專利名稱：刺五加指紋圖譜檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種對天然刺五加藥品的測定方法。
背景技術：
現(xiàn)有的刺五加注射液是由刺五加提取而成的制劑，一九七四年研制成功，一九八三年批準正式生產(chǎn)。經(jīng)多年的臨床實踐證明，其對治療肝腎不足所致的短暫性腦缺血發(fā)作，腦動脈硬化，腦血栓形成，腦栓塞等疾病療效顯著，具良好的擴張血管，改進腦血流供應，降血壓的功效?，F(xiàn)行標準為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》中成藥成方制劑第十八冊標準，編號為WS3-B-3425-98。含量測定項是以蘆丁為參照物，用紫外分光光度法測定總黃酮的含量。研究已證明，蘆丁并不是刺五加的有效成分，且刺五加化學成分復雜，現(xiàn)有的含測方法專屬性差，同時又難以實現(xiàn)整體的質量控制。因此，為更加準確地反映刺五加注射液的整體質量狀況，有必要研究建立刺五加注射液的指紋圖譜，同時對原質量標準進行提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種刺五加指紋圖普檢測方法，提高檢測方法專屬性，實現(xiàn)整體的質量控制，更加準確地反映刺五加注射液的整體質量狀況。
上述的目的通過以下的技術方案實現(xiàn)刺五加指紋圖譜檢測方法a.將刺五加溶液注入高效液相色譜儀進行洗脫，采用0.1％的磷酸溶液作為A相、用30％乙腈70％水的水溶液作為B相進行梯度洗脫，洗脫液進入紫外檢測器，通過所述的紫外檢測器采集70分鐘之內(nèi)數(shù)據(jù)；b.所述的紫外檢測器的檢測波長為200-360nm；c.所述的色譜儀的色譜柱的柱溫20-40℃；d.所述的高效液相色譜儀的高壓輸液泵的流速0.8-1.2ml/min。
所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，梯度洗脫程序中，洗脫液的A、B兩項變化為在開始時，A相為100％，到15分鐘時A相88％，B相為12％；到21分鐘時A相82％，B相為18％；到60分鐘時A相31％，B相為69％；到65分鐘時B相為100％；所述的色譜儀為Agilent液相色譜儀或者島津液相色譜儀。
上述的刺五加指紋圖譜檢測方法，所述的檢測波長為270nm。
上述的刺五加指紋圖譜檢測方法所述的柱溫為20℃，流速0.8ml/min。
這個技術方案有以下有益效果1.經(jīng)過藥廠調(diào)研、工藝考察，實驗室模擬工藝小樣，統(tǒng)一生產(chǎn)工藝及不同產(chǎn)地藥材的采集分析后，對指紋圖譜的檢測條件和獲取過程進行考察和方法學驗證，通過有效性和耐受性考察，最終建立了藥材和成品的HPLC-FPS(HPLC-fingerprint spectrum)，通過穩(wěn)定的指紋圖譜實現(xiàn)對制劑質量的控制。同時增加了紫丁香苷、刺五加總苷的含量測定項，通過對指標性成分的控制，來進一步保證制劑質量的可靠性。
本方法檢驗的產(chǎn)品為刺五加經(jīng)提取加工制成的滅菌水溶液，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》中成藥成方制劑第十八冊。在本課題研究的第一階段，課題組對參加本課題的兩家企業(yè)所提供的51批制劑進行了考察，實驗證明譜圖差異較大。在第二階段實驗室工藝模擬及大生產(chǎn)工藝考察的基礎上，證明生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定是刺五加指紋圖譜研究的前提條件。因此，第三階段兩家生產(chǎn)企業(yè)統(tǒng)一了生產(chǎn)工藝，嚴格控制工藝參數(shù)，在此基礎上，課題組采用HPLC指紋圖譜技術，對刺五加注射液指紋圖譜的整個獲取過程進行了方法學驗證。結果證明，HPLC法靈敏度高，重復性好，專屬性強，具有很好的可行性，可以對本品的質量進行科學、有效的評價。
刺五加注射液是單一藥味制備而成的中藥制劑，其原料刺五加是藥典品種，為五加科(Araliaceae)植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr.Et MaXim.)Harms的干燥莖。主要含刺五加苷類化合物，也是刺五加的有效成分，現(xiàn)已從正品刺五加中研究發(fā)現(xiàn)紫丁香苷(刺五加苷B)等苷類成分，此外還含部分糖類、脂肪酸、醌類及少量維生素等物質。
各工藝特征的優(yōu)點和比較的具體效果附在實施例中。


附圖1是刺五加注射液指紋圖譜保留時間1號蜂6.9572號峰8.1173號峰13.3374號峰15.8175號峰20.760 6號峰25.777 7號峰30.8838號峰31.6309號峰32.403 10號峰38.863 11號峰39.427 12號峰39.99313號峰41.083 14號峰43.157。
附圖2是A相為0.1％磷酸溶液的色譜圖。
附圖3是A相為0.5％甲酸溶液的色譜圖。
附圖4是不同波長處色譜圖比較。
附圖5是洗脫曲線。
附圖6是2小時色譜圖。
附圖7是不同柱溫條件下刺五加注射液樣品色譜圖(270nm)。
附圖8不同流速條件下刺五加注射液樣品色譜圖(270nm)。
附圖9是在Zorbax Eclipse SDB-C18(250mm×4.6)及ZorbaxSB-C18(250mm×4.6)型液相色譜儀對同一批樣品分析得到的色譜圖。
附圖10是在Agilent-1100型液相色譜儀分析得到的色譜圖。
附圖11在島津LC-2010型液相色譜儀分析得到的色譜圖。
圖12是18批刺五加注射液樣品測定結果，表明在保證工藝穩(wěn)定的情況下，可以保證樣品指紋譜的一致性，從而確保樣品質量的穩(wěn)定。
圖13是精密度測定色譜圖。
圖14是重復性測定色譜圖。
圖15是24小時穩(wěn)定性測定色譜圖。
圖16是2年穩(wěn)定性測定色譜圖。
圖17是不同濃度醇沉樣品色譜圖比較。
圖18是冷凍和冷藏樣品色譜圖比較。
圖19是不同pH值樣品色譜圖比較。
圖20是投料用藥材色譜圖。
圖21是大生產(chǎn)水煎樣品色譜圖。
圖22是大生產(chǎn)石硫樣品色譜圖。
圖23是大生產(chǎn)稀配樣品色譜圖。
圖24大生產(chǎn)滅菌樣品色譜圖。
本發(fā)明的
具體實施例方式實施例1.刺五加指紋圖譜檢測方法a.將刺五加溶液注入高效液相色譜儀進行洗脫，采用0.1％的磷酸溶液作為A相、用30％乙腈70％水的水溶液作為B相進行梯度洗脫，洗脫液進入紫外檢測器，通過所述的紫外檢測器采集70分鐘之內(nèi)數(shù)據(jù)；b.所述的紫外檢測器的檢測波長為200-360nm；c.所述的色譜儀的色譜柱的柱溫20-40℃；d.所述的高效液相色譜儀的高壓輸液泵的流速0.8-1.2ml/min。
所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，梯度洗脫程序中，洗脫液的A、B兩項變化為在開始時，A相為100％，到15分鐘時A相88％，B相為12％；到21分鐘時A相82％，B相為18％；到60分鐘時A相31％，B相為69％；到65分鐘時B相為100％；所述的色譜儀為Agilent液相色譜儀或者島津液相色譜儀。
所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，所述的檢測波長較好值是270nm。
所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，所述的柱溫為20℃，流速0.8ml/min。
下面進行具體敘述2.1刺五加注射液指紋圖譜的建立2.1.1儀器與試劑儀器CHIMADZU LC-2010型高效液相色譜儀，Agilent-1100型高效液相色譜儀，均配有在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器及二極管陣列檢測器；Zorbax Eclipse SDB-C18250×4.6mm 5μm色譜柱。
試劑乙腈(色譜純、Dikma公司)，甲酸(分析純)刺五加注射液2個申請人單位共提供69批樣品。刺五加注射液中間體共30批。刺五加藥材共33批。
2.1.2供試品溶液的制備取本品用0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。
2.1.3指紋圖譜的建立色譜條件Zorbax Eclipse SDB-C18 250×4.6mm 5μm色譜柱；流動相A相為0.5％甲酸(V/V)，B相為乙腈-水(30∶70)；檢測波長270nm；柱溫20℃，流速為0.8ml/min；洗脫程序見表1表1 梯度洗脫程序

測定法 精密吸取供試品溶液5ul，注入液相色譜儀，記錄60分鐘色譜。色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，與對照譜圖比較，計算相似度，即得，參見圖1。
2.2指紋圖譜獲取方法的確定(1)流動相即洗脫液的選擇刺五加注射液成分復雜，極性差別較大，應用等度洗脫需建立多個標準譜圖才有可能全面控制刺五加注射液的質量，較為繁瑣，因此有必要應用梯度分離方法來使大部分各種性質的成分在60分鐘內(nèi)得到洗脫，并獲得較好的分離。
B相分別考察了乙腈-水(30∶70)和甲醇。單用甲醇可以使操作簡便，從而減少溶劑配制引起的誤差。但由于本品極性物質較多，多數(shù)譜峰在甲醇相應濃度之前出峰，對儀器的精度要求較高，從而很大程度上限制了方法的適用性，最重確定以乙腈-水(30∶70)作為B相，參見圖3。
A相在第一、二階段工作中主要采用0.1％磷酸溶液，所得到的譜圖分離效果好，重現(xiàn)性高，參見附圖2?？紤]到將來應用液-質的要求，又用0.5％甲酸溶液進行考察。結果，獲得與0.1％磷酸溶液譜峰一致的色譜圖，參見附圖3，僅是保留時間有所延長。由于14號峰后已無影響相似度計算的譜峰，而14號峰之前的共有峰之外的小峰較多，拉長此段更便于共有峰的選擇和計算，綜合考慮，決定應用0.5％甲酸溶液作為A相。
(2)波長的選擇刺五加注射液中，目前已知且有對照品的成分有紫丁香苷、異秦皮啶及刺五加苷D等。其中，紫丁香苷的含量較高，且相對于異秦皮啶及刺五加苷D化學性質穩(wěn)定。所以波長的選擇紫丁香苷最大吸收波長270nm，同時為得到信息量大的色譜圖，分別在344nm(異秦皮啶的最大吸收處)及300nm、260nm處進行對比試驗。結果，344nm及300nm處的色譜圖信息量較少，且紫丁香苷峰無吸收或僅有很小的吸收(圖4)；260nm處的色譜圖與270nm處的色譜圖相似，其中2、5、8、10、11號峰270nm處吸收值較260nm處吸收值高，7、9、12、13、14號峰二者吸收值接近(表2)，故選擇270nm波長作為本品的測定波長。
表2 260nm與270nm波長比較

(3)梯度時間的設定0-60分鐘段采用3個陡度不同的洗脫區(qū)段，使全部譜峰均勻分布且有效分離；60-70分鐘段采用梯度洗脫清洗色譜柱，參見圖5；最后，用5分鐘的時間以起始濃度平衡色譜柱。在此條件下，可使大部分色譜峰達到較好分離，保留時間適中，無浪費空間。圖6為2小時色譜圖，表明該洗脫方法洗脫完全，足以保證下一次分析的正常進行。
(4)柱溫的選擇為了保持色譜分析的一致性，分別對20℃、25℃、30℃、35℃及40℃柱溫進行考察。結果表明提高柱溫，色譜峰保留時間提前，同時部分峰發(fā)生峰位間的相對位移與合并。鑒于本品譜峰較多，較寬的分析區(qū)間可以保證大部分峰得到較好的分離，決定柱溫設在20℃。參見圖7。
(5)流速的設定在其它色譜條件一致的情況下，分別對0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的流速條件進行考察。結果表明，不同的分析流速對本品種色譜峰的分離影響很大，從對譜圖整體分離效果的考慮出發(fā)，選擇0.8ml/min的流速較為適宜。參見圖8。
(6)色譜柱的考察分別在Zorbax Eclipse SDB-C18(250mm×4.6)及Zorbax SB-C18(250mm×4.6)色譜柱上進行實驗，在相同的色譜條件下，不同固定相對本品的色譜分離行為影響較大，為得到相對穩(wěn)定的譜圖，本指紋圖譜應采用固定型號的色譜柱。參見圖9。
(7)不同儀器的考察在相同的色譜條件下，分別在島津LC-2010A及Agilent-1100型液相色譜儀上對同一批樣品進行檢測，結果得到的色譜圖相同。結果表明不同的液相色譜分析系統(tǒng)對本品指紋譜的分析影響不大。參見圖11、圖10。
(8)供試品溶液的制備供試品溶液分別進樣5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，另取供試品溶液加水稀釋5倍，進樣10ul。分析結果，稀釋的樣品基線飄移過大，其它5個條件除峰面積值遞增外，譜圖分離情況一致。故選擇10ul為本方法的進樣量，既可以最大程度的減少對色譜柱的污染，又可以在濃度變化的有效范圍內(nèi)保證基線的穩(wěn)定性。
(9)樣品測試在工藝統(tǒng)一后，對2個廠家共18批刺五加注射液進行了測定參見圖12，在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)上進行計算，除1批相似度為0.879外，其余17批相似度均再在0.9以上，見表3。

表3 18批刺五加注射液樣品的相似度刺五加注射液指紋圖譜方法研究A.精密度試驗取同一批樣品(批號040233)，按正文方法進行供試品溶液制備，連續(xù)進樣測定6次，計算。相似度在0.99以上，精密度良好，參見表4、表5和附圖13。
表4 精密度測定數(shù)據(jù)


表5 精密度測定色譜圖的相似度數(shù)據(jù)

B.重復性試驗取同一批樣品(批號040233)，按正文方法進行制備供試品溶液6份，分別進樣測定，計算，數(shù)據(jù)參見表6及圖14。相似度在0.99以上，重復性良好，參見表7。
表6 重復性測定數(shù)據(jù)


表7 重復性測定色譜圖的相似度數(shù)據(jù)

C.穩(wěn)定性試驗c.1方法穩(wěn)定性試驗取同一批樣品(批號040233)，按正文方法進行制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24小時時進樣測定，計算參見表8和附圖15。相似度在0.99以上，穩(wěn)定性良好，參見表9。
表8 24小時穩(wěn)定性測定數(shù)據(jù)


表9 24小時穩(wěn)定性測定色譜圖的相似度數(shù)據(jù)

c.2樣品穩(wěn)定性將表10中的3批刺五加注射液樣品分別在02年與04年按正文方法測定，并進行相似度計算(圖16，表10，)。結果相似度在0.97以上，表明刺五加注射液在有效期內(nèi)質量是基本穩(wěn)定的，參見表11。
表10 2年穩(wěn)定性測定數(shù)據(jù)


表11 2年穩(wěn)定性測定色譜圖的相似度數(shù)據(jù)

D.實驗室模擬生產(chǎn)工藝參數(shù)的波動對指紋圖譜的影響刺五加注射液的提取工藝是按照部頒標準執(zhí)行的。分別對工藝中的各個環(huán)節(jié)進行試驗室小試。
D.1各工藝段工藝參數(shù)的變化對刺五加指紋譜的影響D.1-1不同醇沉濃度比較取同一批刺五加藥材，按同一工藝步驟制備試驗室小樣，醇沉一步分別采用75％、85％的醇沉濃度進行制備，醇沉24小時后，取樣測定。結果表明二種方法得到的樣品差異不大，參見表12和附圖17。
表12 不同濃度醇沉樣品相似度比較

D.1.2冷凍和冷藏的比較取同一批刺五加藥材，按同一工藝步驟制備試驗室小樣，冷凍一步分別采用冷凍3天和冷藏3天的方法進行制備，取樣測定，參見表13和附圖18。結果表明二種方法得到的樣品差異不大，相似度為0.998。參見表13。

表13 冷凍和冷藏樣品相似度比較D.1.3樣品不同pH值的比較取同一批刺五加藥材，按同一工藝步驟制備試驗室小樣，調(diào)pH值一步分別將樣品的pH值調(diào)為4.66、5.22、5.73，取樣測定。結果表明在規(guī)定的pH值范圍內(nèi)，樣品差異不大，相似度為0.998。參見表14及附圖19。

表14 不同pH值樣品相似度比較綜上所述，各工藝段工藝參數(shù)的變化對刺五加指紋譜的影響不大，在實際生產(chǎn)過程中按生產(chǎn)工藝嚴格控制，即可保證產(chǎn)品質量的穩(wěn)定性。
D.2整體工藝對刺五加注射液指紋譜的影響課題組在實驗室小試的基礎上，結合刺五加注射液的實際生產(chǎn)工藝，按“水煎→石硫→醇沉→稀配→滅菌→冷藏”為生產(chǎn)工藝路線，與兩家藥廠協(xié)作，各生產(chǎn)5-6批大生產(chǎn)樣品，并在每個工藝點留樣分析，得到色譜數(shù)據(jù)170個(圖表15)。結果表明，刺五加藥材中原有的成分會在工藝過程中增加或減少，呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，如紫丁香苷會在生產(chǎn)過程中逐步損失，而5、10號峰的有無則完全取決于工藝過程，由此說明整體工藝的穩(wěn)定對刺五加注射液指紋譜的成功建立起著決定性的作用，是其必要的前提之一。參見附圖20、附圖21、附圖22、附圖23、附圖24。數(shù)據(jù)匹配結果見下表。
表15 烏批號030878組數(shù)據(jù)匹配結果

權利要求
1.一種刺五加指紋圖譜檢測方法，其特征是a.將刺五加溶液注入高效液相色譜儀進行洗脫，采用0.1％的磷酸溶液作為A相、用30％乙腈70％水的水溶液作為B相進行梯度洗脫，洗脫液進入紫外檢測器，通過所述的紫外檢測器采集70分鐘之內(nèi)數(shù)據(jù)；b.所述的紫外檢測器的檢測波長為200-360nm；c.所述的色譜儀的色譜柱的柱溫20-40℃；d.所述的高效液相色譜儀的高壓輸液泵的流速0.8-1.2ml/min。
2.根據(jù)權利要求1所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，其特征是梯度洗脫程序中，洗脫液的A、B兩項變化為在開始時，A相為100％，到15分鐘時A相88％，B相為12％；到21分鐘時A相82％，B相為18％；到60分鐘時A相31％，B相為69％；到65分鐘時B相為100％；所述的色譜儀為Agilent液相色譜儀或者島津液相色譜儀。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，其特征是所述的檢測波長為270nm。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，其特征是所述的柱溫為20℃，流速0.8ml/min。
5.根據(jù)權利要求3所述的刺五加指紋圖譜檢測方法，其特征是所述的柱溫為20℃，流速0.8ml/min。
全文摘要
刺五加指紋圖譜檢測方法，目前刺五加的含量測定項是以蘆丁為參照物，用紫外分光光度法測定總黃酮的含量。研究已證明，蘆丁并不是刺五加的有效成分，且刺五加化學成分復雜，現(xiàn)有的含測方法專屬性差，同時又難以實現(xiàn)整體的質量控制。刺五加指紋圖譜檢測方法，將刺五加溶液注入高效液相色譜儀進行洗脫，采用0.1％的磷酸溶液作為A相、用30％乙腈70％水的水溶液作為B相進行梯度洗脫，洗脫液進入紫外檢測器，通過所述的紫外檢測器采集70分鐘之內(nèi)數(shù)據(jù)；所述的紫外檢測器的檢測波長為200－360nm；所述的色譜儀的色譜柱的柱溫20－40℃；所述的高效液相色譜儀的高壓輸液泵的流速0.8－1.2ml/min。本方法用作刺五加注射液的指紋圖普檢測。
文檔編號G01N30/14GK1796992SQ20041004416
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月23日 優(yōu)先權日2004年12月23日
發(fā)明者張清波, 宋士岳, 姜濱 申請人:黑龍江烏蘇里江制藥有限公司, 黑龍江省完達山制藥廠