專利名稱：新的氧化酶基因及使用該基因生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的氧化酶基因及利用該基因生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的新方法。
背景技術(shù)：
在Giovanna De Luca等的用于生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的化學(xué)方法中，通過(guò)在存在 用于使質(zhì)子受體脫水的堿的條件下使作為起始材料的色氨酸與吡啶醛反應(yīng)，以50-62%產(chǎn) 率獲得了 3-吲哚-丙酮酸(參見(jiàn)JP Sho-62-501912[專利文件1]，國(guó)際公開87/00169小 冊(cè)子[專利文件2])。在此方法中，所需要的堿和吡啶醛價(jià)格昂貴，而且產(chǎn)率低。結(jié)果， 其生產(chǎn)成本似乎很高。通過(guò)使用吲哚和3-溴-2-肟基丙酸乙酯(ethyl-3-bromopyruvate ester oxime)作為原料進(jìn)行的縮合反應(yīng)及隨后進(jìn)行的酸水解，Politi Vincenzo等以64%產(chǎn) 率獲得了 3-吲哚-丙酮酸(參見(jiàn)歐洲專利申請(qǐng)公開No.421946[專利文件3])。在此方法 中，需要使用硅膠進(jìn)行的純化步驟，產(chǎn)率低，原料昂貴，而且工業(yè)生產(chǎn)的成本很高。另一方面，作為生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的酶促方法，使用氨基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的方法 是已知的(參加下文反應(yīng)式1)。(反應(yīng)式1)
氣基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)報(bào)告了如下的一種方法，其中通過(guò)容許源自麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的L-色氨酸(L-Trp)氨基轉(zhuǎn)移酶作用于L-Trp而自40mM L-色氨酸和80mM 2_酮戊二酸生成3-吲哚-丙酮酸，并通過(guò)離子交換樹脂純化以實(shí)現(xiàn)72%的產(chǎn)率(參見(jiàn) Bobe Ruediger等，東德專利DD 297190[專利文件4])，還已經(jīng)報(bào)告了如下的一種方法， 其中容許天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶作用于L-Trp和2-酮戊二酸以生成3-吲哚-丙酮酸，然 后通過(guò)用石油醚萃取反應(yīng)液和通過(guò)柱層析進(jìn)行的分級(jí)進(jìn)行純化，并收集級(jí)分(參見(jiàn)Mario Materazzi 等，JPSho_59-95894_A[專利文件 5])。國(guó)際公開 No.2003/091396 小冊(cè)子[專 利文件6]和美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2005/0282260[專利文件7]記載了由源自大腸桿菌 (Escherichia coli)的aspC基因和tyrB基因編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶。在使用氨基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行的 這些方法中，產(chǎn)率是低的，需要作為氨基受體的酮酸(如2-酮戊二酸)作為L(zhǎng)-Trp之外 的原料，而且以與待產(chǎn)生的3-吲哚-丙酮酸等摩爾的量生成與所存在的氨基受體對(duì)應(yīng)的 一種氨基酸作為副產(chǎn)物。此外，為了提高產(chǎn)率，向反應(yīng)體系添加相對(duì)于L-Trp過(guò)量的酮 酸。如此，在反應(yīng)后剩余未反應(yīng)的酮酸。由于這些原因，為了自反應(yīng)液收集目標(biāo)3-吲 哚-丙酮酸，需要使用離子交換樹脂進(jìn)行的純化步驟。如此，操作是復(fù)雜的，而且成本 是高的。作為自L-Trp生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的方法，使用L-氨基酸氧化酶的方法也是已知的。然而，在這點(diǎn)上，3-吲哚-丙酮酸被L-氨基酸氧化酶氧化色氨酸(參見(jiàn)下文反 應(yīng)式2)時(shí)作為副產(chǎn)物生成的過(guò)氧化氫分解成吲哚乙酸(參見(jiàn)下文反應(yīng)式3)。如此，產(chǎn)生 了通過(guò)向反應(yīng)體系添加過(guò)氧化氫酶來(lái)分解過(guò)氧化氫(參見(jiàn)下文反應(yīng)式4)的方法(參見(jiàn)美 國(guó)專利No.5,002,963，授予De Luca等，1991[專利文件8])。(反應(yīng)式2)
權(quán)利要求
1.選自如下(a) (e)的多核苷酸(a)編碼具有SEQID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(b)編碼具有在SEQID NO: 2所示氨基酸序列中取代、缺失和/或插入一個(gè)或數(shù)個(gè) 氨基酸而得到的氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(C)編碼具有與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列有90%或更高的同源性的氨基酸序列 且具有氧化酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(d)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列中核苷酸編號(hào)第61-1476位的核苷酸序列的 多核苷酸；(e)與SEQID NO 1所示核苷酸序列中核苷酸編號(hào)第61-1476位的核苷酸序列的互 補(bǔ)核苷酸序列或與能夠由該序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有氧化酶活性 的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中所述嚴(yán)格條件是以相當(dāng)于1XSSC和0.1 % SDS 的鹽濃度于60°C進(jìn)行清洗的條件。
3.—種重組多核苷酸，其具有如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸。
4.一種轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入了如權(quán)利要求3所述的重組多核苷酸。
5.—種生產(chǎn)氧化酶的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體， 從而在該培養(yǎng)基和/或轉(zhuǎn)化體中積累氧化酶。
6.一種生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的方法，其包括在如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體和/或其 培養(yǎng)物的存在下將色氨酸轉(zhuǎn)變成3-吲哚-丙酮酸的步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向?qū)⑸彼徂D(zhuǎn)變成3-吲 哚_丙酮酸的反應(yīng)體系中添加超氧化物歧化酶。
8.如權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向?qū)⑸彼徂D(zhuǎn)變成3-吲 哚_丙酮酸的反應(yīng)體系中添加表達(dá)超氧化物歧化酶的轉(zhuǎn)化體和/或其培養(yǎng)物。
9.如權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)3-吲哚-丙酮酸的方法，其中所述培養(yǎng)物是通過(guò)破裂表 達(dá)所述超氧化物歧化酶的所述轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞膜而獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供了實(shí)現(xiàn)3-吲哚-丙酮酸的節(jié)約且便利生產(chǎn)的手段。使用具有限定堿基序列的多核苷酸構(gòu)建了轉(zhuǎn)化體，該限定堿基序列編碼具有氧化酶活性的蛋白質(zhì)。然后，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)此轉(zhuǎn)化體，如此通過(guò)在培養(yǎng)基和/或轉(zhuǎn)化體中積累氧化酶而生成氧化酶。另外，在存在上文所述轉(zhuǎn)化體和/或其培養(yǎng)物的條件下將色氨酸轉(zhuǎn)變成3-吲哚-丙酮酸，由此生成3-吲哚丙酮酸。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102027117SQ20088010414
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2008年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日
發(fā)明者原誠(chéng)一, 杉山雅一, 橫關(guān)健三, 渡部乙比古, 田場(chǎng)登志希, 鈴木俊一, 高倉(cāng)康彰 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社