使用奈福泮化合物治療瘢痕和β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的疾病的方法
【專利說明】
[00011 本分案申請是基于申請?zhí)枮?01080057504.7，申請日為2010年12月15日，發(fā)明名 稱為"使用奈福泮化合物治療瘢痕和聯(lián)蛋白介導(dǎo)的疾病的方法"的原始中國專利申請的 分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002 ]本發(fā)明主要涉及瘢痕和β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的疾病的治療。
【背景技術(shù)】
[0003] 纖維增生進程是一組特征在于間質(zhì)成纖維細(xì)胞樣梭形細(xì)胞過度增生的疾病。它們 范圍涵蓋了從肥大性傷口到諸如侵襲型纖維瘤病(AF)的腫瘤進展。
[0004] 在傷口愈合的過程中，幾種細(xì)胞類型和信號通道被活化從而重組皮膚的上皮和真 皮層。在皮膚損傷之后，開始三個連續(xù)不同的但相重疊的進程:炎癥、增生和重塑。在增生 期，間質(zhì)成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞聚積在皮膚的表皮組分中而上皮細(xì)胞屏障層被改造 （Singer 1999,Martin 1997 ,McClain 1996)。0_聯(lián)蛋白已經(jīng)顯示出調(diào)節(jié)上皮和間充質(zhì)細(xì)胞活性，因 此它能促進表皮間充質(zhì)細(xì)胞的增生和分化和減少上皮角蛋白細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(Cheon 2002)。小 鼠模型已經(jīng)表明β-聯(lián)蛋白能夠調(diào)節(jié)最終傷口的大小，而由鋰處理所誘導(dǎo)的β-聯(lián)蛋白水平導(dǎo) 致更大尺寸的傷口愈合(Cheon 2006)。并且，在四環(huán)素調(diào)節(jié)的促進子控制之下的，在間充質(zhì) 細(xì)胞中表達穩(wěn)定聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)基因鼠已經(jīng)被生產(chǎn)出來。將有增生性皮膚傷口的已經(jīng)愈合的 受傷小鼠與野生型對照小鼠相比較(Cheon 2002)。這表明β-聯(lián)蛋白在間充質(zhì)細(xì)胞中的重要 性和它在傷口愈合中的決定性作用。
[0005] 另一種β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的纖維增生疾病為侵襲型纖維瘤病(AF)，也被稱作硬纖維 瘤。AF是一種局部侵襲型軟組織腫瘤，包括間質(zhì)成纖維細(xì)胞樣梭形細(xì)胞。AF作為零星病灶或 者諸如家族性多發(fā)性腺癌(FAP)的家族性綜合征而發(fā)生。β-聯(lián)蛋白穩(wěn)定作用普遍出現(xiàn)在AF 中，其通過提高的β-聯(lián)蛋白水平和增加的β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性表現(xiàn)出來。此外，β-聯(lián) 蛋白穩(wěn)定作用足以引起AF，如在使用β-聯(lián)蛋白穩(wěn)定型過度表達的基因小鼠模型中所示的 (Cheon 2002)。這暗示了β-聯(lián)蛋白在纖維增生疾病中的關(guān)鍵作用和它在間充質(zhì)細(xì)胞中的重 要性。
[0006] 除了 β-聯(lián)蛋白在纖維增生疾病中的作用之外，大量研究已經(jīng)表明β-聯(lián)蛋白表達失 調(diào)在諸如結(jié)腸癌、黑色素瘤、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、髓母細(xì)胞瘤、毛母質(zhì)瘤和前列 腺癌的大量惡性腫瘤的起源中是重要事件。聯(lián)蛋白變異在這一組癌癥的進展中表現(xiàn)為關(guān) 鍵步驟，這表明它在細(xì)胞增生或者細(xì)胞死亡的控制中的重要作用（如Polakis Ρ.The many ways of Wnt in cancer .Curr Opin Genet Dev. 2007年2月；17(1) :45-51 所描述的）。
[0007] 考慮到上述情況，有望研發(fā)出有效治療可能與β_聯(lián)蛋白相關(guān)的病況和疾病的新方 法。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)奈福泮及其類似物，對于治療如纖維增生疾病的β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的疾 病以及治療瘢痕組織有益。
[0010] 相應(yīng)地，在本發(fā)明的一個方面，提供一種在哺乳動物中治療β-聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的疾病 或者病況的方法，包括向哺乳動物施用奈福泮，或其功能上相當(dāng)?shù)念愃莆?、前藥、鹽或者溶 劑化物。
[0011] 在發(fā)明的另一個方面，一種治療瘢痕組織或者減少瘢痕組織形成的方法包括向組 織施用治療有效量的奈福泮，或其藥學(xué)上可接受的類似物、鹽、溶劑化物或者前藥。
[0012] 在可選擇的一個方面，提供了一種產(chǎn)品，其包括包裝和包括奈福泮或其功能上相 當(dāng)?shù)念愃莆?、鹽、溶劑化物或者前藥的組合物。
[0013] 在另一個方面，提供了奈福泮或其功能上相當(dāng)?shù)念愃莆铩Ⅺ}、溶劑化物或者前藥的 新用途，用于制備治療聯(lián)蛋白-介導(dǎo)的疾病或者病況或者瘢痕組織的藥物。
[0014] 附圖簡述
[0015] 本發(fā)明現(xiàn)在將參考下圖被進一步描述：
[0016] 附圖IA為柱形圖，其表明在用DMSO(對照）或者奈福泮處理后使用SRB分析所測量 得到的所培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)成纖維細(xì)胞和所培養(yǎng)的來自于兩個增生性傷口的細(xì)胞的活性。以平均 值和95 %置信區(qū)間給出細(xì)胞存活百分比。與DMSO對照的增生性傷口細(xì)胞培養(yǎng)物相比，用奈 福泮處理的培養(yǎng)物中細(xì)胞存活百分比有顯著的降低，然而，在正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中的 細(xì)胞存活率仍相對無變化(星號表明相比于正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的顯著性）。
[0017] 附圖IB是在增生性傷口細(xì)胞培養(yǎng)物中β-聯(lián)蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析。相比于 DMSO處理的對照組，奈福泮治療組表現(xiàn)為大量減少β-聯(lián)蛋白的水平。
[0018] 附圖2是比較用奈福泮未處理（左側(cè)）的或者處理過的或者DMSO對照組的雄性Apc +/Apcl638N小鼠中侵襲型纖維瘤病(AF)腫瘤形成的數(shù)量的圖表，其圖示了在同樣處理條件 下胃腸道上段中來自上皮的息肉數(shù)量。1)未處理(n=ll)，2)0.1%DMS0(n=10)jP3)& 40mg/kg體重的奈福泮(n = 10)。
[0019]附圖3A為在用0.1 %DMS0(對照）或奈福泮之一處理5天后來自于人類侵襲型纖維 瘤病（AF)腫瘤的原代細(xì)胞培養(yǎng)物的提取物（n = 5)中的β-聯(lián)蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡 (92kDa)。也在利用Wnt3a同時有或者沒有奈福泮進行培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中測定 聯(lián)蛋白水平。實驗以三份量進行。肌動蛋白表達被表示為裂解物內(nèi)參對照。
[0020] 附圖3Β是蛋白水平數(shù)據(jù)的光密度分析的圖表，其表明利用0.1%DMS0(對照）或者 奈福泮進行處理的來自于人類AF腫瘤的細(xì)胞培養(yǎng)物中的β-聯(lián)蛋白總水平減少近五倍。顯示 為平均值和95%置信區(qū)間。相比于對照組在統(tǒng)計上的顯著性差異(ρ〈0.05)，利用星號進行 表不。
[0021] 附圖4Α是表示利用DMS0(n = 5)或者奈福泮(η = 5)處理了5天的來自于人類AF腫瘤 原代細(xì)胞的細(xì)胞活性的平均值和95%置信區(qū)間的圖表。通過利用錐蟲藍(lán)染料染色細(xì)胞并清 點所有活著(透明）和死亡(藍(lán)色)細(xì)胞數(shù)量來測量細(xì)胞活性。奈福泮顯著減少活細(xì)胞數(shù)量而 死亡細(xì)胞的數(shù)量并未改變。相比于對照組在統(tǒng)計上的顯著性差異(Ρ〈〇.05)，利用星號進行 表不。
[0022] 附圖4Β為一個圖表，其表示BrdU-陽性/DAPI-陽性細(xì)胞相比于總DAPI-陽性細(xì)胞的 百分比，其作為利用DMSO或者奈福泮以三份量處理5天后的來自于人類侵襲型纖維瘤病腫 瘤(η = 2)的原代細(xì)胞培養(yǎng)物中增生的度量。奈福泮顯著減少BrdU進入細(xì)胞。顯示為平均值 和95%置信區(qū)間。相比于對照組在統(tǒng)計上的顯著性差異(p〈0.05)，利用星號進行表示。
[0023]附圖5A表示提取自永生人類成纖維細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析。觀察到相比于 利用DMSO處理的細(xì)胞在奈福泮處理過的細(xì)胞中β-聯(lián)蛋白水平顯著減少。GAPDH表達被表示 為裂解物內(nèi)參對照。
[0024]附圖5Β為與附圖5Α的蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)相一致的光密度法數(shù)據(jù)的圖表。
[0025]附圖6Α為Tcf小鼠受傷14天后傷口的細(xì)胞培養(yǎng)物中β-聯(lián)蛋白的蛋白水平的蛋白質(zhì) 印跡分析。GAPDH表達被表示為裂解物內(nèi)參對照。
[0026]附圖6Β為用與載體一同配制的奈福泮(奈福泮)或者僅有載體(對照）處理后的有 全層環(huán)形傷口的小鼠正常瘢痕大小的圖表，其中通過每日40mg/kg系統(tǒng)性給藥兩周進行處 理。該圖表表示使用4mm活檢穿孔器所產(chǎn)生的皮膚傷口表面積直徑的平均值和95%置信區(qū) 間。相對于對照處理，奈福泮處理后傷口的直徑明顯更小(星號表示顯著性差異）。
[0027]附圖7是線形圖，其表示正常傷口愈合（正常）過程中一段時間后（以周記)和在增 生性傷口（增生）中，相比于未受傷組織的相對的聯(lián)蛋白的蛋白水平。在正常傷口愈合過 程中聯(lián)蛋白的蛋白水平的上升和下降正常模式在增生性傷口中是失調(diào)的，其展示出聯(lián) 蛋白水平提高的時間顯著延長。
[0028] 附圖8為受傷四周后皮膚增生性瘢痕表面積直徑的平均值和95%置信區(qū)間的圖 表。使用活檢穿孔器產(chǎn)生4mm直徑的全層環(huán)形傷口。傷口直徑以mm給出。星號表示相比于 TGF-β處理時在所記錄的瘢痕大小中的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(p〈0.01)，其中當(dāng)受傷時注射 TGF-β已知會引起增生性瘢痕尺寸增大。
[0029] 附圖9為在三種不同載體中的不同濃度奈福泮局部制劑的圖表：羧甲纖維素 (CMC)、礦脂和羧丙甲纖維素。這三種載體在