表皮生長因子受體抑制劑在制備治療乙型腦炎藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體地說，是一種表皮生長因子受體抑制劑在制備治 療乙型腦炎藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)又稱日本腦炎，簡稱乙腦。在中國在內(nèi)的 東亞、東南亞、南亞和西太平洋部分地區(qū)廣泛流行。乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，又稱日本腦炎病毒，是乙型腦炎的病原體，以感染兒童為主，常引起中樞神經(jīng) 系統(tǒng)感染，嚴重可導致死亡。乙型腦炎病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，黃病毒科病毒是一種正 鏈RNA病毒，約有11000個核酸，病毒顆粒包括3個結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白（C)、前膜蛋白（prM) 和糖基化包膜蛋白（E)，以及7個非結(jié)構(gòu)蛋白（Yun S-I，Lee Y-M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines .Hum Vaccin Immunother · 2014; 10:263-279)。目前，雖有一些針 對JEV復制周期抗病毒藥物、疫苗開發(fā)、RNA等方面的報道，但迄今為止，還沒有特異的藥物 或有效的方法來治療乙型腦炎。為了找到乙型腦炎病毒感染的有效治療方法，目前，國內(nèi)外 學者在藥物研發(fā)方面已經(jīng)取得了一些研究成果。一是利用現(xiàn)有的抗病毒藥物治療乙型腦 炎;二是依據(jù)JEV的分子生物學特點設計并合成現(xiàn)有抗病毒藥物的衍生物;三是篩選新的抗 JEV的藥物。但是現(xiàn)今取得的抗JEV效果評估主要停留在動物模型、細胞和分子水平階段，能 否被應用于臨床治療，還有待深入的研究。目前抗JEV的藥物主要包括以下幾種:核酸靶向 治療劑、核酸類似物、細胞因子類和黃酮類化合物等。
[0003] 表皮生長因子受體(EGFR)的分子量為170kda，由細胞外受體、跨膜的疏水基團和 細胞內(nèi)的酪氨酸激酶3個部分組成。細胞外受體與配體結(jié)合后，通過跨膜的疏水基團誘導細 胞內(nèi)酪氨酸激酶構(gòu)像改變，構(gòu)像改變后的酪氨酸激酶通過自身磷酸化的方式得以激活，被 激活的EGFR參與調(diào)控下游信號傳導途徑。這一過程的正常進行對于細胞的生長分化有極其 重要的意義（Yarden Y. : The EGFR family and its ligands in human cancer. signalling mechanisms and therapeutic opportunities.Eur J Cancer,2001, 37Suppl 4:S3-S8.)〇
[0004] 厄洛替尼(Erlotinib)，是喹唑啉胺類EGFR酪氨酸激酶抑制劑。EGFR在腫瘤細胞中 常呈過度表達，激活的EGFR參與調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導途徑，與腫瘤細胞的惡性行為密切相關。 研究表明，非小細胞肺癌(NSCLC)中EGFR表達率約為40%~85%。故厄洛替尼已經(jīng)成為非小 細胞肺癌(NSCLC)的重要二線治療藥物之一(Fuster LM，Sandier AB.Select clinical trials of erlotinib(0SI_774)in non-small-cell lung cancer with emphasis on phaseHIoutcomes.Clin Lung Cancer.2004,6 Suppl I:S24-S29.)〇
[0005] 目前尚未有文獻報道EGFR抑制劑在治療乙型腦炎中的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供EGFR抑制劑的新的醫(yī)藥用途。為了發(fā)現(xiàn)治療乙型腦炎的特 異的藥物或有效的方法，本發(fā)明經(jīng)過實驗研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑具有抑 制乙型腦炎病毒的作用。
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供EGFR抑制劑在制備治療或預防乙型腦炎藥物中的應用。 [0008]所述的EGFR抑制劑為影響EGFR磷酸化作用的藥物。
[0009] 所述的EGFR抑制劑是抑制或降低EGFR基因轉(zhuǎn)錄(翻譯）的物質(zhì)，例如通過s iRNA或 shRNA等方法降低EGFR基因轉(zhuǎn)錄，或能抑制EGFR正常生物學功能的物質(zhì)。優(yōu)選的，所述的 EGFR抑制劑是在EGFR磷酸化作用中抑制或降低EGFR基因轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)，或能抑制EGFR正常生 物學功能的物質(zhì)。
[0010]所述的EGFR抑制劑是抑制或降低EGFR激酶基因轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)，或能抑制EGFR激酶正 常生物學功能的物質(zhì)。優(yōu)選的，所述的EGFR抑制劑是在EGFR磷酸化作用中抑制或降低EGFR 激酶基因轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)，或能抑制EGFR激酶正常生物學功能的物質(zhì)。
[0011] 優(yōu)選的，所述的EGFR抑制劑為厄洛替尼(Erlotinib)、其衍生物或喹唑啉胺類EGFR 酪氨酸激酶抑制劑。
[0012] 所述的治療或預防乙型腦炎藥物為經(jīng)胃腸道給藥劑型或注射劑。所述的治療或預 防乙型腦炎藥物的給藥方式包括靜脈注射、口服和局部給藥等。
[0013] 本發(fā)明的第二方面，提供表皮生長因子受體(EGFR)在篩選治療或預防乙型腦炎藥 物中的應用，所述的治療或預防乙型腦炎藥物是影響EGFR磷酸化作用的藥物，優(yōu)選為EGFR 抑制劑。
[0014] 本發(fā)明的第三方面，提供一種治療或預防乙型腦炎的藥物，所述的治療或預防乙 型腦炎的藥物是影響EGFR磷酸化作用的藥物。
[0015] 所述的治療或預防乙型腦炎的藥物的活性成分為抑制或降低EGFR基因轉(zhuǎn)錄（翻 譯）的物質(zhì)，或能抑制EGFR正常生物學功能的物質(zhì)。
[0016] 優(yōu)選的，所述的治療或預防乙型腦炎的藥物的活性成分為EGFR抑制劑。
[0017]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)EGFR抑制劑同時具有抑制乙型腦炎病毒的特性，進一步發(fā)現(xiàn)EGFR抑制 劑是通過抑制EGFR磷酸化作用從而影響乙型腦炎病毒的感染起到抗該病毒的作用。本發(fā)明 提供了 EGFR抑制劑在制備治療乙型腦炎藥物中的應用，為乙型腦炎病毒的預防和治療提供 了新的藥物，具有較好的市場價值和臨床應用前景。
【附圖說明】
[0018]圖1為Western Blot檢測JEV感染引發(fā)EGFR蛋白磷酸化作用圖；
[0019] 圖2為下調(diào)EGFR后對病毒感染的影響，其中A為Western Blot檢測干擾EGFR后蛋白 的表達圖，B為干擾EGFR后JEV病毒量圖；C為干擾EGFR后對病毒感染性影響的免疫熒光檢測 圖；
[0020] 圖3為EGFR抑制劑厄洛替尼對病毒感染的抑制作用圖，其中A為使用不同濃度的厄 洛替尼作用于靶細胞后抑制JEV感染及細胞毒性檢測的示意圖，圖中主縱坐標軸表示JEV病 毒量，次縱坐標軸表示對細胞毒性的影響，B為不同濃度的厄洛替尼作用于靶細胞后對病毒 感染性影響的免疫熒光檢測圖；
[0021] 圖4為使用EGFR抑制劑厄洛替尼作用于靶細胞后檢測對EGFR磷酸化的抑制作用 圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0023] 實施例1 [0024] 一、實驗材料
[0025]厄洛替尼(Erlotinib)為表皮生長因子受體抑制劑。
[0026] 人神經(jīng)母細胞瘤系SK-N-SH，購自ATCC，保藏號:ATCC HTB-11。
[0027] 二、實驗方法
[0028] IsiRNA 干擾
[0029] 1.1 RNA 轉(zhuǎn)染
[0030] 轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000說明書
[0031] 1)提前12-16小時將SK-N-SH細胞(購自ATCC，保藏號:ATCC HTB-11)鋪在24孔細胞 培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使得轉(zhuǎn)染時細胞密度為80 % -90 %。
[0032] 2)取2yL Lipofectamine 2000加入50yL opti-MEM中并輕柔混勻，室溫孵育5分 鐘；另取5yL濃度為5μΜ的干擾RNA和50yL opti-MEM混合。孵育結(jié)束后，將稀釋的 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑加入稀釋的RNA中，并輕柔吹吸混勻。室溫孵育20min后，加入 SK-N-SH細胞中，補加400yL opti-MEM，使得RNA終濃度為50nM。
[0033] 3)轉(zhuǎn)染后6-8小時更換含有雙抗的新鮮培養(yǎng)基。
[0034] 2實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測JEV病毒量
[0035] l)TRIzol提取對照組與處理組細胞的總RNA，具體步驟如下：
[0036] 靶細胞處理后去培養(yǎng)上清，在細胞中加入1ml TRIzoI，充分混合室溫裂解細胞3-5 分鐘。加入1/5體積的氯仿，手動劇烈混合15秒。于4°C、12,000轉(zhuǎn)離心15分鐘。取上層水相并 轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入等體積異丙醇，充分混合，室溫沉淀10分鐘。于4°C、12,000轉(zhuǎn)離心 10分鐘。棄上清，加入1ml預冷的75%乙醇。于4°C、12,000離心5分鐘。充分棄上清，室溫晾干 RNA沉淀，加入DEPC處理水溶解沉淀，得到總RNA。
[0037] 2)利用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取對照組與干擾組細胞的cDNA，具體步驟如下：
[0038] 在PCR管中加入如下反應體系， SxPrimeSeript Buffer 2tuL PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μΙ.,
[0039] Random 6 rners 0.5tuL