專利名稱：新的噬菌體粘附蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合革蘭氏陰性細(xì)菌O-抗原的噬菌體粘附蛋白，其缺少結(jié)合噬 菌體和水解脂多糖的能力。本發(fā)明還涉及一種核酸分子其包括編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的序列。 此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的噬菌體粘附蛋白的方法。本發(fā)明還涉及所述蛋白質(zhì)的用途 以及檢測、純化和富集細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
噬菌體是高度特異的病毒，其僅侵染細(xì)菌。侵染時，噬菌體利用粘著結(jié)構(gòu)來與它們 的細(xì)菌宿主結(jié)合。噬菌體的特異性由其自身的一系列蛋白質(zhì)來定義，所述一系列的蛋白質(zhì) 對于與目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合是重要的。噬菌體-細(xì)菌體系在自然界中已經(jīng)進(jìn)化了相當(dāng)長的時 間，因此噬菌體以高特異性的方式識別它們的宿主細(xì)菌，并且具有高水平的結(jié)合親和性。噬菌體特異地結(jié)合到細(xì)菌上是由于噬菌體粘附蛋白所引起的。噬菌體粘附蛋白特 異地結(jié)合到位于細(xì)菌表面的不同的一群受體上。這些細(xì)菌表面受體可以為脂多糖成分，特 別是革蘭氏陰性細(xì)菌中的0-抗原或LPS核以及革蘭氏陰性細(xì)菌表面的是莢膜多糖的K-抗 原，革蘭氏陽性細(xì)菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸質(zhì)成分，細(xì)菌的膜結(jié)合型蛋白，特殊細(xì) 菌的突起物例如鞭毛、菌毛或傘部，或胞外成分例如被膜或粘液層，糖類，多糖基質(zhì)，表面蛋 白質(zhì)層或細(xì)胞壁結(jié)合型蛋白。一些噬菌體粘附蛋白有酶活性，例如0-抗原或K-抗原結(jié)合 蛋白，而另外一些沒有酶活性，例如噬菌體粘附蛋白結(jié)合膜結(jié)合型細(xì)菌蛋白質(zhì)。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的一部分，其由脂質(zhì)Α、核心區(qū)和0-抗原形 成。0-抗原是細(xì)菌脂多糖最外表面暴露的部分，其由寡糖的重復(fù)單元形成，脂質(zhì)A為錨定在 外膜或革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)的區(qū)域。與脂質(zhì)A和核心區(qū)相比，0-抗原是細(xì)菌脂多糖中變化最 多的部分。0-抗原結(jié)構(gòu)中的巨大變化(幾百種變體)提供了將對細(xì)菌的檢測深入到血清群 (serogroup)水平的一種根據(jù)。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測利用抗體來區(qū)分接近地相關(guān)菌株。例如， 目前在本領(lǐng)域中，利用不同的抗血清已經(jīng)將沙門氏菌屬分為具有67種不同的0-抗原的46 種血清群(一些血清群被定義為多于一種的0-抗原的組合)。大腸桿菌數(shù)據(jù)庫(EC0DAB; Stenutz et al. ,2006, FEMS Microbiol. Rev. 30,382-403)列出了 178 種不同的 0-抗原。 通常通過利用大腸桿菌的抗血清的經(jīng)典凝集方法來鑒定大腸桿菌的血清型。天然存在的噬 菌體利用細(xì)菌表面上的不同的受體來吸附到細(xì)菌細(xì)胞上。噬菌體粘附蛋白包括至少兩個功能域，其中N-端區(qū)域與噬菌體結(jié)合，C-端區(qū)域與 細(xì)菌表面的受體結(jié)合。當(dāng)噬菌體粘附蛋白有酶活性，例如水解細(xì)菌的0-抗原或K-抗原時， 該C-端區(qū)域也包含活性位點。然而，噬菌體粘附蛋白常包括多個域的模塊式排列，經(jīng)常可 以觀察到不同功能部分的同源性有不同。在結(jié)合之后，結(jié)合0-抗原的噬菌體粘附蛋白顯示出水解脂多糖0-抗原的水解活 性。所述脂多糖的水解是噬菌體侵染時多糖層侵入過程中的一部分。涉及噬菌體侵染的另 一個過程是所謂的“表面行走(surface walk)”過程。正在侵染的細(xì)菌進(jìn)行所述的“表面 行走”以找到適合于DNA注入的位于細(xì)菌表面的位點。上述兩個生物學(xué)過程(多糖侵入和 “表面行走”)均包括噬菌體的反復(fù)結(jié)合和釋放。因此，所述噬菌體粘附蛋白和細(xì)菌表面的0-抗原的結(jié)合是由所述噬菌體粘附蛋白的水解活性所引起的可逆的結(jié)合。高水平的結(jié)合親和性使得噬菌體粘附蛋白可以用作“生物吸附劑”，實現(xiàn)無論是在 自然界中存在的復(fù)雜環(huán)境中，還是在生物學(xué)樣品例如食品中均可以特異性地結(jié)合細(xì)菌。到目前為止，已經(jīng)有不同的針對噬菌體粘附蛋白用作生物吸附劑的實際應(yīng)用，例 如檢測和鑒定單一菌株或細(xì)菌群，或者純化細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)胞成分?？焖俸蜏?zhǔn)確的檢測細(xì)菌是用來診斷和治療人類和動物中的細(xì)菌傳染，以及啟動預(yù) 防措施的第一主要步驟。另外，所述檢測對于控制原料和已加工食品的衛(wèi)生和質(zhì)量是有用 的，并且對于監(jiān)控飲用水、工業(yè)用水和公共浴室用水的衛(wèi)生和質(zhì)量方面是有用的。此外，所 述檢測對于過程監(jiān)控和最優(yōu)化，以及環(huán)境分析中的質(zhì)量控制也是有用的。EP1198713A2和EP1356080A1描述了用于檢測和鑒定單一菌株和細(xì)菌群的方法， 其中將整個噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)偶聯(lián)在支撐物上。在對偶聯(lián)的噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)與 測試樣品進(jìn)行溫育后，可以檢測出結(jié)合到噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)上的樣品中的細(xì)菌。當(dāng)用在微生物檢測體系時，在細(xì)菌檢測和鑒定方面，噬菌體粘附蛋白提供了大量 優(yōu)于其它生物吸附劑(例如抗體)的優(yōu)點，例如優(yōu)異的特異性和出眾的結(jié)合性。特異性越 高越可以降低假陽性和假陰性的數(shù)量，并且目標(biāo)結(jié)合性越好可以提供的信號比噪音的比值 越好。另外，噬菌體粘附蛋白可以被固定于任何表面并且可以容易地與其它分子(例如熒 光標(biāo)記)偶聯(lián)。已經(jīng)證實了噬菌體粘附蛋白在多種不同的應(yīng)用中可以提供良好的表現(xiàn)，即 使是面對要求最為嚴(yán)格和復(fù)雜的食品領(lǐng)域。此外，細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)胞成分的純化對于幾乎任何后續(xù)加工、分析或細(xì)胞成分的分 離均是非常重要的。EP1399551A2描述了用于純化細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)胞成分的方法，其中含有細(xì) 菌細(xì)胞或細(xì)胞成分的樣品與整個噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)接觸。然后，所述細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞 成分以及噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)的樣品與固體支撐物一起溫育。溫育之后，固體支撐物可 以從樣品中分離，從而也將細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分分離，該細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分結(jié)合在噬菌 體或噬菌體蛋白質(zhì)上，而噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)結(jié)合在固體支撐物上。如EP1399551A2所述借助噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)對細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)胞成分進(jìn)行純 化，除了其它優(yōu)點之外，該方法還可以自動地進(jìn)行，并且因此可以整合到自動分析或分離方 法(例如質(zhì)粒的純化)中。然而，在天然存在的噬菌體或噬菌體蛋白質(zhì)以及細(xì)菌之間存在結(jié)合平衡，這歸因 于由噬菌體粘附蛋白的水解活性而產(chǎn)生的噬菌體粘附蛋白的可逆的結(jié)合。這個效果降低了 這類基于噬菌體的細(xì)菌分析方法的靈敏度。在本領(lǐng)域中已知的基于噬菌體的細(xì)菌分析方法中，噬菌體粘附蛋白通常是非常大 的蛋白，由多于1000個氨基酸的多肽鏈構(gòu)成，其中所述噬菌體粘附蛋白由提供不同功能的 數(shù)個結(jié)構(gòu)部分組成。噬菌體粘附蛋白的這種大小和數(shù)個結(jié)構(gòu)部分的特點導(dǎo)致難以表達(dá)、純 化，分離并且保存所述的噬菌體粘附蛋白。噬菌體粘附蛋白的模塊區(qū)域排列還具有對蛋白 酶解敏感的風(fēng)險，蛋白酶可以在噬菌體粘附蛋白的不同功能模塊之間降解。這樣的蛋白酶 降解引起噬菌體粘附蛋白性質(zhì)的變化，并伴有蛋白質(zhì)活性的喪失。因此，本發(fā)明的目的在于提供噬菌體粘附蛋白，其用于更有效地結(jié)合、富集、移除、 捕獲和檢測革蘭氏陰性細(xì)菌。在權(quán)利要求書中限定的發(fā)明主題解決了上述目的。


下面的附圖用來說明本發(fā)明。圖1為示出大腸桿菌0111 :B4的LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)的示意圖。標(biāo)記出代表LPS的三 個部分，即脂質(zhì)A、核心區(qū)和0-抗原，η =重復(fù)單元的數(shù)量；H印=L-甘油-D-甘露糖-庚 糖；Gal =半乳糖；Glc =葡萄糖；KDO = 2-酮基-3-脫氧辛酸；NGa = N-乙?；?半乳糖 胺；NGc = N-乙?；咸前?。圖2示出了 P22尾部刺突(tail spike)和Det7尾部刺突(SBPl)的氨基酸序列的 比對。相同的氨基酸殘基用“*”表示，具有密切相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸殘基用“”表示，不太密 切相關(guān)的氨基酸殘基用“.”表示。兩個序列之間顯示高度同源性的氨基酸序列用下劃線標(biāo) 出。用黑體字體指出Det7尾部刺突的S152，其為N-端截短變體(N-terminally truncated variant)的第一個氨基酸殘基，參與活性位點的三個氨基酸殘基用斜黑體來表示。圖3示出了 ε 15尾絲和Det7 0RF790公認(rèn)尾部蛋白(SBP2)的氨基酸序列的比對。 相同的氨基酸殘基用“*”表示，具有密切相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸殘基用“”表示，不太密切相關(guān) 的氨基酸殘基用“.”表示。兩個序列之間顯示高度同源性的氨基酸序列用下劃線標(biāo)出。用 黑體字體指出Det7 0RF790公認(rèn)尾部蛋白的S252，其為N-端截短變體的第一個氨基酸殘 基。參與活性位點的D485用斜黑體來表示。圖4示出了 P22尾部刺突和噬菌體14尾部刺突的氨基酸序列的比對。相同的氨 基酸殘基用“*”表示，具有密切相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸殘基用“”表示，不太密切相關(guān)的氨基酸 殘基用“.”表示。兩個序列之間顯示高度同源性的氨基酸序列用下劃線標(biāo)出。用黑體字體 指出噬菌體14尾部刺突的K108，其為N-端截短變體的第一個氨基酸殘基。參與失活作用 的酸性氨基酸殘基E171、D433和D435用斜黑體來表示。圖5示出了 ε 15尾絲和0157_ΒΡ1的氨基酸序列的比對。相同的氨基酸殘基用 “*”表示，具有密切相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸殘基用“”表示，不太密切相關(guān)的氨基酸殘基用“.，， 表示。兩個序列之間顯示高度同源性的氨基酸序列用下劃線標(biāo)出。用黑體字體指出0157_ BPl的V 163，其為N-端截短變體的第一個氨基酸殘基。參與活性位點的D463用斜黑體來表不。圖6示出了 ΗΚ620尾部刺突和0111_ΒΡ1的氨基酸序列的比對。相同的氨基酸殘 基用“*”表示，具有密切相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸殘基用“”表示，不太密切相關(guān)的氨基酸殘基 用“.”表示。兩個序列之間顯示高度同源性的氨基酸序列用下劃線標(biāo)出。用黑體字體指出 0111_ΒΡ1的Κ108，其為N-端截短變體的第一個氨基酸殘基。與酶失活相關(guān)的D204、D277、 D302、D332、E337、D345、E354、E357、E415、D471、E476、D477、E482 和 D492 用斜黑體來表示。圖7為銀染色的"Tris-Tricin梯度凝膠，其示出了 wt_Det7 0RF790與N-端截短且 失活的變體 Det7 0RF790(A2-251,D485N)對列克星敦沙門氏菌(Salmonella Lexington) LPS的水解結(jié)果的比較。M為多肽分子量標(biāo)記，LPS表示分離的、且未加入噬菌體尾部蛋白的 脂多糖，wt表示分離的、且加入了有酶活性的野生型Det7 0RF790尾部刺突的脂多糖，Det7 0RF790(A2-251,D485N)表示分離的、且加入了具有失活突變D485N的N-端截短變體的脂 多糖。各自的溫育時間用其下方標(biāo)注的小時數(shù)來表示?！?”表示噬菌體粘附蛋白的條帶， “2”表示在制備LPS過程的蛋白質(zhì)雜質(zhì)的條帶。
圖8為考馬斯染色的SDS凝膠，其示出了 Det7尾部刺突SBPl的三個N-端截短失 活變體在表達(dá)、可溶性和SDS穩(wěn)定性組合測試中的結(jié)果?！癕”表示的泳道為分子量標(biāo)記，分 子量的大小在左邊的空白處給出。“P”表示不可溶的沉淀組分，“_”表示在上樣之前未被煮 沸的可溶的蛋白質(zhì)組分?！?+ ”表示在上樣之前被煮沸的可溶的蛋白質(zhì)組分。凝膠上方給出 了表達(dá)溫度30°C或37°C，以及樣品經(jīng)IPTG誘導(dǎo)(+IPTG)或未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)(-IPTG)。在右 邊的空白處表示出蛋白條帶屬于單體(-M)或抗SDS三聚體(-T)。泳道1 8表示突變體 SBP1(A2-151)E406Q，道 9 16 表示突變體 SBPl ( Δ 2-151) D437N，泳道 17 24 表示突變 # SBP1( Δ 2-151)D440No圖9為考馬斯染色的SDS凝膠，其示出了融合了不同N-端標(biāo)簽的0157_BP1的截 短和失活形式在表達(dá)、可溶性和SDS穩(wěn)定性組合測試中的結(jié)果?！癕”表示的泳道為分子量 標(biāo)記，分子量的大小在左邊的空白處給出?！癙”表示不可溶的沉淀組分，“_”表示在上樣之 前未被煮沸的可溶的蛋白質(zhì)組分?！?+ ”表示在上樣之前被煮沸的可溶的蛋白質(zhì)組分。所有 的蛋白質(zhì)均為截短八2-162，且具有氨基酸突變0463仏泳道2 4表示未經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿 菌蛋白質(zhì)背景，泳道5 7表示具有N-端Mi^p-標(biāo)簽的0157BP1，泳道8 10表示具有 N-端JS-標(biāo)簽的0157_BP1，泳道11 13表示具有N-端Cys-標(biāo)簽的0157_BP1，所有均經(jīng) IPTG誘導(dǎo)。兩個箭頭標(biāo)記出噬菌體粘附蛋白的SDS抗性寡聚形式(上箭頭)和噬菌體粘附 蛋白的單體形式(下箭頭)的位置。圖10為示出利用Det7尾部刺突SBPl ( Δ 2-151 ；D437N)特異性捕獲血清群Dl和 B的沙門氏菌屬菌株的細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)果的圖。數(shù)據(jù)棒示出使用環(huán)氧偶聯(lián)SBPl的磁珠(白色 數(shù)據(jù)棒)或甲苯磺?；悸?lián)SBPl的磁珠(深色數(shù)據(jù)棒)從樣品中捕獲的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。圖11為示出利用0157_ΒΡ1按與ELISA形式類似的分析方法對大腸桿菌0157細(xì) 胞進(jìn)行檢測的結(jié)果的圖。用細(xì)菌細(xì)胞的比色檢測數(shù)據(jù)G05nm處的吸光度)對樣品中細(xì)菌 細(xì)胞的濃度(微量滴定板每孔的cfu)作圖。顯示了在添加了 Iyg的0157_BP1作為特異 的噬菌體粘附蛋白的樣品溫育90分鐘后的顏色變化(黑色數(shù)據(jù)棒)，并用未添加0157_BP1 的微量滴定板的背景吸光度作為對照(灰色數(shù)據(jù)棒)。圖12為銀染色的Tris-Tricin梯度凝膠，其示出了 wt-0111_BP1與N-端截短和 失活變體0111_ΒΡ1(Δ2-107)對大腸桿菌0111 LPS的LPS水解結(jié)果的比較，變體0111_ BPl ( Δ 2-107)包括如下突變:D204N 或 D277N 或 E337Q 或 E415Q 或 D471N 或 E482Q 或 D492N 或雙突變E476Q/D477N。M為多肽分子量標(biāo)記，LPS表示分離的、且未加入脂多糖噬菌體尾 部蛋白的脂多糖，wt表示分離的、且加入了有酶活性的野生型0111_BP1的脂多糖。“+LPS” 表示在樣品中存在分離的脂多糖和噬菌體粘附蛋白，“-LPS”表示僅存在噬菌體粘附蛋白的 對照。還標(biāo)注了它們各自的溫育時間(用小時表示)。圖13為SDS-聚丙烯酰胺凝膠，其示出了于37 °C用蛋白酶K水解1小時Det7 0RF790(D485N)的有限蛋白酶解的結(jié)果?！唉睘榉肿恿繕?biāo)記。道1 6表示經(jīng)蛋白酶降解的 結(jié)果，其中蛋白酶K以如下比例加入蛋白酶K比噬菌體粘附蛋白的摩爾比為3Χ10_5 1 ； 3 Χ10-4 1;3Χ10_2 1 ；0.3 1或3 1。“_1”標(biāo)注出全長噬菌體粘附蛋白條帶的位 置，“_2”標(biāo)注出經(jīng)有限蛋白酶解產(chǎn)生的N-端截短變體的條帶，其通過N-端測序被確定為 Det7 0RF790(Δ 2-320 ；D485N)。圖14示出了使用經(jīng)噬菌體粘附蛋白涂覆的磁珠或經(jīng)抗體涂覆的磁珠捕獲沙門氏菌屬細(xì)胞的效率的比較。圖中給出了利用Det7尾部刺突SBP1(A2-151，D437N)(黑 色數(shù)據(jù)棒)或利用抗體涂覆的Dynabead抗沙門氏菌型(灰色數(shù)據(jù)棒)的相對捕獲效率。 “1”表示鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)(血清群B)，“2”表示勃蘭登堡沙門 氏菌(Salmonella Brandenburg)(血清群B)，“3”表示海德爾堡沙門氏菌(Salmonella Heidelberg)(血清群B)，以及“4”表示腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)(血清群 Dl)。圖15為示出利用0111_BP1 wt和0111_ΒΡ1 ( Δ 2-107)的比色法大腸桿菌的6檢 測分析方法的結(jié)果的圖。該oNPG(鄰-硝基苯基-β D-吡喃半乳糖苷)測試?yán)么竽c桿菌 自身的半乳糖苷酶活性來進(jìn)行檢測。圖中給出了利用0111_ΒΡ1涂覆的磁珠捕獲細(xì)胞 的信號除以利用未涂覆的磁珠捕獲細(xì)胞的信號得到的信號比率(測定425nm處的吸光度)。 黑色的數(shù)據(jù)棒代表用0111_ΒΡ1(Δ2-107)涂覆的磁珠，灰色數(shù)據(jù)棒代表用0111_BP1 wt涂 覆的磁珠。數(shù)據(jù)棒下方的數(shù)字表示來自不同的大腸桿菌0 菌株的PROFOS培養(yǎng)物的菌株 編號。圖16示出了屬于組P22、印silon 15和Det7的不同尾部刺突蛋白的比對結(jié)果。白 色棒表示已經(jīng)被除去的同源殼體結(jié)合域?；疑舯硎綥PS-結(jié)合域(實驗顯示或預(yù)測的)。 黑色棒表示三聚化的域。LPS-結(jié)合域中的黑線表示用于除去水解活性的突變的位點?；?同源性和在 P22tsp、14tsp、0111 Bp9、E15、0157 BPl、Det7tsp SBPl 和 Det7 0RF790 SBP2 中的有效突變的位置，預(yù)測了新家族成員0103，026和0145的突變區(qū)域(背景中的暗灰色 區(qū)域)。

發(fā)明內(nèi)容
用于本文的術(shù)語“噬菌體(bacteriophage或phage) ”表示僅可以在細(xì)菌中感染并
繁殖的病毒。用于本文的術(shù)語“噬菌體粘附蛋白(bacteriophage adhesion protein)”表示特 異地結(jié)合細(xì)菌表面受體的噬菌體蛋白質(zhì)。噬菌體粘附蛋白至少包括兩個功能域，其中一個功能域為與噬菌體結(jié)合的噬菌體 結(jié)合域，第二個域與細(xì)菌表面受體結(jié)合。噬菌體粘附蛋白中的一些有酶活性，例如0-抗原 或K-抗原結(jié)合蛋白，其它的一些沒有酶活性，例如與膜結(jié)合型細(xì)菌蛋白結(jié)合的噬菌體粘附 蛋白。具有酶活性的噬菌體粘附蛋白的酶活性位于與細(xì)菌表面受體結(jié)合的功能域中。該 酶活性優(yōu)先為水解活性。噬菌體粘附蛋白包括噬菌體尾部刺突(tail spike)、尾絲(tail fiber)、尾釘(tail pin)和參與結(jié)合細(xì)菌表面的其它尾部蛋白。然而，術(shù)語噬菌體粘附蛋白 不包括不參與細(xì)菌結(jié)合的結(jié)構(gòu)性尾部蛋白，例如尾鞘蛋白、鉸鏈區(qū)的尾部蛋白、基片蛋白、 頸蛋白。用于本文的術(shù)語“細(xì)菌表面受體”是指脂多糖成分，特別是指革蘭氏陰性細(xì)菌中的 0-抗原或LPS核；革蘭氏陽性細(xì)菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸的成分；細(xì)菌的膜結(jié)合 型蛋白；特殊的細(xì)菌突起物(protrusion)例如鞭毛、菌毛或傘毛；或胞外成分例如包膜或 粘液層、糖類、多糖基質(zhì)(polysaccharide matrices)、表面蛋白質(zhì)層或細(xì)胞壁結(jié)合型蛋白。 一些革蘭氏陰性細(xì)菌在其表面也展示K抗原(為莢膜多糖)，其也屬于術(shù)語“細(xì)菌表面受 體”。
用于本文的術(shù)語“0-抗原”是指革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞表面上的菌體抗原。該 0-抗原是細(xì)菌脂多糖在最外表面暴露的部分。其由重復(fù)的具有不同長度的寡糖單元組成， 每個單元通常具有2 7個糖分子(sugar moiety)。用于本文的術(shù)語“野生型(wild-type) ”或“wt”是指蛋白質(zhì)或核酸天然存在的形 式，其沒有經(jīng)人為介入修飾。術(shù)語野生型主要是指多肽或核酸序列。用于本文的術(shù)語“噬菌體結(jié)合域(bacteriophage binding domain) ”是指野生型 噬菌體粘附蛋白的域，其負(fù)責(zé)噬菌體粘附蛋白與噬菌體的結(jié)合。用于本文的術(shù)語“大腸菌(coliform) ”是指腸細(xì)菌(enterobacteria)的亞組，其 顯著的特征在于它們分別利用乳糖以及表達(dá)酶β-半乳糖苷酶。用于本文的術(shù)語“變體”是指核苷酸或氨基酸序列，其指野生型序列展示有以一個 或多個氨基酸或核苷酸的缺失、取代、增加、翻轉(zhuǎn)和/或化學(xué)修飾形式的修飾。例如，連接蛋 白質(zhì)的術(shù)語“ Δ 2-107”表示氨基酸2 107的缺失。原始蛋白質(zhì)的氨基酸108是蛋白質(zhì)變 體在專性甲硫氨酸(起始密碼子)之后的第一個氨基酸。就取代和突變而言，分別地，例如 術(shù)語“D204N”表示將位于204位的原始氨基酸D替換為位于蛋白質(zhì)變體中的204位的N，其 中，除非另外說明，位置204是指在野生型序列中的氨基酸位置。用于本文的術(shù)語“片段”是指氨基酸序列和核苷酸序列的一部分，其編碼只要顯示 出根據(jù)本發(fā)明的包含氨基酸序列的多肽的生物學(xué)功能的那些氨基酸序列。用于本文的術(shù)語“特異性(specificity) ”是指噬菌體粘附蛋白僅識別和結(jié)合單一 的屬、種、或亞種、或細(xì)菌細(xì)胞的血清型或菌株、或細(xì)胞成分。用于本文的術(shù)語“捕獲(capture)”、“富集(enrichment)”或“純化 (purification)”是指從含水溶液中特異分離細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分，例如從培養(yǎng)基(其中 含有細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分)，或存在于自然界中的環(huán)境樣品，或生物學(xué)樣品例如食品中特異 分離。捕獲、純化或富集可以借助于固體支撐物來進(jìn)行，例如磁性顆粒、玻璃顆粒、瓊脂糖顆 粒、膠乳顆粒、反應(yīng)管、移液管吸頭、微量滴定板、膜、過濾介質(zhì)、色譜介質(zhì)，或通過離心來進(jìn) 行。用于本文的術(shù)語“細(xì)菌細(xì)胞成分”是指細(xì)菌的所有成分包括細(xì)菌脂多糖或細(xì)菌 0-抗原或它們的片段，例如由重復(fù)的0-抗原單元形成的多糖或寡糖。本發(fā)明涉及特異性結(jié)合革蘭氏陰性細(xì)菌的0-抗原的噬菌體粘附蛋白，其中，與其 野生型相比所述噬菌體粘附蛋白缺少與噬菌體結(jié)合的能力和水解脂多糖的能力。所述噬菌 體粘附蛋白可以包括突變和/或缺失。所述缺失可以包括噬菌體結(jié)合域和/或酸性氨基酸 突變?yōu)榉撬嵝园被?，特別是1 7、1 6、1 5、1 4、1 3或1 2個酸性氨基酸突 變?yōu)榉撬嵝园被幔约案唧w的是一個酸性氨基酸突變?yōu)榉撬嵝园被?。本發(fā)明還涉及噬菌體粘附蛋白，其包含標(biāo)志物分子(marker moiety)(優(yōu)選生物素 或鏈霉抗生物素)或標(biāo)簽(tag)(優(yōu)選HA-標(biāo)簽、His-標(biāo)簽、Str印-標(biāo)簽、Avi-標(biāo)簽、Myc-標(biāo) 簽、GST-標(biāo)簽、JS-標(biāo)簽或半胱氨酸-標(biāo)簽)。優(yōu)選地，所述噬菌體粘附蛋白具有SEQ ID N0 2、4、5、7、9、11 14,36 42,56或58的氨基酸序列。本發(fā)明的噬菌體粘附蛋白本發(fā)明的噬菌體粘附蛋白優(yōu)選特異地結(jié)合革蘭氏陰性細(xì)菌的0-抗原，并且與其 野生型相比，其缺乏與噬菌體結(jié)合的能力以及顯示出降低的水解脂多糖的能力。
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尤其優(yōu)選這樣的噬菌體粘附蛋白，其與革蘭氏陰性細(xì)菌特異性結(jié)合，所述革蘭氏 陰性細(xì)菌為下述包括人類或動物的治病菌株的細(xì)菌群(group)、科、屬或種的細(xì)菌，例如 腸桿菌科(埃希氏菌屬(尤其是大腸桿菌)、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、愛德 華氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、克雷伯氏菌屬、摩根氏菌屬、變形菌屬、普羅威登斯菌屬、 沙雷氏菌屬、耶爾森氏菌屬)；假單胞菌科(假單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌 屬、希瓦氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、叢毛單胞菌屬)；奈瑟氏球菌屬；莫拉氏菌屬；弧菌屬；氣 單胞菌屬；布魯氏菌屬；弗朗西絲菌屬；博德特氏菌屬；軍團(tuán)菌屬；巴爾通氏體屬；考克斯 氏體屬；嗜血菌屬；巴斯德氏菌屬；溶血性曼氏桿菌屬(Marmheimia)；放線桿菌屬；加德納 氏菌屬；螺旋體科(密螺旋體屬和疏螺旋體屬)；鉤端螺旋體科；彎曲桿菌屬；螺桿菌屬；螺 菌屬；鏈桿菌屬；擬桿菌科(擬桿菌屬、梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬；卟啉單胞菌屬)。最優(yōu)選 特異結(jié)合大腸桿菌或沙門氏菌屬的噬菌體粘附蛋白。尤其優(yōu)選特異結(jié)合沙門氏菌屬的噬菌 體粘附蛋白，例如SEQ ID N0:l、3、6和55的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)。優(yōu)選特異結(jié)合大腸桿菌的噬 菌體粘附蛋白有SEQ ID NO :8、10、60、62、64、66、68、70、72和74的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)。優(yōu)選的噬菌體粘附蛋白來源于感染上述革蘭氏陰性細(xì)菌的噬菌體的野生型噬菌 體粘附蛋白，特別優(yōu)選來自下組的噬菌體短尾噬菌體科(podoviridae)、肌尾噬菌體科 (myoviridae)和長尾噬菌體科(siphoviridae)，更具體來說優(yōu)選的噬菌體為Ρ22、ε 15、 Sf6、HK620、Tl、T5、T7、噬菌體 14、gifsy、P2、phiV10、APSE_l、Al、A18a、ST104、ST64T、JK106 或 Gifsy0進(jìn)一步優(yōu)選的噬菌體粘附蛋白來源于具有N-端同源性的噬菌體的野生型噬菌體 粘附蛋白，即氨基酸序列的N-端部分，在多于至少50個連續(xù)的氨基酸殘基上，與下列噬菌 體的噬菌體粘附蛋白的序列同源性至少為30 %，優(yōu)選為60 %，更優(yōu)選為70 %、80 %、90 %、 95%和 98%，上述噬菌體為噬菌體 P22、ε 15、Sf6, ΗΚ620、Tl、Τ7、噬菌體 14、PhiVlO, APSE-l、Al、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、0157、0111 或 Gifsy，并且其與各噬菌體粘附 蛋白在不涉及噬菌體結(jié)合的蛋白質(zhì)的C-端部分的氨基酸序列上，同源性小于30%。還優(yōu)選 噬菌體粘附蛋白來源于具有C-端同源性的噬菌體的野生型噬菌體粘附蛋白，即氨基酸序 列的C-端部分，在多于至少150個連續(xù)的氨基酸殘基上，與下列噬菌體的噬菌體粘附蛋白 的序列同源性至少為30 %，優(yōu)選為60 %，更優(yōu)選為70 %、80 %、90 %、95 %和98 %，上述噬菌 體為噬菌體 P22、ε 15、Sf6, ΗΚ620、Tl、Τ7、噬菌體 14、PhiVlO, APSE-I、Al、A18a、ST104、 ST64T、JK106、Det7、0157、0111或Gifsy，并且其與各噬菌體粘附蛋白在不涉及噬菌體結(jié)合 的蛋白質(zhì)的N-端部分的氨基酸序列上，同源性小于30%。還優(yōu)選的噬菌體粘附蛋白與下 述噬菌體的噬菌體粘附蛋白在全部氨基酸序列上的序列同源性為至少30%，優(yōu)選為60% 或更優(yōu)選為70%、80%、90%、95%、98%，上述噬菌體為噬菌體P22、ε 15、Sf6、HK620、Tl、 T7、噬菌體 14、PhiVIO、SPSE-1、Al、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、0157、0111 或 Gifsy0在本發(fā)明的一個實施方式中，噬菌體粘附蛋白與噬菌體P22或ε 15具有如上所述 的N-端同源性。優(yōu)選的噬菌體粘附蛋白與SEQ ID Ν0:53的ρ22尾部刺突的野生型噬菌體 粘附蛋白具有如上所述的N-端同源性，或者與SEQ ID Ν0:55的ε 15側(cè)尾絲(side tail fiber)的野生型噬菌體粘附蛋白具有如上所述的N-端同源性。特別優(yōu)選的噬菌體粘附蛋白來源于表1列出的野生型噬菌體粘附蛋白。表1
權(quán)利要求
1.特異性結(jié)合革蘭氏陰性細(xì)菌0-抗原的噬菌體粘附蛋白，其中所述噬菌體粘附蛋白 與其野生型相比缺少結(jié)合噬菌體和水解脂多糖的能力。
2.權(quán)利要求1所述的噬菌體粘附蛋白，其包括突變和/或缺失。
3.權(quán)利要求2所述的噬菌體粘附蛋白，其包括噬菌體結(jié)合域的缺失和/或包括酸性氨 基酸突變?yōu)榉撬嵝园被幔貏e是1 7個、1 6個、1 5、1 4個、1 3個或1 2個 酸性氨基酸突變?yōu)榉撬嵝园被幔约案唧w的是一個酸性氨基酸突變?yōu)榉撬嵝园被帷?br> 4.上述權(quán)利要求中的任一項所述的噬菌體粘附蛋白，其包括標(biāo)志物分子或標(biāo)簽，所述 標(biāo)志物分子優(yōu)選生物素或鏈霉抗生物素，所述標(biāo)簽優(yōu)選HA-標(biāo)簽、His-標(biāo)簽、Strep-標(biāo)簽、 Avi-標(biāo)簽、Myc-標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽、JS-標(biāo)簽或半胱氨酸-標(biāo)簽。
5.噬菌體粘附蛋白，其具有SEQID NO :2、4、5、7、9、11 14、36 42、56或58的氨基 酸序列；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID NO :60被截去了從氨基酸殘基2直到氨基酸殘基 161的N-端、且具有D332突變?yōu)镹、D341突變?yōu)镹、D345突變?yōu)镹、E365突變?yōu)镼、D381突 變?yōu)镹、E392突變?yōu)镼、D402突變?yōu)镹、D405突變?yōu)镹、E411突變?yōu)镼、D417突變?yōu)镹、D428 突變?yōu)镹、D431突變?yōu)镹、E444突變?yōu)镼、E456突變?yōu)镼、D459突變?yōu)镹、E483突變?yōu)镼、E500 突變?yōu)镼、E518突變?yōu)镼或D519突變?yōu)镹中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID NO :62被截去了從氨基酸殘基2直到氨基酸殘基 161的N-端、且具有D332突變?yōu)镹、D341突變?yōu)镹、D345突變?yōu)镹、E365突變?yōu)镼、D381突 變?yōu)镹、E392突變?yōu)镼、D402突變?yōu)镹、D405突變?yōu)镹、E411突變?yōu)镼、D417突變?yōu)镹、D428 突變?yōu)镹、D431突變?yōu)镹、E444突變?yōu)镼、E456突變?yōu)镼、D459突變?yōu)镹、E483突變?yōu)镼、E500 突變?yōu)镼、E518突變?yōu)镼或D519突變?yōu)镹中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID NO :64被截去了從氨基酸殘基2直到氨基酸殘基 161的N-端、且具有D340突變?yōu)镹、D344突變?yōu)镹、E364突變?yōu)镼、D380突變?yōu)镹、E391突 變?yōu)镼、D401突變?yōu)镹、D404突變?yōu)镹、E410突變?yōu)镼、D416突變?yōu)镹、D427突變?yōu)镹、D430 突變?yōu)镹、E443突變?yōu)镼、E455突變?yōu)镼、D458突變?yōu)镹、E482突變?yōu)镼、E499突變?yōu)镼、E517 突變?yōu)镼或D518突變?yōu)镹中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID NO :66被截去了從氨基酸殘基2直到氨基酸殘基 156的N-端、且具有突變?yōu)镼、D351突變?yōu)镹、D358突變?yōu)镹、E375突變?yōu)镼、E377突 變?yōu)镼、D383突變?yōu)镹、D385突變?yōu)镹、E393突變?yōu)镼、E401突變?yōu)镼、D446突變?yōu)镹、E468 突變?yōu)镼、D487突變?yōu)镹、E494突變?yōu)镼、D495突變?yōu)镹、D496突變?yōu)镹、E503突變?yōu)镼、E518 突變?yōu)镼或D523突變?yōu)镹中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID N0:68具有D180突變?yōu)镹、D186突變?yōu)镹、D190 突變?yōu)镹、D211突變?yōu)镹、D241突變?yōu)镹、E246突變?yōu)镼、D2M突變?yōu)镼、D261突變?yōu)镹、D263 突變?yōu)镹、D265突變?yōu)镹、E266突變?yōu)镼、D301突變?yōu)镹、E3M突變?yōu)镼、D333突變?yōu)镹、E334 突變?yōu)镼、E336突變?yōu)镼、D339突變?yōu)镼或D357突變?yōu)镹中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID NO :70被截去了從氨基酸殘基2直到氨基酸殘基 169的N-端、且具有D344突變?yōu)镹、D345突變?yōu)镹、E351突變?yōu)镼、E356突變?yōu)镼、D362突 變?yōu)镹、D398突變?yōu)镹、E405突變?yōu)镼、D408突變?yōu)镹、D412突變?yōu)镹、E425突變?yōu)镼、E432 突變?yōu)镼、D435突變?yōu)镹、D452突變?yōu)镹、E498突變?yōu)镼、D509突變?yōu)镹、E511突變?yōu)镼、D5^突變?yōu)镹、E534突變?yōu)镼、E538突變?yōu)镼、E547突變?yōu)镼、D5M突變?yōu)镹、D567突變?yōu)镹、D573 突變?yōu)镹、D595突變?yōu)镹、E609突變?yōu)镼、D615突變?yōu)镹或D636突變?yōu)镹中的至少一個突 變；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID NO :72被截去了從氨基酸殘基2直到氨基酸殘基 107的N-端、且具有D178突變?yōu)镹、D179突變?yōu)镹、E185突變?yōu)镼、E190突變?yōu)镼、D196突 變?yōu)镹、D232突變?yōu)镹、E239突變?yōu)镼、D242突變?yōu)镹、D246突變?yōu)镹、E259突變?yōu)镼、E266 突變?yōu)镼、D269突變?yōu)镹、D286突變?yōu)镹、E332突變?yōu)镼、E345突變?yōu)镼、D363突變?yōu)镹、E368 突變?yōu)镼、E372突變?yōu)镼、E381突變?yōu)镼、D388突變?yōu)镹、D401突變?yōu)镹、D407突變?yōu)镹、D429 突變?yōu)镹、E443突變?yōu)镼、D449突變?yōu)镹或D470突變?yōu)镹中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對于SEQ ID NO :74被截去了從氨基酸殘基2直到氨基酸殘基 107的N-端、且具有D178突變?yōu)镹、D179突變?yōu)镹、E185突變?yōu)镼、E190突變?yōu)镼、D196突 變?yōu)镹、D232突變?yōu)镹，E239突變?yōu)镼、D242突變?yōu)镹、D246突變?yōu)镹、E259突變?yōu)镼、E266 突變?yōu)镼、D269突變?yōu)镹、D286突變?yōu)镹、E332突變?yōu)镼、E345突變?yōu)镼、D363突變?yōu)镹、E368 突變?yōu)镼、E372突變?yōu)镼、E381突變?yōu)镼、D388突變?yōu)镹、D401突變?yōu)镹、D407突變?yōu)镹、D429 突變?yōu)镹、E443突變?yōu)镼、D449突變?yōu)镹或D470突變?yōu)镹中的至少一個突變。
6.核酸分子，其編碼根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項所述的噬菌體粘附蛋白，優(yōu)選如SEQ ID NO 43 51所示的序列。
7.載體，其編碼權(quán)利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白。
8.宿主細(xì)胞，其被權(quán)利要求6所述的核酸分子或權(quán)利要求7所述的載體轉(zhuǎn)化。
9.產(chǎn)生權(quán)利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白的方法，其包括以下步驟(a)識別噬菌體粘附蛋白的噬菌體結(jié)合域；(b)從包含編碼步驟(a)的噬菌體粘附蛋白的序列的核酸分子中刪除步驟(a)識別的 噬菌體結(jié)合域；(c)利用突變使噬菌體粘附蛋白的水解活性失活。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中在步驟(a)中，所述噬菌體結(jié)合域通過先進(jìn)行氨基酸 比對，再確定所述噬菌體粘附蛋白相比另一種噬菌體粘附蛋白而言的N-端來識別，或其中所述噬菌體結(jié)合域通過用適于同源性釣取噬菌體結(jié)合域的引物擴(kuò)增編碼該噬 菌體結(jié)合域的核酸序列來識別。
11.權(quán)利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白的用途，用于結(jié)合、富集、移除、捕 獲和檢測革蘭氏陰性細(xì)菌。
12.檢測細(xì)菌的方法，其包括以下步驟(a)使權(quán)利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白與支撐物偶聯(lián)；(b)將偶聯(lián)有所述噬菌體粘附蛋白的支撐物與樣品一起溫育；(c)任選除去樣品以及該樣品中未結(jié)合所述噬菌體粘附蛋白的細(xì)菌；(d)任選加入透化或破壞細(xì)菌膜的物質(zhì)；以及(e)檢測樣品中與所述噬菌體粘附蛋白結(jié)合的細(xì)菌。
13.檢測細(xì)菌的方法，其包括以下步驟(a)使含有細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分的樣品與權(quán)利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附 蛋白接觸，優(yōu)選溫育約1秒 20分鐘；(b)然后將含有細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分和所述噬菌體粘附蛋白的樣品與固體支撐物一起 溫育，優(yōu)選約1 60分鐘；(c)任選除去樣品以及該樣品中未結(jié)合所述噬菌體粘附蛋白的細(xì)菌；(d)任選加入透化或破壞細(xì)菌膜的物質(zhì)；以及(e)檢測樣品中與所述噬菌體粘附蛋白結(jié)合的細(xì)菌。
14.權(quán)利要求12或13所述的方法的用途，用于檢測在醫(yī)藥、食品工業(yè)和分析、牲畜飼 養(yǎng)、新鮮水或環(huán)境分析中的細(xì)菌。
15.選擇性純化細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分的方法，其包括以下步驟a)使含有細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分的樣品與權(quán)利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋 白接觸，優(yōu)選溫育約1 20分鐘；b)隨后將所述樣品與固體支撐物一起溫育，其中所述樣品含有細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分和 所述噬菌體粘附蛋白，優(yōu)選溫育約1 60分鐘；c)從樣品中分離出結(jié)合有細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成分的固體支撐物，其中細(xì)菌細(xì)胞或細(xì)胞成 分通過所述噬菌體粘附蛋白結(jié)合到所述固體支撐物上。
16.富集和純化細(xì)菌細(xì)胞和/或細(xì)胞成分的方法，其包括下述步驟c)使含有細(xì)菌細(xì)胞和/或細(xì)胞成分的樣品與磁性支撐物相接觸，在所述磁性支撐物的 表面有權(quán)利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白，優(yōu)選溫育約1 60分鐘；d)從樣品中分離出結(jié)合有所述細(xì)菌細(xì)胞和/或細(xì)胞成分的磁性支撐物。
17.—種試劑盒，其用來進(jìn)行權(quán)利要求12、13、15或16所述的方法，所述試劑盒包括權(quán) 利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白，支撐物和用于檢測、純化或富集革蘭氏陰性 細(xì)菌和/或細(xì)胞成分的檢測試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合革蘭氏陰性細(xì)菌的O-抗原的噬菌體粘附蛋白，其缺乏結(jié)合噬菌體和水解脂多糖的能力。本發(fā)明還涉及核酸分子，其包括編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的序列。另外，本發(fā)明涉及用來產(chǎn)生本發(fā)明噬菌體粘附蛋白的方法。本發(fā)明還涉及所述蛋白質(zhì)的用途以及檢測、純化和富集細(xì)菌的方法。
文檔編號G01N33/569GK102099371SQ200980125992
公開日2011年6月15日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者斯蒂芬·米勒, 曼弗雷德·比布爾, 莫尼卡·沃爾特, 雷納特·格拉斯?fàn)?申請人:拜奧默里克斯公司