專利名稱：生物硅-粘附蛋白納米復(fù)合材料合成和在牙科中的應(yīng)用的制作方法
生物硅-粘附蛋白納米復(fù)合材料合成和在牙科中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
硅石作為分子篩的組分、作為食品添加劑、載體、穩(wěn)定劑(如在牙膏 中)以及作為半導(dǎo)體裝置的絕緣體，廣泛用于工業(yè)和醫(yī)藥中，如用于制造 玻璃、陶瓷、涂料、膠粘劑以及催化劑。硅石在納米(生物)技術(shù)中也是重 要的材料。硅石的生產(chǎn)工藝大多要求高溫條件以及極端的pH。值得注意 的是，某些單細(xì)胞或多細(xì)胞有機(jī)體，包括硅藻、多孔動(dòng)物以及高等植物， 在周圍低溫、低壓以及近中性pH條件下，能形成它們的硅石骨架。另外， 這些有機(jī)體骨架元件的產(chǎn)生是高保真性的且拷貝數(shù)巨大，因此，使得這 些有機(jī)體以及解釋它們的目的骨架形成的機(jī)制可用于制造具獨(dú)特特性的
新生物^圭(biosilicas)。
海洋和淡水多孔動(dòng)物具有酶促合成硅石(生物硅)的獨(dú)特能力。這種能 力使得多孔動(dòng)物受到(納米)生物技術(shù)的高度關(guān)注。迄今，用于生產(chǎn)硅石(玻 璃)的方法需要高溫、高壓以及侵蝕性化學(xué)制品的存在。多孔動(dòng)物能在生 物學(xué)的以及環(huán)境無(wú)害的條件下高精確度和高重復(fù)性地通過(guò)酶(生物催化劑) 合成;圭納米結(jié)構(gòu)。
硅質(zhì)多孔動(dòng)物骨架的主要元件是針樣骨針，其由尋常海綿綱 (Demospongia)和六放海綿綱(Hexactinellida)內(nèi)的無(wú)定形非晶體珪石組成。
骨針形態(tài)和骨針生物起源的現(xiàn)有技術(shù)描述于Uriz et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:163-193; Miiller et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:195-221。多孔動(dòng)物骨針的蛋白石硅石(opal sinica)含有6-13%的水， 對(duì)應(yīng)于式(Si02)2 H20 (Schwab & Shore (1971) Nature 232:501-502)。尋常 海綿綱類生物骨針的形成開始于軸絲周圍，硅石在軸絲的周圍酶促沉積。
已經(jīng)描述了在形成硅石的有機(jī)體中與Si02骨架的合成和/或降解有關(guān) 的兩種酶以及它們的4支術(shù)應(yīng)用。
第一種酶是存在于多孔動(dòng)物骨針(針)軸絲中的Q!-硅酸鹽蛋白(silicatein-a)(也稱為A主酸鹽蛋白)(PCT/US99/30601: Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polycondensation of silicon alkoxides， metal alkoxides, and their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly(silicon/ metallo)oxane materials under environmentally benign conditions(在環(huán)境無(wú)害的條{牛下，用于催化和在空 間上指導(dǎo)硅醇鹽(silicon alkoxides)、金屬醇鹽(metal alkoxides)和它們的有 機(jī)共扼物的縮聚以制備硅石、聚硅氧烷(polysiloxanes)、聚金屬氧烷 (polymetallo-oxanes)以及混合的聚(硅/金屬)氧烷材料的方法、組合物和 仿生催化劑，如硅酸鹽蛋白和嵌段共聚多肽)。發(fā)明人/申請(qǐng)人Morse DE, Stucky GD， Deming， TD， Cha J, Shimizu K, Zhou Y; DE 10037270 A 1。 Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung.發(fā)明人/申i奮人Mtiller WEQ Lorenz B， Krasko A, Schr6der HC; European Patent No. 1320624(歐洲專利號(hào)1320624)。 Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof(硅酸鹽蛋白介導(dǎo)的無(wú)定形硅酸鹽和硅氧烷的合成及其用途)。發(fā)明 人/申i青人Mtiller WEQ Lorenz B， Krasko A， Schr6der HC;國(guó)家階段 US2003134391;第20030407號(hào)；日本第2002-516336號(hào)；中國(guó)第1460110T 號(hào)；加拿大第2,414,602號(hào)；澳大利亞第2001289713號(hào))。已經(jīng)從海洋硅 質(zhì)多孔動(dòng)物寄居蟹皮海綿OS"Z^n'tes ^mw"cw/fl)克隆了這種酶(Krasko et al. (2000) Eur J Biochem 267:4878-4887)。硅酸鹽蛋白能由有機(jī)硅化合物(烷 氧基硅烷)合成無(wú)定形石圭石(聚石圭酸和聚硅酸鹽)(Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:361-365)。
除了 a-硅酸鹽蛋白外，發(fā)明人從淡水多孔動(dòng)物中還克隆了其他的硅 酸鹽蛋白包括/5-硅酸鹽蛋白(專利申請(qǐng)DE10352433.9. Enzym- und Template-gesteuerte Synthese von Silica aus nicht-organischen Siliciumverbindungen sowie Aminosilanen und Silazanen und Verwendung. 申請(qǐng)人:University of Mainz(美因茲大學(xué))。發(fā)明人Schwertner H, Mtiller WEG, Schr6der HC)以及4種硅酸鹽蛋白同種型(硅酸鹽蛋白-al-4; DEI 02006001759.5.KontrollierteHerstellungvonSilber- undGold-Nanopartikeln und Nanokristallen definierter Gr6Be und Form durch chirale Induktion mittels Silicatein.申i貪人/發(fā)明人Tremel W, Tahir MN, Miiller WEG. Schr6der HC)。硅酸鹽蛋白在與表面結(jié)合后保留了其催化活 性(Tahir et al. (2004) Chem Commun 2004:2848-2849)。
第二種酶是屬于碳酸酐酶(carbonic anhydrase)群組的硅酶(silicase)(德 國(guó)專利第10246186號(hào)。In vitro and in vivo degradation or synthesis of silicon dioxide and silicones, usefUl e.g. for treating silicosis or to prepare prosthetic materials, using a new silicase enzyme (可用于利用i斤石圭酶治療石圭 肺或制備修復(fù)術(shù)材料的二氧化硅和硅樹脂的體外和體內(nèi)降解或合成)。申 請(qǐng)人University of Mainz(美因茲大學(xué))。發(fā)明人Miiller WEQ Krasko A， Schr6der HC; PCT/EP03/10983. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. 申請(qǐng)人: University of Mainz(美因茲大學(xué))。發(fā)明人Mtiller WEQ Krasko A, Schr6der HC)。這種酶是在海洋多孔動(dòng)物寄居蟹皮海綿中首次發(fā)現(xiàn)的，能在游離硅 酸形成的過(guò)程中溶解硅(Schr6der et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:250-268)。另外，硅酶，在可逆反應(yīng)中，也可介導(dǎo)多聚體的合成 (DE10352433.9. Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. 申請(qǐng)人:University of Mainz(美因茲大學(xué))。發(fā)明人Miiller WEQ Schwertner H， Schr6der HC)。 同硅酸鹽蛋白一樣，硅酶也受到納米技術(shù)的關(guān)注，例如在醫(yī)藥和微電子 中用于硅基質(zhì)的修飾。
硅石是用作組織工程骨和軟骨中的包括生物活性玻璃和合成材料的 支架材料的重要成分(Hench and Wilson (1984) Science 226:630-636; Yamamuro et al. (1990) Handbook on Bioactive Ceramics, Vol I: Bioactive Glasses and Glass-Ceramics (生物活性制陶術(shù)手冊(cè)第一巻生物活性玻璃 和玻璃制陶術(shù))，CRC Press, Boca Raton, FL)。生物相容性和穩(wěn)定性是決定 這些材料適用性的關(guān)^:特征，改進(jìn)用于手術(shù)(如骨替換)和牙科的這些材料 的需求日益增加。多聚體硅和其他基于硅氧烷的材料的化學(xué)合成通常需 要?jiǎng)×业臈l件，如高溫和高壓，以及使用腐蝕性化學(xué)品，這可損害用作 合成材料的組分的有機(jī)分子。然而，硅質(zhì)多孔動(dòng)物在環(huán)境條件(低溫和低
9壓)下，利用硅酸鹽蛋白的生物催化活性，能合成它們的硅骨架。
本發(fā)明人證明，當(dāng)培養(yǎng)于用硅酸鹽蛋白和I型膠原蛋白預(yù)包被并隨后
利用硅酸鹽蛋白底物TEOS通過(guò)用生物硅進(jìn)行包被而受到修飾的培養(yǎng)平 板上時(shí)，人類骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞的礦化(磷酸鈣的形成)顯著增加 (Schr6der et al. (2005) J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 75B:387-392; DE102004021229.5. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung bioaktiver, Osteoblasten-stimulierender Oberflachen und Verwendung. 申請(qǐng) 人University of Mainz(美因茲大學(xué))。發(fā)明人Schwertner H, Miiller WEQ Schr6derHC)。這些結(jié)果表明，生物硅修飾的表面是生物活性的并可用于 提高成骨細(xì)胞的功能。
重組的石圭合成酶(silica-synthesizing enzyme)(石圭酸鹽蛋白)的可用性為
段。本發(fā)明人也解決了以可持續(xù)的方式產(chǎn)生新的生物材料即多孔動(dòng)物生 物義圭的才支術(shù)其是通過(guò)建立多孔動(dòng)物細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)物(primmorph culture，多 孔動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特殊形式；專利/專利申請(qǐng)DE19824384.7、 PCT/EP99/ 03121和EP99955288.8)而實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞團(tuán)的硅石產(chǎn)生可通過(guò)某些添加劑 而i曾力口(EP05012162.3. Selenium-enriched liquid media for the cultivation of siliceous sponges and for biogenic silica production(用于培養(yǎng)石圭質(zhì)多孑L動(dòng)物 以及用于產(chǎn)生生物來(lái)源的硅的竭富集液體培養(yǎng)基)。申請(qǐng)人University of Mainz(美因茲大學(xué))。發(fā)明人Mtiller WEQ Schr6der HC， Osinga R, Schwertner H》
粘附蛋白
已知粘附蛋白來(lái)自貽貝(貽貝粘附蛋白MAPs (mussel adhesive proteins),如足蛋白1和Mefp-l)。貽貝能經(jīng)由由粘附蛋白組成的粘附斑 (adhesive plaques)將自身附著于金屬、陶瓷以及玻璃的表面。這些粘附蛋 白含有高百分比的3，4-二羥苯丙氨酸(DOPA)。紫貽貝(M,7w e^/fc)的 Mefp-l具有序列為Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-DHP-Hyp-Thr-DOPA-Lys的串聯(lián) 樣重復(fù)的十肽(tandem-like repeating decapeptide)。對(duì)表面的粘附受鄰苯二 酚氧(catechol oxygens)介導(dǎo)。粘附蛋白也存在于其他的海洋生物體中，如海參屬(Holothuria)種類。 本發(fā)明人已經(jīng)研究并首次描述了海參屬Z/o/^Awn'a/orac幼'的顧維爾氏器 官(Cuvier organs)的生化粘附機(jī)制(Miiller et al. (1972) Cytobiologie 5:335; Mtiller et al. (1976) Biochim Biophys Acta 433:684);

圖1 。另夕卜，本發(fā)明人 還證明，多孔動(dòng)物也含有將一元酚(monophenols)轉(zhuǎn)變?yōu)槎拥睦野彼?酶(Miiller et al. (2004) Micron 35:87)(圖2)。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及合成無(wú)定形二氧化硅(硅石)、硅氧烷和這些化合物的修飾 物的方法、用于合成無(wú)定形二氧化硅(硅石)、硅氧烷和這些化合物的修飾 物的重組的；圭酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白(recombinant silicatein-silk fibroin fUsion proteins)的用途以及它們?cè)谘揽浦械尼t(yī)藥用途。
發(fā)明的詳細(xì)描述
描述了含有硅酸鹽蛋白(硅石形成序列)序列以及絲心蛋白序列的融 合蛋白以及編碼此融合蛋白的cDNA。硅酸鹽蛋白用于(生物)硅石的生物 催化形成，而生物硅可以單獨(dú)地或作為納米復(fù)合材料(nanocomposite)的組 分用作牙齒填充材料。絲心蛋白可用作粘附蛋白("水下膠粘 劑"("underwaterglue"))，將硅酸鹽蛋白和由硅酸鹽蛋白形成的硅石納米顆 粒附著于牙齒的牙釉質(zhì)或包括金屬、塑料和復(fù)合材料的其他固體材料的 表面。幾種類型和同種型的硅酸鹽蛋白可用于構(gòu)建融合蛋白，例如使用 PCR方法，分離自寄居蟹皮海綿的編碼o:-硅酸鹽蛋白多肽的cDNAs。相 關(guān)的cDNAs可分離自其他的海洋多孔動(dòng)物，如GeoAa Q^om'wm,或分離 自淡水多孔動(dòng)物，如繁茂膜海綿(Z^wm'raha 6a/ca/e"w》。融合蛋白，或 其部分，可與人類牙釉質(zhì)來(lái)源的肽或含DOPA的肽/蛋白結(jié)合，因而可設(shè) 計(jì)基于硅石/肽的納米復(fù)合材料。
本發(fā)明的另 一方面是用于體外或體內(nèi)合成硅石(硅酸和/或硅酸鹽的 濃縮產(chǎn)物)、硅氧烷和其他的金屬氧化物以及這些化合物的混合多聚體的 方法，其中所用的融合蛋白含有顯示了與SEQ ID NO.l所示的序列至少 25%的序列同源性優(yōu)選同一性的a-硅酸鹽蛋白結(jié)構(gòu)域。對(duì)于合成而言，使用方法，其中諸如下列的化合物可以用作底物
硅酸，單烷氧基硅烷三元醇(monoalkoxysilanetriols)，單烷氧基硅烷二元 醇(monoalkoxysilanediols),單》克氧基石圭義克酉f"(monoalkoxysilanols)， 二步克氧 基石圭烷二元醇(dialkoxysilane-diols), 二烷氧基石圭烷醇(dialkoxysilanols)， 三烷氧基硅烷醇(trialkoxysilanols)，四烷氧基娃烷(tetraalkoxysilanes)，烷 基-、芳基-或金屬-硅烷三元醇，烷基-、芳基-或金屬-硅烷二元醇，烷基-、 芳基-或金屬-硅烷醇，烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅烷二元醇，烷基-、 芳基-或金屬-單烷氧基硅烷醇，烷基-、芳基-或金屬-二烷氧基硅烷醇，烷 基-、芳-基或金屬-三烷氧基硅烷。通過(guò)使用這些化合物的限定混合物， 可以制備混合的多聚物。
根據(jù)本發(fā)明另外優(yōu)選的方面，通過(guò)將融合蛋白結(jié)合于其他分子或玻 璃、金屬、金屬氧化物、塑料、生物多聚體或其他的材料表面作為模板， 可形成限定的2維或三維結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明另外優(yōu)選的方面，提供了修飾含有表面結(jié)構(gòu)的羥基磷灰 石(實(shí)例牙釉質(zhì))、硅石或金屬氧化物的方法，其中融合蛋白用于進(jìn)行修 飾，其含有與SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示的序列具有至少25。/。的 序列同源性優(yōu)選同一性的硅酸鹽蛋白和/或絲心蛋白結(jié)構(gòu)域。
含硅石結(jié)構(gòu)或含硅石表面。
本發(fā)明另外優(yōu)選的方面涉及根據(jù)SEQIDNO. 1的來(lái)自寄居蟹皮海綿 的a-硅酸鹽蛋白或同源多肽的融合蛋白，所述同源多肽具有與SEQ ID NO.l所示的序列具至少25%的序列同源性優(yōu)選同一性的的a-硅酸鹽蛋白 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或其部分。
"同源性"定義為比對(duì)候選氨基酸序列和參考氨基酸序列即a-硅酸 鹽蛋白結(jié)構(gòu)域，如有必要，引入空位，以獲得最大百分比同源性后，候 選氨基酸序列中與參考氨基酸殘基即a-硅酸鹽蛋白結(jié)構(gòu)域中的殘基相同 的殘基的百分比。用于比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域公知的?？捎?來(lái)或適合測(cè)定候選序列是否落入此定義內(nèi)的一種計(jì)算機(jī)程序是由 Genentech Inc.創(chuàng)4乍的"Aling2"。
本發(fā)明另一優(yōu)選的方面涉及核酸，特別是根據(jù)SEQ ID NO. 3以及
12SEQ ID NO. 4的核酸，其中，該核酸編碼本專利申請(qǐng)所示的多肽。所述 核酸可以是DNA、 cDAN、 RNA或起混合物。核酸的序列含有至少一個(gè) 內(nèi)含子和/或polyA序列。
本發(fā)明的另 一優(yōu)選方面涉及(a)融合蛋白(嵌合蛋白)構(gòu)建體(construct) 形式的核酸或(b)具有分別蛋白表達(dá)(蛋白酶切割位點(diǎn))的構(gòu)建體形式的核 酸。核酸也可以合成的方式產(chǎn)生。必要的方法是現(xiàn)有技術(shù)。
本發(fā)明另一優(yōu)選的方面涉及載體，優(yōu)選下列形式的載體質(zhì)粒、穿 梭載體、噬菌粒、粘粒、表達(dá)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或顆 粒、納米顆粒或脂質(zhì)體，其中載體含有本發(fā)明的核酸。此外，這些載體 優(yōu)選含有本發(fā)明融合蛋白的納米顆?；蛑|(zhì)體形式，可用于蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。
本發(fā)明另 一優(yōu)選方面是用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞或用本發(fā)明的 顆粒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可表達(dá)權(quán)利要求1或7的多肽 或其部分。可以使用任何已知的宿主細(xì)胞有機(jī)體，諸如酵母、真菌、多 孔動(dòng)物、細(xì)菌、CHO細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
本文請(qǐng)求保護(hù)的融合蛋白可以以合成的方式產(chǎn)生或存在于原核或真 核細(xì)胞或細(xì)胞提取物或裂解物中。細(xì)胞提取物或裂解物可以由來(lái)自體內(nèi) (ex Wvo)或來(lái)自體夕卜Ojc v"ra)的細(xì)胞如重組細(xì)菌細(xì)胞制備。
本文請(qǐng)求保護(hù)的融合蛋白可利用現(xiàn)有技術(shù)的方法進(jìn)行純化，因而基 本上不含其他的蛋白。
融合蛋白中的粘附蛋白可用于調(diào)控硅酸鹽蛋白和生物硅構(gòu)造區(qū) (biosilica building blocks)只十表面的附著。
此外，本發(fā)明的融合蛋白或核酸也可用于調(diào)節(jié)硅和硅移植物的代謝 和再吸收。硅酸鹽蛋白可以由單體硅前體合成多聚體硅，因此可用于移 除體細(xì)胞吸收的單體。最后，本文所述的本發(fā)明可應(yīng)用于用本文所述的 核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用于調(diào)節(jié)硅和硅移植物的代謝和再吸收。用于上文提到 的實(shí)際應(yīng)用的方法是現(xiàn)有技術(shù)，可很容易地適應(yīng)于具體的要求。
此外，已知含聯(lián)苯酚的蛋白/肽，特別是含DOPA(3，4-dihydroxy phenylalanine， 3,4-二羥基苯丙氨酸)的蛋白/肽可作為水性環(huán)境中的膠粘 劑。本發(fā)明人克隆了多孔動(dòng)物酪氨酸酶并表達(dá)了重組蛋白。這種酶利用 一元酚化合物合成聯(lián)苯酚。通過(guò)利用重組多孔動(dòng)物酶制備的含DOPA的蛋白和肽可用于在表面上結(jié)合硅酸鹽蛋白/生物硅構(gòu)造區(qū)。
經(jīng)由特別修飾的含DOPA的蛋白和肽的粘附，可以在不同材料(金屬、
玻璃、塑料等)的表面上通過(guò)用含DOPA的蛋白和肽進(jìn)行包被產(chǎn)生圖案。 可以使用金屬(鈥、鈥合金或CoCr)表面和所選塑料和復(fù)合物材料的
表面兩者。鄰苯二酚氧特別是對(duì)Fe(in)和其他的離子具有強(qiáng)烈的親和性，
因而其對(duì)含DOPA的肽和蛋白在表面上的結(jié)合很重要。
在骨和移植物(如由鈦、鈦合金或CoCr制成的金屬移植物)之間產(chǎn)生
穩(wěn)定的連接是主要的問(wèn)題。金屬移植物"生物組織化(biologisation)"的
一種方式是用含DOPA的蛋白和肽包被表面。
重纟且的石圭酸鹽蛋白-絲心蛋白融4、蛋白的表達(dá)和《、離
重組的硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的制備優(yōu)選在大腸桿菌(E co/z〕 中進(jìn)行。在酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備所述重組的蛋白也是可能的， 并且已經(jīng)成功進(jìn)行。將cDNA克隆至適宜的載體，如/;7h:歷W-r(9尸0 (Invitrogen)。 在大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，通過(guò) IPTG (isopropyl畫/5-D-thiogalactopyranoside，異丙基畫/3-D-碌b代半乳糖苷)誘導(dǎo)石圭 酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的表達(dá)(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)現(xiàn)行實(shí)'驗(yàn)方案).John Wiley and Sons, New York)?？衫萌绱嬖谟谥亟M蛋白中的組氨酸標(biāo)簽，在適宜的親 和性基質(zhì)如Ni-NTA基質(zhì)(Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519) 上，進(jìn)行硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的表達(dá)和重組蛋白的純化。
使用兩種可選構(gòu)建體進(jìn)行a-硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的表達(dá)。
1.無(wú)蛋白酶切割位點(diǎn)的融合蛋白的制備
為了用a-硅酸鹽蛋白多肽和絲心蛋白制備融合蛋白，使用適宜的表 達(dá)載體(如p7Vc/似2-:TOPO載體；Invitrogen)。制備在5'端和3'端兩端都 具有例如7VcoI限制位點(diǎn)的a-硅酸鹽蛋白cDNA。移除a-硅酸鹽蛋白cDNA 中的終止密碼子。使用PCR技術(shù)(PCR-Technik)且擴(kuò)增所用的引物具有各 自的限制位點(diǎn)。因此制備編碼第二蛋白的cDNA，借此在5'末端使用與a-^i酸鹽蛋白cDNA的3'端相同的限制位點(diǎn)(在本實(shí)施例中為iVcoI)，且在3， 端，也有iVcoI限制位點(diǎn)。
14采用標(biāo)準(zhǔn)的步驟，連接兩種cDNAs，將其純化并與/ 7)r歷W-rO尸(9 載體連接?？拷M氨酸標(biāo)簽進(jìn)行連接。使用例如存在于重組蛋白中的組 氨酸標(biāo)簽的融合蛋白的表達(dá)和純化，可利用適宜的親和基質(zhì)如Ni-NTA基 質(zhì)(Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519)進(jìn)行。
2.分別表達(dá)(蛋白酶切割位點(diǎn))
可選地，對(duì)于l中的步驟，在編碼a-硅酸鹽蛋白多肽的cDNA和編 碼絲心蛋白的cDNA之間克隆蛋白酶切割位點(diǎn)(如腸激酶位點(diǎn))。在表達(dá)和 純化后，以蛋白水解的方式切割融合蛋白。隨后分離兩種蛋白。
在下面的實(shí)施例中描述了含有來(lái)自寄居蟹皮海綿的a-硅酸鹽蛋白基 因和來(lái)自地中海貽貝(M;;"/ms ga〃o/ rav/"c^fo)的絲心蛋白基因的融合蛋 白在大腸桿菌中的表達(dá)。在這個(gè)實(shí)施例中，使用僅含有催化活性結(jié)構(gòu)域 的硅酸鹽蛋白插入片段(短硅酸鹽蛋白形式)；使用含有該蛋白的完整氨基 酸序列的插入片段也是可能的。
用于構(gòu)建編碼融合蛋白的cDNAs的硅酸鹽蛋白cDNAs已有描述。
編碼來(lái)自寄居蟹皮海綿的a-硅酸鹽蛋白和/3-硅酸鹽蛋白的cDNAs 是，a-硅酸鹽蛋白AJ272013 (Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267:4878-4887); /3-硅酸鹽蛋白AJ547635和AJ784227 (Schr6der et al. (2004) Cell Tissue Res 316:271-280)。編碼a-硅酸鹽蛋白的寄居蟹皮海綿 cDNA的核苷S臾序列，顯示于圖3中。編碼a-硅酸鹽蛋白的寄居蟹皮海 綿cDNA的推導(dǎo)的氨基酸序列，顯示于圖4中。
編碼來(lái)自繁茂膜海綿的硅酸鹽蛋白al-4的cDNA是a硅酸鹽蛋白 AJ872183;石圭酸鹽蛋白a2: AJ968945;硅酸鹽蛋白a3: AJ968946;硅酸鹽 蛋白a4: AJ968947 (Wiens et al. (2006) Dev Genes Evol 216:229-242)。
編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的核苷酸序列顯示于圖5中。 編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的推導(dǎo)的核香酸序列顯示于圖6 中。
編碼絲心蛋白的地中海貽貝cDNA的核苷S吏序列和推導(dǎo)的氨基S吏序 列，顯示于圖7和圖8中。
載體； 7>r/fe2-rOPO (Invitrogen)用于產(chǎn)生融合蛋白；； 7h:州W-:rO尸0 的核苷酸序列，請(qǐng)參考圖9。其他的表達(dá)載體也已證明是合適的。使用限制酶iVcol (C山CATGG)。這種限制酶 在絲心蛋白cDNA上無(wú)限制位點(diǎn) 在a-石圭酸鹽蛋白cDNA上無(wú)限制位點(diǎn) 在one restriction site inp7h://^2載體上有一個(gè)卩艮制^f立點(diǎn)。 含有用Wcol消化的突出端(overhangs)的下列引物用于硅酸鹽蛋白 cDNA:
iSV/zTVoc—For/
CCA TGG TTC TTG TCA CAG TGG TAG TAC TG (SEQ ID No. 10)。
在第一步中，使用下列特異性引物，從; w-0)/Z) cDNA中分離編碼 絲心蛋白的序列 皿F
5' GGT GGA CTC GGA GGA GC 3、 (SEQ ID No. 12)。
5、 ATA TCC TGG TTT GTG ATA GC 3、 (SEQ ID No. 13)。 隨后將絲心蛋白cDNA克隆(T/A克隆)至栽體； 7Vc/^^-rOPO
(Invitrogen)。隨后用所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)菌菌4朱BL121 。
對(duì)于a-硅酸鹽蛋白序列，構(gòu)建含有突出端的下述的反向引物，以便
用這種突出端作為蛋白酶(腸激酶)結(jié)合位點(diǎn)
5, ATC GTC ATC TAG GGT GGG ATA AG 3' (SEQ ID No.
14) 。
在下一步驟中，構(gòu)建含有突出端的下列引物 礎(chǔ)TVoc一For/
5、 CCA TGG TTC TTG TCA CAG TGG TAG TAC TG 3、 (SEQ ID No.
15) 。
5、 CCA TGG ACT TGT CAT CGT CAT CTA GG 3、 (SEQ ID No. 16)。 這些突出端用來(lái)作為限制酶TVcoI的限制位點(diǎn)。p7h^fo2載體也具有這種限制酶的限制位點(diǎn)。這允許用載體和擴(kuò)增的硅酸鹽蛋白進(jìn)行雙消化。 所述消化后，將硅酸鹽蛋白克隆至絲心蛋白的前方。
用于從絲心蛋白中切割硅酸鹽蛋白的蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)(腸激酶識(shí)別位 點(diǎn))顯示于圖10中。
在用A^coI消化后，將具有蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)的硅酸鹽蛋白cDNA克隆 至絲心蛋白cDNA前方的； 7 ci^2載體(圖11)。
大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，通常用IPTG誘導(dǎo)硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白 的表達(dá)，并在37。C進(jìn)行4或6小時(shí)(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)方案).John Wiley and Sons, New York)。例如在Ni-NTA基質(zhì)上通過(guò)親和層析，純化所得的融合蛋白。 為了從絲心蛋白中分離硅酸鹽蛋白，用腸激酶切割融合蛋白。隨后在2-巰基乙醇存在的情況下，將該蛋白進(jìn)行凝膠電泳。凝膠電泳可在具有0.1% NaDodS04的10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行(聚丙烯酰胺凝膠電泳， polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)。用考馬斯亮蘭染色凝月交。切割、 純化合和隨后的PAGE后，獲得短形式的重組硅酸鹽蛋白和絲心蛋白。
使用抗體分離和純化硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白 可在親和性基質(zhì)上進(jìn)一步純化a-硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白。親 和性基質(zhì)可例如通過(guò)將a-硅酸鹽蛋白特異性抗體固定于固相(CNBr-激活 的瓊脂糖或其他適宜的載體)來(lái)制備。可使用針對(duì)a-硅酸鹽蛋白的單克隆 抗體或多克隆抗體，其采用標(biāo)準(zhǔn)的方法(Osterman (1984) Methods of Protein and Nucleic Acid Research Vol. 2 (蛋白和核酸研究的方法第二巻); Springer-Verlag [Berlin])制備。根據(jù)制造商(Pharmacia)的使用說(shuō)明書，將 抗體與基質(zhì)偶聯(lián)。通過(guò)pH變化或離子強(qiáng)度變化，進(jìn)行純a-硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的洗脫。
也可以使用其他的親和性基質(zhì)。
硅酸鹽蛋白活性和硅石合成的檢測(cè)
為了測(cè)定重組硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的酶活性，進(jìn)行測(cè)定實(shí) 驗(yàn)，該測(cè)定基于水解以及隨后的四乙氧基硅烷(TEOS)的聚合后測(cè)量聚合通常如下進(jìn)行重組硅酸鹽蛋白的酶活性的測(cè)量。將融合蛋白用適合酶促反應(yīng)的緩沖液如pH 6.8的50 mM MOPS [pH變動(dòng)范圍為4.5到10.5 的其他緩沖液，也是合適的]透析過(guò)夜。將融合蛋白(1-50嗎)溶解于lml的適宜緩沖液，諸如補(bǔ)充了 1 ml 1-4.5 mM TEOS溶液的50 mM MOPS (pH 6.8)。酶促反應(yīng)可在室溫下進(jìn) 行。60分鐘孵育后，通常每100 pg硅酸鹽蛋白合成200nmol無(wú)定形硅石。 通過(guò)離心(12 000xg; 15分鐘；十4。C)收集硅石產(chǎn)物，用乙醇洗滌并空氣 千燥。隨后將沉淀溶解于1 M NaOH中。使用基于鉬酸鹽的測(cè)定如硅測(cè) 定(Merck),定量測(cè)定溶解的硅酸鹽?？梢允褂孟率龅孜锼耐檠趸柰椋檠趸柰榇?(trialkoxysilanols)， 二烷氧基硅烷二元醇(dialkoxysilanediols)，單坑氧基珪 》克三元酉享(monoalkoxysilanetriols)， 二》克氧基石圭》克酉孚(dialkoxysilanols)， 單 烷氧基硅烷二元醇(monoalkoxysilanediols)， 單烷氧基硅烷醇 (monoalkoxysilanols)，烷基-、芳基-或金屬-三烷氧基硅烷，烷基-、芳基 -或金屬-硅烷醇，烷基-、芳基-或金屬-硅烷二元醇，烷基-、芳基-或金 屬-硅烷三元醇，烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅烷二元醇，烷基-、芳 基-或金屬-二烷氧基硅烷醇，或其他的金屬氧化物前體(鎵、鋯或鈦的烷 氧基化合物)。因此，可以產(chǎn)生混合的多聚體。反應(yīng)可在溫和的條件下進(jìn)行。因此，本發(fā)明介紹了節(jié)省能量、環(huán)境 友好的方法。使用硅石而不是羥磷灰石(其是真正的再生)的另 一個(gè)原因是，因?yàn)楣?石更抗酸，而羥》壽灰石和"天然，，牙釉質(zhì)一樣是齲#文感的。硅酸鹽蛋白-粘附蛋白融合蛋白的結(jié)合硅酸鹽蛋白絲心蛋白融合蛋白和由硅酸鹽蛋白產(chǎn)生的(生物)硅石可 以與下列物質(zhì)結(jié)合使用a)人牙釉質(zhì)來(lái)源的肽。這些肽允許設(shè)計(jì)基于硅石/肽的納米復(fù)合材 料。它們是生物相容的，無(wú)需濾去潛在地引起副作用的樹脂單體或添加 劑。18b)含DOPA的多肽/蛋白。使用多孔動(dòng)物酪氨酸酶，可制備這些多肽 /蛋白。它們用作硅酸鹽蛋白/生物硅表面結(jié)合的膠粘劑(生物)硅石與牙釉質(zhì)來(lái)源的肽/蛋白的結(jié)合使用來(lái)自牙釉質(zhì)的肽的理由是因?yàn)樗鼈冊(cè)谘烙再|(zhì)中遞送內(nèi)聚力，并 將在硅石復(fù)合材料中產(chǎn)生最佳的可能的粘合，以及產(chǎn)生基于硅石的納米復(fù)合材料向齲齒引起的齲洞的牙釉質(zhì)邊緣粘附。在樹脂膠(resin adhesives) 的下側(cè)，它們是"能感知水的"并傾向于水解降解。(生物)硅石與含DOPA的蛋白和肽的結(jié)合從海洋多孔動(dòng)物中克隆的重組酪氨酸酶(Mtiller et al. (2004) Micron 35:87)用于合成含有3,4-二羥基苯基丙氨酸(DOPA)單位的粘附多肽或蛋 白。采用所述的方法(Marumo and M&ite (1986) Biochim Biophys Acta 872:98; Akemi Ooka and Garrell (2000) Biopolymers 57:92)，進(jìn)行所用的含 酪氨酸蛋白和肽的酶促羥基化作用。由于酪氨酸酶介導(dǎo)的酪氨酸羥基化 后形成的DOPA到其它產(chǎn)物特別是多巴醌的氧化，在蛋白或肽中的酪氨 酸殘基到DOPA的酶促羥基化作用可能存在一個(gè)問(wèn)題。多巴醌能與賴氨 酸殘基形成交聯(lián)。為了減少來(lái)自DOPA的氧化產(chǎn)物的形成，在羥基化過(guò) 程中加入抗壞血酸；抗壞血酸將形成的多巴醌和其他氧化產(chǎn)物還原為鄰 苯二酚。在低分子量肽羥基化過(guò)程中，通過(guò)離心/過(guò)濾(微孔過(guò)濾膜)除去 酶。通過(guò)反相HPLC，將抗壞血酸從產(chǎn)物中分離。使用"GST融合"系統(tǒng)("GST Fusions" system, Amersham)制備重組多 孔動(dòng)物酪氨酸酶。所得的GST融合蛋白通過(guò)在谷胱甘肽-瓊脂糖4B上的 親和層析來(lái)純化。為了從重組多孔動(dòng)物酶中分離谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，用 凝血酶切割融合蛋白。使用作為L(zhǎng)-酪氨酸底物，在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行 酪氨酸酶酶促活性的測(cè)定。在280nm處，測(cè)量轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-DOPA(3，4-二羥 基苯基丙氨酸)的酪氨酸。也可以使用重組的多孔動(dòng)物酪氨酸酶《奮飾,圭酸鹽蛋白，該酶將一元 酚(如酪氨酸殘基)轉(zhuǎn)化聯(lián)苯酚。所得的膠粘劑蛋白可用于連接由生物硅(由硅酸鹽蛋白合成)制成的形成高階結(jié)構(gòu)(higher-ordered structures)的構(gòu)造區(qū)。 ce-硅酸鹽蛋白絲心蛋白融合蛋白的應(yīng)用本發(fā)明的另外方面是oc-硅酸鹽蛋白絲心蛋白融合蛋白的下列應(yīng)用。1. )牙齒材料表面修飾的應(yīng)用(與目前所用的材料相比，改進(jìn)生物相 容性、更高的穩(wěn)定性和更高的多孔性)。2. )制備新牙齒材料(復(fù)合材料)的應(yīng)用，如牙齒替換材料。3. )制備用于由金屬、金屬氧化物、塑料和其他材料制成的牙齒材料 的包被的應(yīng)用；特別是制備這些材料上的單分子層(生物組織化；在骨和 牙齒材料間形成穩(wěn)定連接)。4. )融合蛋白中存在的粘附蛋白("水下膠粘劑")將硅酸鹽蛋白和生 物硅構(gòu)造區(qū)(由硅酸鹽合成的生物硅顆粒)粘附于表面(金屬、玻璃等)以連 接形成高階結(jié)構(gòu)的生物硅構(gòu)造區(qū)的用途。5. )生物硅作為牙科中填充顆粒(filler particles)的用途。與常規(guī)材料相 比，生物硅具有兩種優(yōu)勢(shì)1.其合成是環(huán)境友好的，因?yàn)樗弥亟M酶^圭 酸鹽蛋白)或生物反應(yīng)器(細(xì)胞團(tuán))酶促產(chǎn)生的。2.用硅酶，可實(shí)現(xiàn)表面修_ 飾，不需要高能或侵蝕性化學(xué)品。以下是圖例說(shuō)明和序列方案圖1.海參屬生化粘附機(jī)制的首次描述。左兩種顧維爾氏管(Cuvier tubuli)。 A, 內(nèi)圓筒(inner cylinder); B，夕卜圓筒(outer cylinder)。右附著 于石蠟的顧維爾氏管(Mtiller and Zahn (1972) Cytobiologie 3: 335-351)。圖2.通過(guò)多孔動(dòng)物酪氨酸酶將一元酚向聯(lián)苯酚的轉(zhuǎn)化(以及進(jìn)一步 向醌的氧化)。圖3.編碼a-硅酸鹽蛋白的寄居蟹皮海綿cDNA的核苷Sl^列。用于 構(gòu)建引物的序列加了下劃線并以粗體標(biāo)記。ATG起始密碼子加有雙下劃 線(SEQ ID No,5)。圖4.編碼a-硅酸鹽蛋白的寄居蟹皮海綿cDNA的推導(dǎo)的氨基酸序列。圖5.編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的核苷酸序列。用于構(gòu)20建引物的序列加有下劃線并以粗體標(biāo)記(SEQ ID No. 6)。圖6.編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的推導(dǎo)的氨基酸序列 (SEQ ID No. 7)。圖7.編碼絲心蛋白的地中海貽貝cDNA的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID No. 8)。圖8.編碼絲心蛋白的地中海貽貝cDNA的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基 酸序列。用于構(gòu)建正向引物和反相引物的序列加了下劃線并以粗體標(biāo)記 (SEQ ID No. 9)。圖9.載體；77)r/^2-r(9尸(9(Invitrogen)的核香酸序列。圖10.用于通過(guò)腸激酶從絲心蛋白切割硅酸鹽蛋白的蛋白酶結(jié)合位 點(diǎn)(腸激酶識(shí)別位點(diǎn))。圖11.用Wco/消化后，將具有蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)的硅酸鹽蛋白基因克 隆至絲心蛋白cDNA前方的； 7 c//^2載體。SEQ ID No. 1:來(lái)自寄居蟹皮海綿的a-硅酸鹽蛋白多肽的氨基酸序列 (rSILICAa—SUBDO)，SEQ ID No. 2:來(lái)自地中海貽貝絲心蛋白多肽的氨基酸序列 (rSILKFIB—MYTGA),SEQ ID No. 3:編碼來(lái)自寄居蟹皮海綿的a-硅酸鹽蛋白多肽的cDNA 的核酸序列。SEQ ID No. 4:編碼來(lái)自地中海貽貝的絲心蛋白的cDNA的核酸序列。
權(quán)利要求
1. 融合蛋白，其含有硅石形成酶和粘附蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其含有介于所述硅酸鹽蛋白形 成酶和所述粘附蛋白之間的蛋白酶切割位點(diǎn)。
3. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述硅石形成酶是硅酸鹽 蛋白。
4. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述硅石形成酶是Q!-硅酸 鹽蛋白。
5. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其中所述粘附蛋白是絲心蛋白。
6. 如權(quán)利要求3、 4或5中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其含有介于Sf X去處容紘4n 6fr ;A :i't 疋■> lVTI AA 電l V^r上 /, i "^"-^'「j" h入_nu a h , 乂 ,1〃 j j^《u ,i j H , —J w 'j w ' j工,r;、。
7. 如權(quán)利要求2、 3、 4、 5或6中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中 所述蛋白酶切割位點(diǎn)是腸激酶切割位點(diǎn)。
8. cDNA，其編碼權(quán)利要求1-7中4壬一項(xiàng)所述的融合蛋白。
9. 合成權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的方法。
10. 納米復(fù)合材料，其含有權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的融合蛋白。
11. 納米復(fù)合材料，其含有權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的化合物以 及適宜的添加劑和補(bǔ)充劑。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的納米復(fù)合材料，其中一種或幾種組分以儲(chǔ)存化合物的形式或作為前體與適宜稀釋液或載體物質(zhì)共存。
13. 如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的納米復(fù)合材料，其中這種 復(fù)合物具有其他的生物學(xué)活性，即與其他的化合物正相互作用并調(diào)節(jié) 磷酸鈣(羥基磷灰石)沉淀、牙釉質(zhì)細(xì)胞更新以及顯示抗菌活性。
14. 使用這些融合蛋白和納米復(fù)合材料，體外或非人類體內(nèi)合成 二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的濃縮產(chǎn)物；也稱為硅石)、硅和包括鈦氧化 物(二氧化鈥)、4告氧化物(氧化鋯)、氧化4夾和4凡氧化物的其他金屬氧4匕 物以及混合的多聚體的方法。
15. 使用這些融合蛋白和納米復(fù)合材料，體外或非人類體內(nèi)合成 二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的濃縮產(chǎn)物；也稱為硅石)、硅和包括鈦氧化 物(二氧化鈦)、鋯氧化物(氧化鋯)、氧化鐵和釩氧化物的其他金屬氧化 物以及混合的多聚體的方法。
16. 體外或非人類體內(nèi)合成二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的濃縮產(chǎn)物； 也稱為硅石)、硅和包括鈦氧化物(二氧化鈦)、鋯氧化物(氧化鋯)、氧 化鐵和釩氧化物的其他金屬氧化物以及混合的多聚體的方法，其中所 用的融合蛋白含有粘附蛋白結(jié)構(gòu)域，所述粘附蛋白結(jié)構(gòu)域顯示了與 SEQ ID NO. 1所示的序列的至少25%的序列相似性。
17.體外或體內(nèi)合成二氧化硅(硅酸或硅酸鹽的濃縮產(chǎn)物；也稱為 硅石)、硅和包括鈦氧化物(二氧化鈦)、鋯氧化物(氧化鋯)、氧化鐵和 釩氧化物的其他金屬氧化物以及混合的多聚體的方法，其中所用的融 合蛋白含有硅酸鹽蛋白結(jié)構(gòu)域，所述硅酸鹽蛋白結(jié)構(gòu)域顯示了與SEQ ID NO. 1所示的序列的至少25%的序列相似性。17. 如權(quán)利要求14-16所述的方法，其中，硅酸，硅酸鹽，單烷 氧基硅烷三元醇，單烷氧基硅烷二元醇，單烷氧基硅烷醇，二烷氧基 硅烷二元醇，二烷氧基硅烷醇，三烷氧基硅烷醇，四烷氧基硅烷醇， 烷基-、芳基-或金屬-硅烷三元醇，烷基-、芳基-或金屬-硅烷二元醇， 烷基-、芳基-或金屬-硅烷醇，烷基-、芳基-或金屬-烷氧基硅烷二元醇， 烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基硅烷醇，烷基-、芳基-或金屬-二烷氧基 硅烷醇，烷基-、芳基-或金屬-三烷氧基硅烷或其他金屬氧化物前體化 合物，用作合成的底物。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中限定復(fù)合物的混合的多聚體 是使用所述化合物的限定的混合物產(chǎn)生的。
19. 如權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)融合蛋白 在用作模板的玻璃、金屬、金屬氧化物、塑料、生物多聚體或其他的 材料上的表面結(jié)合，產(chǎn)生限定的2維或3維空間結(jié)構(gòu)。
20. 使用重組的多孔動(dòng)物酪暴.酸酶制備含DOPA的蛋白和肽的方法。
21. 使用含DOPA的多肽，將硅酸鹽蛋白/生物硅構(gòu)造區(qū)結(jié)合于表 面(金屬表面、塑料表面或復(fù)合材料的表面)的方法。
22. 牙齒填充材料，其通過(guò)利用上述權(quán)利要求所述方法獲得。
23. 如權(quán)利要求8所述的核酸，其為(a)融合蛋白(嵌合蛋白)構(gòu)建體 的形式或(b)具有分別蛋白表達(dá)(蛋白酶切割位點(diǎn))的構(gòu)建體的形式。
24. 如權(quán)利要求23所述的核酸，其中所述核酸是DNA、 cDNA、 RNA或其混合物。
25. 如權(quán)利要求8、 23或24中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述核酸 的序列含有至少 一個(gè)內(nèi)含子和/或poly A序列。
26. 如權(quán)利要求8和權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)所述的核酸，其中 所述核酸是以合成的方式產(chǎn)生的。
27. 載體，其優(yōu)選為下列形式質(zhì)粒、穿梭載體、噬菌粒、粘粒、 表達(dá)載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或顆粒、納米顆?；蛑|(zhì)體， 所述載體含有權(quán)利要求8和權(quán)利要求23-25中任一項(xiàng)所述的核酸。
28. 載體，其優(yōu)選為納米顆粒或脂質(zhì)體形式，含有權(quán)利要求1-7 中任一項(xiàng)所述的多肽。
29. 宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求8和權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)所述 的載體轉(zhuǎn)染或用權(quán)利要求8和權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)所述的顆粒感 染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
30. 如權(quán)利要求29所述的宿主細(xì)胞，其中權(quán)利要求1-7所述的多 肽或其部分得以表達(dá)。
31. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽是以合 成的方式產(chǎn)生的。
32. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽存在于 原核或真核細(xì)胞提取物或裂解物中。
33. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽得到純 化且基本上不含其他蛋白。
34. 上述權(quán)利要求所述的多肽、核酸或納米復(fù)合材料用于調(diào)節(jié)硅移植物中硅和硅單體的再吸收的用途。
35. 上述權(quán)利要求所述的核酸用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞以調(diào)節(jié)硅移植物中硅 和珪單體的再吸收的用途。
36. 由硅酸鹽蛋白酶促產(chǎn)生的硅石或其他金屬氧化物和粘附蛋白作為金屬、金屬氧化物、塑料和其他材料的包被的用途，特別是在這 些材料上產(chǎn)生單分子層的用途。
37. 硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白與生物相容的人類牙釉質(zhì)來(lái) 源的肽/蛋白的結(jié)合物(基于硅石/肽的納米復(fù)合材料)的用途。
38. 硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白與含DOPA的蛋白和肽的結(jié)合 物的用途。
39. 使用硅酸鹽蛋白產(chǎn)生的(生物)硅石作為牙科的填充顆粒的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及牙科的硅酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白合成用作填充材料的含硅的納米復(fù)合材料的用途。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101506365SQ200780031255
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2007年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月23日
發(fā)明者海因茨·C.·施羅德, 維爾訥·E·G·米勒, 維爾訥·K·戈特森 申請(qǐng)人:海洋納米技術(shù)有限公司