專(zhuān)利名稱：表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子的構(gòu) 建及應(yīng)用，屬于基因工程疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PPV (Porcine Parvovirus)不僅是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，而且能夠引起多種豬病。 VP2是病毒粒子主要成分，約占80%，細(xì)小病毒的外殼蛋白在自然狀態(tài)下可自主裝配。VP2具有良好 的免疫原性，眾多的科學(xué)家利用VP2的良好免疫特性構(gòu)建重組疫苗來(lái)預(yù)防本病，取得了很好的效果， 同時(shí)還是具有血凝活性的物質(zhì)。Martinez等將PPVVP2基因克隆到桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，并成功地在 昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)，表達(dá)的VP2多肽能自我裝配成病毒樣粒子(Vims-Like Particles, VLPs)，用其免 疫母豬能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。盡管未見(jiàn)有關(guān)該種疫苗進(jìn)一步研究和應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)，但是VP2基因在體外 表達(dá)的蛋白能自我包裝成病毒樣粒子的特性，為重組多價(jià)亞單位疫苗的研究打下了基礎(chǔ)。Sedlik等將 PPVVP2和包含淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)的118-132位氨基酸的抗原決定簇區(qū)相連，然后克隆 于桿狀病毒表達(dá)載體PACYM，轉(zhuǎn)染表達(dá)PPV:VP2-LCMV蛋白。利用該重組蛋白免疫鼠可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈 的CTL反應(yīng)，在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月，并可抵抗致死量的LCMV攻擊。之后，Sedlik又將LCMV 的CD8+T細(xì)胞抗原決定簇多膚共價(jià)結(jié)合于1 pm的脂質(zhì)微球上，與上述表達(dá)的PPV:VP2-LCMV蛋白一 起進(jìn)行了免疫小鼠的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者都能誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。但是PPV:VP2-LCMV 攜帶的抗原量比脂質(zhì)體微球少100倍時(shí)，誘導(dǎo)的CTL活性仍比脂質(zhì)體微球誘導(dǎo)的CTL活性高6倍， 并且只有PPV:VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻擊。Richard等用PPV VP2共價(jià)結(jié)合 乙肝病毒HBSAg的抗原決定簇區(qū)多肽，然后免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了很強(qiáng)的針對(duì)插人的HBSAg決定簇的 T細(xì)胞反應(yīng)，并能抵抗乙肝病毒的致死性攻擊。這些結(jié)果均說(shuō)明PPV VP2病毒樣粒子作為一種抗原的 轉(zhuǎn)運(yùn)載體具有很大的潛在價(jià)值，并為進(jìn)行多價(jià)重組疫苗的研究創(chuàng)造了良好的條件。
豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)與多種豬病相關(guān)，主要引起仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜 合征(PDNS)、繁殖障礙、豬呼吸綜合征、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴腺炎、也可能引起滲出性皮炎、 仔豬先天性震顫等。尤其PMWS,自1991年加拿大首次報(bào)道以來(lái)，現(xiàn)已證實(shí)呈世界性流行，我國(guó)的一 些豬場(chǎng)也普遍存在本病。大量報(bào)道證明易感豬單獨(dú)感染PCV2后會(huì)出現(xiàn)典型的病理變化，但不表現(xiàn)或 只出現(xiàn)輕微的臨床征狀，但在感染其他病原如PPV、 PRRSV、各種致病菌等、飼養(yǎng)條件改變或外界刺 激條件下表現(xiàn)臨床征狀。PCV2與PPV和PRRSV混合感染引起的PMWS很難治愈，國(guó)外研究表明在 實(shí)驗(yàn)條件下PCV2與這兩種病毒混合感染可以復(fù)制出典型的PMWS，但單獨(dú)感染這三種病毒不表現(xiàn)臨 床征狀,因此有人認(rèn)為PCV2與其他病原可能有協(xié)同作用，但其機(jī)理還不清楚。豬一旦感染圓環(huán)病毒病， 無(wú)有效治療的藥物，因此研究安全、有效的疫苗是預(yù)防本病的主要途徑。己有研究表明PCV2 Cap蛋 白成為疫苗研究的候選基因，PCV2抗原決定簇主要集中在Cap蛋白第47 85， 165 200及C端最后 4個(gè)氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明目的在于1)利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)外源基因的重組PPV VP2病毒樣粒子的方法， 及以該重組PPV VP2病毒樣粒子作為一種抗原轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)行多價(jià)重組疫苗的研制；2)構(gòu)建了在腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子及其在疫苗免疫上的應(yīng)用。 技術(shù)方案
1) 獲取ACap-AVP2目的基因并克隆入pMD19-T載體
以GenBank中PCV2-js2002基因登錄號(hào)為AY691679和PPV VP2重組質(zhì)粒的基因序列為模板，用 軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物P3， P4， P5， P6和P7，分別加入酶切位點(diǎn) P3 5' - ctggtaccatggtccaccgcccaggag - 3' Kpnl P4 5' -cagctagccgttaccgctggagaagg -3' Nhel P5 5'-gagctagcgggggggttggtgtgt-3' Nhel P6 5' -cggctgcagctagtataa加cttgg -3' Pstl P7 5'-cgggcggccgcctagtataattttcttgg陽(yáng)3' jVort
以P3， P4引物擴(kuò)增PCV2 Cap蛋白的165-200位氨基酸的抗原決定簇區(qū)多肽基因108 bp的片段 △Cap,以P5， P6引物擴(kuò)增PPV VP2蛋白C端1640 bp的片段AVP2，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖 凝膠上電泳后，回收并將其與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化五.co//DH5cu堿裂解法提取質(zhì)粒，分別用 AT;wI/涵el和M2d/尸M雙酶切鑒定，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒pTACap和pTAVP2。
利用引物上的內(nèi)切酶A%el和pMD19-T Vector上的ftrt將陽(yáng)性質(zhì)粒pTACap雙酶切，回收2.8 Kb 的片段，同時(shí)利用引物上的內(nèi)切酶Mzd和尸Wl將陽(yáng)性質(zhì)粒pTAVP2雙酶切，回收1.64Kb的小片段， 然后將回收的兩片段用T4DNALigase連接，轉(zhuǎn)化DH5a,堿裂解法提取質(zhì)粒，尺p"IAPM雙酶切 鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pTACap-AVP2。
2) 重組質(zhì)粒pAd-ACap-AVP2的構(gòu)建與鑒定
以P3， P7為引物，陽(yáng)性質(zhì)粒pTACap-AVP2為模板，PCR擴(kuò)增ACap-AVP2片段，并引入內(nèi)切酶 《戶1/湯 1，按照pAdEasy 載體系統(tǒng)操作說(shuō)明，利用雙酶切位點(diǎn)Kp"I/MWl將外源片段ACap-AVP2 克隆至轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV中；用PCR、 A^"I/Afert雙酶切及測(cè)序分析進(jìn)行鑒定，命名為 rShuttle-ACap-AVP2;
3) 表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子的獲得
用Pwe I酶切該重組質(zhì)粒，使其線性化，然后與骨架載體pAdEasyTMVector在1.8 kV、 25 和200 Q條件下電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌A/57W感受態(tài)細(xì)胞，使rShuttle-ACap-AVP2與pAdEasy Vector發(fā)生同 源重組，轉(zhuǎn)化至DHsa宿主菌，挑選出陽(yáng)性克隆，用PCR、 i^cl酶切鑒定重組是否正確，構(gòu)建成重組 質(zhì)粒，命名為pAd-ACap-AVP2;
將重組質(zhì)粒pAd-ACap-AVP2轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，獲得重組病毒rAd-ACap-AVP2;重組腺病毒 rAd-ACap-AVP2表達(dá)ACap-AVP2嵌合蛋白在該重組腺病毒感染的293A細(xì)胞中自我裝配成病毒樣粒 子PPV: VLP(PCV2)，即為獲得的表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子。上述 表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子在制備疫苗方面的應(yīng)用可以獲得一種蛋白 質(zhì)載體多價(jià)重組疫苗。
有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下
1、 本發(fā)明應(yīng)用的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)是缺失了 El和E3基因的人腺病毒血清5型(Ad5 )，具有無(wú)致病 性、復(fù)制效率高、克隆空間大(可容納7.5 Kb的外源片段)、能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中表達(dá)重 組蛋白、在同種細(xì)胞和組織中可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等特點(diǎn)，可對(duì)外源基因進(jìn)行正確的翻譯和修飾，使 表達(dá)的蛋白具有與天然蛋白相同的生物活性。使用該系統(tǒng)構(gòu)建的重組病毒用于豬體，還可以避免由于 豬體自身產(chǎn)生的腺病毒抗體影響免疫效果。
2、 利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)外源基因的重組PPV VP2病毒樣粒子將PPV VP2 C端基因片段 △VP克隆到腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染HEK-293 A細(xì)胞，RT-PCR、間接免疫熒光及Western-blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AVP2蛋白在服K-293 A細(xì)胞中高效表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物的粗提物用3%的磷鎢酸負(fù)染后經(jīng) 透射電鏡觀察，在電鏡下可以看到大量病毒樣顆粒子存在，呈圓型，直徑為30 nm左右，其形態(tài)大小 均與全病毒粒子相似。
3、 利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)外源基因的重組PPVVP2病毒樣粒子，以PPVVP2病毒樣粒子 作為一種抗原轉(zhuǎn)運(yùn)載體，為重組多價(jià)亞單位疫苗的研制打下了基礎(chǔ)。
4、 本發(fā)明以PPVVP2病毒樣粒子作為PCV2抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)載體:將PCV2核衣殼蛋白(Cap)的165-200 位氨基酸(ACap)基因嵌合在PPV VP2的N端(AVP2)，然后克隆到腺病毒表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染HEK-293 A細(xì)胞，RT-PCR、間接免疫熒光及Western-blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AVP2蛋白在HEK-293 A細(xì)胞中 高效表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物的粗提物用3%的磷鎢酸負(fù)染后經(jīng)透射電鏡觀察，在電鏡下可以看到大量病毒樣顆 粒子存在，呈圓型，直徑為30nm左右，其形態(tài)大小均與全病毒粒子相似。
5、 本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)的嵌合病毒樣粒子，免疫小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在首免后第14天實(shí) 驗(yàn)組能檢測(cè)到PCV2特異性抗體，抗體的滴度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，在二免后35天時(shí)杭體水平達(dá)最 高為1:10000; 二免后35天，實(shí)驗(yàn)組PPV中和抗體滴度為20， PCV2中和抗體滴度位16; 二免后28至 42天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Con A/LPS刺激指數(shù)差異極顯著。說(shuō)明重組的嵌合病毒樣粒子具有良好的PPV VP2和PCV2Cap的免疫原性，免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。
6、 本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)的嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]作為一種蛋白質(zhì)載體多價(jià)重 組疫苗不但安全性高、價(jià)廉，而且可以有效的預(yù)防PCV2感染及由PCV2與PPV混合感染而導(dǎo)致的 PMWS的發(fā)生，是一種新型的安全有效的候選疫苗。
四

圖1: PPVAVP2目的基因擴(kuò)增片段
圖2:重組質(zhì)粒rShuttle-AVP2 I I雙酶切酶切鑒定圖譜 圖3:重組質(zhì)粒pAd-AVP2Pad酶切鑒定圖譜
圖4:重組腺病毒rAd-AVP2間接免疫熒光圖重組腺病毒(a)和細(xì)胞對(duì)照(b) 圖5:表達(dá)AVP2蛋白的免疫轉(zhuǎn)印鑒定 圖6: PPVVP2病毒樣粒子電鏡圖 圖7: PCV2 ACap目的基因擴(kuò)增片段
圖8:重組質(zhì)粒rShuttle-ACap-AVP2 A:戸I WW I雙酶切酶切鑒定圖譜 圖9:重組質(zhì)粒pAd-ACap-AVP2尸acl酶切鑒定圖譜 圖10:重組病毒間接免疫熒光圖豬抗PPV(a)和PCV2(b)血清的對(duì)應(yīng)孔， 細(xì)胞對(duì)照孔(c)
圖ll:表達(dá)嵌合蛋白的免疫轉(zhuǎn)印鑒定豬抗PPV(1)和PCV2(2)血清，細(xì)胞對(duì)照孔(3)
圖12:嵌合病毒樣粒子電鏡圖
圖13: PCV2特異性抗體圖 圖14:淋巴轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)圖(ConA刺激) 圖15:淋巴轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)圖(LPS刺激) 圖16:嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]構(gòu)建示意圖 五具體實(shí)施例方式
1、表達(dá)外源基因的PPVVP2病毒樣粒子的構(gòu)建及應(yīng)用
1)獲取AVP2目的基因并克隆入pMD19-T載體
以GenBank中NADL-2基因登錄號(hào)為NC:001718基因序列為模板，用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物 分別加入A^"I和Wo I酶切位點(diǎn)。PPV弱毒株(NADL-2)購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。 P1 5 '-gaggtacc鵬ggggttggtgtgt-3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'
以Pl， P2引物擴(kuò)增含VP2(1740 bp)基因C端1640 bp的片段(圖1)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后，回收并將其與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化DH5a，堿裂解法提取質(zhì)粒， 和A/on雙酶切鑒定，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒(pTAVP2)。 2)重組質(zhì)粒pAd-AVP2的構(gòu)建與鑒定
利用雙酶切位點(diǎn)(A:p"I/A/o/I)將目的片段克隆至穿梭載體pShuttle-CMV中；用Kp"I/A^1雙酶切(圖 2)及測(cè)序分析進(jìn)行鑒定，命名為rShuttle-AVP2;用戶me I酶切該重組質(zhì)粒，使其線性化，然后與腺 病毒骨架載體(pAdEasyTMVector)在1.8 kV、 25 和200 Q條件下電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ5/S3感受態(tài)細(xì) 胞，使rShuttle-AVP2與pAdEasyTM Vector發(fā)生同源重組，轉(zhuǎn)化至DHsa宿主菌，挑選出陽(yáng)性克隆，用 PCR、尸acl酶切(圖3)鑒定重組是否正確，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，命名為pAd-AVP2。
3) 重組病毒的獲得
按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑操作方法，將預(yù)先用線性化的重組質(zhì)粒pAd-AVP2轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì) 胞，5%C02, 37'C靜置培養(yǎng)10d以上，顯微鏡觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70%時(shí)，收毒。經(jīng)3次噬 斑純化實(shí)驗(yàn)，獲得重組病毒(rAd-AVP2)的滴度為10112TCID5()/mL。
4) 病毒樣粒子的生物學(xué)特征研究
① 間接免疫熒光
將重組腺病毒稀釋后接種于長(zhǎng)滿單層的HEK-293A細(xì)胞，5%C02、 37'C培養(yǎng)，約24h,棄去上清， 用PBS洗滌一次，37。C干燥45min， .2(TC冷凍45 min，再以冷的無(wú)水乙醇4'C固定45 min， PBST洗 滌3次；加入50 nL 1:40稀釋的豬抗PPV的血清，37。C作用1 h，用PBST洗滌3次；加入1:100 FITC-SPA， 37'C作用1 h，洗滌3次；顯微鏡觀察。重組腺病毒rAd-AVP2對(duì)應(yīng)孔(a)中呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而細(xì)胞 對(duì)照孔(b)沒(méi)有熒光出現(xiàn)(圖4),說(shuō)明重組腺病毒rAd-AVP2在細(xì)胞中表達(dá)了 PPV: AVP2蛋白。
② 蛋白質(zhì)印記
用8。/。PEG-6000濃縮重組腺病毒HEK-293A細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)設(shè)定正常HEK-293A細(xì)胞培養(yǎng)物為 對(duì)照。將上述濃縮蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝纖膜后，10%脫脂乳封閉過(guò)夜；加入1:40豬抗 PPV的血清室溫作用2 h;洗滌3次，加入l:20000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG,室溫作 用1.5 h;充分洗漆后，加入化學(xué)發(fā)光法顯色液(DAB)，觀察特異蛋白條帶。濃縮的重組腺病毒經(jīng)電 泳轉(zhuǎn)印顯色后顯示，在66 KD處均有一條明顯的條帶，而對(duì)照正常的HEK-293A細(xì)胞沒(méi)有(圖5)， 說(shuō)明重組腺病毒rAd-AVP2在細(xì)胞中表達(dá)了 PPV: AVP2蛋白。
③ 病毒樣粒子的粗純化與電鏡觀察
收集病變細(xì)胞，用PBS洗兩次，1000r/minl5min離心，重懸于50 mmo1/1 NaHC03中，超聲波裂 解后，24 000r/min離心15min，上清液中含有表達(dá)的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸銨至終濃度20n/。， 4'C攪拌過(guò)夜進(jìn)行沉淀，然后離20 000 r/min離心10 min ，沉淀重懸于中，透析除鹽即為嵌合病毒樣 粒子的粗提物。腺病毒野毒做同樣處理后做對(duì)照。加入1:10稀釋的豬抗PPV血清37'C作用1 h后再 4'C過(guò)夜，以12 000r/min離心90 min，沉淀重懸于少量水中，用3%的磷鎢酸負(fù)染后經(jīng)透射電鏡觀察。 在電鏡下可以看到大量病毒樣粒子存在，呈圓型，直徑為30nm左右，其形態(tài)大小均與全病毒粒子相 似(圖6)，說(shuō)明重組腺病毒rAd-AVP2在細(xì)胞中表達(dá)的PPV:AVP2蛋白能自我組裝成病毒樣粒子。
紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)
參照《動(dòng)物病毒學(xué)》，使用0.7%豚鼠紅細(xì)胞的生理鹽水懸液。重組腺病毒rAd-AVP2血凝效價(jià)為1:64， 空的腺病毒野毒沒(méi)有血凝活性，說(shuō)明rAd-AVP2表達(dá)的AVP2蛋白保持PPV原有的生物學(xué)活性。
2、以PPV VP2病毒樣粒子作為一種抗原轉(zhuǎn)運(yùn)載體，構(gòu)建表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基 因的重組病毒樣粒子(圖16)
1)獲取ACap-AVP2目的基因并克隆入pMD19-T載體
以GenBank中PCV2-js2002基因登錄號(hào)為AY691679和PPV VP2重組質(zhì)粒的基因序列為模板，用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物P3, P4， P5， P6禾卩P7，分別加入酶切位點(diǎn)，PCV2 js2002由本實(shí)驗(yàn)室 分離鑒定(公知公用，見(jiàn)參考文獻(xiàn)潘群興等，檢測(cè)PCV2、PPV、 PRV疫苗株與野毒株的多重PCR 方法，中國(guó)病毒學(xué)，2005， 20 (6) 603 60)。
以P3， P4引物擴(kuò)增PCV2Cap蛋白的165-200位氨基酸基因108 bp (圖7)的片段ACap,以P5， P6引物擴(kuò)增PPV VP2蛋白C端1640 bp (圖1)的片段AVP2，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上 電泳后，回收并將其與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化Eco/ZDH^,堿裂解法提取質(zhì)粒，分別用/^wI/Mzel 和7Vfel/尸M雙酶切鑒定，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒(pTACap, pTAVP2)。
利用引物上的內(nèi)切酶和pMD19-T Vector上的ftrt將陽(yáng)性質(zhì)粒pTACap雙酶切，回收2.8 Kb 的片段，同時(shí)利用引物上的內(nèi)切酶A%el和尸WI將陽(yáng)性質(zhì)粒pTAVP2雙酶切，回收1.64 Kb的小片段， 然后將回收的兩片段用T4DNALigase連接，轉(zhuǎn)化￡.CO//DH5a，堿裂解法提取質(zhì)粒，K/wI/PwI雙酶切 鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pTACap-AVP2 。
2) 重組質(zhì)粒pAd-ACap-AVP2的構(gòu)建與鑒定
以P3， P7為引物，陽(yáng)性質(zhì)粒pTACap-AVP2為模板，PCR擴(kuò)增ACap-AVP2片段，并引入內(nèi)切 酶^M/WM。按照pAdEasy Vector載體系統(tǒng)操作說(shuō)明，利用雙酶切位點(diǎn)(A^I/M^I)將外源片段 (ACap-AVP2)克隆至轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV中；用PCR、 A:戸I/Afert雙酶切及測(cè)序分析進(jìn)行鑒定 (圖8)，命名為rShuttle-ACap-AVP2。
用尸wd酶切該重組質(zhì)粒，使其線性化，然后與pAdEasyTMVector在1.8 kV、 25和200 Q條件 下電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ5/W感受態(tài)細(xì)胞，使rShuttle-ACap-AVP2與骨架載體(pAdEasy Vector) 發(fā)生同源重組，轉(zhuǎn)化至DH5d宿主菌，挑選出陽(yáng)性克隆，用PCR、酶切鑒定重組是否正確(圖9)， 構(gòu)建成重組質(zhì)粒，命名為pAd-ACap-AVP2。
3) 重組病毒的獲得與純化
按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑操作方法，將預(yù)先用線性化的重組質(zhì)粒pAd-ACap-AVP2轉(zhuǎn)染 HEK-293A細(xì)胞，5%C02， 37'C靜置培養(yǎng)10 d以上，顯微鏡觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)70%時(shí)，收 毒。經(jīng)3次噬斑純化實(shí)驗(yàn)，獲得重組病毒(rAd-AVP2)的滴度為10118TCID5()/mL。
4) 嵌合病毒樣粒子的生物學(xué)特征研究
① 間接免疫熒光
將重組腺病毒稀釋后接種于長(zhǎng)滿單層的HEK-293A細(xì)胞，5。/。C02、 37'C培養(yǎng)，約24h,棄去上清， 用PBS洗滌一次，37。C干燥45min， -20°。冷凍45 min,再以冷的無(wú)水乙醇4'C固定45 min， PBST洗滌 3次；分別加入50 nL 1:40稀釋的豬抗PCV2血清(a)和豬抗PPV的血清(b)， 37。C作用1 h，用PBST洗 滌3次；加入1:100 FITC-SPA， 37。C作用1 h，洗漆3次；顯微鏡觀察。重組腺病毒rAd-ACap-AVP2 呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而細(xì)胞對(duì)照孔(c)沒(méi)有熒光出現(xiàn)(圖10)。說(shuō)明重組腺病毒rAd-ACap-AVP2在細(xì)胞 中表達(dá)了 PPV: AVP2和PCV2: ACap蛋白。
② 蛋白質(zhì)印記
用8"/。PEG-6000濃縮重組腺病毒HEK-293A細(xì)胞培養(yǎng)物，同時(shí)設(shè)定正常HEK-293A細(xì)胞培養(yǎng)物為 對(duì)照。將上述濃縮蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印到硝纖膜后，10%脫脂乳封閉過(guò)夜；加入1:40豬抗 PCV2血清和豬抗PPV的血清室溫作用2 h;洗滌3次，加入1:20000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG，室溫作用1.5h;洗滌4次，加入化學(xué)發(fā)光法顯色液(DAB)，觀察特異蛋白條帶。濃縮的重 組腺病毒經(jīng)電泳轉(zhuǎn)印顯色后顯示， 一抗為豬抗PPV血清或豬抗PCV2血清時(shí)，在66KD處均有一條明 顯的條帶，而對(duì)照正常的HEK-293A細(xì)胞沒(méi)有(圖11)，說(shuō)明重組腺病毒在細(xì)胞中表達(dá)了ACap-AVP2 蛋白。
③ 嵌合病毒樣粒子的粗純化與電鏡觀察
收集病變細(xì)胞，用PBS洗兩次，1000 r/min離心15 min，重懸于50 mmo1/1 NaHC03中，超聲波 裂解后，24 000r/min離心15min，上清液中含有表達(dá)的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸銨至終濃度 20%， 4'C攪拌過(guò)夜進(jìn)行沉淀，然后離20 000 r/min離心10 min，沉淀重懸于中，透析除鹽即為嵌合 病毒樣粒子的粗提物。腺病毒野毒做同樣處理后做對(duì)照。加入1:10稀釋的豬抗PPV血清37'C作用l h后再4'C過(guò)夜，以12 000 r/min離心卯min，沉淀重懸于少量水中，用3%的磷鎢酸負(fù)染后經(jīng)透射電 鏡觀察。在電鏡下可以看到大量病毒樣粒子存在，呈圓型，直徑為30nm左右，其形態(tài)大小均與全病 毒粒子相似(圖12)，說(shuō)明重組腺病毒rAd-ACap-AVP2在細(xì)胞中表達(dá)的ACap-AVP2蛋白能自我組 裝成病毒樣粒子。
④ 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)
參照《動(dòng)物病毒學(xué)》，使用0.7%豚鼠紅細(xì)胞的生理鹽水懸液。重組腺病rAd-ACap-AVP2 血凝效價(jià)為1:64，空的腺病毒野毒沒(méi)有血凝活性，說(shuō)明rAd-ACap-AVP2表達(dá)ACap-AVP2蛋白保持PPV
原有的生物學(xué)活性。
5)小鼠免疫實(shí)驗(yàn)
① 免疫程序
6-8周齡的雄性小鼠60只，隨機(jī)分為2組，每組30只。第一組背部皮下多點(diǎn)注射101()TCID50 重組腺病毒rAd-AC叩-AVP2;第二組每只小鼠皮下注射101。 TCID5。重組腺病毒rAd-Cap;第三組每 只小鼠皮下注射IO1。 TCIDso沒(méi)有外源基因的空的腺病毒作為陰性對(duì)照；第四組每只小鼠皮下注射適量 的PBS作對(duì)照；兩周后進(jìn)行相同的免疫。分別在首免、首免后14， 28, 35， 42， 49和56天，采集血 清測(cè)定PCV2抗體及PPV/PCV中和抗體。首免后28， 42和56天，每組宰殺3只小鼠，取其脾臟，分 離淋巴細(xì)胞，測(cè)定淋巴增殖能力。
② ELISA抗體的檢測(cè)
PCV2 0RF2原核表達(dá)產(chǎn)物(本實(shí)驗(yàn)室制備)經(jīng)His-band純化試劑盒純化，測(cè)定蛋白的平均濃度 為1.10mg/mL。由ELISA方陣試驗(yàn)可以得出，當(dāng)抗原包被濃度為1.8嗎/mL，抗體稀釋100倍， 一抗 37'C分別孵育1.5h，酶標(biāo)二抗37'C孵育45min，加TMB-H202 (四甲基聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫)溶液顯色， 37'C反應(yīng)10-15 min。力卩2MH2S04溶液，終止反應(yīng)，50nL/孔。反應(yīng)條件比較合適，此時(shí)P/N值較大， 且，性血清的^)D值較小，即非特異性比較/」1。結(jié)，判^^ P^-N^XU5時(shí)實(shí)，有效。(樣品OD值-N^)/(P^-N^)y).45陽(yáng)性；(樣品OD值-N^/(P^-N7;K0.45陰性。其中P 表示陽(yáng)性對(duì)照平均 值-，N^表示陰性對(duì)照平均值。
間接ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果rAd-ACap-AVP2免疫組小鼠在首免后第14天能檢測(cè)到PCV2特異性 抗體，抗體的滴度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，在二免后35天時(shí)ELISA杭體水平達(dá)最高為1:10000，明顯 高于rAd-Cap免疫組；而空的腺病毒和PBS免疫組小鼠沒(méi)有產(chǎn)生PCV2特異性抗體(圖13)，說(shuō)明表達(dá) 嵌合病毒樣粒子的重組腺病毒具有良好的免疫原性，免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫保護(hù)反應(yīng)。
③ 中和抗體的檢測(cè)
用IFA檢測(cè)PCV2的中和抗體。具體方法如下小鼠血清56'C滅活30 min, 12000 r/min離心10 min， 取上清，用含2。/oFCS的1640培養(yǎng)基按1:4， 1:8， 1:16， 1:32禾B1:64倍比稀釋病毒PCV2被稀釋為 2000 TCID5。/mL;上述血清和病毒的稀釋液各取50 pL，混合均勻，37'C水浴1 h;取出后加入已長(zhǎng)滿 細(xì)胞單層的PK-15細(xì)胞，每孔100pL，每個(gè)血清稀釋度接種四孔，同時(shí)設(shè)定只接種病毒PCV2的陽(yáng)性 對(duì)照孔和正常細(xì)胞陰性對(duì)照孔，37'C靜置培養(yǎng)72h。按常規(guī)方法進(jìn)行IFA實(shí)驗(yàn)，以減少70%或更多熒 光的血清最高稀釋度的倒數(shù)為中和抗體滴度。在IFA中，所有陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的熒光，陰性對(duì)照無(wú)熒光，而加入免疫小鼠血清的孔沒(méi)有或僅有微弱的熒光。同一組在不同時(shí)間中和抗體滴度不同， 首免后14天所有小鼠中和抗體滴度均<4，到二免后35天rAd-ACap-AVP2免疫組的中和抗體平均滴 度為16，高于rAd-Cap免疫組(12);空的腺病毒和PBS免疫組中和抗體滴度幾乎為0。
用TCID5Q降低試驗(yàn)測(cè)定PPV的中和抗體。具體方法如下小鼠血清56。C滅活30 min， 12000 r/min 離心10min，取上清，用含2。/。FCS的1640培養(yǎng)基按1:4， 1:8， 1:16， 1:32和1:64倍比稀釋;病毒PPV 被稀釋為2000TCID5c/mL;上述不同稀釋度的血清和病毒的稀釋液等體積混合，37'C水浴1 h;取出接 種40 50%融合的PK-15細(xì)胞，每孔100 pL，每個(gè)血清稀釋度接種4孔，同時(shí)設(shè)定只接種病毒的PK-15 陽(yáng)性對(duì)照孔和正常細(xì)胞陰性對(duì)照孔。37'C靜置培養(yǎng)4-5天；顯微鏡觀察。能100%抑制病變的血清最高 稀釋度的倒數(shù)為中和抗體滴度。所有陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，陰性對(duì)照細(xì)胞均沒(méi)有出現(xiàn) 細(xì)胞病變r(jià)Ad-ACap-AVP2免疫組PPV中和抗體滴度為20， rAd-Cap免疫組，空的腺病毒組和PBS 對(duì)照組中和抗體滴度幾乎為0。
④淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
宰殺小鼠，無(wú)菌取其脾臟，剝離結(jié)締組織，置于無(wú)菌平皿中加入少量的無(wú)菌PBS，用針頭刺脾臟， 然后用彎針頭擠壓，擠出其中的細(xì)胞；用彎針頭研磨均勻，棄去多余的結(jié)締組織和大的組織塊；在10 mL 的離心管中加入6mL的淋巴細(xì)胞分離液，再輕輕地加入研磨地組織勻漿液；2000r/min離心15min: 取中間云霧狀的白色細(xì)胞層，置于新的離心管中，加入適量的Hank'液；2000 r/min離心1 0 min;棄上 清，加入適量的含10n/。FCS的1640營(yíng)養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞濃度調(diào) 整為5xlO"mL，加入96孔細(xì)胞板中，每孔100nL細(xì)胞懸液，每只小鼠鋪12孔；其中4孔加入終濃 度為20嗎/nL的ConA，另4孔加入終濃度為15 Hg/pL的LPS，其余4孔作為陰性對(duì)照；37'C， 5%C02 靜置培養(yǎng)44 h;每孔加入20 nL MTT(濃度5 mg/mL),培養(yǎng)4 h;棄去上清，每孔加入100 pL DMSO, 使結(jié)晶溶解，振蕩；測(cè)定OD57onm，計(jì)算ConA刺激孔地平均OD57()nm/未刺激孔的平均OD57Cnm ( SI 值)。用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)免疫組和對(duì)照組的SI值差異是否顯著。二免后14天，四組的刺激指數(shù)(SI)接近， 從第二次免疫后28天到42天rAd-ACap-AVP2免疫組的SI值迅速升高，而Wild Ad和對(duì)照組的SI 值變化不大，經(jīng)t檢驗(yàn)分析二免后28至42天免疫組和對(duì)照組的SI值差異極顯著((P0.01)，說(shuō)明重組 腺病毒rAd-ACap-AVP2能增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫(圖14)。
本發(fā)明構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)的嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]，具有良好的免疫原性，免 疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]作為一種蛋白質(zhì)載體多價(jià)重組 疫苗不但安全性高、價(jià)廉，而且可以有效的預(yù)防PCV2感染及由PCV2與PPV混合感染而導(dǎo)致的PMWS 的發(fā)生，是一種新型的安全有效的候選疫苗。序列表
〈110〉江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
<120〉表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子
〈130〉 說(shuō)明書(shū)
<140〉 00
<141〉 2008-03-25
<160> 7
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
〈211〉 24
〈212〉 DNA
<213〉人工合成
〈220>
<221〉 引物P1
〈222> (1)..(24) 〈223〉 〈400〉 1
g鄉(xiāng)taccgg gggggttggt gtgt 24
〈210〉 2
<211〉 29
<212> DNA <213>人工合成 〈220〉
<221> 引物P2
〈222〉 (1)..(29)
〈223〉 <400〉 2
cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29
<210> 3
<211> 27
〈212> DNA <213〉人工合成 <220>
〈221〉 引物P3
〈222〉 (l)..咖 <223〉
〈400〉 3
ctggtaccat ggtccaccgc ccaggag 27
〈210〉 4
〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉人工合成
〈220〉
〈221〉 引物P4
<222> (1)..(26)
〈223> 〈400〉 4cagctagccg ttaccgctgg agaagg 26
〈210〉5
<211>24
〈212〉腿
〈213〉人工合成
〈220>
〈221〉引物P5
<222>(l).. (24)
〈223〉
<400>5
gagctagcgg gggggttggt gtgt 24
〈210〉 6
<211〉 27
<212〉 腿
〈213〉人工合成
〈220〉
<221> 引物P6
〈222〉 (1)..(27) <223〉
<400〉 6
cggctgcagc tagtataatt ttcttgg 27
〈210〉 7
〈211> 29
〈212〉 DNA
〈213〉人工合成
<220〉
〈221〉 引物P7
〈222〉 (1)..(29) 〈223〉
〈400〉 7
cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29
權(quán)利要求
1、表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子，其特征在于，是由以下方法構(gòu)建而成1)獲取ΔCap-ΔVP2目的基因并克隆入pMD19-T載體以GenBank中PCV2-js2002基因登錄號(hào)為AY691679和豬細(xì)小病毒PPV VP2重組質(zhì)粒的基因序列為模板，用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物P3，P4，P5，P6和P7，分別加入酶切位點(diǎn)P35′-ctggtaccatggtccaccgcccaggag-3′KpnIP45′-cagctagccgttaccgctggagaagg-3′N(xiāo)heIP55′-gagctagcgggggggttggtgtgt-3′N(xiāo)heIP65′-cggctgcagctagtataattttcttgg-3′PstIP75′-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3′N(xiāo)otI以P3，P4引物擴(kuò)增PCV2Cap蛋白的165-200位氨基酸基因108bp的片段ΔCap，以P5，P6引物擴(kuò)增PPV VP2蛋白C端1640bp的片段ΔVP2，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳后，回收并將其與pMD19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，堿裂解法提取質(zhì)粒，分別用KpnI/NheI和NheI/PstI雙酶切鑒定，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒pTΔCap和pTΔVP2。利用引物上的內(nèi)切酶NheI和pMD19-TVector上的PstI將陽(yáng)性質(zhì)粒pTΔCap雙酶切，回收2.8Kb的片段，同時(shí)利用引物上的內(nèi)切酶NheI和PstI將陽(yáng)性質(zhì)粒pTΔVP2雙酶切，回收1.64Kb的小片段，然后將回收的兩片段用T4DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，堿裂解法提取質(zhì)粒，KpnI/PstI雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pTΔCap-ΔVP2。2)重組質(zhì)粒pAd-ΔCap-ΔVP2的構(gòu)建與鑒定以P3，P7為引物，陽(yáng)性質(zhì)粒pTΔCap-ΔVP2為模板，PCR擴(kuò)增ΔCap-ΔVP2片段，并引入內(nèi)切酶Kpn I/NotI，按照pAdEasyTM載體系統(tǒng)操作說(shuō)明，利用雙酶切位點(diǎn)KpnI/NotI將外源片段ΔCap-ΔVP2克隆至轉(zhuǎn)移載體pShuttle-CMV中；用PCR、KpnI/NotI雙酶切及測(cè)序分析進(jìn)行鑒定，命名為rShuttle-ΔCap-ΔVP2；3)表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子的獲得用Pme I酶切該重組質(zhì)粒，使其線性化，然后與骨架載體pAdEasyTMVector在1.8kV、25μF和200Ω條件下電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，使rShuttle-ΔCap-ΔVP2與pAdEasyTM Vector發(fā)生同源重組，轉(zhuǎn)化至DH5α宿主菌，挑選出陽(yáng)性克隆，用PCR、PacI酶切鑒定重組是否正確，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，命名為pAd-ΔCap-ΔVP2。將重組質(zhì)粒pAd-ΔCap-ΔVP2轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，獲得重組病毒rAd-ΔCap-ΔVP2；重組腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2表達(dá)ΔCap-ΔVP2嵌合蛋白在該重組腺病毒感染的293A細(xì)胞中自我裝配成病毒樣粒子PPV:VLP(PCV2)，即為獲得的表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子。
2、權(quán)利要求1所述表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子在制備疫苗方面 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)2型豬圓環(huán)病毒核衣殼蛋白Cap基因的重組病毒樣粒子的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于基因工程疫苗領(lǐng)域。將豬細(xì)小病毒(PPV)VP2基因的C端基因片段克隆于人5型腺病毒穿梭載體，獲得重組腺病毒rAd-ΔVP2，ΔVP2蛋白成功的高效表達(dá)，并能自我裝配成病毒樣粒子[PPV:VLPs]。以PPV VP2病毒樣粒子作為抗原轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)核衣殼蛋白(Cap)的165-200位氨基酸(ΔCap)基因嵌合在PPV VP2的N端(ΔVP2)，獲得重組腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2。嵌合的VP2(ΔCap-ΔVP2)蛋白成功的高效表達(dá)，并能自我裝配成病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]。本發(fā)明還涉及該重組病毒及其表達(dá)Cap基因的重組PPV VP2病毒樣粒子在疫苗免疫等方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101289658SQ20081002464
公開(kāi)日2008年10月22日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者何孔旺, 俞正玉, 倪艷秀, 呂立新, 張雪寒, 溫立斌, 潘群興, 琦 肖, 茅愛(ài)華, 郭容利, 黃克和 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院