專利名稱：納米粒組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療組合物和應用作為傳遞載體的納米粒制劑的方法。納
親和部分。納米粒還任選包含用于立體穩(wěn)定性和延長循環(huán)的親水聚合物的表面包衣。
背景技術：
納米?？梢杂糜诙喾N治療目的，特別是用于通過全身施用納米粒將治療劑攜帶至靶細胞。
由于多種原因，可能希望應用納米粒^床護治療劑。為了開發(fā)二膦酸鹽類藥物的治療作用，必須以某種方式改變藥物的分布以便治療劑可以有效與治療目標的靶表面特異性相互作用。因此，希望提供治療性納米粒組合物。
發(fā)明概述
一方面，本發(fā)明包括基于納米粒治療哺乳動物個體的方法，該方法包
括給個體全身施用納米粒，所述的納米粒包含
(i) 聚合物基質；和
(ii) 治療劑。
聚合物基質給治療劑提供了保護，該治療劑在傳統(tǒng)制劑中是溶液形式并且快速分布至全身。
基于嚢泡的納米粒，例如脂質體制劑是另外的用于靶向藥物傳遞的治療劑的施用方法。在二膦酸鹽的情況中，令人驚奇的是發(fā)現(xiàn)了此類嚢泡制劑實際上可以引起低鈣血癥，這是由于全身施用后嚢泡中的鉤與周圍的介質隔離的原因。這最終可能引起中毒(參見脂質體專利)。如本發(fā)明所述，在基于聚合物基質的納米粒的情況中，所述的鈣離子的隔離將被避免并且因此希望此類制劑提供與基于嚢泡的系統(tǒng)比較更優(yōu)越的安全性。另一方面，本發(fā)明包括基于納米粒治療哺乳動物個體的方法，該方法
包括給個體全身施用納米粒，所述的納米粒包含
(i) 聚合物基質；
(ii) 治療劑；
(iii) 用于立體穩(wěn)定性和延長循環(huán)的親水聚合物包衣；以及任選
(iv) 有效與治療目標的耙表面特異性結合的親和部分。 親水聚合物包衣包含或者在納米粒中與聚合物基質表面組分共價連接
或者通過電荷相互作用吸附在聚合物基質表面上的聚合物鏈。 在一個實施方案中，聚合物基質包含鉤離子。
在一個實施方案中，當治療劑施用于靶區(qū)域時，親和部分是在靼區(qū)域 有效與受體特異性結合的配體，并且納米粒包含包埋形式的治療劑。該實 施方案的實例是治療實體瘤，其中親和部分有效與腫瘤特異性受體或抗原 特異性結合，納米粒的平均粒徑為約10 nm至約500 nm之間并且包含包 埋的藥物。
在一個實施方案中，聚合物基質包含乳酸和乙醇酸的共聚物。
發(fā)明詳述
I.納米并立組合物
用于基于納米粒治療的納米粒具有至少一個具有外表面的外層?？梢?br> 理解的是納米粒可以包含另外的層。在一種情況中，外層或者包含共價連
接的親水聚合物，其依次與靼部分共價連接。在另外的情況中，外層包含 一端與靶部分共價連接并且另一端也通過靜電相互作用與電荷部分共價連
接的親水聚合物。電荷部分選自多種氨基酸或基于氨基酸的聚合物，其與 聚合物基質具有相反的電荷。
納米粒包含聚合物基質，該聚合物基質包含在暴露用于與耙相互作用 之前有效保護治療劑免于滲漏的二價陽離子。二價陽離子基質增加了包嚢 的有效性和治療劑的藥物載量并且通過包埋藥物降低了治療劑穿過納米粒 的通透性。二價陽離子基質有助于包埋高溶解性的治療劑。另外，二價陽 離子可以易于將治療劑更有效地傳遞至腫瘤。
在一個實施方案中，將鈣離子摻入至納米粒中在靶標作用之前幫助保持活性藥物免于M。
施用于靶細胞或靶區(qū)域的治療劑包埋于納米粒中。如本文所應用的，
治療劑、化合物和藥物可以互^L應用。
包埋的治療劑可以是任何可以包埋于聚合物基質中的大量治療劑，包 括水溶性物質、親脂化合物或可以例如通過靜電連接與嚢泡外表面穩(wěn)定連 接的物質。示例性的水溶性化合物包括二膦酸鹽類藥物。治療劑的實例是 取代的烷二膦酸，特別是式(I)的雜芳基烷二膦酸，及其鹽、所述化合物的
制劑、包含它們的藥物組合物以及其作為藥物的用途
po3h2
—r2
r1——c h.
po，h.
其中
Rl是5-元雜芳基，其包含作為雜原子的2-4個N-原子或者1或2個 N-原子以及1個O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基團C-取 代的低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或面素取代的苯基， 或低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷l^克代和/或囟素，和/或 是在N-原子上N-取代的，其可以被低級垸基、低級烷氧基和/或卣素取代； 并且
R2是氬、羥基、 、低級烷^^克代或卣素。
包含2-4個N-原子或者1或2個N-原子以及1個O-或S-原子作為雜 原子的5-元雜芳基的實例是咪唑基(例如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪唑-4-基)、吡唑基(例如吡唾-l-基或吡唑-3-基)、蓉峻基(例如蓬唑-2-基或塞峻-4-基)，或者更少優(yōu)選噁唑基(例如噁唑-2-基或噁唑-4-基)、異噴、唑基(例如異 ，懲唑-3-基或異嗜、唑-4-基)、三唑基(例如1H-l，2，4-三唑-l-基、4H-l，2，4-三哇 -3-基或4H-l,2，4-三唑-4-基或2H-l，2，3-三唑-4-基)、四唑基(例如四唑-5-基)、 蓉二唑基(例如1，2,5-蓉二唑-3-基)和嗜、二唑基(例如1，3,4-嗜、二唑-2-基)。這 些基團可以包含一個或多個相同的或不同的、優(yōu)選一個或兩個相同的或不 同的取代基，所述的取代基選自上文提及的基團?；鶊FRl(如上所述未取 代的或取代的)是例如咪唑-2-基或咪唑-4-基，其是未取代的或者被苯基或
8如上所述被取代的苯基C-取代，或者被d-C4烷基(例如甲基)C-或N-取代， 并且典型地是咪唑-2-基、l-CrC4烷基咪唑-2-基(例如l-曱基咪唑-2-基)或 者2-或5-C廣C4烷基咪唑-4-基(例如2-或5-甲基咪喳-4-基)；未取代的噻唑 基(例如噻唑-2-基)；或lH-l，2，4-三唑基，其是未取代的或被C廣C4烷基(例 如曱基)取代，例如l-C廣C4烷基-lH-l,2，4-三唑-5-基(例如1-甲基-lH-l,2，4-三唑-5-基)；或者咪唑-l-基、吡唑基-l-基、lH-l，2，4-三唑-l-基、4H-1,2，4-三唑-4-基或四哇-l-基，它們是未取代的或者被苯基或如上所述被取代的苯 基C-取代或者被d-C4烷基(例如甲基)C-取代，例如咪唑-l-基、2-、 4-或 5-C廣C4烷基咪唑-l-基(例如2-、 4-或5-甲基咪唑-l-基)、吡唑-l-基、3-或 4-d-d烷基吡唑-l-基(例如3-或4-曱基吡唑-l-基)、1H-l，2，4-四唑-l-基、 3-C廣C4烷基-lH-l，2，4-三唑-l-基(例如3-甲基-lH-l，2，4-三唑-l-基)、 411-1，2，4-三唑-1-基、3-<:1畫<:4烷基-411-1，2,4-三唑-4-基(例如3-曱基畫411-1，2，4-三唑-4-基)或1H-l，2，4-四唑-l-基。
下文被術語"低級，，限定的基團或化合物應當被理解為典型地指的是 包含至多7個(包括7個)碳原子、優(yōu)選至多4個(包括4個)碳原子的那些。 通用術語具有例如以下含義
低級烷基是例如d-C4烷基，例如曱基、乙基、丙基或丁基，并且也 可以是異丁基、仲丁基或叔丁基，并且可以進一步是Cs-C7烷基，例如戊 基、己基或庚基。
苯基-低級烷基是例如苯基-d-C4烷基，優(yōu)選l-苯基-CVC4烷基，例如芐基。
低級烷氧基是例如d-C4烷氧基，例如曱氧基、乙氧基、丙氧基、異 丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。
二-低級烷基氨基是例如二-C廣C4烷基^，例如二曱基M、 二乙基
氨基、N-乙基-N-甲基氨基、二丙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基或二丁基氨基。
低級烷l^fu代是例如C廣C4烷^i^克代，例如甲^^克代、乙J^危代、丙 !^危代或丁基硫代，并且也可以是異丁基疏代、仲丁基硫代或叔丁基硫代。
鹵素是例如具有至多35(包括35)原子數(shù)的卣素，包括例如氟、氯或溴。
9式(I)化合物的鹽特別是其與可藥用堿的鹽，例如衍生自Ia、 Ib、 IIa 和lib族的無毒金屬鹽，例如堿金屬鹽，優(yōu)選鈉鹽或鉀鹽，堿土金屬鹽， 優(yōu)選鉀鹽或鎂鹽，銅鹽、鋁鹽或鋅鹽，以及與氨或有機胺或季銨堿的銨鹽， 所述的氨或有機胺或季銨堿例如游離或C-羥基化的脂肪族胺，優(yōu)選單-、 二-或三-低級烷基胺(例如甲基胺、乙基胺、二甲基胺或二乙基胺)、單-、 二-或三(羥基-低級烷基)胺(例如乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺)、三(羥基甲 基)氨基曱烷或2-羥基-叔丁基胺，或N-(羥基-低級烷基)-N，N-二-低級烷基 胺或N-(多羥基-低級烷基)-N-低級烷基胺(例如2-(二甲基氨基)乙醇或D-葡 糖胺)，或季脂肪族氬氧化銨，例如四丁基氫氧化銨。
在該關系中，還應當提及的是式(I)化合物也可以以內鹽的形式獲得， 條件是基團Rl具有足夠的堿性。因此，這些化合物也可以通過用強質子 酸處理轉化為相應的酸加成鹽，所述的強質子酸例如氫卣酸、硫酸、磺酸(例 如甲磺酸或對甲^t酸)或M磺酸(例如N-環(huán)己基M磺酸)。
在一個實施方案中，治療劑是式(I)化合物，及其鹽，特別是內鹽和其 與堿的可藥用鹽，
其中
Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基、1H-l，2,4-三唑基或4H-1，2，4-三唑基、四唑基、喁唑基、異鳴唑基、喁二唑基、瘞唑基或瘞二唑基，其 是未取代的或者被一個或兩個選自下列的基團C-取代低級烷基、低級烷 氧基、苯基或依次被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基和/或卣素的基 團取代的苯基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷基硫代和/或卣素，和/或 是在N-原子上N-取代的，其可以被低級烷基或苯基-低級烷基(其是未取代 的或者被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基和/或卣素的基團取代)取 代；并且
R2是氫、羥基、氨基、低級烷1^克代或鹵素。
在一個實施方案中，治療劑是式(I)化合物，及其鹽，特別是內鹽和其 與堿的可藥用鹽， 其中
Rl是咪唑基、吡唑基、2H-l，2，3-三唑基或4H-l，2，4-三唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、噻唑基或噻二唑基，其是未取代的或者被
一個或兩個選自下列的基團C-取代低級烷基、低級烷氧基、苯基或依次 被一個或兩個選自低級烷基、低級烷氧基和/或卣素的基團取代的苯基、羥 基、二-低級烷基氨基、低級烷l^克代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低級烷基或苯基-低級烷基(其是未取代的或者被一個或 兩個選自低級烷基、低級烷氧基和/或囟素的基團取代)取代；并且 R2是氫、羥基、氨基、低級烷J^克代或鹵素。
在一個實施方案中，治療劑是式(I)化合物，及其鹽，特別是內鹽和其 與堿的可藥用鹽， 其中
Rl是咪唑基(例如咪唑-l-基、咪唑-2-基或咪唑-4-基)、4H-l，2,4-三唑基 (例如4H-l，2，4-三唑-4-基)或瘞唑基(例如瘞唑-2-基)，該基團是未取代的或 者被一個或兩個選自下列的基團C-取代CrC4烷基(例如甲基)、C,-C4烷
氧基(例如甲氧基)、苯基、羥基、二-C廣C4烷基氨基(例如二甲基氨基或二
乙基氨基)、CrC4烷基硫代(例如甲基硫代)和/或具有至多35(包括35)原子 數(shù)的卣素(例如氯)，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被d-C4烷基(例 如甲基)或苯基-CrC4烷基(例如千基)取代；并且 R2優(yōu)選是羥基或較少優(yōu)選氫或氨基。
在一個實施方案中，治療劑是式(I)化合物，及其鹽，特別是可藥用鹽， 其中
Rl是咪哇-2-或-4-基，其是未取代的或者被苯基C-取代或者被d-C4 烷基(例如甲基)C-或N-取代，例如咪唑-2-基、l-C廣C4烷基咪唑-2-基(例如 l-甲基咪唑-2-基)，或者2-或5-d-C4烷基咪唑-4-基(例如2-或5-甲基咪唑 -4-基，或者是未取代的噻唑基(例如噻唑-2-基)，或者是1H-l，2，4-三唑基(其 是未取代的或者被d-C4烷基(例如曱基)取代，例如l-C廣C4烷基-lH-l，2，4-三唑-5-基(例如l-甲基-lH-l，2，4-三唑-5-基))；并且
R2是羥基或較少優(yōu)選氫。
在一個實施方案中，治療劑是式(I)化合物，及其鹽，特別是可藥用鹽， 其中Rl是咪峻陽l畫基、p比喳-l-基、lH誦l，2，4畫三唑-l-基、4H畫l，2,4-三峻-4-基 或四唑-l-基(其是未取代的或者被苯基或d-C4烷基(例如曱基)C-取代)，例 如咪唑-l-基、2-、 4-或5-d-C4烷基咪唑-l-基(例如2-、 4-或5-甲基咪唑-1-基)、p比哇-1-基、3-或4-C廣C4烷基吡唑-l-基(例如3-或4-曱基吡唑-l-基)、 111-1，2，4-四唑-1-基、3-(:1-(:4烷基-111-1，2，4-三唑-1-基(例如3-曱基-111-1，2，4-三哇腳l-基)、4H-l，2，4-三唑-l國基、3畫d-C4烷基-4H-l，2，4-三唑-4-基(例如3-曱基-4H-l，2，4-三唑-4-基)或1H-四哇-l-基；并且
R2是羥基或較少優(yōu)選氫。
在一個實施方案中，治療劑是式(I)化合物，及其鹽，特別是可藥用鹽， 其中
Rl是咪唑基(其是未取代的或者被d-C4烷基(例如甲基)取代)，例如 咪唑-l-基、咪唑-2-基、l-甲基咪唑-2-基、咪唑-4-基或者2-或5-曱基咪唑-4-基；并且
R2是羥基或較少優(yōu)選氫。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，納米粒包含用于治療實體瘤的包埋的藥 物，例如喳來膦酸。
納米粒的外表面可以包含親水聚合物的表面包衣，所述的親水聚合物 包含親水聚合物鏈，其優(yōu)選濃密填充以形成有效保護納米粒表面組分的刷 子樣包衣。根據(jù)本發(fā)明，親水聚合物鏈在化學上與納米粒聚合物連接或者 無需任何化學鍵而吸附。
納米粒的外表面可以包含親和部分，該部分有效與基于納米粒治療目 標的靼標、例如生物表面例如細胞膜、細胞基質、組織或或乾表面或耙區(qū) 域特異性結合。親和部分通過共價連接以及與納米粒的表面組分和/或親水 聚合物包衣的靜電相互作用而與納米粒外表面結合。親和部分是有效與靼 標上攜帶的配體結合分子特異性結合并且具有高親和力的配體。例如，在 一個實施方案中，親和部分有效與實體瘤中過表達的肺瘤特異性抗原和/ 或受體結合，并且在另外的實施方案中，親和部分有效與炎癥部位的細胞 結合。在另外的實施方案中，親和部分是維生素、多肽或多糖或蛋白質效 應器。
12本發(fā)明的納米粒用于給靶標施用治療劑。治療劑包埋于納米粒中。 本發(fā)明的納米粒組合物主要包含聚合物基質。此類聚合物基質的納米
粒組合物
(a) 可以通過乳化形成；
(b) 沉淀或表面沉積方法；或
(c) 可以通過本領域已知的其它納米粒制備方法形成。
形成納米?；|的聚合物包括聚交酯、聚乙醇酸交酯以及前述聚合物 的共聚物(通常稱為聚乳酸乙醇酸或PLGA)、聚氛基酸、聚氨基酸共聚物、 葡糖胺基葡聚糖、富含脂質的(lipidated)葡糖胺基葡聚糖等。
另外，選擇聚合物以獲得特別程度的流動性或硬度，控制納米粒在血 漿中的穩(wěn)定性并且控制納米粒中包埋的物質的釋方文速率。由聚合物確定的 納米粒的硬度也可以在納米粒與靶細胞融合中發(fā)揮作用，其將在下文中描 述。
本發(fā)明的納米?？梢园H水聚合物包衣，該包衣包含與納米粒表面 連接的聚合物鏈。所述的親水聚合物鏈摻入至納米粒中，包含約l-20摩爾 百分比的親水聚合物-聚合物基質結合物。適合用于聚合物包衣的親水聚合 物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、 聚羥基丙基^惡唑啉、聚羥基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲 基丙烯酰胺、聚羥基丙基甲基丙烯酸酯、聚羥基乙基丙烯酸酯、羥曱基纖 維素、羥乙基纖維素、聚乙二醇、聚丙三醇和聚天冬酰胺、透明質酸、聚 氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、卵磷脂、聚乙烯醇。
在優(yōu)選的實施方案中，親水聚合物是聚乙二醇(PEG)，優(yōu)選具有 500-10,000道爾頓之間、更優(yōu)選2,000-10,000道爾頓之間并且最優(yōu)選 1,000-5,000道爾頓之間分子量的PEG鏈。
在另外優(yōu)選的實施方案中，親水聚合物是聚丙三醇(PG)，優(yōu)選具有 400-2000道爾頓之間、更優(yōu)選500-1,000道爾頓之間并且最優(yōu)選600-700 道爾頓之間分子量的PG鏈。
本發(fā)明的納米粒組合物可以包含親和部分。親和部分通常有效與靼標， 即生物表面例如靶細胞表面或膜、細胞表面受體、細胞基質、斑塊區(qū)域等
13特異性結合。親和部分通過直接與聚合物基質的聚合物組分連接或者通過 與親水聚合物鏈連接而與納米粒表面連接，其將在下文描述。
在一個實施方案中，親和部分是有效在靶區(qū)域與受體特異性結合的配 體，更特別的是，它是與靶細胞上的受體結合的配體。適合該目的的配體 的非限制性實例在表1中列出。
表l配體-受體對和相關的耙細胞
葉酸鹽葉酸鹽受體上皮癌、骨髓干細胞
水溶性維生素維生素受體多種細胞
磷酸吡,醇(PyridoxylCD4CD4+淋巴細胞
phosphate)肝細胞
載脂蛋白血管內皮細胞
胰島素胰島素受體
轉鐵蛋白轉移受體內皮細胞(腦)
半乳糖脫唾液酸糖蛋白肝細胞
Sialyl-Lewis*E,P選擇蛋白活化的內皮細胞
VEGFFk-1，2腫瘤上皮細胞
堿性FGFFGF受體腫瘤上皮細胞
EGFEGF受體上皮細胞
VCAM-1A^2-整聯(lián)蛋白血管內皮細胞
ICAM-10^2-整聯(lián)蛋白血管內皮細胞
PECAM-1/CD31Ov卩3-整聯(lián)蛋白血管內皮細胞
纖連蛋白OvP3-整聯(lián)蛋白活化的血小板
骨橋蛋白Ov卩i和OvPs-整聯(lián)蛋白動脈粥樣硬化斑塊中
的平滑肌細胞
基質蛋白的RGD序列OCv!33-整聯(lián)蛋白腫瘤內皮細胞、血管
平滑肌細胞
表1中列出的配體在本發(fā)明的一個實施方案中可以用于將納米粒耙向
至特別的靶細胞。例如，在聚合物基質中與聚合物連接或者與PEG鏈的末 端連接的葉酸鹽配體可以摻入至納米粒中。本文所用的PEG鏈指的是具有
14選擇長度(分子量)的PEG鏈以便當配體摻入至納米粒中時，其通過親水聚
合物鏈的表面包衣被掩蓋或保護。對于將包埋的治療劑施用于靼細胞，例
如施用腫瘤劑治療上皮癌，摻入至納米粒的表面連接的葉酸鹽配體有效與
上皮細胞的葉酸鹽受體結合。
親和部分是具有細胞結合活性的短肽并且有效與配體竟爭受體位點。 配體-受體細胞結合事件的抑制引起了感染過程的阻止。
包含包埋的物質的聚合物基質根據(jù)眾所周知的方法制備，例如上文描 述的那些方法，典型的是乳化、復乳化和微嚢化。待傳遞的化合物或者包 含在有機介質中(在親脂化合物的情況中)或者包含在水介質中(在水溶性治 療劑的情況中)?？蛇x擇的是，治療劑可以在施用于個體之前裝入形成的基 質中。
II.納米粒的制備
A. 可辨，;故的聚合物包衣的制備
親水聚合物鏈通過鍵與納米粒連接，該鍵可以響應選擇的刺激而裂解。 在一個實施方案中，該鍵是肽鍵、酯鍵或二硫鍵。
肽-連接的化合物例如通過將聚烷基醚(例如PEG)與胺偶聯(lián)而制備。末 端帶帽的PEG用羰基二咪唑偶聯(lián)試劑活化，以形成活化的咪唑化合物。然 后，活化的PEG與示例性三肽的N-末端胺偶聯(lián)。然后，肽胺基可以用于 通過常規(guī)的碳二亞胺偶聯(lián)試劑、例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)將羧基偶聯(lián)。
酯連接的化合物可以例如通過應用醇通過酸酐偶聯(lián)試劑將聚合物酸 (例如聚乳酸)與聚烷基醚的末端醇基偶聯(lián)而制備?？蛇x擇的是，包含內酯 鍵和適合的末端基團(例如伯胺基團)的短鍵片段可以用于將聚烷基醚與基 質形成聚合物通過酰胺鍵或氨基曱酸酯鍵偶聯(lián)。
B. 親和部分的連接
如上所述，本發(fā)明的納米粒可以包含與PEG-包衣的納米粒表面連接 的親和部分。親和部分通過與納米粒表面組分直接連接或通過短的間隔臂 或鏈與納米粒連接，這取決于該部分的性質。
可獲得多種將分子(例如親和部分)與聚合物基質的表面連接的方法。 在一個優(yōu)選的方法中，親和部分通過下述偶聯(lián)反應與聚合物偶聯(lián)以形成親和部分-聚合物結合物。該結合物用于納米粒的形成。在另外的方法中，將 活化用于共價連接或親和部分的其它相互作用(即靜電相互作用)的基質形 成聚合物摻入至納米粒中。
通常，部分與間隔臂的連接可以通過將基質形成聚合物(典型的是
PEG)衍生化而實現(xiàn)。將配體與活化的PEG鏈連接的方法在本領域中描述 (Allen等人，1995; Zalipsky, 1993; Zalipsky, 1994; Zalipsky, 1995a; Zalipsky, 1995b)。在這些方法中，mPEG的惰性末端曱氧基用適合結合反 應的活化的官能度代替，所述的官能度例如氨基或酰肼基。末端官能的 PEG與脂質、典型的是DSPE連接。官能的PEG-聚合物衍射物應用于納 米粒的形成并且在納米粒形成前或后，預期的配體與PEG鏈的反應性末端 連接。在前述方法中，與聚合物組分共價連接的作用取決于所用的聚合物 而實現(xiàn)。因此，在另外的方法中，雙官能聚合物可以用于將一端的華巴部分 與另 一端的電荷部分共價連接。選擇電荷部分以便使電荷與用于形成聚合 物基質的聚合物組分的電荷相反。 C.納米粒的制備
納米?？梢酝ㄟ^多種技術制備，例如乳化或復乳化。典型的是，將聚 合物溶于有機溶劑中并且將藥物溶于有機溶劑或水相中(取決于在這兩相 中的相對溶解度)。形成水包油乳化并且溶劑快速^l使聚合物沉淀為納米 粒。該方法通?？蓱迷谂c聚合物相同的溶劑中溶解的疏水藥物。對于親 水藥物，可以應用水包油包水復乳化(w/o/w)方法。粒徑通過能量輸入、例 如通過超聲確定。
用于形成本發(fā)明的納米粒的基質聚合物優(yōu)選以基質的約20-98%存在。 適合制備本發(fā)明的納米粒的另外的納米粒制備方法是溶劑注入方法。 在該方法中，將溶于溶劑中的聚合物混合物在攪拌下注入至水介質中以形 成納米粒。通過適合的技術、例如透析或蒸發(fā)將溶劑除去。
優(yōu)選制備具有在選擇的粒徑范圍內的基本均勻粒徑的納米粒，所述的 選擇的粒徑范圍典型的是在約10
nm至約500 nm之間，優(yōu)選50 nm至約 300 nm并且最優(yōu)選80 nm至約200 nm。如果希望，可以將納米粒干燥，例如通過蒸發(fā)或凍干并且可以懸浮于 任何預期的溶劑中。當將納米粒凍干時，在凍干前或在納米粒形成過程中 可以加入非還原性糖以提供穩(wěn)定性。此類糖是甘露醇、蔗糖、海藻糖
(trehlaose)。其它穩(wěn)定劑可以包括氨基酸，例如甘氨酸。
具有二價陽離子基質的納米?？梢酝ㄟ^在納米粒制備過程中加入包含
二價陽離子的溶劑而制備。
納米?？梢酝ㄟ^將溶液溫和渦旋而再懸浮于水溶液中。再水化可以在 室溫或在其它適合納米粒和它們的內部成分的組合物的溫度下進行。 III.治療方法
一方面，本發(fā)明包括基于納米粒治療哺乳動物個體的方法，該方法包 括給個體全身施用納米粒，所述的納米粒包含
(i) 二價陽離子基質；和
(ii) 治療劑。
二價陽離子基質給治療劑提供了保護，否則該治療劑在貨架上并且一 旦引入至體內可能滲漏出傳統(tǒng)的脂質體制劑。另一方面，本發(fā)明包括基于 納米粒治療哺乳動物個體的方法，該方法包括給個體全身施用納米粒，所 述的納米粒包含
(i) 二價陽離子基質；
(ii) 治療劑；
(iii) 用于穩(wěn)定性和延長循環(huán)的親水聚合物包衣；和任選
(iv) 有效與治療目標的靶表面特異性結合的親和部分。
親水聚合物包衣包含或者共價連接或者表面吸附于納米粒中的表面聚 合物組分的聚合物鏈。施用的納米粒全身循環(huán)直至獲得納米粒的預期的生 物分布，從而將親和劑暴露于靶表面。
在優(yōu)選的實施方案中，納米粒用于治療實體瘤。納米粒包含包埋形式 的抗腫瘤藥物并且通過有效與肺瘤特異性抗原特異性結合的親和部分革巴向 于肺瘤區(qū)域。例如，納米?？梢酝ㄟ^在納米粒中包含VEGF配體而乾向于 腫瘤的血管內皮細胞，用于選擇性與Flk-1，2受體(在增殖性肺瘤內皮細胞 中表達)連接。
17在該實施方案中，納米粒的粒徑為約10-200 nm之間、優(yōu)選50-150 nm 并且最優(yōu)選80-120 nm。在該粒徑范圍內的納米粒顯示能夠通過腫瘤血管 系統(tǒng)內皮細胞系中存在的"間隙"i^V腫瘤[Yuan等人(1995)。
在一個實施方案中，治療劑選自式(I)化合物。式(I)化合物及其鹽具有 有價值的藥理學性質。特別的是，它們對溫血動物的鈣代謝具有顯著的調 節(jié)作用。最特別的是，它們在大鼠的骨吸收中發(fā)揮顯著的抑制作用，其可 以在ActaEndrocinol，第78巻，第613-24頁(1975)中描述的試驗方法中證 明，通過皮下施用劑量范圍為約0.01-1.0 mg/kg后PTH誘導的血漿4丐水平 的增加來證明，以及在TPTX(甲狀腺甲狀旁腺切除術)的大鼠模型中，通過 皮下施用劑量為約0.0003-1.0 mg后維生素D;j誘導的血釣過多證明。由 Walker 256肺瘤誘導的胂瘤釣血癥也在口服施用約1.0-100 mg/kg后被抑 制。另外，當根據(jù)Newbould，Brit J Pharmacol,第21巻，第127頁(1963) 和Kaibara等人，J Exp Med，第159巻，第1388-96頁(1984)在試驗方法中 皮下施用劑量為約0.001-1.0 mg/kg時，式(I)化合物及其鹽發(fā)揮在佐劑性關 節(jié)炎的大鼠中顯著抑制關節(jié)炎病癥的進程的作用。因此，它們非常適合用 作治療以下疾病的藥物與鈣代i射損傷有關的疾病，例如關節(jié)的炎性病癥、 骨質疏松癥的關節(jié)軟骨變性過程、牙周炎、甲狀旁腺功能亢進和血管或假 體移植物的4丐沉積。在治療其中觀察到溶解性差的釣鹽的異常沉積的疾病 中也獲得了很好的結果，例如在關節(jié)炎疾病、例如強直性脊推炎(ancylosing spondilitis)、神經(jīng)炎、滑嚢炎、牙周炎和肌腱炎、纖維發(fā)育不良、骨關節(jié) 炎或動脈硬化，以及那些其中硬的機體組織的異常分解是主要癥狀的疾病， 例如遺傳性低磷酸酯酶癥、關節(jié)軟骨的變性狀態(tài)、不同起源的骨質疏松、 佩吉特病和纖維性骨營養(yǎng)不良以及腫瘤誘導的溶骨病癥。
施用納米粒、例如靜脈內施用納米粒后并且過去足夠時間以^吏納米粒 分別于個體并且滲入腫瘤中后，納米粒的親和部分提供了結合并且內化進 入靶細胞中。在一個實施方案中，親水表面包衣通過pH敏感鍵與納米粒 連接，并且納米粒滲入腫瘤后該鍵釋放，這是由于腫瘤區(qū)域的含氧量低的 性質引起的。
從前述，應當理解的是本發(fā)明的多種特征和目標是如何實現(xiàn)的。本發(fā)明的納米粒提供了靶向納米粒的方法。親水表面包衣降低了納米粒的攝入， 對于納米粒的分布實現(xiàn)了長的血液循環(huán)時間。分布后，納米粒連接的親和 部分以多價存在并且與靶結合。
以下實施例i兌明了制備、表征和應用本發(fā)明的納米粒的方法。實施例 決不旨在限制本發(fā)明的范圍。盡管本發(fā)明已經(jīng)描述了特別的實施方案，但 是本領域技術人員應當顯而易見的是可以進行多種改變和修飾而不脫離本 發(fā)明。
實施例
在以下實施例中，通過復乳化方法制備納米粒。所有的樣品通過在水
或5%甘露醇(或其它適合的填充劑，即蔗糖)的存在下超聲、蒸發(fā)、濃縮和 凍干處理。
其中，以下實施例沒有任何二價陽離子而制備并且該制劑提供了在基 質中非常低的藥物載量。 實施例A
1. ZOL446 30 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩沖液pH 8)
2. PLGA， 50:50，卯，OOO MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 3。/。(tris緩沖液pH8+氯化釣) 通過超聲將步驟1的藥物溶液加入至步驟2的聚合物溶液中。將初乳
加入至步驟3的PVA溶液中并且繼續(xù)超聲。通過蒸發(fā)溶劑、洗滌和濃縮收 集納米粒。在水或5%甘露醇的存在下將產物凍干。 實施例B
1. ZOL446 30 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩沖液pH 8)
2. PLGA， 50:50, 50,000 MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 3。/。(tris緩沖液pH8+氯化鈣) 通過超聲將步驟1的藥物溶液加入至步驟2的聚合物溶液中。將初乳
加入至步驟3的PVA溶液中并且繼續(xù)超聲。通過蒸發(fā)溶劑、洗滌和濃縮收 集納米粒。在水或5%甘露醇的存在下將產物凍干。 實施例C
1. ZOL446 30 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩沖液pH8)
192. PLGA， 50:50, 10,000 MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 2。/。(tris緩沖液pH8+氯化鈣) 通過超聲將步驟1的藥物溶液加入至步驟2的聚合物溶液中。將初乳
加入至步驟3的PVA溶液中并且繼續(xù)超聲。通過蒸發(fā)溶劑、洗滌和濃縮收 集納米粒。在水或5%甘露醇的存在下將產物凍干。 實施例D
1. ZOL446 10mg/mL(l。/。PVA/tris緩沖液pH8)
2. PLGA， 50:50, 10,000 MW 50 mg/mL(在乙酸乙酯中)
3. PVA 5。/0(tris緩沖液pH8+氯化鈣) 通過超聲將步驟1的藥物溶液加入至步驟2的聚合物溶液中。將初乳
加入至步驟3的PVA溶液中并且繼續(xù)超聲。通過蒸發(fā)溶劑、洗滌和濃縮收 集納米粒。在水或5%甘露醇的存在下將產物凍干。 實施例E
1. ZOL446 30mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩沖液pH8)
2. PLGA， 50:50，卯,000 MW 30 mg/mL(在二氯甲烷中)
3. PVA 3Q/o(tris緩沖液pH8) 通過超聲將步驟1的藥物溶液加入至步驟2的聚合物溶液中。將初乳
加入至步驟3的PVA溶液中并且繼續(xù)超聲。通過蒸發(fā)溶劑、洗滌和濃縮收 集納米粒。在水或5%甘露醇的存在下將產物凍干。 實施例F
1. ZOL446 10 mg/mL(2.8。/。PVA/tris緩沖液pH 8)
2. PLGA， 50:50， 140,000 MW 50 mg/mL(在乙酸乙酯中)
3. PVA 1。/0(tris緩沖液pH8+氯化鈣) 通過超聲將步驟1的藥物溶液加入至步驟2的聚合物溶液中。將初乳
加入至步驟3的PVA溶液中并且繼續(xù)超聲。通過蒸發(fā)溶劑、洗滌和濃縮收 集納米粒。在水或5%甘露醇的存在下將產物凍干。 實施例G
1. ZOL446 0.4 mg/mL(l。/o泊洛沙姆，0.1 N HC1)
2. PLGA， 50:50， 75,000 MW 4mg/mL(在丙酮中)
203.泊洛沙姆 1%
通過混合將步驟2的聚合物溶液加入至步驟1的藥物溶液中。將丙酮 蒸發(fā)并且收集納米粒。在5%甘露醇的存在下將產物凍干。
權利要求
1. 給哺乳動物個體施用治療劑的方法，該方法包括給個體全身施用納米粒組合物，該納米粒組合物包含聚合物基質以及二價陽離子，包含治療劑。
2. 權利要求l的方法，其中全身施用后聚合物基質不使4丐從周圍介質隔離，因此防止了低4丐血癥。
3. 權利要求l的方法，其中所述的治療劑是水溶性的。
4. 權利要求3的方法，其中所述的治療劑是式(I)化合物及其可藥用鹽<formula>formula see original document page 2</formula>其中Rl是5-元雜芳基，其包含作為雜原子的2-4個N-原子或者1或2個N-原子以及1個O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基團C-取代的低級烷基、苯基或4皮低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷基硫代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氬、羥基、氨基、低級烷1^克代或鹵素。
5. 權利要求4的方法，其中所述的治療劑是唑來膦酸。
6. 權利要求l的方法，其中聚合物基質包含鉤離子。
7. 權利要求l的方法，其中聚合物基質包含PLGA。
8. 權利要求1的方法，其中納米粒組合物具有平均粒徑為約10納米(nm)至約500 nm。
9. 權利要求l的方法，其中納米粒組合物進一步包含親水聚合物。
10. 權利要求l的方法，其中納米粒組合物進一步包含親和部分。
11. 給哺乳動物個體施用治療劑的方法，該方法包括給個體全身施用納米粒組合物，該納米粒組合物包含二價陽離子基質，包含治療劑。是
12. 權利要求ll的方法，其用于給靶細胞施用治療劑，其中親和部分有效與靼細胞上的細胞表面受體特異性結合的配體，并且納米粒進一步包含包埋形式的治療劑。
13. 權利要求11的方法，其中親和部分有效與腫瘤特異性受體和/或抗原特異性結合。
14. 權利要求ll的方法，其中所述的治療劑是水溶性的。
15. 權利要求ll的方法，其中所述的治療劑是式(I)化合物及其可藥用鹽:<formula>formula see original document page 3</formula>，其中Rl是5-元雜芳基，其包含作為雜原子的2-4個N-原子或者1或2個N-原子以及1個O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基團C-取代的低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷基硫代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氯、羥基、 、低級烷1^克代或卣素。
16. 權利要求ll的方法，其中所述的治療劑是唑來膦酸。
17. 權利要求ll的方法，其中二價陽離子包括鉤離子。
18. 權利要求ll的方法，其中聚合物基質包含PLGA聚合物。
19. 權利要求ll的方法，其中納米粒組合物具有平均粒徑為約10nm至約500 nm。
20. 權利要求ll的方法，其中納米粒組合物進一步包含親水聚合物。
21. 權利要求ll的方法，其中納米粒組合物進一步包含親和部分。
22. 納米粒組合物，該納米粒組合物包含二價陽離子基質，包含治療劑。
23. 權利要求22的組合物，其中所述的治療劑是水溶性的。
24.權利要求22的組合物，其中所述的治療劑是式(I)化合物及其可藥用鹽<formula>formula see original document page 4</formula>其中Rl是5-元雜芳基，其包含作為雜原子的2-4個N-原子或者1或2個N-原子以及1個O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基團C-取代的低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷基硫代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氫、羥基、氨基、低級烷基硫代或卣素。
25. 權利要求22的組合物，其中所述的治療劑是唑來膦酸。
26. 權利要求22的組合物，其中二價陽離子基質包含鉤離子。
27. 權利要求22的方法，其中納米粒組合物進一步包含親水聚合物。
28. 權利要求22的方法，其中納米粒組合物進一步包含親和部分。
29. 納米粒組合物，該納米粒組合物包含(a) 治療劑；(b) 二價陽離子基質；(c) 親水聚合物包衣；和(d) 4壬選親和部分。
30. 權利要求29的納米粒組合物，其中親和部分是有效與革巴表面的細胞表面受體特異性結合的配體。
31. 權利要求29的納米粒組合物，其中親和部分有效與肺瘤特異性受體和/或抗原特異性結合。
32. 權利要求29的納米粒組合物，其中所述的治療劑是水溶性的。
33. 權利要求29的納米粒組合物，其中所述的治療劑是式(I)化合物及其可藥用鹽<formula>formula see original document page 5</formula>，其中Rl是5-元雜芳基，其包含作為雜原子的2-4個N-原子或者1或2個N-原子以及1個O-或S-原子，并且其是未取代的或者是被以下基團C-取代的低級烷基、苯基或被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代的苯基，或低級烷氧基、羥基、二-低級烷基氨基、低級烷^5克代和/或卣素，和/或是在N-原子上N-取代的，其可以被低級烷基、低級烷氧基和/或卣素取代；并且R2是氬、羥基、氨基、低級烷J^危代或卣素。
34. 權利要求29的納米粒組合物，其中所述的治療劑是唑來膦酸。
35. 權利要求29的納米粒組合物，其中二價陽離子基質包含4丐離子。
36. 權利要求29的納米粒組合物，其中聚合物基質包含PLGA。
37. 權利要求29的納米粒組合物，其中納米粒組合物具有平均粒徑為約10 nm至約500 nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于納米粒治療哺乳動物個體的方法。該方法應用納米粒和/或具有外表面的納米粒，所述的外表面包含有效與治療目標的生物表面特異性結合的親和部分以及親水聚合物包衣。親水聚合物包衣包含或者與聚合物組分共價連接或者與聚合物組分表面吸附的聚合物鏈。完成預期的納米粒生物分布后，親和劑與靶表面結合并且?guī)椭{米粒進入。
文檔編號A61K9/51GK101500546SQ200780029804
公開日2009年8月5日 申請日期2007年8月15日 優(yōu)先權日2006年8月17日
發(fā)明者J·L·杰林斯基, S·庫馬爾, S·托梅爾, W-C·謝 申請人:諾瓦提斯公司