專利名稱：隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體elisa檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體ELISA檢測方法及試劑盒，用于動物及人隱孢子蟲感染血清抗體的檢測，本發(fā)明還公開了上述ELISA試劑盒的制備方法，屬于血清學檢測技術領域。
背景技術：
隱孢子蟲是普遍存在的胃腸道寄生性原蟲，能引起人類與家畜的腹瀉。含有隱孢子蟲卵囊的人類、家畜、寵物和野生動物的糞便，直接威脅著人類飲用水安全，導致隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)。分子流行病學研究結果顯示出大多數(shù)人隱孢子蟲病是由人隱 ？包子蟲禾口微小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum, C. parvum genotype II)弓|起的。目前，還沒有有效的方法治療人的隱孢子蟲感染。而現(xiàn)行的診斷方法直接鏡檢和染色鏡檢法費時、費力、檢出率低；間接熒光抗體試驗和PCR方法對儀器設備和試劑的要求較高，因此建立一種快速、特異性較高且可直接判定結果的診斷方法是十分必要的。隱抱子蟲病毒(Cryptosporidium parvum virus, Cryspovirus, CSpV)是 1997 年Khramtsov在牛犢中分離出來的C. parvum卵囊中發(fā)現(xiàn)的，該病毒含有含長的dsRNA (L-dsRNA)和短的dsRNA(S-dsRNA)，其中S-dsRNA編碼病毒衣殼蛋白。之后，Khramtsov 又發(fā)現(xiàn)所有C. hominis和C. parvum都含此dsRNA病毒，而Cryptosporidium其他種中不存在。因此可以把CSpV的分子特征和抗原特性作為檢測C. hominis和C. parvum卵囊的一個依據(jù)。而該病毒衣殼蛋白基因S-dsRNA就可作為對人具有感染性的隱孢子蟲(C. hominis 和C. parvum)與其它種類隱孢子蟲鑒別的一個分子標記和含病毒蟲株的分離和鑒定的依據(jù)。目前尚無利用抗隱孢子蟲病毒檢測感染動物血清中抗體的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白血清中抗體ELISA檢測試劑盒，解決了當前糞便檢測靈敏度低、費時、費力的缺點，能檢測感染人的隱孢子蟲。本發(fā)明還提供了上述ELISA檢測試劑盒的制備方法，利用在大腸桿菌E. coli BL2KDE3)表達的S-dsRNA蛋白作為抗原，建立了檢測人的隱孢子蟲感染血清中抗體的間接ELISA方法。本發(fā)明的隱孢子蟲病毒衣殼蛋白血清中抗體ELISA檢測方法，其特征在于抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白，用于檢測血清中隱孢子蟲病毒抗體。本發(fā)明的隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體間接ELISA檢測試劑盒，組成包括隱孢子蟲病毒標準陽性血清、隱孢子蟲病毒標準陰性血清、酶標二抗、包被病毒衣殼蛋白的酶標板、底物顯色液、洗滌液、終止液、封閉液和酶標物稀釋液及樣品稀釋液。上試劑盒的制備方法，其特征在于以隱孢子蟲病毒衣殼蛋白為抗原包被于酶標板，隱孢子蟲病毒蛋白標準陽性血清和標準陰性血清、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標物稀釋液、樣品稀釋液和封閉液，組成ELISA試劑盒。所述抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白。本發(fā)明ELISA試劑盒檢測方法，包括以下步驟
(1)樣品前處理將被檢血清用樣品稀釋液1 200稀釋；
(2)用本發(fā)明的ELISA試劑盒檢測，向包被隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白的酶標板孔中加入封閉液，再加入血清，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入酶標二抗，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入顯色液孵育10分鐘，終止液終止反應，用酶標儀測定吸光度值；
(3)分析檢測結果
當0D490nm ^ 0. 32時，樣品判定為陽性；當0D490nm < 0. 268時，樣品判定為陰性。本發(fā)明的積極效果在于檢測的樣品為血清，檢測特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好， 能檢測人隱孢子蟲的感染，適合于臨床的快速診斷和基層、農村等流行病學調查大規(guī)模應用。


圖1為重組蛋白的純化SDS-PAGE電泳圖中M:低分子量蛋白標志物；1:純化的重組蛋白；M :DL 2000 Marker ；lanel :the protein purfiecL
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領域技術人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權利要求范圍內。實施例1
隱孢子蟲病毒衣殼蛋白CSpV表達 1材料和方法
1.1菌株隱孢子蟲病毒CSpV衣殼蛋白表達菌pET48a(+)-S。隱孢子蟲病毒CSpV衣殼蛋白的表達、純化及復性
將CSpV衣殼蛋白陽性表達菌按1 %的比例接種于500 mL LB培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)2 3 h，至菌液0D_nm值為0. 4 0. 6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h， 誘導表達結束后，收集菌液。按照Ni-NTA說明書進行目的蛋白的純化。用含有8，6，4，2，0 mol/L尿素，0.5 mol/L L-Arg的PBS溶液進行梯度透析復性。用BCA蛋白含量分析試劑盒測定蛋白濃度。1.3鼠抗隱孢子蟲陽性血清的制備
取純化的2X107個微小隱孢子蟲卵囊溶于PBS中，超聲粉碎，期間間隔取樣，直至顯微鏡下看不見卵囊為止，12 000 r/min離心20 min，上清即為抗原。用BCA蛋白含量分析試劑盒測定蛋白濃度。用該抗原腹腔免疫6只6、周齡的BALB/c小鼠(100 Pg/只)，按常規(guī)免疫程序制備陽性血清。結果
2. 1隱孢子蟲病毒CSpV衣殼蛋白的純化重組蛋白陽性表達菌經(jīng)IPTG誘導表達后，用Ni-NTA親和層析柱純化目的蛋白。純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，可見在37 ku處有一條單一的蛋白帶，見附圖1。實施例2
以重組蛋白為抗原建立檢測人的隱孢子蟲感染血清中抗體的間接ELISA方法 1材料和方法 1. 1、封閉劑的選擇
用重組蛋白包被酶標板，4 0C過夜。以10 %胎牛血清、10 %正常兔血清、5 %脫脂奶粉為封閉劑，用PBST稀釋，每孔加200 UL, 37。C孵育2 h。洗滌后封閉2 h，分別加陽性血清對照和陰性血清對照，37 0C孵育1 h。洗滌，加入HRP標記的羊抗鼠二抗，37 °C孵育1 h。洗滌后加入底物，觀察顏色變化。顯色后，用2 mol/L 終止反應。酶標儀測定OD49tlIim值。同時設陽性對照(P)、陰性對照(N)和空白對照，P/N > 2，判為陽性。選擇封閉效果最佳者。1. 2抗原和一抗工作濃度的確定
用不同濃度1、0. 5、0. 25、0. 125、0. 0125、0. 00 625 Pg/孔的重組蛋白包被酶標板，用不同稀釋倍數(shù)1:200、1 :400、1:800、1:1 600,1:3 200的陽性血清孵育，進行間接ELISA，確
定抗原和一抗最佳工作濃度。1.3 HRP標記的羊抗鼠二抗工作濃度的確定
選擇最佳封閉劑，抗原和一抗按最佳工作濃度稀釋，將HRP標記羊抗鼠二抗稀釋為不同濃度 1:500、1:1 000、1:2 000,1:4 000,1:8 000,1:16 000。加底物緩沖液顯色，測定 OD49tlIim值，確定二抗最佳工作濃度。1. 4間接ELISA結果判定標準的確定
檢測12份健康小鼠血清，測定OD49tlIim值，計算平均值T和標準差SD。結果
2.1微小隱孢子蟲抗體檢測ELISA方法的建立
根據(jù)測定的結果，選擇最佳封閉液為5 %脫脂奶粉的PBST溶液，最佳抗原包被濃度 0. 25 μ g/孔、被檢血清稀釋度1 200，羊抗鼠二抗稀釋倍數(shù)1:2 000為最佳檢測條件。2.2間接ELISA結果判定標準的確定
經(jīng)間接ELISA檢測12份健康小鼠血清OD49tlIim值平均值T力0. 216，標準差SD為 0.026，因此陽性樣品檢出下限為I +3SD=0J94。為了減少假陽性和假陽性的出現(xiàn)，將臨界值加減一個標準差作為可疑區(qū)間。因此當OD49tlIim ^ 0. 32時，樣品判定為陽性；當0D49(1nm < 0. 268時，樣品判定為陰性；當0. 268 ^ OD490Iim < 0. 32時，樣品判定為陽性，但是需要重新檢測。若重檢時，OD49tlIim ^ 0.四4，樣品判定為陽性；OD49tlIim < 0.四4，樣品判定為陰性(見附表1)。
附表1間接ELISA結果判定標準的確定實施例3
檢測人的隱孢子蟲感染血清中抗體間接ELISA試劑盒組裝
1、隱孢子蟲病毒標準陽性血清、隱孢子蟲病毒標準陰性血清
2、包被病毒重組蛋白酶標板
3、HRP標記的羊抗鼠二抗
4、底物顯色液A液pH值為5.0的0. lmol/L醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0. 3%過氧化氫儲備液。B液四甲基聯(lián)苯胺，先制備成0. 2mg/mL溶液，用0. Imol/LpH值為5. 0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0. 2mg/L溶液。5.洗滌液pH值為7. 4的0. 1%吐溫-20的PBST緩沖液。6.酶標物稀釋液:pH值為7. 4的0. 01%吐溫-20的PBST緩沖液。7.樣品稀釋液pH值為7. 4的0. 1%吐溫-20的PBST緩沖液，。8.終止液2mol/L 硫酸。試驗例1
間接ELISA方法性能測定 1材料和方法 1.1材料
鼠抗安氏隱孢子蟲ip. mdersoni)陽性血清、鼠抗弓形蟲ij. gondii)陽性血清、鼠抗藍氏賈第蟲(P-Iamblia)陽性血清、鼠抗雞柔嫩艾美爾球蟲広tenella)陽性血清均按常規(guī)方法制備。1. 2 方法
1.2.1敏感性試驗將鼠抗Cparra 陽性血清按1:200、1 :400、1:800、1:1 600,1:3
200倍比稀釋，應用已建立的間接ELISA，確定其敏感性。1. 2. 2特異性試驗以鼠抗C. parvum陽性血清和陰性血清為對照，用已建立的間接ELISA方法測定鼠抗C. andersoni陽性血清、鼠抗T. gondii陽性血清鼠、抗Iamblia 陽性血清、鼠抗五tenella陽性血清，觀察血清交叉反應情況，來確定反應的特異性。1. 2. 3重復性試驗在同一塊板內檢測7份陽性血清樣品，每份血清樣品重復3 孔，按照間接ELISA的操作程序進行測定，計算每份血清樣品OD49tlIim值的變異系數(shù)(CV)， 以檢驗批內被檢測樣品的重復性；另取3塊用純化重組蛋白包被好的酶標板，在相同條件下檢測7份陽性血清樣品，按照間接ELISA的操作程序進行測定，計算同一份血清樣品在不同板間OD49tlIim值的變異系數(shù)(CV)，以檢驗批間被檢測樣品的重復性。附表2 ELISA檢測的敏感性
權利要求
1.一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白血清中抗體ELISA檢測方法，其特征在于抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白，可檢測血清中隱孢子蟲病毒抗體。
2.一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體間接ELISA檢測試劑盒，組成包括隱孢子蟲病毒標準陽性血清、隱孢子蟲病毒標準陰性血清、酶標二抗、包被病毒衣殼蛋白的酶標板、底物顯色液、洗滌液、終止液、封閉液和酶標物稀釋液及樣品稀釋液。
3.如權利要求2所試劑盒的制備方法，其特征在于以隱孢子蟲病毒衣殼蛋白為抗原包被于酶標板，隱孢子蟲病毒蛋白標準陽性血清和標準陰性血清、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標物稀釋液、樣品稀釋液和封閉液，組成ELISA試劑盒。
4.權利要求3所述ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于所述抗原為隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白。
5.ELISA試劑盒檢測方法，包括以下步驟(1)樣品前處理將被檢血清用樣品稀釋液1 200稀釋；(2)用權利要求2所述的ELISA試劑盒檢測，向包被隱孢子蟲病毒衣殼重組蛋白的酶標板孔中加入封閉液，再加入血清，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入酶標二抗，孵育60分鐘，洗滌液洗滌，加入顯色液孵育10分鐘，終止液終止反應，用酶標儀測定吸光度值；(3)分析檢測結果當0D490nm ^ 0. 32時，樣品判定為陽性；當0D490nm < 0. 268時，樣品判定為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種隱孢子蟲病毒衣殼蛋白抗體ELISA檢測方法及試劑盒，用于動物及人隱孢子蟲感染血清抗體的檢測，以隱孢子蟲病毒衣殼蛋白為抗原包被于酶標板，隱孢子蟲病毒蛋白標準陽性血清和標準陰性血清、底物顯色液、洗滌液、終止液、酶標物稀釋液、樣品稀釋液和封閉液，組成ELISA試劑盒。本發(fā)明的積極效果在于檢測的樣品為血清，檢測特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能檢測人隱孢子蟲的感染，適合于臨床的快速診斷和基層、農村等流行病學調查大規(guī)模應用。
文檔編號G01N33/535GK102221619SQ20111015090
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月7日 優(yōu)先權日2011年6月7日
發(fā)明者任文陟, 刁玉梅, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 李 赫, 楊舉, 高華義 申請人:吉林大學