一種馬兜鈴酸a快速檢測(cè)卡及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種馬兜鈴酸A快速檢測(cè)卡及其檢測(cè)方法，是一種檢測(cè)馬兜鈴酸A的檢測(cè)器具，屬于馬兜鈴酸A檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]馬兜鈴酸類化合物是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物特有的一類硝基菲類化合物，包括馬兜鈴酸A、B、C和D等。在我國(guó)作為藥用的馬兜鈴科馬兜鈴屬植物包括馬兜鈴、關(guān)木通、廣防己、朱砂蓮、大葉馬兜鈴、漢中防己、尋骨鳳等，這些中藥含有馬兜鈴酸及其硝基菲類有機(jī)酸衍生物或馬兜鈴內(nèi)酰胺成分。早期發(fā)現(xiàn)此類化合物可以抑制腫瘤細(xì)胞，后又發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛、消炎、祛痰、利尿、調(diào)節(jié)血壓等作用以及可預(yù)防化、放療引起的白細(xì)胞減少，因此此類中藥在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。
[0003]近年來(lái)，馬兜鈴酸的腎毒性已引起廣泛關(guān)注，各國(guó)紛紛對(duì)含馬兜鈴酸的中藥采取管制及限制措施。研宄表明馬兜鈴酸類化合物的毒性主要由馬兜鈴酸A或其代謝物馬兜鈴內(nèi)酰胺所致。因此，在檢測(cè)馬兜鈴酸時(shí)，常選擇馬兜鈴酸A為指標(biāo)性成分。目前，檢測(cè)馬兜鈴酸的方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法及酶聯(lián)免疫分析法等。薄層色譜法和紫外分光光度法靈敏度較低；高效液相色譜法靈敏度較高、測(cè)定準(zhǔn)確，是目前測(cè)定馬兜鈴酸最常用的方法，但儀器設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)技能要求高。例如:
[0004]對(duì)比文件CN102579961A公開(kāi)了一種消腫止痛酊中馬兜鈴酸A的質(zhì)量控制方法，該對(duì)比文件是運(yùn)用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0005]對(duì)比文件公開(kāi)了 CN103063799A公開(kāi)了一種龍膽瀉肝顆粒有效成分的檢測(cè)方法，通過(guò)高效液相色譜儀對(duì)馬兜鈴酸A的含量進(jìn)行檢測(cè)，更有利于降低其毒副作用。
[0006]因此克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，建立一種準(zhǔn)確可靠又快速方便的檢測(cè)食品中馬兜鈴酸A的分析方法是非常必要的。
[0007]本發(fā)明擬發(fā)明一種基于小分子物質(zhì)馬兜鈴酸A偶聯(lián)蛋白質(zhì)后而具有抗原性的免疫學(xué)檢測(cè)方法，采取免疫學(xué)競(jìng)爭(zhēng)法的原理，結(jié)合膠體金(或乳膠顆粒)標(biāo)記技術(shù)和免疫層析法設(shè)計(jì)的一種快速檢測(cè)試劑，可快速特異地檢測(cè)中藥材或中成藥中的馬兜鈴酸A。根據(jù)檢測(cè)卡樣品檢測(cè)線(T)和質(zhì)控線(C)的有無(wú)顯色來(lái)判定樣品中的馬兜鈴酸A含量。反應(yīng)是利用馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物抗原性而建立的一種檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可避免其它檢測(cè)方法的假陽(yáng)性導(dǎo)致的誤檢問(wèn)題。同時(shí)檢測(cè)卡操作簡(jiǎn)單快速，無(wú)需特殊的儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)操作。由于樣本量需要少、簡(jiǎn)便快速，適用于大量樣本的篩查。結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，準(zhǔn)確率大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種能快速檢測(cè)馬兜鈴酸A的檢測(cè)器具，直接應(yīng)用免疫學(xué)的方法檢測(cè)中藥材或中成藥中馬兜鈴酸A的含量，克服現(xiàn)有色譜法檢測(cè)的操作繁瑣等缺點(diǎn)，建立基于免疫學(xué)特異性的檢測(cè)方法。
[0009]為解決本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題，所采用的技術(shù)方案如下:
[0010]一種馬兜鈴酸A快速檢測(cè)卡包括在長(zhǎng)條扁平薄殼狀的檢測(cè)卡外殼和設(shè)置在外殼中的測(cè)試條；所述檢測(cè)卡外殼表面有檢測(cè)窗孔和加樣孔；所述測(cè)試條是多層結(jié)構(gòu)的窄條薄片，由支承背板上通過(guò)不干膠在其上依次粘貼樣品墊、膠體金膜、硝酸纖維素膜、和吸水膜所組成；所述支承背板中部疊置粘貼硝酸纖維素膜，所述支承背板一端疊置粘貼吸水膜，另一端疊置粘貼樣品墊，所述吸水膜內(nèi)端與所述樣品墊內(nèi)端各自分別與硝酸纖維素膜搭接，在所述樣品墊與硝酸纖維素膜的搭接部，兩者之間夾置粘貼一段膠體金膜；所述膠體金膜為抗馬兜鈴酸A抗體膠體金標(biāo)記的玻璃纖維膜；所述硝酸纖維素膜上依次設(shè)有一條檢測(cè)帶和一條質(zhì)控帶，所述檢測(cè)帶為含馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的檢測(cè)帶；所述質(zhì)控帶為含抗鼠抗體或抗兔抗體的質(zhì)控帶；所述測(cè)試條置入檢測(cè)卡外殼內(nèi)，所述樣品墊正對(duì)加樣孔，所述硝酸纖維素膜正對(duì)檢測(cè)窗孔。
[0011]所述膠體金膜也可以為乳膠顆粒膜，所述乳膠顆粒膜為含抗馬兜鈴酸A抗體乳膠顆粒標(biāo)記的玻璃纖維膜。
[0012]優(yōu)選地，所述檢測(cè)卡外殼由殼蓋與殼座兩半聯(lián)接構(gòu)成，所述檢測(cè)窗孔和加樣孔開(kāi)設(shè)在所述檢測(cè)卡外殼殼蓋上。
[0013]優(yōu)選地，所述長(zhǎng)條扁平薄殼狀的檢測(cè)卡外殼由長(zhǎng)70mm，寬20mm，厚5mm，薄殼壁厚Imm的工程塑料制成。
[0014]優(yōu)選地，所述測(cè)試條片長(zhǎng)60mm，片寬4mm，厚度2.5mm。
[0015]優(yōu)選地，所述支承背板，為聚氯乙稀塑料薄片，厚約0.5mm，長(zhǎng)60mm，寬4mm。
[0016]優(yōu)選地，所述樣品墊為吸水玻璃纖維膜，厚0.5-0.8mm，長(zhǎng)20mm，寬4臟。
[0017]優(yōu)選地，所述膠體金膜厚0.5-0.8mm,長(zhǎng)5mm，寬4mm。
[0018]優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜厚0.5mm，長(zhǎng)20_25mm，寬4mm ;所述檢測(cè)帶和質(zhì)控帶在所述硝酸纖維素膜上橫向間隔開(kāi)排列。
[0019]優(yōu)選地，所述吸水膜為吸水紙，厚0.5-0.8mm，長(zhǎng)16_20mm，寬4臟。
[0020]優(yōu)選地，所述膠體金膜、樣品墊及吸水膜與所述硝酸纖維素膜的搭接長(zhǎng)度為1-2mmο
[0021]本發(fā)明還涉及一種采用上述馬兜鈴酸A快速檢測(cè)卡快速檢測(cè)馬兜鈴酸A的檢測(cè)方法，該方法是應(yīng)用免疫學(xué)的方法直接檢測(cè)待檢樣品中馬兜鈴酸A的含量，待檢樣品為川木通、廣防己、關(guān)木通等中藥材或含有馬兜鈴酸藥材的中成藥，具體處理方法如下:
[0022]①提取樣品液:取川木通、廣防己、天仙藤、青木香、關(guān)木通和馬兜鈴等中藥材磨成細(xì)粉，過(guò)60目篩(0.30mm孔徑)，稱取0.5g ;中成藥如雙香排石顆粒、龍膽瀉肝丸等1.0g于試管中。以5mL甲醇浸提，超聲15min，以4000r/min離心1min取上清液，甲醇重復(fù)提取一次，合并兩次所得溶液，氮?dú)獯蹈?，?0mL無(wú)水甲醇或0.0lmol/LPBS溶解殘余物，即得馬兜鈴酸提取液。
[0023]②檢測(cè)卡檢測(cè):先將所述馬兜鈴酸提取液從所述加樣孔中滴注入所述馬兜鈴酸A快速檢測(cè)卡的樣品墊上，由于虹吸作用原理，帶動(dòng)所述馬兜鈴酸提取液及膠體金膜中所含的抗馬兜鈴酸A抗體膠體金標(biāo)記物一起向所述硝酸纖維素膜擴(kuò)散，5-10分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。
[0024]③檢測(cè)結(jié)果對(duì)比:檢測(cè)卡的主要反應(yīng)是免疫學(xué)的抗原和抗體反應(yīng)，在所述加樣孔中加入馬兜鈴酸提取液后，在硝酸纖維素膜上迀移的膠體金標(biāo)記的抗馬兜鈴酸A抗體，在測(cè)試帶上分別與檢測(cè)帶含馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，以及質(zhì)控帶所含有的抗兔抗體或抗鼠抗體反應(yīng)，形成棕紅色條帶。若樣品中有待檢馬兜鈴酸A存在，當(dāng)樣品加入后即與質(zhì)控帶所含有的抗兔抗體或抗鼠抗體發(fā)生反應(yīng)，而不會(huì)與檢測(cè)帶241所含的馬兜鈴酸A蛋白質(zhì)偶聯(lián)物反應(yīng)，從而不顯色。主要反應(yīng)的結(jié)果有以下3種情況:
[0025]a、當(dāng)檢測(cè)帶和質(zhì)控帶同時(shí)顯現(xiàn)棕紅色印跡帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性，表示被檢測(cè)樣品中馬9?鈴酸A含量未超標(biāo)(< 10 μ g/g)；
[0026]b、當(dāng)檢測(cè)帶不顯示顏色，只有質(zhì)控帶顯現(xiàn)棕紅色印跡，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，表示被檢測(cè)樣品中馬9?鈴酸A含量超標(biāo)(> 10 μ g/g)；
[0027]C、當(dāng)檢測(cè)帶和質(zhì)控帶均不顯色，則表明測(cè)試條已失效。
[0028]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明能快速、特異地檢測(cè)中藥材或中成藥中含有的馬兜鈴酸A，本發(fā)明易于制備且節(jié)省檢測(cè)費(fèi)用，使用方便，檢測(cè)快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說(shuō)明】
[0029]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030]圖1為本發(fā)明馬兜鈴酸A快速檢測(cè)卡外殼及測(cè)試條在外殼內(nèi)的安置示意圖；
[0031]圖2為本發(fā)明的馬兜鈴酸A快速檢測(cè)卡的測(cè)試條結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032]圖3為本發(fā)