專利名稱：：通過提取式發(fā)酵減少原料中雜質(zhì)的毒性作用的制作方法通過提取式發(fā)酵減少原料中雜質(zhì)的毒性作用引用的相關(guān)申請本專利申請要求享有于2007年9月27日提交的U.S.臨時專利申請No.60/975，798的優(yōu)先權(quán)，通過引用將其并入。
背景技術(shù)：
：石油是在地球上發(fā)現(xiàn)的以液態(tài)、氣態(tài)或固態(tài)形式存在的有限的、天然資源。石油主要由碳?xì)浠衔锝M成，碳?xì)浠衔镏饕商己蜌浣M成。它也含有大量的以不同形式存在的其他成分，例如，氮、氧或硫。除了勘探、提取、運輸和精煉石油這些問題之外，石油還是有限的以及縮減的資源。估計世界上石油的消耗量是每年300億桶。據(jù)一些估算，預(yù)計以現(xiàn)在的生產(chǎn)水平，世界上石油的儲量會在2050年之前耗盡。石油是寶貴的資源，但是開發(fā)石油產(chǎn)品的成本相當(dāng)大，不管是財政上還是環(huán)境上。首先，必須發(fā)現(xiàn)石油資源。石油勘探是昂貴的并且有風(fēng)險的投資?？碧缴钏某杀究沙^1億美元。并且，不能保證這些井一定含有石油。估計只有40%的鉆井是可產(chǎn)生商業(yè)碳?xì)浠衔锏目缮a(chǎn)性井。石油提取還伴隨環(huán)境成本。例如，石油提取能導(dǎo)致大量石油滲出到表面。此外，近海鉆井包括挖掘海床，這會破壞或毀壞周圍的海洋環(huán)境。在發(fā)現(xiàn)可生產(chǎn)性井之后，必須以巨大的花費從地里提取石油。在一次開采(primaryrecovery)中，地下的自然壓力足夠?qū)⒕锛s20%的石油提取出來。當(dāng)自然壓力下降后，應(yīng)用二次開采(secondaryrecovery)方法。通常，二次開采包括例如通過水噴射、天然氣噴射或氣升來提高井壓。使用二次開采的方法，可以開采另外的5%-15%的石油。一旦二次開采的方法耗盡，可以使用三次開采方法。三次方法包括降低石油的粘性來使它更容易提取。使用三次開采方法，可以開采另外的5%-15%的石油。因此，即使是在最好的情況下，在一口井中也只能提取50%的石油。由于發(fā)現(xiàn)石油礦層并不是均一地遍及地球，必須通過很長的距離將石油從石油生產(chǎn)地運輸?shù)绞拖牡?。除了運輸成本外，同樣也有毀滅性的漏油的環(huán)境風(fēng)險。從地表提取的天然形式的原油幾乎沒有商業(yè)用途。它是不同長度和復(fù)雜性的碳?xì)浠衔?例如，鏈烷烴(或烷烴)、烯烴(或烯)、炔、napthenes(或環(huán)烷)、脂肪族化合物，芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有機化合物(例如，含有氮、氧、硫等的有機化合物)和雜質(zhì)(例如，硫、鹽、酸、金屬等)。因此，在商業(yè)化使用之前，必須精煉及純化原油。由于其高能量密度及其容易可運輸性，將大多數(shù)石油精煉成燃料，諸如運輸燃料(例如，汽油、柴油、航空燃料等)，民用燃料油和液化石油氣等。原油也是用于生產(chǎn)石化產(chǎn)品的原料的主要來源。源自石油的原料的兩種主要類型是短鏈烯烴(例如，乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如，苯和二甲苯異構(gòu)體)。這些原料源自原油中的鏈更長的碳?xì)浠衔?，通過使用多種方法以相當(dāng)大的費用將其裂化而獲得，例如催化裂化、蒸汽裂化，或催化重整。這些原料用于制造石化產(chǎn)品，這些產(chǎn)品不能直接從原油中精煉而來，例如單體、溶劑、去垢劑，或粘合劑。源自原油的原料的一個實例是乙烯。乙烯可用于生產(chǎn)石化產(chǎn)品，例如聚乙烯、乙醇、環(huán)氧乙烷、乙二醇、聚酯、乙二醇醚，乙氧基化物、醋酸乙烯、1，2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯，以及聚氯乙烯。原料的另一個實例是丙烯，可用于生產(chǎn)異丙醇、丙烯腈、聚丙烯、環(huán)氧丙烷、丙二醇、乙二醇醚、丁烯、異丁烯、1，3_丁二烯、合成橡膠、聚烯烴、α-烯烴、脂肪醇、丙烯酸、丙烯酸聚合體、烯丙基氯、表氯醇，以及環(huán)氧樹脂。隨后用這些石化產(chǎn)品制造特種化學(xué)品(specialitychemicals)，例如塑膠、樹脂、纖維、人造橡膠、藥物、潤滑劑或凝膠。可以由石化產(chǎn)品原料生產(chǎn)的具體特種化學(xué)品為月旨肪酸、碳?xì)浠衔?例如，長鏈、支鏈、飽和的、不飽和的等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、潤滑劑等。特種化學(xué)品有許多商業(yè)用途。脂肪酸在商業(yè)上被用作表面活性劑，例如，在去垢劑和肥皂中。它們也可以用作燃料、潤滑油、涂料、油漆、蠟燭、色拉油、起酥油、化妝品以及乳化劑中的添加劑。此外，脂肪酸在橡膠制品中被用作促進活性劑。脂肪酸液可以用作給料，生產(chǎn)甲酯、酰胺、胺、酰基氯、酸酐、乙烯酮二聚體，以及過氧酸與酯。碳?xì)浠衔镉性S多商業(yè)用途。例如，用鏈較短的烷烴作為燃料。甲烷和乙烷是天然氣的主要成分。用鏈較長的烷烴(例如，5-16個碳)作為運輸燃料(例如，汽油、柴油或航空燃料)。具有多于16個碳原子的烷烴是燃料油和潤滑油的重要成分?？梢杂迷谑覝叵率枪虘B(tài)的更長的烷烴作為，例如，固體石臘。發(fā)現(xiàn)含有約35個碳的烷烴存在于浙青中，用于路面鋪平。此外，鏈較長的烷烴可以經(jīng)裂化產(chǎn)生商業(yè)上有用的鏈較短的碳?xì)浠衔?。與短鏈烷烴一樣，短鏈烯烴用于運輸燃料中。鏈較長的烯烴用于塑膠、潤滑劑以及人造潤滑劑中。此外，烯用作給料，生產(chǎn)酒精、酯、可塑劑、表面活性劑、叔胺、增強型采油劑(enhancedoilrecoveryagent)、脂肪酸、硫醇、烯基琥珀酸酐、環(huán)氧化物、氯化烷、氯化烯、蠟、燃料添加劑，以及粘性流還原劑(dragflowreducer)。脂肪醇有許多商業(yè)用途，包括例如，鏈較短的脂肪醇在化妝品和食品工業(yè)中用作乳化劑、潤膚劑和增稠劑。由于它們的兩性性質(zhì)，脂肪醇表現(xiàn)為非離子性表面活性劑，這作為去垢劑很有用。此外，脂肪醇用于蠟、橡膠、樹脂、醫(yī)藥品藥膏和洗液、織物抗靜電和拋光試劑、可塑劑、化妝品、工業(yè)溶媒，以及脂肪溶劑中。酯有許多商業(yè)用途，包括例如，生物柴油作為另一種燃料。生物柴油由酯(例如，脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯)組成。一些低分子量的酯是易揮發(fā)的，帶有令人愉悅的氣味，這使它們可用作香料(fragrances)或調(diào)味劑。此外，酯可用作油漆、涂料以及清漆的溶劑。并且，一些天然存在的物質(zhì)，例如蠟、脂肪以及油，是由酯組成的。酯也可在樹脂和塑膠中用作軟化劑，在汽油和油中用作可塑劑、阻燃劑以及添加劑。另外，酯可用來制造聚合體、膠片、紡織品、染料以及藥物。醛用于生產(chǎn)許多特種化學(xué)品，包括例如，產(chǎn)生多聚體、樹脂(例如，酚醛樹脂)、染料、調(diào)味品、可塑劑、香水、藥物，以及其他化學(xué)品。一些被用作溶劑、防腐劑或消毒劑。一些天然的和合成的化合物是醛類，例如維生素和激素。此外，許多糖類含有醛基。酮在商業(yè)上用作溶劑。例如，丙酮經(jīng)常用作溶劑，但是它也是用于制備多聚體的原料。酮也用于油漆、涂料、炸藥、香水以及紡織品的加工中。此外，酮用于生產(chǎn)酒精、烯烴、烷烴、亞胺以及烯胺。另外，原油是潤滑劑的來源。源自石油的潤滑劑通常由烯烴，尤其是聚烯烴和α-烯烴組成。潤滑劑可以從原油中精煉而來或使用從原油提煉的原料制造而來。從原油中獲得這些特種化學(xué)品需要極大的財政投資以及大量的精力。這同時也是一個低效的過程，因為原油中的長鏈碳?xì)浠衔锝?jīng)常經(jīng)裂化產(chǎn)生更小的單體。這些單體隨后被用作原料來生產(chǎn)更復(fù)雜的特種化學(xué)品。最后，基于石油的燃料的燃燒會釋放溫室氣體(例如，二氧化碳)和其他形式的空氣污染(例如，一氧化碳、二氧化硫等)。由于世界對燃料的需求增加，溫室氣體和其他形式的空氣污染的排放也增加了。大氣中溫室氣體的積累導(dǎo)致全球溫度的升高。因此，除了破壞當(dāng)?shù)丨h(huán)境(例如，漏油、海洋環(huán)境的挖掘等)，燃燒石油也會破壞全球的環(huán)境。由于石油引起的內(nèi)在難題，因此需要避免與石油勘探、提取、長途運輸和精煉有關(guān)的成本、時間和精力的可再生的石油資源。也需要可再生的石油資源，其可以經(jīng)濟地產(chǎn)生，而不產(chǎn)生由石油工廠和基于石油的燃料的燃燒所產(chǎn)生的環(huán)境破壞?；陬愃频脑?，也需要通常源自石油的可再生的化學(xué)品資源。生產(chǎn)可再生石油的一種方法是通過工程微生物產(chǎn)生可再生的石油產(chǎn)品。一些微生物具有產(chǎn)生化學(xué)品的天然能力。例如，數(shù)百年來酵母被用于產(chǎn)生乙醇(例如，啤酒、葡萄酒等)。近年來，通過先進的生物技術(shù)，人工改造生物體的新陳代謝來產(chǎn)生不是生物體正常所能產(chǎn)生(或者產(chǎn)生水平非常低)的生物產(chǎn)品。源自這些細(xì)胞活動的產(chǎn)品，例如，化學(xué)品，稱為生物產(chǎn)品(bioproduct)。由這些細(xì)胞活動產(chǎn)生的燃料稱為生物燃料。生物燃料是基于石油的燃料的可再生的替代物。生物燃料可以取代任何基于石油的燃料(例如，汽油、柴油、航空燃料、民用燃料油等)。生物燃料可以源自可再生資源，例如植物物質(zhì)、動物物質(zhì)或甚至廢品。這些可再生資源統(tǒng)稱為生物質(zhì)。生物燃料相對于基于石油的燃料的一個優(yōu)勢是，它們不需要昂貴的和有風(fēng)險的勘探或提取。另外，生物燃料可以在本地生產(chǎn)。因此，它們不需要長途運輸。并且，生物燃料可以直接生產(chǎn)而不需要精煉原油所需要的昂貴的和精力集中的精煉，或者它可能需要有限的和成本有效的水平的精煉。此外，生物燃料的使用通過減少基于石油的燃料的燃燒釋放的環(huán)境有害性排放物(例如，室溫氣體，空氣污染等)從而改善了環(huán)境。由于燃燒生物燃料所釋放的碳的量等于其由生物質(zhì)生產(chǎn)所使用的碳的量，因此生物燃料被認(rèn)為是碳中立的。例如，由于生物燃料是由作為可再生天然資源的生物質(zhì)所產(chǎn)生，因此生物燃料保持了碳循環(huán)的平衡。雖然燃燒生物燃料會釋放碳(例如，二氧化碳)，但是這種碳會在生物質(zhì)生產(chǎn)(例如，農(nóng)作物耕作)中再循環(huán)，從而平衡碳循環(huán)，這與基于石油的燃料是不同的?；陬愃频脑?，生物學(xué)方式獲得的化學(xué)品相對于基于石油的燃料提供了與生物燃料相同的優(yōu)勢。生物學(xué)方式獲得的化學(xué)品是石化產(chǎn)品的可再生代替物。生物學(xué)方式獲得的化學(xué)品，例如碳?xì)浠衔?例如，烷烴、烯或炔)、脂肪醇、酯、脂肪酸、脂肪醛以及酮優(yōu)于石化產(chǎn)品，因為它們是直接生產(chǎn)的而不需要大量精煉。不同于石化產(chǎn)品，生物學(xué)方式獲得的化學(xué)品不需要像原油一樣被精煉來開采原料，原料隨后必須被進一步處理來產(chǎn)生更復(fù)雜的石化產(chǎn)品。生物學(xué)方式獲得的化學(xué)品是從生物質(zhì)直接轉(zhuǎn)化成所需要的化學(xué)產(chǎn)品。在由細(xì)胞進行生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生所需要的生物產(chǎn)品之前，可以處理生物質(zhì)，從而使生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶的碳源，或粗碳源(crudecarbonsource，例如，碳水化合物、糖、葡萄糖等)。將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為粗碳源包括使用，例如，酶，稀釋的無機酸或堿如石灰溶液(limesolution)。這種處理也可以包括，例如，溫度升高的熱加工步驟。這些處理的常見副作用是副產(chǎn)品的產(chǎn)生，其對細(xì)胞通常是有毒的或抑制的。例如，在木質(zhì)纖維素物質(zhì)水解過程中，會產(chǎn)生抑制細(xì)胞的副產(chǎn)品的復(fù)雜混合物?？梢詫⑦@些化合物分為3種主要的類群弱酸(例如，乙酸、蟻酸等)、呋喃衍生物(例如，糠醛、羰甲基糠醛等)以及酚類化合物。這些副產(chǎn)品對微生物的生長產(chǎn)生有害影響，從而降低了將碳源轉(zhuǎn)化為商業(yè)上有價值的化合物的總效率。同樣，去除或稀釋這些多余的毒素的需要，導(dǎo)致最終產(chǎn)品成本的實質(zhì)性增加。因此，需要使用粗碳源由工程微生物產(chǎn)生商業(yè)上有價值的生物產(chǎn)品例如生物燃料的方法，其中粗碳源含有抑制細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的副產(chǎn)品。特別是，所需要的方法是在大規(guī)模生產(chǎn)中有效并且經(jīng)濟的那些方法。發(fā)明概述本發(fā)明一方面包括改進由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的方法，該方法包括提供包含粗碳源的發(fā)酵液(fermentationbroth)；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；以及培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。本發(fā)明的另一方面包括從發(fā)酵液的水相中被動地相分離毒副產(chǎn)品的方法，發(fā)酵液是粗碳源和微生物細(xì)胞的混合物，該微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造在所述的微生物細(xì)胞培養(yǎng)物的發(fā)酵中產(chǎn)生生物產(chǎn)品，該方法包括提供包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液形成發(fā)酵培養(yǎng)物；以及培養(yǎng)所述發(fā)酵培養(yǎng)物來產(chǎn)生所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。本發(fā)明的另一方面包含用于由生物工程細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的試劑盒，該試劑盒包含經(jīng)生物工程改造從而由碳源產(chǎn)生生物產(chǎn)品的生物工程細(xì)胞的樣品；包含源自生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的粗碳源的發(fā)酵液；與所述發(fā)酵液不混溶并且能提取在所述生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中形成的毒副產(chǎn)品的疏水性溶劑；以及使用所述生物工程細(xì)胞樣品、發(fā)酵液和疏水性溶劑的發(fā)酵方法的說明書。本發(fā)明另一方面包括由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的持續(xù)發(fā)酵方法，該方法包括提供所述微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物；將包含粗碳源的一定量的發(fā)酵液的連續(xù)流引入所述培養(yǎng)物中；用所述發(fā)酵液使所述培養(yǎng)物發(fā)酵；以及從所述培養(yǎng)物中去除一定量的所述發(fā)酵液的連續(xù)流；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。在本發(fā)明另一方面中，提供的是通過一種方法由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，該方法包括制備包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；從培養(yǎng)的發(fā)酵液中回收所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。在本發(fā)明另一方面中，提供的是由能量驅(qū)動的交通工具(vehicles)，該能量是通過一種方法由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)品的燃燒獲得的，該方法包括制備包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；從培養(yǎng)的發(fā)酵液中回收所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述“生物轉(zhuǎn)化”和“發(fā)酵”在本文中互換使用。發(fā)酵是由活的生物(例如，細(xì)菌、單細(xì)胞植物，如酵母、霉菌或真菌)或酶引起的化學(xué)變化。該反應(yīng)可以包括將碳源(例如，糖、淀粉、碳水化合物等)轉(zhuǎn)化成生物產(chǎn)品。如本文所用的，該反應(yīng)可以在厭氧、微需氧或需氧的條件下發(fā)生。本文所用的術(shù)語“生物柴油，，是指生物燃料的特殊類型。生物柴油可以是源自石油的柴油的替代品。生物柴油可以以稱為“純的”生物柴油的純的形式，或作為任何濃度的與基于石油的柴油的混合物，用于內(nèi)燃柴油發(fā)動機。生物柴油可以由碳?xì)浠衔锘蝓ソM成。在一個實施方案中，生物柴油由脂肪酯組成，例如脂肪酸甲基酯(FAME)或脂肪酸乙基酯(FAEE)。在優(yōu)選實施方案中，這些FAME和FAEE由碳鏈長度為約8_20、10-18或12-16個碳的脂?；糠纸M成。用作生物柴油的脂肪酯可以含有飽和的或不飽和的碳鏈。本文所用的術(shù)語“生物燃料”是指由長鏈碳?xì)浠衔锘蝓ブ瞥傻囊兹既剂?，?yōu)選那些生物可降解的，更優(yōu)選那些清潔燃燒的可燃物。術(shù)語生物燃料也包括生物柴油。本文所用的術(shù)語“生物質(zhì)”是指任何可獲得碳源的生物材料。碳源隨后由本文所討論的工程微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化為合成的生物產(chǎn)品，包括在某些情況下的生物燃料。生物質(zhì)可以包括來自工廠、農(nóng)業(yè)、林業(yè)或家庭的廢品。可以用作生物質(zhì)的此類廢品的實例為發(fā)酵廢棄物(fermentationwaste)、禾S草(straw)、木材(lumber)、污物(sewage)、垃圾(garbase)禾口食物剩余物(foodleftovers)。生物質(zhì)也包括碳源，例如碳水化合物(例如，單糖、二糖或多糖)。用所提供的方法使用的生物質(zhì)優(yōu)選是那些在被用于生物轉(zhuǎn)化成生物產(chǎn)品之前需要一些初始加工的生物質(zhì)。生物質(zhì)的加工會導(dǎo)致有毒化學(xué)品的形成。這類有毒化學(xué)品或毒副產(chǎn)品的實例包括糠醛、5-羥甲基糠醛、脂肪族酸、酚類化合物、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酸、兒茶酚、4-甲基兒茶酚、丁香醛、丁香酸、鄰甲氧基苯酚、香草酸或香草醛。本文所用的術(shù)語“生物產(chǎn)品”是指由工程微生物細(xì)胞(例如，E.coli細(xì)胞)所產(chǎn)生的有機分子。優(yōu)選地，工程微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造產(chǎn)生所述生物產(chǎn)品。生物產(chǎn)品可以是幾乎任何可以由工程微生物細(xì)胞的新陳代謝機制產(chǎn)生的有機分子，并且優(yōu)選地是可以用作工業(yè)產(chǎn)品、工業(yè)產(chǎn)品的起始反應(yīng)物或生物燃料的有機分子。例如，生物產(chǎn)品可以包括烷烴、酯、烯烴(例如，內(nèi)烯烴、末端烯烴等)、脂肪酸、脂肪醇醛或酮。本文所用的短語“碳源”是指適合用作支持原核或簡單真核細(xì)胞生長的碳源的基質(zhì)或化合物。碳源可以成多種形式，包括但不限于多聚體、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽以及氣體(例如，CO和co2)。這些包括，例如，各種單糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖以及阿拉伯糖；寡糖，如果糖-寡糖和半乳糖-寡糖；二糖，如蔗糖、麥芽糖以及松二糖；纖維素物質(zhì)，如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；木質(zhì)纖維素物質(zhì)；半纖維素物質(zhì)；有機酸，如琥珀酸、乳酸以及醋酸；醇，如乙醇；或其混合物。碳源也可以是光合作用的產(chǎn)物，包括但不限于葡萄糖。優(yōu)選地，碳源是最終源自加工的或處理的生物質(zhì)的一種碳源。例如，生物質(zhì)經(jīng)處理可以產(chǎn)生單糖，如葡萄糖；多糖，如淀粉；或例如源自甜菜或糖漿的二糖。優(yōu)選的碳源是葡萄糖。在生物質(zhì)處理之后，碳源處于未加工的狀態(tài)，并且通常需要純化以達(dá)到工程微生物細(xì)胞有效利用的純度水平。本文所用的短語“生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化”或“生物質(zhì)的處理”是指處理或轉(zhuǎn)化生物質(zhì)來產(chǎn)生可溶的碳源，或粗碳源(例如，碳水化合物、糖等)。將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成粗碳源包括使用，例如酶，稀釋無機酸或堿，如石灰溶液。這類處理也可以包括，例如，溫度升高的熱加工步驟。然而，這些處理常見副作用是產(chǎn)生經(jīng)常毒害或抑制細(xì)胞的副產(chǎn)品。本文所用的“粗碳源”是指處于自然狀態(tài)或碳源不純的加工狀態(tài)的碳源，并且除了其他化學(xué)品外，包括存在抑制細(xì)胞生長或細(xì)胞功能的有毒化學(xué)品或毒副產(chǎn)品。粗碳源源自生物質(zhì)。將生物質(zhì)加工成粗碳源會導(dǎo)致有毒化學(xué)品的形成，包括例如，糠醛、5_羥甲基糠醛、脂肪族酸、酚類化合物、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酸、兒茶酚、4-甲基兒茶酚、丁香醛、丁香酸、鄰甲氧基苯酚、香草酸或香草醛。本文所用的“工程微生物細(xì)胞”是指新陳代謝被人工改造的微生物或微生物細(xì)胞，例如，通過用核酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化來修飾微生物細(xì)胞，所述核酸序列優(yōu)選為異源序列。微生物細(xì)胞稱為生產(chǎn)宿主(productionhost，例如，新陳代謝被人工改造用于產(chǎn)生生物產(chǎn)品的微生物宿主)。在本文中可互換使用的“發(fā)酵液”或“生物轉(zhuǎn)化液(bioconversionbroth)”是指用于維持微生物細(xì)胞的液體培養(yǎng)基或化學(xué)品或材料的含水混合物，并且通常包括粗碳源，氮源(例如，銨鹽、酵母提取物或蛋白胨)、無機物、鹽、輔因子、緩沖液以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他成分。發(fā)酵液也為本文所述的工程微生物細(xì)胞提供細(xì)胞產(chǎn)生所需的生物產(chǎn)品而需要的起始反應(yīng)物。本文所用的術(shù)語“疏水性溶劑”是指液相的有機化合物，或可選地指有疏水特性的液相的有機化合物的混合物，其中這種疏水特性導(dǎo)致疏水性溶劑與發(fā)酵液不混溶?？梢杂孟挛乃龅姆椒ㄊ褂檬杷匀軇⑶覂?yōu)選地用疏水性溶劑預(yù)處理粗碳源，例如加工過的生物質(zhì)，去除毒副產(chǎn)品。在優(yōu)選的實施方案中，生物產(chǎn)品是疏水性溶劑，雖然生物產(chǎn)品通常稱為由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的所需的生物產(chǎn)品而不是用于處理粗碳源的溶劑。在其他實施方案中，用于處理粗碳源的疏水性溶劑可以是與生物產(chǎn)品產(chǎn)生的相同的化合物。本文所用的術(shù)語“不混溶”是描述不能均一地混合或混成一體的相同相或狀態(tài)的物質(zhì)的性質(zhì)，并且優(yōu)選地是指發(fā)酵液的水相和疏水性溶劑(和/或生物產(chǎn)品)的有機相的分離。此外，不混溶也可以指不是完全不混溶(例如，部分混溶)的相同相或狀態(tài)的物質(zhì)的性質(zhì)。術(shù)語“毒素”，“有毒產(chǎn)品”，“毒副產(chǎn)品”當(dāng)涉及本文所提供的方法時是可以互換使用，并且指在將生物質(zhì)加工成可為微生物細(xì)胞所用的碳源時所產(chǎn)生的副產(chǎn)品。例如，在木質(zhì)纖維素物質(zhì)水解過程中，形成了3種主要類型的毒副產(chǎn)品弱酸(例如，乙酸、蟻酸)、呋喃衍生物(例如，糠醛和羰甲基糠醛)以及酚類化合物。工程微生物細(xì)胞可以用本文所討論的方法和試劑盒來使用多種工程微生物細(xì)胞。選擇用于生物轉(zhuǎn)化，優(yōu)選為大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)生物合成產(chǎn)品，優(yōu)選為生物燃料的細(xì)胞菌株，將取決于所使用的粗碳源，因為一些粗碳源包含某些毒副產(chǎn)品，以及所使用的溶劑(從發(fā)酵液中將同一毒素分相出來)。通過引用將PCT公開WO2007/136762A2("W0‘762pub，，)中公開的全部內(nèi)容并入本發(fā)明。特別是，將WO‘762pub所討論的工程微生物細(xì)胞并入本發(fā)明，包括產(chǎn)生有特定碳鏈長度、分枝和飽和度的脂肪酸衍生物的微生物。在一些實例中，微生物經(jīng)人工改造已包括一個或多個外源核酸序列，該序列編碼硫酯酶(EC3.1.2.14)、酯合酶(EC2.3.1.75)、醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶(2.3.1.84)、?；o酶A還原酶(EC1.2.1.50)、醇脫氫酶(EC1.1.1.1)、脂肪醇形成酰基輔酶A還原酶(1.1.1.*)或其他本領(lǐng)域可獲得的脂肪酸(或其衍生物)代謝酶。可以選擇由外源核酸序列編碼的硫酯酶肽來提供均一的產(chǎn)物。在一些實施方案中，可以被人工改造的細(xì)胞選自哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。在一些實施方案中，工程微生物細(xì)胞是革蘭氏陽性菌細(xì)胞。在其他實施方案中，宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性菌細(xì)胞。在一些實施方案中，可以被人工改造的微生物細(xì)胞選自埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、脈抱菌屬(Neurospora)、鍵刀霉菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、根毛霉屬(Rhizomucor)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、毛霉屬(Mucor)、蝕絲霉屬(Myceliophtora)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(Trametes)、金抱屬(Chrysosporium)、酵母菌屬(Saccharomyces)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophamonas)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、耳口氏酵母屬(Yarrowia)或鏈霉菌屬(Streptomyces)0在具體實施方案中，可以被人工改造的微生物細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)細(xì)胞、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)細(xì)胞、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)細(xì)胞、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilis)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)細(xì)胞，或解淀粉芽孢Iflif(Bacillusamyloliquefaciens)細(xì)胞。在其他實施方案中，工程微生物細(xì)胞是康寧木霉(Trichodermakoningii)細(xì)胞、綠色木霉(Trichodermaviride)細(xì)胞、里氏木霉(Trichodermareesei)細(xì)胞、長梗木M(Trichodermalongibrachiatum)^^^ftβ(Aspergillusawamori)^f^.'M曲霉(Aspergillusfumigates)細(xì)胞、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)(Aspergillusniger)(Aspergillusoryzae)細(xì)胞、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)細(xì)胞、疏棉狀嗜熱絲孢菌(Humicolanuginose)細(xì)胞、混濁紅球菌(Rhodococcusopacus)細(xì)胞、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)細(xì)胞，或米黑毛霉(Mucormichei)細(xì)胞。在其他實施方案中，工程微生物細(xì)胞是變鉛青鏈霉菌(Str印tomyceslividans)細(xì)胞或鼠灰鏈霉菌(Sti^ptomycesmurinus)細(xì)胞。在其他實施方案中，宿主細(xì)胞是放線菌(Actinomycetes)細(xì)胞。在一些實施方案中，可以被人工改造的微生物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Cvl細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞，或PC12細(xì)胞。在具體實施方案中，工程微生物細(xì)胞是E.coli細(xì)胞，如菌株B、菌株C、菌株K，或E.coli菌株W細(xì)胞。在一些實施方案中，經(jīng)人工改造產(chǎn)生生物產(chǎn)品的微生物的一些實例是，運動發(fā)酵單胞菌(Z.mobilis)、真養(yǎng)雷氏菌(Ralstoniaeutropha)、弗氏弧菌(Vibriofurnissii)>啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophila)或藤黃微球菌(Micrococusluteus)及其親緣生物。在一些實例中，可以通過優(yōu)化本文所述的脂肪酸生物合成途徑人工改造內(nèi)源性產(chǎn)生生物產(chǎn)品的微生物來過量產(chǎn)生生物產(chǎn)品。已知可以產(chǎn)生生物產(chǎn)品并且可以使用本文所提供的方法經(jīng)人工改造產(chǎn)生有機化合物或生物產(chǎn)品的示例性微生物包括，節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、紅硫細(xì)菌(Chromatiumsp.)、Cladosporiumresina(ATCC2271I)、巴氏梭菌VKM(ClostridiumpasteurianumVKM)、假破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtenanomorphum)、尿酸梭菌(Clostridiumacidiurici)、棒桿菌屬(Corynebacterium)種類、藍(lán)細(xì)菌屬(Cyanobacterial)種類(灰色念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostocmuscorum)、巢狀組囊藍(lán)細(xì)菌(Anacystis(Synechococcus)nidulans)、淺黃席藍(lán)細(xì)菌(Phormnidiumluridum)、佛氏綠膠藍(lán)細(xì)菌(Chlorogloeafritschii)、紅海束毛藍(lán)細(xì)菌(Trichodesmiumerythaeum)>Oscillatoriawilliamsii、原型體微鞘藍(lán)細(xì)菌(Microcoleuschthonoplaseis)、球藍(lán)藻(Coccochloriselabens)、阿格門氏藻(Agmenellumquadruplicatum)、細(xì)小織線藻(Plectonematerebrans)、具鞘微鞘藻(M.Vaginatus)以及C.scopulorum)、脫硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)(ATCC29577)、耐輻射動球菌(Kineococcusradiotolerans)(BAA-149)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)(FD533,ATCC272,381,382,1SD，540，4698，7468，27141)、微球菌(Micrococcussp.)(ATCC146，398，401，533)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(ATCC412,416,516)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、分支桿菌屬(Mycobacterium)種類、綠色木霉(Trichodermavirida)、出芽茁霉(Pullulariapullulans)、Jeotgalicoccussp.(Μ.candicans)(ATCC8456)、球紅假單抱菌(Rhodopseudomonasspheroids)、綠菌屬(Chlorobiumsp.)、深紅紅螺菌(Rhodospirilliumrubrum)(ATCCI1170)、萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobiumvannielii)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC13637,17444,17445,17666,11668,17673,17674，17679，17617)、路德類酵母(Saccharomycodesludwigii)(ATCC22111)、酵母(Saccharomycessp.)(卵形、路德類、熱帶)、弗氏弧菌(Vibriofurnissii)Ml、海產(chǎn)弧菌(Vibriomarinus)MP_l、Vibrioponticus、海紅沙雷氏菌(Serratiamarinorubra)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、裸黑粉菌(Ustilagonuda)、冰草條黑粉菌(Urocystis已gropyri)、Ξ^!Ι_胃(Sphacelothecareiliana)>Tilletfasp.(foetida,caries,controversa)、角軍酉旨fi絲酵母(Candidalipolytica)、E.Coli、節(jié)桿菌(Arthrobacter)AK19、紅酵母粘紅酵母(Rhodotorulaglutinins)、不動桿菌(Acinetobactersp.)菌株M-1，以及解酯假絲酵母(Candidalipolytic^)。除了經(jīng)人工改造表達(dá)產(chǎn)生諸如脂肪酸衍生物的生物產(chǎn)品的外源核酸序列外，微生物還可以有一個或多個內(nèi)源基因功能缺失或衰減。例如，ackA(EC2.7.2.1)、ackB(EC2.7.2.1)、adhE(EC1.1.1.1,1.2.1.10)、fabF(Ee2.3.1.119)、fabR(accessionNP_418398)、fadE(Ee1.3.99.3，1.3.99.-)、GST(EC6.3.2.3)、gpsA(EC1.1.1.94)、IdhA(EC1.1.1.28)、pflB(EC2.3.1.54)、plsB(EC2.3.1.15)、poxB(EC1.2.2.2)、pta(BC2.3.1.8)、谷胱甘肽合酶(EC6.3.2.3)及其組合可以衰減。此外，微生物還可以有一個或多個超表達(dá)的額外基因。例如，pdh、panK、aCeEF(編碼丙酮酸和2-氧代戊二酸酯脫氫酶復(fù)合物的Elp脫氫酶成分和E2p二氫硫辛酰胺(dihydrolipoamide)?；D(zhuǎn)移酶成分，登錄號NP_414656，NP_414657,EC:1.2.4.1，2.3.1.61,2.3.1.12)、accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(編碼FAS，登錄號CAD85557，CAD85558,NP_842277,NP_841683.NP_415613,EC:2.3.1.180,2.3.1.39，1.1.1.100，1.6.5.3,2.3.1.179)、編碼脂?；o酶A還原酶的基因(登錄號AAC45217，EC1.2.1.-)、UdhA或相似基因(編碼嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶，登錄號CAA46822，EC1.6.1.1)以及編碼脂酰基輔酶A還原酶的基因(登錄號:AAC45211，EC1.2.1.-)。優(yōu)選地，工程微生物細(xì)胞是生產(chǎn)宿主或包括修飾的核酸序列來超表達(dá)編碼酰基輔酶A合酶、硫酯酶或酯合酶的基因的微生物。在一些實例中，修飾核酸序列來超表達(dá)編碼?；o酶A合酶和硫酯酶或酯合酶的基因。在一些實例中，修飾核酸序列，超表達(dá)編碼酰基輔酶A合酶、硫酯酶和酯合酶的基因。在一些實例中，核酸序列還包含編碼?；o酶A脫氫酶的核酸序列，該序列經(jīng)修飾而使?；o酶A脫氫酶的表達(dá)衰減?？梢酝ㄟ^修飾所選擇的硫酯酶的表達(dá)，可以選擇脂肪酸衍生物底物的鏈長。硫酯酶會影響所產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長。因此，宿主細(xì)胞經(jīng)人工改造可以表達(dá)、超表達(dá)、衰減表達(dá)，或不表達(dá)一個或多個選擇的硫酯酶，從而提高優(yōu)選的脂肪酸衍生物底物的產(chǎn)生。例如，可以通過表達(dá)優(yōu)先產(chǎn)生Cltl脂肪酸的硫酯酶且使優(yōu)先產(chǎn)生非Cltl脂肪酸(例如，優(yōu)先生產(chǎn)C14脂肪酸的硫酯酶)的硫酯酶衰減來產(chǎn)生Cltl脂肪酸。這將產(chǎn)生相對均一量的碳鏈長度為10的脂肪酸。在其他實例中，可以通過使產(chǎn)生非C14脂肪酸的內(nèi)源硫酯酶衰減并表達(dá)使用C14-ACP的硫酯酶來產(chǎn)生C14脂肪酸。在一些實例中，可以通過表達(dá)使用C12-ACP的硫酯酶并使產(chǎn)生非C12脂肪酸的硫酯酶衰減來產(chǎn)生C12脂肪酸。酰基輔酶A、丙二酰基輔酶A以及脂肪酸的過量產(chǎn)生可以使用本領(lǐng)域已知的方法來檢驗，例如，通過將放射性前體、HPLC或GC-MS隨后細(xì)胞裂解?？梢杂糜诒疚乃龇椒ǖ牧蝓ッ傅姆窍拗菩詫嵤├杏诒?。表1硫酯酶<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*Mayeretal.，BMCPlantBiology71—11,2007E.coli?；o酶A合酶(ACS)酶FadD和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白FadL是脂肪酸攝取系統(tǒng)的重要成員。FadL介導(dǎo)脂肪酸轉(zhuǎn)運到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，而FadD介導(dǎo)酰基輔酶A酯的形成。當(dāng)沒有其他碳源可利用時，細(xì)菌吸收外源的脂肪酸，并且將其轉(zhuǎn)化成酰基輔酶A酯，該酯結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子FadR上并且解除編碼負(fù)責(zé)脂肪酸轉(zhuǎn)運(FadL)、激活(FadD)和β-氧化(FadA、FadB、FadE以及FadH)的蛋白的fad基因的表達(dá)抑制。當(dāng)可選的碳源可利用時，細(xì)菌合成脂肪酸如?；?ACP，其被用于磷脂合成，但不是β-氧化的底物。因此，?；o酶A和?；?ACP是可產(chǎn)生不同終產(chǎn)物的脂肪酸的獨立來源。參見Cavigliaetal.,J.Biol.Chem.279(12)1163-1169,2004ο可以使用已知的肽人工改造生產(chǎn)宿主從而產(chǎn)生可轉(zhuǎn)化為?；o酶A的各種長度的脂肪酸。產(chǎn)生脂肪酸衍生物的一種方法包括提高一個或多個?；o酶A合酶肽(EC6.2.1.-)的表達(dá)，或表達(dá)更過活性形式的一個或多個?；o酶A合酶肽(EC6.2.1.-)。表B顯示了可以表達(dá)產(chǎn)生酰基輔酶A和脂肪酸衍生物的?；o酶A合酶的列表。表B:?；o酶A合酶<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>編碼酯合酶的基因已知來自加州希蒙得木植物和細(xì)菌不動桿菌(Acinetobactersp.)菌株ADPl(以前為乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)ADPl)。細(xì)菌酯合酶是雙功能酶，表現(xiàn)酯合酶活性以及可由甘油二酯底物和脂?；o酶A形成甘油三酯的能力(酰基輔酶A二甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)活性)?；騱ax/dgat編碼酯合酶和DGAT兩者。參見Chengetal.，J.Biol.Chem.279(36):37798_37807，2004；KalscheuerandSteinbuchel,J.Biol.Chem.278=8075-8082,2003。酯合酶也可以用于產(chǎn)生某些脂肪酯，該脂肪酯可以用作本文所述的燃料，例如生物柴油。脂肪酯，包括蠟，由?；o酶A和醇的生產(chǎn)，可以用已知的多肽進行人工改造，例如一種或多種酯合酶(EC2.3.1.20，2.3.1.75)。酯合酶肽序列可以公開獲得，例如基因aftl，一種雙功能蠟酯合酶/?；o酶A甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(登錄號AA017391)；以及基因mWS，其為蠟酯合酶(希蒙德木(simmondsia))(登錄號AAD38041)。此外，美國專利No.7，118，896提供了鑒定酯合酶活性的方法，通過引用將其全部內(nèi)容并入。在具體實例中，如果所需的產(chǎn)物是基于酯的生物燃料，則人工改造生產(chǎn)宿主，從而產(chǎn)生由粗碳源產(chǎn)生的酯。這種生產(chǎn)宿主包括編碼酯合酶的外源DNA序列，該酯合酶經(jīng)表達(dá)從而賦予所述生產(chǎn)宿主由粗碳源合成飽和的、不飽和的、或分枝的脂肪酯的能力。在一些實施方案中，生產(chǎn)宿主也可以表達(dá)編碼以下示例性蛋白的DNA序列脂肪酸延長酶、?；o酶A還原酶、?；D(zhuǎn)移酶、酯合酶、脂?；D(zhuǎn)移酶、甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶、酰基輔酶A蠟醇?；D(zhuǎn)移酶。在可選的實施方案中，生物表達(dá)編碼雙功能的酯合酶/酰基輔酶A甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶的DNA序列。例如，雙功能的酯合酶/?；o酶A甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶可以選自多酶復(fù)合物，該多酶復(fù)合物來自希蒙得木(Simmondsiachinensis)、不動桿菌(Acinetobactersp.)菌株ADPl(以前為乙酸鈣不動桿菌ADP1)，泊庫島食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)、銅綠假單胞菌、Fundibacterjadensis、擬南芥或真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneseutrophus)(后來重命名為真養(yǎng)雷氏菌)。在一個實施方案中，脂肪酸延長酶、酰基輔酶A還原酶或蠟合酶來自真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(后來重命名為真養(yǎng)雷氏菌)的或其他在文獻(xiàn)中已知產(chǎn)生諸如蠟或脂肪酯的生物的多酶復(fù)合物。編碼在脂肪酯產(chǎn)生過程中有用的酯合酶的外源DNA序列的另外的來源包括但不限于，高山被孢霉(Mortierellaalpina)(例如，ATCC32222)、彎曲隱球酵母(Cryptococcuscurvatus)(也禾爾為Apiotricumcurvatum)、Alcanivoraxjadensis(例如，T9T=DSM12718=ATCC700854)、不動桿菌(Acinetobactersp.)H01_N(例如，ATCC14987)和混濁紅球菌(例如，PD630，DSMZ44193)。在一個實例中，使用了來自不動桿菌(Acinetobactersp.)ADPl基因座A017391(KalscheuerandSteinbuchel,J.Biol.Chem.278:8075_8082，2003中有描述，通過引用并入本發(fā)明)處的酯合酶。在另一個實例中，使用了來自希蒙得木基因座AAD38041處的酯合酶。示例性的生產(chǎn)宿主是LS9001。通過修飾C41(DE3)產(chǎn)生LS9001，C41(DE3)是從www.overexpress.com(SaintBeausine7France)獲得并高支除了fadE基因(酉先基輔酶A脫氫酶)的E.coliB菌株。簡而言之，使用引物YafV_NotI和Ivry_01來擴增約fadE的約830bp的上游以及引物L(fēng)pcaf_ol和LpcaR_Bam來擴增fadE的約960bp的下游，制備fadE敲除的E.coli菌株。使用重疊PCR來產(chǎn)生整個fadE基因框架內(nèi)缺失構(gòu)件體。將fadE基因缺失構(gòu)件體克隆到溫度敏感性質(zhì)粒PK0V3中，pK0V3含有用于反向選擇的sacB基因，并且根據(jù)Linketal.，J.Bact.179=6228-6237,1997的方法，進行fadE的染色體缺失。所產(chǎn)生的菌株不能降解脂肪酸和脂?；o酶A。該敲除菌株在本文中稱為AfadE。包括于生產(chǎn)宿主中的另外的修飾包括引入帶四種基因的質(zhì)粒，這些基因負(fù)責(zé)E.coli的乙酰輔酶A羧化酶(accA、accB、accC以及accD，登錄號:NP_414727，NP_417721，NP_417722，NP_416819，EC6.4.1.2)的活性。將accABCD基因作為雙順反操縱子以兩個步驟克隆到pACYCDuet-1(Novagen,Madison,WI)的Ncol/Hindlll和Ndel/Avrll位點中，并且產(chǎn)生的質(zhì)粒稱為pAS004.126。包括于生產(chǎn)宿主中的另外的修飾包括如下超表達(dá)aceEF(編碼丙酮酸和2-氧代戊二酸酯脫氫酶復(fù)合物的Elp脫氫酶成分和E2p二氫硫辛酰胺?；D(zhuǎn)移酶成分)；以及來自E.coli、歐洲亞硝基單胞菌(Nitrosomonaseuropaea)(ATCC19718)、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、鏈球菌(Sti^ptomycesspp)、雷氏菌屬(Ralstonia)、紅球菌屬、棒桿菌(Corynebacteria)、短桿菌(Brevibacteria)、分枝桿菌(Mycobacteria)禾口油質(zhì)酵母(oleaginousyeast)的fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(編碼FAS)。同樣，生產(chǎn)宿主經(jīng)人工改造表達(dá)來自豌豆(Pisumsavitu)的accAB⑶(編碼乙酰輔酶A羧化酶)。然而，當(dāng)生產(chǎn)宿主也生產(chǎn)丁醇時，就不是很合適用于表達(dá)豌豆的同源物。在一些生產(chǎn)宿主中，使用Link,etal.，J.Bacteriol.179:6228_6237，1997的方法來敲除或削弱基因。被敲除或削弱的基因包括gpsA(編碼生物合成的sn-甘油3-磷酸脫氫酶，登錄號NP_418065，EC1.1.1.94)；IdhA(編碼乳酸脫氫酶，登錄號NP_415898，EC1.1.1.28)；pflb(編碼甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶1，登錄號P09373，EC2.3.1.54)；adhE(編碼醇脫氫酶，登錄號:CAA47743,EC:1.1.1.1,1.2.1.10)；pta(編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶，登錄號NP_416800,EC2.3.1.8)；poxB(編碼丙酮酸氧化酶，登錄號:NP_415392,EC1.2.2.2)；ackA(編碼乙酸激酶，登錄號:NP_416799,EC2.7.2.1)及其組合。同樣，將PlsB[D311E]突變引入LS9001，使plsB衰減。該突變減少了轉(zhuǎn)化成磷脂產(chǎn)物的碳的量。通過將編碼天冬胺酸311的GAC密碼子替換成編碼谷氨酸的GAA密碼子來產(chǎn)生編碼PlsB[D311E]的等位基因。通過合成來產(chǎn)生改變的等位基因，并且用Link等的方法將染色體的PlsB野生型等位基因替換成突變的plsB[D311E]等位基因。工程微生物細(xì)胞的一個實施例是LS9-ID1MG1655fadE:PTRC-tesA-fadD-AtfAl菌株。該菌株帶四種遺傳修飾敲除的fadE，其可消除細(xì)胞利用脂肪酸作為碳源的能力，和整合入染色體的操縱子，其由修飾的細(xì)胞內(nèi)硫酯酶組成，?；o酶A合酶和酯合酶。這三種酶賦予細(xì)胞產(chǎn)生和分泌脂肪酸酯的能力。類似的菌株，除了它們也有額外的敲除以及自身或外源基因表達(dá)或超表達(dá)外，還允許其他目的生物產(chǎn)品的產(chǎn)生，例如，烷烴、烯烴、酮以及脂肪醇。牛物質(zhì)/耜碳源以生物質(zhì)，優(yōu)選可再生生物質(zhì)(或給料)開始，可以產(chǎn)生用于微生物培養(yǎng)的碳源。本文所提供的方法允許使用粗碳源，例如帶高水平毒素(相對于糖)的加工過的生物質(zhì)被用于生物轉(zhuǎn)化成生物產(chǎn)品?？梢栽谏镛D(zhuǎn)化過程中將粗碳源遞增或持續(xù)添加到微生物培養(yǎng)物中，并且隨著在生物轉(zhuǎn)化的進行，基本上去除毒素。碳源(例如，基本的糖)被大量轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)品或生物產(chǎn)品。毒素在本文稱為毒副產(chǎn)品。本文也提供了通過運用一個步驟提高粗碳源的利用率的方法，在該步驟中，將疏水性溶劑作為成分添加到發(fā)酵液(或生物轉(zhuǎn)化液)制劑中，從而在毒副產(chǎn)品接觸到微生物之前可以就地將其提取。如果需要，也可以在生物轉(zhuǎn)化之前而不是之中，進行這種處理。纖維素和半纖維素物質(zhì)木質(zhì)纖維素物質(zhì)是生物質(zhì)的來源，并且可以包含木材、草、林業(yè)廢棄物和農(nóng)業(yè)殘留物(例如，玉米秸、甘蔗渣、稻草等)?？梢约庸つ举|(zhì)纖維素物質(zhì)從而產(chǎn)生碳源。例如，如果碳水化合物成分可以被廉價地解聚成可溶的和可發(fā)酵的糖，那么這些物質(zhì)可以作為用于不同生物轉(zhuǎn)化的底物。木質(zhì)纖維素物質(zhì)的成分主要取決于生物質(zhì)的來源，但是所有都是由半纖維素、纖維素和木質(zhì)素組成。半纖維素是帶不同乙?；降奈焯?、己糖和糖醛酸等分枝的多糖；纖維素是D-葡萄糖的高分子量的線性多聚體；木質(zhì)素是酚類化合物的芳香類多聚體。碳水化合物多聚體均可以被無機酸或酶水解，并且大部分方法應(yīng)用半纖維素的稀酸水解作為最初的步驟，產(chǎn)生可溶的糖并且提高纖維素的酶的消化性。在稀酸水解過程中，產(chǎn)生了微生物毒素的復(fù)雜混合物。這些毒素包括來自木聚糖脫乙酰作用的醋酸鹽、呋喃降解產(chǎn)物(例如，糠醛和5-羥甲基糠醛)、來自糖的脂肪酸(例如，蟻酸和乙酰丙酸)，以及來自木質(zhì)素的幾種酚類化合物。沒有一種化合物被鑒定為主要的毒素，但是呋喃及其衍生物是最常引用的。在水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的也被報道為微生物毒素的一些化合物包括4_羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酚(1，4-二-羥基苯)、兒茶酚(1，2-二-羥基苯)、由紫丁香基丙烷單元降解得到的丁香醛和丁香酸，以及由木質(zhì)素的愈創(chuàng)木基(guaiacylpropane)單元降解衍生而來的香草酸和香草醛。已經(jīng)報道不同類型的毒素對微生物的不同的作用方式。尤其對E.coli而言，但同樣也對很多其他微生物而言，Zaldivar等(Biotech.Bioeng.Vol.65，1，24-33，1999)報道稱，幾種毒素的效力隨它們各自的疏水性以及化學(xué)反應(yīng)性而提高。毒素的抑制濃度對于不同的的生物是不同的，并且也隨環(huán)境條件而變化，環(huán)境條件可以加強或減弱它們的作用。本申請優(yōu)選用于疏水性毒素，疏水性毒素可以優(yōu)先地分離進入疏水性生物產(chǎn)品或目的溶劑中(例如，脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、烷烴、烯等)。生物質(zhì)水解產(chǎn)物中的所提及的毒素的濃度，取決于生物質(zhì)的類型以及處理條件。一般而言，低于1.5g/L的呋喃總值曾被提到，其中糠醛作為主要成分。全部酚類化合物的值為約幾百mg/L，其中每種主要類型(羥苯基單體，愈創(chuàng)木基單體和紫丁香基單體)的重量不超過100-200mg/L。本文所介紹的實施例所使用的濃度要高得多，從而清楚地證明所述的處理的好處可以延伸至比正常水解產(chǎn)物要高得多的濃度。用所述工程微生物細(xì)胞進行批量生物轉(zhuǎn)化的方法可以允許在批量過程持續(xù)期間收集和濃縮毒素。然而，本方法允許從包含細(xì)胞的水層中去除這種毒素，從而減少毒素的任何抑制或毒害作用。鐘本文所述的方法使用了發(fā)酵的一些基本概念，并且并可以以此程度并入本領(lǐng)域用于發(fā)酵尤其是大規(guī)模發(fā)酵的已知的原料和方法。用目前的方法，工程微生物細(xì)胞在發(fā)酵液的存在下可以培養(yǎng)于發(fā)酵罐中?？梢允褂萌魏魏线m的發(fā)酵罐，包括攪拌槽發(fā)酵罐、氣動發(fā)酵罐、泡沫發(fā)酵罐或其任意組合。用于微生物培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法為微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(參見，例如，Baileyetal.,BiochemicalEngineeringFundamentals,secondedition,McGrawHill,NewYork，1986)。必須考慮適合生長的培養(yǎng)基、pH、溫度，以及需氧、微需氧或厭氧條件的需求，這些取決于對微生物、發(fā)酵和加工方法的特殊要求。所使用的液體培養(yǎng)基不是關(guān)鍵性的，但是它必須維持所使用的細(xì)胞的生長并且促進產(chǎn)生所需產(chǎn)品必須的酶促通路。示例性的培養(yǎng)基可以包括基本培養(yǎng)基、復(fù)雜培養(yǎng)基、或已知成分培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通常包括發(fā)酵碳源、氮源(例如，銨鹽、酵母提取物或蛋白胨)、無機物、鹽、輔因子、緩沖液、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其他成分?？梢酝ㄟ^應(yīng)用特殊的發(fā)酵技術(shù)促進化合物的產(chǎn)生和分離。在降低成本的情況下使產(chǎn)量最大化的一種方法是提高來自轉(zhuǎn)化成生物產(chǎn)品的碳源中的碳的百分比。在正常的細(xì)胞生命周期中，碳被用于細(xì)胞功能中，包括，例如，產(chǎn)生脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、有機酸和核酸。減少生長相關(guān)活動所需的碳量會提高碳生物轉(zhuǎn)化成生物產(chǎn)品的效率。這可以通過先使微生物生長至所需密度而完成，例如達(dá)到對數(shù)生長期最高點的密度。在最高點時，可以控制復(fù)制檢查點基因，從而使細(xì)胞生長停止。給料碳轉(zhuǎn)化成生物產(chǎn)品的百分比是關(guān)鍵的成本操縱者一效率越高(例如，轉(zhuǎn)化百分比越高)則加工費用就越低。對含氧的碳源(例如，葡萄糖或其他碳水化合物)而言，氧必須以二氧化碳的形式被釋放。釋放每2個氧原子，就也要釋放一個碳原子從而產(chǎn)生約34%(w/w)的最大理論新陳代謝效率(對于脂肪酸衍生物產(chǎn)物而言)。然而，對于其他生物產(chǎn)品和碳源而言，這一數(shù)值會發(fā)生改變。在文獻(xiàn)中典型的效率為低于約5%。產(chǎn)生生物產(chǎn)品的工程細(xì)胞的效率可以高約1、3、5、10、15、20、25或30%。在一個實例中，細(xì)胞可以呈現(xiàn)約10%至約25%的效率。在其他實例中，這種細(xì)胞可以呈現(xiàn)約25%至約30%的效率，并且在其他實例中，這種細(xì)胞可以呈現(xiàn)約30%或更高的效率。在一些實例中，可以應(yīng)用持續(xù)的方法。在該方法中，帶有可產(chǎn)生生物產(chǎn)品的工程微生物細(xì)胞的反應(yīng)器可以通過多種途徑來組裝。在一個實例中，將發(fā)酵液持續(xù)供應(yīng)到發(fā)酵罐中，并且將剩余的發(fā)酵液、工程微生物細(xì)胞、生物產(chǎn)品和副產(chǎn)品從發(fā)酵罐中不斷去除。在可選的實施方案中，可以將去除的細(xì)胞分離并且放回發(fā)酵罐中再利用。在另一實施方案中，去除一些或全部的生物產(chǎn)品，并且放回發(fā)酵罐中再利用從而從含于新添加的發(fā)酵液中的新引入的粗碳源中去除疏水性毒素。在一個實例中，生物轉(zhuǎn)化會不斷減少。在該實例中，需要建立穩(wěn)定的還原性環(huán)境?？梢酝ㄟ^在厭氧性環(huán)境中進行生物轉(zhuǎn)化從而建立還原性環(huán)境?？梢酝ㄟ^二氧化碳?xì)怏w的釋放維持電子平衡?？蛇x地，在缺少氧氣的情況下，可以將硝酸鹽或琥珀酸鹽提供于液體培養(yǎng)基中作為電子供體用于生物轉(zhuǎn)化。促進增強NAD(H)和NADP(H)平衡也可以促進穩(wěn)定電子平衡。通過人工改造生產(chǎn)宿主表達(dá)NADH:NADPH轉(zhuǎn)氫酶，也可以增強細(xì)胞內(nèi)NADPH的有效性。一個或多個NADHNADPH轉(zhuǎn)氫酶的表達(dá)使糖酵解產(chǎn)生的NADH轉(zhuǎn)化為NADPH，從而提高脂肪酸衍生物的產(chǎn)生。可以選擇生產(chǎn)宿主或微生物細(xì)胞(將被人工改造的)釋放碳?xì)浠衔锘蛏锂a(chǎn)品的內(nèi)在能力。生物產(chǎn)品生產(chǎn)和釋放到培養(yǎng)基的效率可以表示為細(xì)胞內(nèi)生物產(chǎn)品和細(xì)胞外生物產(chǎn)品的比例。在一些實例中，比例可以是約51、41、31、21、11、12、13、14或15。生產(chǎn)宿主可以經(jīng)另外的人工改造，表達(dá)重組多纖維素酶體(cellulosomes)，從而使生產(chǎn)宿主使用纖維素物質(zhì)作為碳源。可選地，生產(chǎn)宿主可以經(jīng)另外的人工改造，來表達(dá)轉(zhuǎn)化酶(EC3.2.1.26)，從而使可以用蔗糖作為碳源。同樣，可以使用一個或多個美國專利5，000，000、5，028，539、5，424，202、5，482，846和5，602，030(Ingrametal.)中所描述的方法來人工改造生產(chǎn)宿主，從而使生產(chǎn)宿主可以有效地吸收碳并且利用纖維素物質(zhì)作為碳源，據(jù)此將這些專利通過引用全文并入。對于發(fā)酵方法或生物處理的一個重要考慮事項是，是否使用批量或持續(xù)的發(fā)酵方法。會影響所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品量的這兩種方法的一個不同點在于，批量方法除了存在指數(shù)生長期外還存在準(zhǔn)備期、延緩期和穩(wěn)定期。相反，持續(xù)方法保持在持續(xù)的指數(shù)生長狀態(tài)，并且如果操作適當(dāng)，可以一次運行數(shù)月。對生物產(chǎn)品的形成而言，由于去除了準(zhǔn)備期、延緩期和穩(wěn)定期，持續(xù)方法提供了高得多的生產(chǎn)率(例如，稀釋率乘以細(xì)胞量)。例如，持續(xù)方法獲得的生產(chǎn)率據(jù)估計要增強8倍(Shuleretal.，PrenticeHall,Inc.=UpperSaddleRiver,N.J.，245-247)。雖然在生產(chǎn)率上有壓倒性優(yōu)勢，但是由于多種原因在操作中批量方法要比持續(xù)方法應(yīng)用更多。首先，批量系統(tǒng)的生產(chǎn)率可以極大地超越持續(xù)方法的生產(chǎn)率，因為后者必須在非常低的稀釋率下操作，而當(dāng)該方法依賴于加工的生物質(zhì)時由于產(chǎn)生的毒素存在于液體培養(yǎng)基中，就不容易達(dá)到非常低的稀釋率。其次，生產(chǎn)菌株通常經(jīng)歷了遺傳物質(zhì)的改良，從而來提高它們的生化或蛋白生產(chǎn)性能。這些專門的菌株可能不如它們的親代補體生長的快，然而持續(xù)方法，例如使用恒化器(以持續(xù)模式操作的發(fā)酵罐)的方法，對生長最快的細(xì)胞而言，施加了極大的選擇性壓力。含有重組DNA或攜帶點突變來獲得需要的過量生產(chǎn)的表型的細(xì)胞，對于突變回原始的低產(chǎn)的親代菌株是敏感的。對于帶有單基因缺失的菌株而言，進行補償性突變是有可能的，該突變會傾向恢復(fù)野生型生長表型。為了有限的營養(yǎng)，生長越快的細(xì)胞通常會將它們的更多產(chǎn)的對手競爭出局，這會極大地減少生產(chǎn)率。在另一方面，批量方法通過在每一輪的最后不重復(fù)使用細(xì)胞從而限制了可用的代數(shù)，因此降低了生產(chǎn)菌株恢復(fù)成其野生型表型的可能性。最后，由于潛在的技術(shù)障礙，持續(xù)方法對于長期操作來說更困難，例如設(shè)備故障和外來生物污染。比起批量方法，這些故障的后果對于持續(xù)方法而言更是相當(dāng)大。對于化合物小規(guī)模生產(chǎn)而言，持續(xù)方法的生產(chǎn)率的提高很少超過與菌株穩(wěn)定性和可靠性有關(guān)的風(fēng)險。然而，對于大規(guī)模生產(chǎn)而言，相比于批量方法，持續(xù)方法的生產(chǎn)率的提高可以產(chǎn)生極大的經(jīng)濟增益。雖然有關(guān)持續(xù)生物方法操作的技術(shù)障礙總是存在，可以通過新陳代謝工程方法來克服菌株穩(wěn)定性問題，該方法通過變更分子途徑來減少或消除負(fù)選擇壓力并且在指數(shù)成長期促進所需生物產(chǎn)品的產(chǎn)生。雙階段發(fā)酵方法本發(fā)明的一個方面包括改善由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的方法，該方法包括提供包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；以及培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。本發(fā)明的另一方面包括從發(fā)酵液的水相中被動地相分離毒副產(chǎn)品的方法，發(fā)酵液是粗碳源和微生物細(xì)胞的混合物，該微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造在所述的微生物細(xì)胞培養(yǎng)物的發(fā)酵中產(chǎn)生生物產(chǎn)品，該方法包括提供包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液，形成發(fā)酵培養(yǎng)物；以及培養(yǎng)所述發(fā)酵培養(yǎng)物來產(chǎn)生所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。本發(fā)明的另一方面包含用于由生物工程細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的試劑盒，該試劑盒包括經(jīng)生物工程改造由碳源產(chǎn)生生物產(chǎn)品的生物工程細(xì)胞的樣品；包含源自生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的粗碳源的發(fā)酵液；與所述發(fā)酵液不混溶的并且能提取在所述生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中形成的毒副產(chǎn)品的疏水性溶劑；以及使用所述生物工程細(xì)胞、發(fā)酵液和疏水性溶劑的發(fā)酵方法的說明書。本發(fā)明另一方面包括由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的持續(xù)發(fā)酵方法，該方法包括提供所述微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物；將包含粗碳源的一定量的發(fā)酵液的連續(xù)流引入所述培養(yǎng)物中；用所述發(fā)酵液使所述培養(yǎng)物發(fā)酵；以及從所述培養(yǎng)物中去除一定量的所述發(fā)酵液的連續(xù)流；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。在本發(fā)明另一方面中，所提供的是通過一種方法由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，該方法包括準(zhǔn)備包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；從培養(yǎng)的發(fā)酵液中回收所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。在本發(fā)明另一方面中，所提供的是由能量驅(qū)動的交通工具，該能量是通過一種方法由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)品的燃燒獲得的，該方法包括制備包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；從培養(yǎng)的發(fā)酵液中回收所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。在一些實施例中，方法也包括用初始量的疏水性溶劑預(yù)處理發(fā)酵液的步驟；以及將所述液從所述疏水性溶劑中分離去除。在一些實施方案中，初始量的疏水性溶劑與所述發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為至多約11(體積體積)的比例混合；從約11到約110，000;從約11到約11，000;從約11到約1100;從約13到約110,000；從約13到約11,000；從約13到約1100；從約110到約110，000;從約110到約11，000;從約110到約1100；從約1100到約110，000；從約1100到約11，000；從約1100到約19，000；從約1100到約18，000；從約1100到約17，000；從約1100到約16，000；從約1100到約15，OOO；從約1100到約14，000；從約1100到約13，000；從約1100到約12，000。優(yōu)選地，體積體積的比例為從約13到約1100的疏水性溶劑發(fā)酵液。普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)的技術(shù)來確定最佳的比例，從而提供足夠的疏水性溶劑來促進毒副產(chǎn)品有效溶解于疏水性溶劑中。粗碳源選自那些已知包含或帶有毒副產(chǎn)品等雜質(zhì)的物質(zhì)。優(yōu)選地，毒副產(chǎn)品是有機副產(chǎn)品，如那些在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的物質(zhì)(例如，纖維素物質(zhì))。在一些實施方案中，毒副產(chǎn)品包含糠醛、5-羥甲基糠醛、脂肪族酸、酚類化合物、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酸、兒茶酚、4-甲基兒茶酚、丁香醛、丁香酸、鄰甲氧基苯酚、香草酸或香草醛。優(yōu)選地，毒副產(chǎn)品包括糠醛或糠醛衍生物，例如5-羥甲基糠醛。疏水性溶劑是針對疏水特性而選擇的溶劑，該疏水特性允許從水性的生物轉(zhuǎn)化液中相分離。普通技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)，可以輕易地挑選提供的方法所使用的疏水性溶劑，允許相分離。在一些實施方案中，疏水性溶劑包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。在一些實施方案中，疏水性溶劑包含十六烷、二十碳十烯(eicosadecene)、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯，C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C160酯、C2C161酯、C2C181酯，或商業(yè)生物柴油。在一些實施方案中，疏水性溶劑可以是與細(xì)胞所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品一樣的化學(xué)品。在一個優(yōu)選的實例中，粗碳源可以是糖漿。正如以下所提供的，可以進行提取式發(fā)酵或雙相發(fā)酵的測試。流速為10，000kg/hr的糖漿流可以與流速為10，000kg/hour的FAME接觸。雜質(zhì)以每個50.5ppm的模式濃度(modelconcentration)存在于糖漿流中。如果一種種類提取大于10%，那么可以認(rèn)為該種類是部分疏水或是疏水的。這些種類是糖漿中所發(fā)現(xiàn)的甘蔗或甜菜汁降解產(chǎn)物的典型化學(xué)物質(zhì)的代表。疏水性種類的一些例證性的實例包括1-乙?；?9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙酰基吡咯烷、2，3-二氫苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、糠醛、呋喃、η-己酸，以及4-羧基苯甲醛。本文所討論的由所提供的工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，是生物衍生性產(chǎn)品，無論作為終產(chǎn)品還是中間產(chǎn)物(或用于進一步加工的反應(yīng)物)均具有商業(yè)價值。本文所提供的生物產(chǎn)品具有疏水特性，并且可以作為疏水性溶劑。生物產(chǎn)品可以包括例如生物燃料、多聚體、有機試劑和其他工業(yè)化學(xué)品等產(chǎn)品。在一些實施方案中，生物產(chǎn)品包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。優(yōu)選地，生物產(chǎn)品是生物燃料。本文所提供的生物質(zhì)是用于產(chǎn)生碳源的起始材料，通常需要處理或轉(zhuǎn)化步驟，以便將生物質(zhì)分解為可用的碳源，例如碳水化合物或糖分子，從而被工程微生物細(xì)胞所利用，其在無需進一步純化而仍然處于自然的或加工的狀態(tài)(粗碳源)。優(yōu)選地，生物質(zhì)包含糖漿、水解的纖維素或水解的半纖維素物質(zhì)。在一些實施方案中，纖維素或半纖維素物質(zhì)包含木材、草、林業(yè)廢棄物或農(nóng)業(yè)殘留物(例如，玉米秸、甘蔗渣、稻草等)。在一些實施方案中，所提供的生物轉(zhuǎn)化方案也可以包括稀釋用于生物轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基來降低毒素濃度的步驟。在一個實例中，可以將培養(yǎng)基稀釋5倍或更多。燃料成分可以優(yōu)化本文所提供的可通過已公開方法生產(chǎn)的生物燃料，來提供用于產(chǎn)生生物燃料的大規(guī)模和商業(yè)可行的方法。優(yōu)選地，該方法是有成本效益的且環(huán)境友好的。在一個實施方案中，生物燃料可以提供可再生的能源，用于柴油機設(shè)備，包括汽車與飛機。生物燃料可以用作能源，無論是作為散裝燃料或者作為其他可用燃料源的成分或添加劑。交通工具本文所提供的交通工具，是那些為了使用生物燃油而制造的交通工具并且是那些為了有效利用生物燃料的改進型的交通工具。該交通工具是由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物燃油燃燒所獲得的能量而供以動力。優(yōu)選地，該生物燃料由工程微生物細(xì)胞直接從粗碳源產(chǎn)生。實施例以下的實施例進一步說明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時，這些實施例只是通過例證的方式給出。根據(jù)以上的討論和這些實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以了解本發(fā)明的基本特征，并且在背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下就可以對本發(fā)明進行多種改變和修改來使它適應(yīng)多種用途和條件。因此，除了本文所展示和所描述的那些實施例外，根據(jù)前面的描述，本發(fā)明的多種修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修改也落入附加的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。以下的實施例包括發(fā)酵方法以及由此產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，該發(fā)酵方法用于使用遺傳工程微生物產(chǎn)生疏水性化合物，例如生物柴油(乙基和甲基酯培養(yǎng)基以及長鏈脂肪酸)、脂肪醇、烯烴和烷烴。一般而言，該方法使用碳水化合物作為原料。這種原料可以來自多種不同的生物材料源，包括例如玉米、甘蔗或植物生物質(zhì)的水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，發(fā)酵方法由基于發(fā)酵產(chǎn)物的生物質(zhì)的預(yù)處理組成。同樣優(yōu)選地，發(fā)酵方法由以發(fā)酵產(chǎn)物作為提取劑進行雙相發(fā)酵。實施例1-發(fā)酵糖產(chǎn)生生物柴油的方法E.coli的遺傳工程菌株LS9-ID1的培養(yǎng)物從冷凍儲存中被轉(zhuǎn)移出來，并且在Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)約3個小時。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到通常用于E.coliM9的已知成分的無機培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基用硫胺素和微量無機物緩沖并補充。將培養(yǎng)物進一步培養(yǎng)并且用于接種帶有50g/L的碳水化合物(葡萄糖、果糖、一些戊糖)的同一發(fā)酵液中。在初始生長之后，用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并且添加10ml/L的甲醇或乙醇來起動生物柴油的生產(chǎn)。葡萄糖通常在24-40小時之內(nèi)被耗盡，同樣地生物柴油生產(chǎn)達(dá)到其峰值。進行發(fā)酵之后，測量0D600值(600nm光密度)、葡萄糖消耗量和酯的產(chǎn)量。該方法可以在搖瓶或發(fā)酵罐中進行。是通過高壓液相層析(HPLC)分析發(fā)酵過程的葡萄糖消耗。根據(jù)本領(lǐng)域通常用于一些糖和有機酸的方法進行HPLC分析，該方法包括以下條件帶有折射率檢測器的AgilentHPLC1200系列；柱子AminexHPX_87H，300mmX7.8匪；柱子溫度35°C；流動相0.OlMH2SO4(水性的)；流速0.6mL/min；注射體積20μL。通過氣相層析和火焰電離檢測儀(GC-FID)，分析脂肪酸甲基和乙基酯的產(chǎn)生。用乙酸乙酯以1lvol/vol的比例從發(fā)酵液中提取樣品。在強力渦旋之后，收集樣品并且通過氣相層析(GC)分析有機相。分析條件如下儀器TraceGCUltra；ThermoElectronCorporation的火焰電離檢測儀(FID)；柱子ThermoElectronCorporation^DB-I(1%二苯基硅氧烷；99%二甲基硅氧烷)COlUFM1/0.1/501DET，相pH5，F(xiàn)T:0.4μm，長度5m,內(nèi)徑(id):0.Imm；入口條件250°C不分流法，所用的3.8minl/25分流方法取決于分流流速為75ml/min的樣品濃度；運載氣體，流速氦，3.Oml/min；阻遏溫度330°C；爐溫在50°C維持0.5分鐘；IOO0C/分鐘至3300C；330°C維持0.5分鐘；檢測器溫度:300°C注射體積2μL；運行時間/流速6.3min/3.Oml/min(不分流法)，3.8min/l.5ml/min(分流1/25方法)，3.04min/l.2ml/min(分流1/50方法)。棚列2-爐纖Φ紐禾早果搬已分別檢測半纖維素和纖維素水解產(chǎn)物中許多化合物對微生物菌株的毒性。在Ε.coli的情況下，毒性與毒素的疏水性有關(guān)。評估了幾種這類化合物對某些微生物菌株生長的作用。通過類似于所述實施例1中所述的方法，但不誘導(dǎo)及添加乙醇，在搖瓶中進行測試ο如文獻(xiàn)所報道添加MIC(最小的抑制濃度來完全抑制生長)的毒素并且在細(xì)胞生長之后測量OD值。也測試其他濃度來測定所觀測的效果的范圍。結(jié)果呈現(xiàn)于表1和表2。將抑制水平報道為不存在毒素(對照)的生長減去存在毒素的生長與對照中的生長之比。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表2農(nóng)度__%生長抑制__g/L___鄰甲綠笨驗_1.00__0__0_1.50__600__4L7_2.00___833_3.00_18.5__100_實施例3-提取式發(fā)酵為了使用E.coli工程菌株LS9-ID1產(chǎn)生的產(chǎn)物測定實施提取式發(fā)酵的能力，提高在毒素的存在下發(fā)酵的性能，采用類似于所述實施例1中所述的方法進行發(fā)酵。準(zhǔn)備兩組雙份搖瓶，帶有用于測試的不同濃度的毒素。一組用作對照，其包括不帶提取劑即疏水性溶劑的毒素。在第二組中，每3體積發(fā)酵液以1體積溶劑的比例添加提取劑。隨后接種搖瓶，并且在37°C下，培養(yǎng)在振動的搖床中。當(dāng)OD600值達(dá)到1時，添加ImMIPTG和20ml/L甲醇，誘導(dǎo)培養(yǎng)物。在24小時時測量細(xì)胞的生長和脂肪酸甲基酯(FAME)的產(chǎn)量。在不含疏水性溶劑的培養(yǎng)物(對照)中，直接在發(fā)酵液中測量OD值。在含溶劑的搖瓶中，OD值的測量有干擾，為了排除這一問題，離心液體培養(yǎng)基并且將細(xì)胞顆粒重懸浮于相同體積的蒸餾水中。在該懸浮液中測量OD值。為了分析FAME產(chǎn)量，將0.5ml的液體培養(yǎng)基與0.5ml的乙酸乙酯混合。通過氣相層析分析有機相。在含溶劑的樣品中，進行了另外的稀釋。用油酸乙酯(C2:C18酯，或C2:C18)作為代表生物柴油的溶劑來測試所有的毒素。每種毒素所得的結(jié)果顯示于表3-7。將生長和FAME產(chǎn)量報道為對照條件(不添加毒素)的百分比。每個結(jié)果是雙份實驗的平均值。表3糠酵糠搭__%生長__%FAME滴冬_濃度(g/L)__無溶劑__含C2;C18無溶劑__含C2:C180.0__100.0__100.0__100.0__100.0_1.5__400__7L9__35^__72J_3.0__2L5__53^_[4^__432_表4丁香酵<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表5:4-羥基苯甲酵<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表6:5-羥甲基糠酵<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表7鄰甲氧基苯酚<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例4-不同溶劑的測試使用其他溶劑進行類似于所述實施例3所示的測試，這些溶劑也可以由遺傳工程微生物產(chǎn)生。在細(xì)胞生長過程中獲益并且并且產(chǎn)物濃度基于在溶劑與發(fā)酵液間每種毒素分離的差異。測試了溶劑月桂酸甲酯(C1:C12酯，或C1:C12)、十六烷(烷烴)、二十碳十烯(eicosadecene，烯烴)以及商業(yè)生物柴油。結(jié)果呈現(xiàn)于表8_11。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表9<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表11<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例5-提取物和發(fā)酵物的分離在發(fā)酵之前可以處理原料，去除毒素。基于這一目的，在最初的純化步驟(例如離心分離)之后但在任何濾清或結(jié)束步驟之前使用生物產(chǎn)品將是有可能的。可以將含有原料的糖與批量或持續(xù)逆流模式的溶劑相接觸。提取之后，可以通過傾析或離心從溶劑中將原料(水相)分離出來。這一方法對于去除毒素尤其有用，該毒素不同于發(fā)酵中所需的那些條件下能更有效地分離進入有機溶劑。例如，當(dāng)生物質(zhì)水解產(chǎn)物中的弱有機酸(羥基苯甲酸的、香草酸的、丁香酸的)在低PH值下不離子化時，它們能更好地分離到有機溶劑中。這種低ρΗ值可能對細(xì)胞并不是有利的，所以在發(fā)酵之前優(yōu)選去除毒素。生物質(zhì)水解產(chǎn)物通常是酸性的，所以它們可以被預(yù)處理而不需要其他調(diào)節(jié)。進行類似于所述實施例所述的測試。制備發(fā)酵培養(yǎng)基并且摻入所需濃度的毒素。月桂酸甲酯用作代表生物柴油的溶劑。將其以13體積體積的比例添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中。將溶劑和液體培養(yǎng)基在37°C下充分混合60分鐘。將水層輕輕倒入分離漏斗，并收集。隨后用LS9-ID1接種產(chǎn)生的培養(yǎng)基，并且其生長與未處理的含有毒素的相似培養(yǎng)進行比對。結(jié)果呈現(xiàn)于表12中。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>權(quán)利要求改善由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的方法，包括提供包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；以及培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。2.如權(quán)利要求1的方法，還包括用初始量的疏水性溶劑預(yù)處理所述發(fā)酵液；以及從所述疏水性溶劑中去除所述發(fā)酵液。3.如權(quán)利要求2的方法，其中所述預(yù)處理步驟包括將所述初始量的疏水性溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液至多約11(體積體積)的比例混合。4.如權(quán)利要求2的方法，其中所述預(yù)處理步驟包括將所述初始量的疏水性溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為約13至約1100(體積體積)的比例混合。5.如權(quán)利要求1的方法，還包括將一定量的疏水性溶劑引入所提供的發(fā)酵液中。6.如權(quán)利要求5的方法，其中引入的一定量的疏水性溶劑是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為至多11(體積體積)。7.如權(quán)利要求5的方法，其中引入的一定量的疏水性溶劑是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為從約13至約1100(體積體積)。8.如權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述的毒副產(chǎn)品包含以下至少一種糠醛、5_羥甲基糠醛、脂肪族酸、酚類化合物、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酸、兒茶酚、4-甲基兒茶酚、丁香醛、丁香酸、鄰甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙?；?9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙?；量┩?、2，3-二氫苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-furnine,2,5-二甲基吡嗪、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃；η-己酸，或4-羧基苯甲醛。9.如權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述的疏水性溶劑包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。10.如權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述的疏水性溶劑包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯或生物柴油。11.如權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述的生物產(chǎn)品包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。12.如權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述的生物產(chǎn)品包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯或生物柴油。13.如權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其中所述的生物產(chǎn)品是生物燃料。14.如權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中所述的疏水性溶劑和所述的生物產(chǎn)品是相似的分子。15.如權(quán)利要求1-14中任一項的方法，其中所述的粗碳源源自生物質(zhì)。16.如權(quán)利要求15的方法，其中所述的粗碳源包含水解的纖維素、水解的半纖維素物質(zhì)或糖漿。17.如權(quán)利要求16的方法，其中所述的纖維素或半纖維素物質(zhì)包含木材、草、林業(yè)廢棄物、農(nóng)業(yè)殘留物或工農(nóng)業(yè)殘留物。18.如權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中所述工程微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造，提高編碼酶的基因的表達(dá)，所述酶選自硫酯酶、酰基輔酶A合酶和酯合酶。19.如權(quán)利要求18的方法，其中所述工程微生物細(xì)胞中編碼?；o酶A合酶的基因衰減或缺失。20.如權(quán)利要求19的方法，其中所述編碼?；o酶A合酶的基因是fadE。21.從發(fā)酵液的水相中被動地相分離毒副產(chǎn)品的方法，所述發(fā)酵液是粗碳源和微生物細(xì)胞的混合物，所述微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造在所述微生物細(xì)胞培養(yǎng)物的發(fā)酵中產(chǎn)生生物產(chǎn)品，所述方法包括提供包含粗碳源的所述發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液來形成發(fā)酵培養(yǎng)物；以及培養(yǎng)所述發(fā)酵培養(yǎng)物來產(chǎn)生所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。22.如權(quán)利要求21的方法，還包括用初始量的疏水性溶劑預(yù)處理所述發(fā)酵液來產(chǎn)生預(yù)處理的發(fā)酵液；以及從所述疏水性溶劑中去除所述發(fā)酵液。23.如權(quán)利要求22的方法，其中所述的預(yù)處理步驟包括將所述的初始量疏水溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為至多約11(體積體積)的比例混合。24.如權(quán)利要求22的方法，其中所述的預(yù)處理步驟包括將所述的初始量疏水溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為從約13至約1100(體積體積)的比例混合。25.如權(quán)利要求21的方法，還包括將一定量的疏水性溶劑引入所述發(fā)酵液中。26.如權(quán)利要求25的方法，其中引入的一定量的疏水性溶劑是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為至多11(體積體積)。27.如權(quán)利要求25的方法，其中引入的一定量的疏水性溶劑是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為從約13至約1100(體積體積)。28.如權(quán)利要求21-27中任一項的方法，其中所述的毒副產(chǎn)品包括以下至少一種糠醛、5-羥甲基糠醛、脂肪族酸、酚類化合物、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酸、兒茶酚、4-甲基兒茶酚、丁香醛、丁香酸、鄰甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙?；量┩?、2，3-二氫苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-furnine,2，5-二甲基吡嗪、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃、η-己酸，或4-羧基苯甲醛。29.如權(quán)利要求21-27中任一項的方法，其中所述的疏水性溶劑包含烷烴、酯、烯烴、月旨肪酸、脂肪醇、醛或酮。30.如權(quán)利要求21-27中任一項的方法，其中所述的疏水性溶劑包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯，C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C160酯、C1C161酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。31.如權(quán)利要求21-30中任一項的方法，其中所述的生物產(chǎn)品包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。32.如權(quán)利要求21-31中任一項的方法，其中所述的生物產(chǎn)品包括十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。33.如權(quán)利要求21-32中任一項的方法，其中所述的生物產(chǎn)品是生物燃料。34.如權(quán)利要求21-33中任一項的方法，其中所述的疏水性溶劑和所述的生物產(chǎn)品是相似的分子。35.如權(quán)利要求21-34中任一項的方法，其中所述的粗碳源源自生物質(zhì)。36.如權(quán)利要求35的方法，其中所述的粗碳源包含水解的纖維素，水解的半纖維素物質(zhì)或糖漿。37.如權(quán)利要求36的方法，其中所述的纖維素或半纖維素物質(zhì)包含木材、草、林業(yè)廢棄物、農(nóng)業(yè)殘留物或工農(nóng)業(yè)殘留物。38.如權(quán)利要求21-37中任一項的方法，其中所述的工程微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造提高編碼酶的基因的表達(dá)，所述酶選自硫酯酶、?；o酶A合酶和酯合酶。39.如權(quán)利要求38的方法，其中所述的工程微生物細(xì)胞中編碼酰基輔酶A合酶的基因衰減或缺失。40.如權(quán)利要求39的方法，其中所述的編碼?；o酶A合酶的基因是fadE。41.用于由生物工程細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的試劑盒，包含經(jīng)生物工程改造從而由碳源產(chǎn)生生物產(chǎn)品的生物工程細(xì)胞的樣品；包含源自生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的粗碳源的發(fā)酵液；與所述發(fā)酵液不混溶并且能提取在所述生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中形成的毒副產(chǎn)品的疏水性溶劑；以及使用所述生物工程細(xì)胞樣品、發(fā)酵液和疏水性溶劑的發(fā)酵方法的說明書。42.如權(quán)利要求41的試劑盒，還包括用于培養(yǎng)所述的生物工程細(xì)胞培養(yǎng)物的設(shè)備。43.如權(quán)利要求41-42中任一項的試劑盒，其中所述的疏水性溶劑和所述的發(fā)酵液是疏水性溶劑發(fā)酵液的體積比為至多11(V01vol)。44.如權(quán)利要求41-43中任一項的試劑盒，其中所述的疏水性溶劑包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。45.如權(quán)利要求41-44中任一項的試劑盒，其中所述的疏水性溶劑包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或商業(yè)生物柴油。46.如權(quán)利要求41-45中任一項的試劑盒，其中所述的生物產(chǎn)品包含烷烴、酯、烯烴、月旨肪酸、脂肪醇、醛或酮。47.如權(quán)利要求41-46中任一項的試劑盒，其中所述的生物產(chǎn)品包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。48.如權(quán)利要求41-47中任一項的試劑盒，其中所述的生物產(chǎn)品是生物燃料。49.如權(quán)利要求41-48中任一項的試劑盒，其中所述的疏水性溶劑和所述的生物產(chǎn)品是相似的分子。50.如權(quán)利要求41-49中任一項的試劑盒，其中所述的粗碳源源自生物質(zhì)。51.如權(quán)利要求50的試劑盒，其中所述的粗碳源包含水解的纖維素、水解的半纖維素物質(zhì)或糖漿。52.如權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述的纖維素或半纖維素物質(zhì)包含木材、草、林業(yè)廢棄物、農(nóng)業(yè)殘留物或工農(nóng)業(yè)殘留物。53.如權(quán)利要求41-52中任一項的試劑盒，其中所述的工程微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造提高編碼酶的基因的表達(dá)，所述酶選自硫酯酶、?；o酶A合酶和酯合酶。54.如權(quán)利要求53的試劑盒，其中所述的工程微生物細(xì)胞中編碼酰基輔酶A合酶的基因衰減或缺失。55.如權(quán)利要求54的試劑盒，其中所述編碼?；o酶A合酶的基因是fadE。56.用于由生物工程細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的持續(xù)發(fā)酵方法，包括提供所述的微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物；將包含粗碳源的一定量的發(fā)酵液的連續(xù)流引入所述培養(yǎng)物中；用所述發(fā)酵液使所述培養(yǎng)物發(fā)酵；以及從所述培養(yǎng)物中去除一定量的所述發(fā)酵液的連續(xù)流；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述的粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。57.如權(quán)利要求56的持續(xù)發(fā)酵方法，還包括用初始量的疏水性溶劑預(yù)處理所述的發(fā)酵液；以及從所述疏水性溶劑中去除所述發(fā)酵液。58.如權(quán)利要求57的持續(xù)發(fā)酵方法，包括將所述的初始量疏水溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為至多約11(體積體積)的比例混合。59.如權(quán)利要求58的持續(xù)發(fā)酵方法，包括將所述的初始量疏水溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為從約13至約1100(體積體積)的比例混合。60.如權(quán)利要求56的持續(xù)發(fā)酵方法，還包括將一定量的疏水性溶劑引入所述發(fā)酵液中。61.如權(quán)利要求60的持續(xù)發(fā)酵方法，其中引入的一定量的疏水性溶劑是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為至多11(體積體積)。62.如權(quán)利要求60的持續(xù)發(fā)酵方法，其中引入的一定量的疏水性溶劑是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為從約13至約1100(體積體積)。63.如權(quán)利要求56-62中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的毒副產(chǎn)品包含以下至少一種糠醛、5-羥甲基糠醛、脂肪族酸、酚類化合物、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酸、兒茶酚、4-甲基兒茶酚、丁香醛、丁香酸、鄰甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙?；量┩椤?，3_二氫苯并呋喃、2，5_二甲基-4-羥基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯酮、5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃、η-己酸，或4-羧基苯甲醛。64.如權(quán)利要求56-63中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的疏水性溶劑包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。65.如權(quán)利要求56-64中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的疏水性溶劑包含月桂酸甲酯、十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或商業(yè)生物柴油。66.如權(quán)利要求56-65中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的生物產(chǎn)品包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。67.如權(quán)利要求56-66中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的生物產(chǎn)品包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。68.如權(quán)利要求56-67中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的生物產(chǎn)品是生物燃料。69.如權(quán)利要求56-68中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的疏水性溶劑和所述的生物產(chǎn)品是相似的分子。70.如權(quán)利要求56-69中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的粗碳源源自生物質(zhì)。71.如權(quán)利要求70的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的粗碳源包含水解的纖維素、水解的半纖維素物質(zhì)或糖漿。72.如權(quán)利要求71的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的纖維素或半纖維素物質(zhì)包含木材、草、林業(yè)廢棄物、農(nóng)業(yè)殘留物或工農(nóng)業(yè)殘留物。73.如權(quán)利要求56-72中任一項的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的工程微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造提高編碼酶的基因的表達(dá)，所述酶選自硫酯酶、?；o酶A合酶和酯合酶。74.如權(quán)利要求73的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的工程微生物細(xì)胞中編碼酰基輔酶A合酶的基因衰減或缺失。75.如權(quán)利要求74的持續(xù)發(fā)酵方法，其中所述的編碼?；o酶A合酶的基因是fadE。76.通過一種方法由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，所述方法包括制備包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；從培養(yǎng)的發(fā)酵液中回收所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。77.如權(quán)利要求76的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，所述的方法還包括用初始量的疏水性溶劑預(yù)處理所述發(fā)酵液；以及從所述疏水性溶劑中去除所述發(fā)酵液。78.如權(quán)利要求77的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述預(yù)處理步驟包括將所述的初始量疏水溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為至多約11(體積體積)的比例混合。79.如權(quán)利要求78的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述預(yù)處理步驟包括將所述的初始量疏水溶劑與所述的發(fā)酵液以疏水性溶劑發(fā)酵液為從約13至約1100(體積體積)的比例混合。80.如權(quán)利要求76的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述方法還包括將一定量的疏水性溶劑引入所述發(fā)酵液中。81.如權(quán)利要求80的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中引入的疏水性溶劑的量是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為至多11(體積體積)。82.如權(quán)利要求80的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中引入的疏水性溶劑的量是疏水性溶劑發(fā)酵液的比例為從約13至約1100(體積體積)。83.如權(quán)利要求76-82中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述回收步驟包括將所述生物產(chǎn)品合并到所述發(fā)酵液中。84.如權(quán)利要求76-83中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，所述方法還包括純化所回收的生物產(chǎn)品。85.如權(quán)利要求84的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的純化步驟包括離心、過濾、或溶劑提取。86.如權(quán)利要求84-85中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，所述方法還包括濾清所述的純化的生物產(chǎn)品。87.如權(quán)利要求86的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的濾清步驟包括去離子化、吸附、脫色(decolizing)或干燥。88.如權(quán)利要求76-87任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的毒副產(chǎn)品包含以下至少一種糠醛、5-羥甲基糠醛、脂肪族酸、酚類化合物、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸、對苯二酸、兒茶酚、4-甲基兒茶酚、丁香醛、丁香酸、鄰甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙?；量┩?、2，3-二氫苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羥基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯酮、5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃、η-己酸，或4-羧基苯甲醛。89.如權(quán)利要求76-88中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的疏水性溶劑包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。90.如權(quán)利要求76-89中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的疏水性溶劑包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或商業(yè)生物柴油。91.如權(quán)利要求76-90中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的生物產(chǎn)包含烷烴、酯、烯烴、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。92.如權(quán)利要求76-91中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的生物產(chǎn)品包括十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C160酯、C1C161酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。93.如權(quán)利要求76-92中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的生物產(chǎn)品是生物燃料。94.如權(quán)利要求76-93中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的疏水性溶劑和所述的生物產(chǎn)品是相似的分子。95.如任一權(quán)利要求76-94中任一項的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的粗碳源源自生物質(zhì)。96.如權(quán)利要求95的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的粗碳源包含水解的纖維素、水解的半纖維素物質(zhì)或糖漿。97.如權(quán)利要求96的方法所產(chǎn)生的生物產(chǎn)品，其中所述的纖維素或半纖維素物質(zhì)包含木材、草、林業(yè)廢棄物、農(nóng)業(yè)殘留物或工農(nóng)業(yè)殘留物。98.由能量驅(qū)動的交通工具，該能量是通過一種方法由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生的生物產(chǎn)品的燃燒獲得的，該方法包括制備包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；從培養(yǎng)的發(fā)酵液中回收所述生物產(chǎn)品；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。99.如權(quán)利要求98的交通工具，所述的方法還包括用初始量的疏水性溶劑預(yù)處理所述發(fā)酵液；以及從所述疏水性溶劑中去除所述發(fā)酵液。100.如權(quán)利要求98-99中任一項的方法，其中所述的工程微生物細(xì)胞經(jīng)人工改造提高編碼酶的基因的表達(dá)，所述酶選自硫酯酶、?；o酶A合酶和酯合酶。101.如權(quán)利要求100的方法，其中所述的工程微生物細(xì)胞中編碼?；o酶A合酶的基因衰減或缺失。102.如權(quán)利要求101的方法，其中所述的編碼?；o酶A合酶的基因是fadE。全文摘要本發(fā)明提供了生物產(chǎn)品和改善由工程微生物細(xì)胞產(chǎn)生生物產(chǎn)品的的方法，該方法包括提供包含粗碳源的發(fā)酵液；用所述微生物細(xì)胞接種所述發(fā)酵液；以及培養(yǎng)接種的發(fā)酵液；其中所述生物產(chǎn)品是與所述發(fā)酵液不混溶的疏水性溶劑，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副產(chǎn)品在所述疏水性溶劑中是可溶的。還提供了用于實施改善生物產(chǎn)品產(chǎn)生的方法的試劑盒。文檔編號C12P7/64GK101802208SQ200880106604公開日2010年8月11日申請日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日發(fā)明者斯蒂芬·B·德爾卡德耶,莫尼卡·巴蒂亞,費爾南多·桑切斯-瑞拉,邁克爾·C·m·科克雷姆申請人:Ls9公司