dǎo)致對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)和針對(duì)表位肽和/或表位肽來(lái)自其中或形成其一部分的抗原的免疫接種。納米顆粒也可以以氣霧劑遞送。納米顆粒的小尺寸使其成為可能。
[0130]本發(fā)明的納米顆粒的超小尺寸對(duì)于遞送至細(xì)胞和組織中是很大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兗词巩?dāng)連接至靶向或治療性分子時(shí)仍可以被細(xì)胞攝取。因此，納米顆粒可被細(xì)胞例如APC內(nèi)化，肽被加工和釋放，例如用于經(jīng)由MHC I類的呈遞或用于與細(xì)胞內(nèi)組分的相互作用。
[0131]本發(fā)明的納米顆?？杀慌渲瞥煽赡苁枪腆w或液體組合物形式的藥物組合物。此種組合物將通常包含某種形式的載體，例如固體載體如明膠或佐劑或惰性稀釋劑，或者液體載體如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}水溶液、或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此種組合物和制備物通常含有至少0.lwt%的化合物。
[0132]對(duì)于靜脈內(nèi)，皮膚或皮下注射，或者注射在痛苦部位，活性成分將以不經(jīng)腸道的可接受的水溶液的形式，其是無(wú)熱原的并且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員完全能夠使用例如所述化合物或其衍生物的溶液以制備合適的溶液，例如在生理鹽水中，以甘油、液體聚乙二醇或油制備的分散物。
[0133]除了一種或多種化合物，任選地與其他活性成分組合，所述組合物可以包含一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑，等滲劑、防腐劑或抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他材料。此種材料應(yīng)該是無(wú)毒的，并且不應(yīng)與活性成分的功效干涉。所述載體或其他材料的確切性質(zhì)可取決于施用的途徑，例如口服或不經(jīng)腸道。
[0134]液體藥學(xué)組合物通常配制成具有在約3.0-9.0之間的pH，更優(yōu)選在約4.5-8.5之間并且仍然更優(yōu)選在約5.0-8.0之間。組合物的pH可以通過(guò)使用緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、Tris或組氨酸來(lái)維持，通常采用的范圍從約lmM-50mM。組合物的pH可以另外通過(guò)使用生理學(xué)可接受的酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)。
[0135]防腐劑通常包括在藥物組合物中以延緩微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)組合物的保質(zhì)期并且允許多次使用的包裝。防腐劑的例子包括苯酚、間甲酚、芐醇、對(duì)羥基苯甲酸及其酯、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、苯甲烴銨氯化物和芐索氯銨。防腐劑通常采用的范圍為約
0.1-1.0% (w/v)。
[0136]優(yōu)選地，所述藥學(xué)組合物以預(yù)防有效量或治療有效量(視情況而定，雖然預(yù)防可被視為治療)給個(gè)體，這足以顯示出對(duì)個(gè)體有利。通常，這將引起對(duì)個(gè)體有利的治療上有用的活性。所施用的化合物的實(shí)際量，以及施用的速率和時(shí)間過(guò)程將取決于所處理的病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。處理的處方例如劑量決定等在全科醫(yī)生和其它醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)，并且通常考慮所處理的病癥、個(gè)體患者的情況、遞送位點(diǎn)、施用方法和醫(yī)生已知的其他因素。上述技術(shù)和方案的例子可以在 Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition(eds.M.Ash and 1.Ash),2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, NewYork,USA) ;Remington’ s Pharmaceutical Sciences,20th Edition,2000, pub.Lippincott, ffilliams&ffilkins;以及 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2ndedition, 1994中找到。舉例為證，組合物優(yōu)選地施用于患者的劑量是每kg體重的活性化合物在約0.01-1OOmg之間，并且更優(yōu)選地在體重的0.5-10mg/kg之間。
[0137]可以理解，就處理腫瘤而言，處理包括醫(yī)師采取任何緩解腫瘤對(duì)患者的影響的措施。因此，盡管腫瘤的完全緩解是一個(gè)期望的目標(biāo)，有效的處理將也包括能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的部分緩解，以及減緩腫瘤包括癌轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)速率的任何措施。此種措施可有效延長(zhǎng)和/或提高生活質(zhì)量以及緩解疾病的癥狀。
[0138]免疫療法
[0139]本發(fā)明的組合物，例根據(jù)權(quán)利要求中定義的疫苗，在一些情況下可以用于疾病如癌癥的預(yù)防和處理，且更特殊地用于免疫療法。
[0140] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“免疫接種”表示主動(dòng)免疫，即因施用而產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，該施用為例如經(jīng)由皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服或經(jīng)鼻途徑的少量的抗原，該抗原被所接種個(gè)體識(shí)別為外源的，因此在合適的配方中是免疫原性的。因此抗原被用作免疫系統(tǒng)的“觸發(fā)”，以建立針對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答。[0141]依照本發(fā)明，免疫接種可以是治療性或預(yù)防性的。舉例為證，也許能夠通過(guò)對(duì)不患癌癥的個(gè)體進(jìn)行免疫接種而達(dá)到針對(duì)癌癥疾病的出現(xiàn)的預(yù)防性保護(hù)?？赡軕?yīng)用此種預(yù)防性接種疫苗的個(gè)體的例子是具有罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加的個(gè)體，盡管這種應(yīng)用不限于此種個(gè)體。處于癌癥風(fēng)險(xiǎn)的患者可以已經(jīng)產(chǎn)生腫瘤，無(wú)論是作為原發(fā)腫瘤還是轉(zhuǎn)移灶，或者顯示出癌癥的傾向。
[0142]對(duì)于依照本發(fā)明的癌癥患者的主動(dòng)免疫，納米顆粒通常配制成疫苗。優(yōu)選地，此種藥學(xué)制備物含有藥學(xué)可接受的載體，舉例，其可進(jìn)一步包含輔助物質(zhì)、緩沖液、鹽和/或防腐劑。所述藥學(xué)制備物可以，例如用于癌癥相關(guān)病況的預(yù)防和療法，如癌癥患者中的轉(zhuǎn)移形成。這樣，抗原呈遞細(xì)胞在體內(nèi)或也在離體被特別調(diào)制從而引起針對(duì)的TAA的免疫應(yīng)答。
[0143]對(duì)于以特定抗原或抗原組合的主動(dòng)免疫，通常使用含有免疫原的疫苗制劑-免疫原無(wú)論是天然的TAA或其表位，模擬物或新表位模擬物，-多半是在低濃度時(shí)，例如免疫原性量的范圍從0.01 μ g-10mg，但是劑量范圍可提高到范圍為100-500mg。取決于例如由外來(lái)種類的序列或通過(guò)衍生化決定的免疫接種抗原的免疫原性，或也取決于分別使用的輔助物質(zhì)或佐劑，所述合適的免疫原性劑量可選擇在例如的范圍為0.01 μ g-lmg，優(yōu)選100yg-500ygo但是，將在一個(gè)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)被遞送至生物體的儲(chǔ)庫(kù)疫苗也含有高得多的疫苗抗原量，例如至少Img-1OOmg以上。濃度將取決于施用的液體或懸浮疫苗的量。疫苗通常提供在即時(shí)可用的注射器或安瓿內(nèi)，具有的體積范圍從0.01-1ml，優(yōu)選0.1-0.75ml。
[0144]疫苗的組分的免疫接種抗原優(yōu)選是以藥學(xué)可接受的載體存在，其適合于皮下、肌內(nèi)以及還有皮內(nèi)或透皮施用。施用的進(jìn)一步模式經(jīng)由粘膜通道例如經(jīng)鼻或經(jīng)口施用的免疫接種發(fā)揮作用。如果采用固體物質(zhì)作為用于疫苗制劑的輔助劑，例如疫苗抗原的被吸附物或懸浮混合物將分別與輔助劑一起施用。在特定的實(shí)施方案中，疫苗作為水性溶劑中的溶液或液體疫苗存在。
[0145]優(yōu)選地，腫瘤疫苗的免疫接種單元已在合適的即可使用的注射器或安瓿中提供。所述疫苗的穩(wěn)定制劑可以有利地以即可使用的形式投放市場(chǎng)。盡管并不一定需要防腐劑如硫柳汞或具有改善的耐受性的其他防腐劑的組分，但為了從冷凍溫度升至室溫的儲(chǔ)存溫度下的較長(zhǎng)的穩(wěn)定性，它可提供于制劑中。但是依照本發(fā)明的疫苗也可以以冷凍或凍干形式提供，并且也可按要求分別被解凍或重構(gòu)。
[0146]在依照本發(fā)明的特定情況下，本發(fā)明的疫苗的免疫原性可通過(guò)采用佐劑而增加。出于這個(gè)目的，使用固體物質(zhì)或液體疫苗佐劑，例如氫氧化招(Alu-Gel)或磷酸招、生長(zhǎng)因子、淋巴因子、細(xì)胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、Y干擾素或補(bǔ)體因子如C3d，其他脂質(zhì)體制備物，又或者針對(duì)其免疫系統(tǒng)已經(jīng)引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的帶有額外抗原的制劑，如破傷風(fēng)類毒素、細(xì)菌毒素如假單胞菌外毒素和脂質(zhì)A及脂多糖的衍生物。
[0147]在特定情況下，不需要采用額外佐劑，特別地，本文所描述的例子顯示了 CTL應(yīng)答的有效產(chǎn)生通過(guò)使用無(wú)任何額外佐劑 的本發(fā)明的納米顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)通常與一種或多種佐劑施用的游離肽)。這在特定環(huán)境下是非常有利的，因?yàn)橐恍┳魟┍徽J(rèn)為是有毒的，或者不適合人類使用。
[0148]下文作為例子呈現(xiàn)且不應(yīng)解釋為對(duì)于權(quán)利要求的范圍的限制。
實(shí)施例[0149]實(shí)施例1-納米顆粒的合成與表征
[0150]測(cè)試配體和它們的識(shí)別號(hào)給出如下(分子wt)；
[0151]SIINFEKL (963) (SEQ ID NO:2)
[0152]SIINFEKL-N- (CH2)2-SH (1021)
[0153]FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1280) (SEQ ID NO:3)
[0154]FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1587) (SEQ ID NO:4)
[0155]AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1325) (SEQ ID NO:5)
[0156]HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL (1051)
[0157]HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL (1309)
[0158]HS (CH2) 2-C0NH-FLAAYSIINFEKL (1616)
[0159]HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL (1356)
[0160]HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_SIINFEKL (1471)
[0161 ] HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH-FLSIINFEKL (1732)
[0162]HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYS IINFEKL (2034)
[0163]HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH-AAYSIINFEKL (1774)
[0164]使用IOymole氯化金(Aldrich484385)、30 μ mole具有硫代乙接頭的葡萄糖(GlcC2)和1.5 μ mole肽配體(變量1.5_3mg)合成測(cè)試NP。
[0165]使用下述方法:將1.5 μ mole肽溶于2ml甲醇中，接著加入在200 μ I甲醇中的30 μ mole GlcC2和116 μ I含10 μ mole Au的水氯化金。將該樣品渦旋30秒，振蕩約5分鐘，然后在快速渦旋共30秒時(shí)加入200 μ I的IM NaBH4,密封試管，然后輕柔振蕩1.5小時(shí)。
[0166]將樣品在工作臺(tái)上旋轉(zhuǎn)除去上清液并將黑色團(tuán)塊溶于2ml水中，然后將其轉(zhuǎn)移至IOkDa vivaspin,并用2ml水洗漆4次,每次在5Krpm8分鐘。將納米顆粒(NP)從vivaspins移出，用水制成500 μ 1，它們接著接受15Krpm工作臺(tái)旋轉(zhuǎn)以除去任何大的聚集物。
[0167]內(nèi)部分析顯示旋轉(zhuǎn)/生產(chǎn)后的金含量低于100%，產(chǎn)量將是1.97mg;
[0168]
【權(quán)利要求】
1.一種納米顆粒，其包含: (i)包含金屬和/或半導(dǎo)體原子的核； (ii)包含共價(jià)連接至所述核的多個(gè)配體的冠，其中所述多個(gè)中的至少第一配體包含經(jīng)由第一接頭共價(jià)連接至所述核的碳水化合物部分或包含谷胱甘肽，并且其中所述多個(gè)中的至少第二配體包含經(jīng)由第二接頭共價(jià)連接至所述核的所選肽，所述第二接頭包含: 肽部分和非肽部分，其中所述第二接頭的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中: X1為選自A和G的氨基酸； X2為選自A和G的氨基酸；和 Z1為選自Y和F的氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的納米顆粒，其中第二接頭的所述非肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15 二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的納米顆粒，其中所述第一配體和/或所述第二配體經(jīng)由含硫基團(tuán)、含氨基基團(tuán)、含磷酸基團(tuán)或含氧基團(tuán)共價(jià)連接至核。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述第二接頭的所述肽部分包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成:
(i)AAY;和
(ii)FLAAY (SEQ ID NO:1)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述第二接頭選自:
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAy;
(ii)HS-(CH2) 2-C0NH-FLAAY;
(iii)HS-(CH2) 3-CONH-AAY;
(iv)HS- (CH2) 3-CONH-FLAAY;
(V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAY;和
(vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAY， 其中所述第二接頭經(jīng)由所述接頭的非肽部分的硫醇基團(tuán)共價(jià)連接至所述核。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述所選肽經(jīng)由其N-末端連接至所述第二接頭的所述肽部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的納米顆粒，其中所述第二配體選自:
(i)HS- (CH2) 2-C0NH-AAYZ2;
(ii)HS-(CH2) 2-C0NH-FLAAYZ2;
(iii)HS-(CH2) 3-C0NH-AAYZ2;
(iv)HS- (CH2) 3-C0NH-FLAAYZ2;
(V) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_AAYZ2;和
(vi) HS- (CH2) 10- (CH2OCH2) 7-C0NH_FLAAYZ2， 其中Z2代表所述所選肽。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述所選肽是與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類分子結(jié)合的表位肽，或者其能夠經(jīng)過(guò)加工從而結(jié)合于MHC I類分子。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述所選肽由8至40個(gè)氨基酸殘基的序列組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的納米顆粒，其中所述所選肽由8至12個(gè)氨基酸殘基的序列組成。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所選肽是能夠被MHCI類分子呈遞從而刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的表位肽。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所選肽形成腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或病毒_、細(xì)菌_、或寄生蟲(chóng)相關(guān)的抗原的至少一部分或者來(lái)自腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或病毒_、細(xì)菌_、或寄生蟲(chóng)相關(guān)的抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的納米顆粒，其中所述TAA是肺癌抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的納米顆粒，其中所述肺癌選自:小細(xì)胞肺癌和任何非小細(xì)胞肺癌,任選地,其中所述非小細(xì)胞肺癌包括腺癌。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的納米顆粒，其中所述病原體相關(guān)的抗原是病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)抗原。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述的所選肽來(lái)自卵白蛋白(OVA)0
17.根據(jù)權(quán)利要求16的納米顆粒，其中所選肽包含氨基酸序列SIINFEKL(SEQID NO:2)或由氨基酸序列SIINFEKL (SEQ ID NO:2)組成。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中: (i)所述第一配體的碳水化合物部分包含單糖和/或二糖；和/或 (ii)所述多個(gè)配體包含經(jīng)由谷胱甘肽硫原子共價(jià)連接至所述納米顆粒的核的至少一個(gè)谷胱甘肽配體；和/或 (iii)所述多個(gè)配體包含: (a)葡萄糖； (b)N-乙酰氨基葡萄糖； (C)谷胱甘肽； Cd)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖； (e)葡萄糖和谷胱甘肽； (f)N-乙酰氨基葡 萄糖和谷胱甘肽；或 (g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18(i)的納米顆粒，其中所述碳水化合物部分包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述第一接頭包含C2-C15烷基和/或 C2-C15 二醇。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述第一配體包含經(jīng)由硫醇硫原子共價(jià)附著至核的2’ -硫乙基-β -D-吡喃葡萄糖苷或2’ -硫乙基-a -D-吡喃葡萄糖苷。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50個(gè)含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5個(gè)的含目的肽的配體。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體與含目的肽的配體的摩爾比的范圍為5:1至100:1。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的納米顆粒，其中含碳水化合物的配體和/或谷胱甘肽配體與含目的肽的配體的摩爾比的范圍為10:1至30:1。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述納米顆粒的核的直徑的范圍為Inm 至 5nm。
27.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述納米顆粒包括其配體的直徑的范圍為5nm至20nm,任選地5nm至15nm,或8nm至10nm。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述核包含選自下述的金屬:Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd、Zn 或其任何組合。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的納米顆粒,其中所述核包含選自下述的鈍態(tài)金屬:Au、Ag、Pt、Pd、Cu或其任何組合。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的納米顆粒,其中所述核包含選自下述的金屬的組合:Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd 和 Au/Fe/Cu/Gd。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述核是磁性的。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述核進(jìn)一步包含選自下述的NMR活性原子:Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+ 和鑭系元素 3+。
33.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的納米顆粒，其中所述核包含半導(dǎo)體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的納米顆粒，其中所述半導(dǎo)體選自:硒化鎘、硫化鎘、碲化鎘和硫化鋅。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或權(quán)利要求34的納米顆粒，其中所述核能夠作為量子點(diǎn)。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述納米顆粒包含至少兩個(gè)含所選肽的配體，并且其中至少兩個(gè)含所選肽的配體各自的所述所選肽不同。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的納米顆粒，其中所述至少兩個(gè)含所選肽的配體的所選肽各自形成一種或多種TAA的至少一部分或各自來(lái)自一種或多種TAA。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的納米顆粒，其中所述至少兩個(gè)含所選肽的配體的所選肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或各自來(lái)自不同的肺癌TAA。
39.一種組合物，其包含如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定義的多個(gè)納米顆粒。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種藥學(xué)可接受的載體、鹽和/或稀釋劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或權(quán)利要求40的組合物，其中所述組合物包含具有第一含所選肽的配體的第一種類納米顆粒和具有第二含所選肽的配體的第二種類納米顆粒，其中所述第一和第二種類的所選肽不同。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的組合物，其中所述第一和第二種類納米顆粒各自的所選肽形成一種或多種TAA的至少一部分或者各自來(lái)自一種或多種TAA。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其中所述第一和第二種類納米顆粒各自的所選肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自來(lái)自不同的肺癌TAA。
44.根據(jù)權(quán)利要求41至43中任一項(xiàng)的組合物，其包含至少3、至少4、至少5或至少10個(gè)不同種類的納米顆粒 的庫(kù)，各個(gè)種類具有不同的所選肽。
45.根據(jù)權(quán)利要求39至44中任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種佐劑。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的組合物，其中所述佐劑共價(jià)附著至至少一個(gè)納米顆粒的核。
47.根據(jù)權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的組合物，其中所述佐劑包含(S)-(2，3-雙(棕櫚酰氧基)_(2RS)_丙基)-N-棕櫚?；?(R)-半胱氨酸-(S)-絲氨酸(S)-賴氨酸4-OH( “Pam3Cys”)。
48.根據(jù)權(quán)利要求39至44中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物基本上不含佐劑或由納米顆粒提供唯一的佐劑功效。
49.一種疫苗，其包含權(quán)利要求39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的疫苗，其中所述疫苗用于癌癥的治療性或預(yù)防性處理。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的疫苗，其中所述癌癥是肺癌。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的疫苗，其中所述肺癌選自:小細(xì)胞肺癌和任何非小細(xì)胞肺癌，任選地，其中所述非小細(xì)胞肺癌包含腺癌。
53.根據(jù)I至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆粒，根據(jù)39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物或者根據(jù)49至52中任一項(xiàng)所定義的疫苗，用于在藥物中使用。
54.根據(jù)I至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆粒，根據(jù)39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物或者根據(jù)49至52中任一項(xiàng)所定義的疫苗，用于在處理哺乳動(dòng)物受試者中的癌癥或病原體感染的方法中使用。
55.根據(jù)I至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆粒，根據(jù)39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物或者根據(jù)49至52中任一項(xiàng)所定義的疫苗，用于在處理哺乳動(dòng)物受試者中的肺癌的方法中使用。
56.在根據(jù)權(quán)利要求55的方法中使用的納米顆粒、組合物或疫苗，其中所述肺癌選自:小細(xì)胞肺癌和任何非小細(xì)胞肺癌，任選地，其中所述非小細(xì)胞肺癌包含腺癌。
57.根據(jù)I至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆粒、根據(jù)39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物或者根據(jù)49至52中任一項(xiàng)所定義的疫苗在制備用于在處理哺乳動(dòng)物受試者中的癌癥或病原體感染的藥物中的用途。
58.根據(jù)I至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆粒、根據(jù)39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物或者根據(jù)49至52中任一項(xiàng)所定義的疫苗在制備用于處理哺乳動(dòng)物受試者中的肺癌的藥物中的用途。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的用途,其中所述肺癌選自:小細(xì)胞肺癌和任何非小細(xì)胞肺癌,任選地，其中所述非小細(xì)胞肺癌包含腺癌。
60.根據(jù)權(quán)利要求53至56中任一項(xiàng)的納米顆粒、組合物或疫苗，或者根據(jù)權(quán)利要求57至59中任一項(xiàng)的用途，其中所述納米顆粒、組合物、疫苗或藥物用于經(jīng)由淋巴攝取的施用。
61.癌癥或病原體感染的預(yù)防性或治療性處理的方法，其包含對(duì)有此需要的哺乳動(dòng)物受試者施用預(yù)防或治療足夠量的根據(jù)I至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆粒、根據(jù)39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物、根據(jù)49至52中任一項(xiàng)所定義的疫苗。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述癌癥是肺癌。
63.根據(jù)權(quán)利要求61或權(quán)利要求62的方法，其中所述肺癌選自:小細(xì)胞肺癌和任何非小細(xì)胞肺癌，任選地，其中所述非小細(xì)胞肺癌包括腺癌。
64.根據(jù)權(quán)利要求61至63中任一項(xiàng)的方法，其中所述納米顆粒、組合物或疫苗施用于用于淋巴攝取的位點(diǎn)。
65.一種產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的體外或體內(nèi)方法，其包含: (i)使至少一種抗原呈遞細(xì)胞(APC)與權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)所定義的至少一種納米顆粒接觸，從而使得所述所選肽被呈遞到所述APC的MHC I類分子上；和 (ii)使所述至少一個(gè)(i)中的APC與至少一個(gè)CTL細(xì)胞接觸，從而使得所述CTL細(xì)胞由所述APC激活以產(chǎn)生對(duì)所述所選肽特異性的CTL應(yīng)答，其中所述所選肽是表位肽。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的體外方法，其中所述APC是在所述納米顆粒存在下進(jìn)行培養(yǎng)，并且同時(shí)或相繼地，與所述CTL細(xì)胞共培養(yǎng)。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述APC在與納米顆粒接觸后、與所述CTL細(xì)胞共培養(yǎng)前接受洗滌步驟。
68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其進(jìn)一步包含對(duì)哺乳動(dòng)物受試者施用CTL細(xì)胞。
69.根據(jù)權(quán)利要求65的體內(nèi)方法，其中所述納米顆粒由選自下述的施用途徑遞送: 在淋巴攝取的位點(diǎn)或其附近向哺乳動(dòng)物受試者的器官或組織中注射； 經(jīng)由噴霧或凝膠的鼻腔遞送； 經(jīng)由噴霧或凝膠或口服可溶解薄膜的頰遞送； 經(jīng)由可溶解薄膜的口腔遞送； 經(jīng)由摻入納米顆粒的貼片的透皮遞送；和 包含納米顆粒的組合物的吸入遞送。
70.根據(jù)權(quán)利要求65至69中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一個(gè)納米顆粒包含具有不同所選肽的納米顆粒的庫(kù)。
71.根據(jù)權(quán)利要求65至66中任一項(xiàng)的方法,其中所述CTL應(yīng)答包含一種或多種細(xì)胞因子的生產(chǎn)。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的方法，其中所述一種或多種細(xì)胞因子包含干擾素Y(IFN-Y)0
73.制造根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)的納米顆粒的方法，其包含: 衍生具有第一接頭的所述碳水化合物； 衍生具有第二接頭的所述所選肽；和 使第一接頭-衍生的碳水化合物和第二接頭-衍生的所選肽與反應(yīng)物反應(yīng)，用于制造納米顆粒的核，使得在納米顆粒的自組裝過(guò)程中，所述納米顆粒核經(jīng)由它們各自的接頭附著碳水化合物和所選肽。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含衍生的碳水化合物、衍生的所選肽、金屬和/或半導(dǎo)體原子的鹽以及還原劑以制造納米顆粒。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的方法，其中包括納米顆粒的所述反應(yīng)產(chǎn)物，接受純化步驟以除去未反應(yīng)的游離肽，任選地，其中所述純化步驟包含使所述反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)G-50Sephadex?柱。
76.根據(jù)權(quán)利要求73至75中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包含以至少一種藥學(xué)可接受的載體、鹽或稀釋劑將所述納米顆粒配制成組合物的步驟。
77.根據(jù)權(quán)利要求73至76中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是用于將所述所選肽經(jīng)由所述第二接頭附著至所述納米顆粒，從而使得具有所附著的所選肽的納米顆粒能夠被細(xì)胞內(nèi)化。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的方法，其中所述方法是用于將所述所選肽經(jīng)由所述第二接頭附著至所述納米顆粒，從而使得具有所附著的所選肽的納米顆粒能夠被抗原呈遞細(xì)胞(APC)內(nèi)化。
79.一種用于所選肽的 細(xì)胞內(nèi)遞送的方法，其包含使細(xì)胞與權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆?；驒?quán)利要求39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物接觸。
80.權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)所定義的納米顆粒或權(quán)利要求39至48中任一項(xiàng)所定義的組合物用于所選肽的細(xì)胞內(nèi)遞送中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK103917249SQ201280049979
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月7日
【發(fā)明者】T·雷德梅徹爾, P·威廉姆斯 申請(qǐng)人:Mida科技有限公司