藥物不良反應風險評估方法及其裝置的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物不良反應風險評估方法及其裝置。本發(fā)明透過偵測病患是否帶有與抗甲狀腺藥物所引發(fā)的無顆粒性白血球癥相關的等位基因，以評估該病患發(fā)展出藥物不良反應的風險。具體而言，本發(fā)明提供一種評估患者針對抗甲狀腺藥物發(fā)展出藥物不良反應風險的方法，該方法包括：自患者取得生物檢體；以及偵測該生物檢體中是否存在與該藥物不良反應相關的HLA?B*38:02等位基因或HLA?DRB1*08:03等位基因，若存在該HLA?B*38:02等位基因或該HLA?DRB1*08:03等位基因中的任意一種，即判定該患者具有針對該抗甲狀腺藥物發(fā)展出該藥物不良反應的風險，其中該藥物不良反應為無顆粒性白血球癥。
【專利說明】藥物不良反應風險評估方法及其裝置 【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及藥物不良反應風險評估方法及其裝置。 【現(xiàn)有技術】
[0002] 葛瑞夫茲氏病(Graves'Disease，簡稱⑶，人類門德爾遺傳編號27500)是甲狀腺機 能亢進的最主要原因，臨床表現(xiàn)包括彌漫性甲狀腺腫大、甲狀腺功能過高、抗甲狀腺抗體、 眼病變以及皮膚病變。該疾病的盛行率高達1.0%至1.6%，且女性比男性更常見?？辜谞钕?藥物（antithyroid drugs，簡稱ATD)包括甲硫咪唑（methimazole)、卡比馬挫 (carbimazole)及丙硫氧啼啶(propylthiouracil)等，是屬于硫代酰胺（thionamide)-類 相對簡單的分子，這些藥物是全世界治療葛瑞夫茲氏病以及甲狀腺功能過高癥的主要選 擇。
[0003] 硫代酰胺類藥物引發(fā)的無顆粒性白血球癥（thionamide induced agranulocytosis，簡稱TiA)，定義為當服用抗甲狀腺藥物期間發(fā)生絕對顆粒性白血球數(shù)量 小于500每立方毫米，是抗甲狀腺藥物所引發(fā)最嚴重的藥物不良反應，在接受這些藥物的患 者中約0.1 % -0.37 %可能發(fā)生。無顆粒性白血球癥可能致命，且可以被許多種非化學治療 藥物所引發(fā)。在最近一篇文獻探討所列舉的十一種可能引發(fā)無顆粒性白血球癥的藥物中， 抗甲狀腺藥物就占了其中的三種，而其他藥物還包括clozapine、dapsone、dipyrone，、 penicillin G、procainamide、rituximab、sulfasalazine及ticlopidine。
[0004] 藥物不良反應(Adverse Drug Reaction，簡稱ADR)為一種非預設且不希望發(fā)生的 藥物反應，其可以大致分為幾種類型，包括A型(劑量相關的，增強型)和B型(非劑量相關的， 奇異型），并且具有不同的遺傳傾向?？辜谞钕偎幬锼l(fā)的無顆粒性白血球癥屬于B型。根 據藥物遺傳學的研究顯示，偵測患者體內藥物不良反應相關的等位基因有助于評估患者是 否有發(fā)展藥物不良反應的風險，而人類白血球表面抗原(HLA)基因已被證明與許多藥物不 良反應相關，包括 carbamazepine 引發(fā)的Stevens-Johnson 癥候群（HLA_B*15:02 及 HLA-A* 31:01)、abacavir引發(fā)的過度敏感癥候群(HLA-B*57 :01)，以及l(fā)apatinib引發(fā)的肝臟傷害 (HLA-DQA1*02:01)等。非人類白血球表面抗原基因也可能經由各種藥代動力學以及藥效學 機轉而引發(fā)各式藥物不良反應。整體而言，有關藥物引起無顆粒性白血球癥的藥物基因體 學研究仍然相當不足，而且往往沒有確定結論，因此，找出抗甲狀腺藥物引發(fā)無顆粒性白血 球癥的致病基因，實屬極為重要的議題。 【
【發(fā)明內容】
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[0005] 就本案的一方面而言，本案提出一種評估患者針對抗甲狀腺藥物發(fā)展出藥物不良 反應風險的方法，包括自患者取得生物檢體，以及偵測該生物檢體中是否存在與該藥物不 良反應相關的HLA-B*38:02等位基因或HLA-DRB1*08:03等位基因，若存在該HLA-B*38:02等 位基因或該HLA-DRB1*08:03等位基因中的任意一種，即判定該患者具有針對該抗甲狀腺藥 物發(fā)展出該藥物不良反應的風險，其中，該藥物不良反應為無顆粒性白血球癥。
[0006] 根據上述構想，該等位基因的存在也可藉由偵測該等位基因的等效基因標記來判 定。由于接近所需HLA等位基因的基因標記與該等位基因易于共同分離或呈現(xiàn)連鎖不平衡 狀態(tài)，因此，此等效基因標記為所需等位基因是否存在的指標，進而可代表患者是否具有發(fā) 展藥物不良反應的風險。
[0007] 前述等效基因標記可為任何型式，包括但不限于:限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、 微衛(wèi)星標記與單核苷酸多型性(SNP)標記。等效基因標記可采用上述的方法或習知相關方 法進行檢測。
[0008] 于本案所提出的藥物不良反應風險評估方法中，偵測該HLA-B*38:02等位基因系 包含偵測該HLA-B*38:02等位基因的一種等效基因標記;其中偵測該HLA-DRB1*08:03等位 基因包含偵測該HLA-DRB1*08:03等位基因的一種等效基因標記。
[0009] 根據上述構想，其中該等效基因標記選自：限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星標記、 單一核苷酸多型性標記及其任意組合。
[0010] 根據上述構想，其中該HLA-B*38:02等位基因的存在以單核苷酸多型性標記 rsl7193122、rsl40833037 或 rs34531986 為代表，其中該 HLA-DRB1*08:03 等位基因的存在以 單核苷酸多型性標記rsll6869525、rsll7921525或rsll7968912為代表。
[0011]于本案所提出的藥物不良反應風險評估方法中，若該HLA-B*38:02等位基因為存 在，即表示該患者發(fā)展出該藥物不良反應的風險相較不具該等位基因者的勝算比（odds ratio)大于20;若該HLA-DRB1*08:03等位基因為存在，即表示該患者發(fā)展出該藥物不良反 應的風險相較不具該等位基因者的勝算比(odds ratio)大于6;若該HLA-B*38:02等位基因 及該HLA-DRB1*08:03等位基因皆存在，即表示該患者發(fā)展出該藥物不良反應的風險相較不 具該二等位基因者的勝算比（odds ratio)大于48。
[0012] 于本案所提出的藥物不良反應風險評估方法中，其中該抗甲狀腺藥物為一硫代酰 胺（t h i ο nam i d e )類藥物。于一較佳實施例中，該硫代酰胺類藥物選自：甲硫咪挫 (methimazole)、卡比馬唑（carbimazole)、丙硫氧啼啶（propylthiouracil)及其任意組合。
[0013] 于本案所提出的藥物不良反應風險評估方法中，該生物檢體為核酸。于一較佳實 施例中，該生物檢體為基因組DNA。于另一較佳實施例中，該生物檢體選自：血液、尿液、唾 液、毛發(fā)及其任意組合。
[0014] 于本案所提出的藥物不良反應風險評估方法中，該患者為亞洲人。于一較佳實施 例中，該患者為華人。
[0015] 就本案的另一方面而言，本案提出一種藥物不良反應風險評估裝置，該裝置包含 至少一探針，該探針可偵測該HLA-B*38:02等位基因或該HLA-DRB1*08:03等位基因。于一較 佳實施例中，所述裝置包括可偵測該HLA-B*38 :02等位基因的探針和可偵測該HLA-DRB1* 08 : 03等位基因的探針。于一較佳實施例中，該探針可偵測該HLA-B*38 :02等位基因或該 HLA-DRB1*08:03等位基因的一種等效基因標記。于另一較佳實施例中，該探針可偵測單核 苷酸多型性標記 rsl7193122、rsl40833037、rs34531986、rsl 16869525、rsl 17921525 或 rsll7968912。
[0016] 根據上述構想，該探針包含一寡核苷酸，該寡核苷酸特異性與該HLA-B*38:02等位 基因或該HLA-DRB1*08:03等位基因相結合。
[0017] 本案還包括可偵測該HLA-B*38:02等位基因的探針和/或可偵測該HLA-DRB1*08: 03等位基因的探針在制備評估患者針對抗甲狀腺藥物發(fā)展出藥物不良反應風險的試劑或 本文所述裝置(如試劑盒）中的用途。
[0018] 本案得藉由以下圖式與實施方式說明而更易于讓在此領域具有通常知識者了解 本案的精神。 【【附圖說明】】
[0019] 圖1為本發(fā)明人類白血球表面抗原基因的相關信號以及連鎖不平衡區(qū)塊分析。
[0020] 圖2為本發(fā)明全基因體掃描所得的相關性結果。
[0021 ]圖3為區(qū)分無顆粒性白血球癥患者(η = 42)與葛瑞夫茲氏病患者(η = 927)的接收 器運作指標（receiver-operating characteristic，R0C)曲線。
[0022]圖4為硫代酰胺類藥物與人類白血球表面抗原的蛋白質-配體互動關系圖。
[0023]圖5A和5B分別為人類白血球表面抗原及其次-口袋(Sub-pocket)結構的表面示意 圖。 【【具體實施方式】】
[0024]本案"藥物不良反應風險評估方法及其裝置"將可透過以下的實施例說明而讓在 此領域具有通常知識者了解其創(chuàng)作精神，并可據以實施。然本案的實施并非由下列實施例 而限制其實施型態(tài)。
[0025]實施例一研究對象的選定
[0026] 葛瑞夫茲氏病是依據臨床上是否出現(xiàn)甲狀腺功能亢進，加上甲狀腺眼疾或是彌漫 性甲狀腺腫大，并加上血清檢驗出自體抗體作為判斷?？辜谞钕偎幬飳е碌臒o顆粒性白血 球癥，其診斷方式由最初對病患的詢問調查到利用病歷資料搜尋。病患如果同時接受化療、 clozapine、dapsone、dipyrone、penicillin G、procainamide、sulfasalazine或 ticlopidine等藥物的治療則被排除。雖然抗甲狀腺藥物導致的無顆粒性白血球癥一般定 義為在使用thionamide類的藥物造成絕對顆粒性白血球數(shù)量小于500每立方毫米，本研究 病患都是在發(fā)生感染癥的情況下被發(fā)現(xiàn)而非只是單純驗血得知?；颊叨加邪l(fā)燒喉嚨痛等癥 狀并可能有皮膚紅疹而住院治療，無顆粒性白血球癥大約在使用抗甲狀腺藥物后三個月內 出現(xiàn)。
[0027] 本案共收入21位病患進入第一階段研究作基因型鑒定。以患有無顆粒性白血球癥 的葛瑞夫茲氏病患為病例組，而第一階段研究的對照組則為497位無親屬關系的葛瑞夫茲 氏病患和165位從葛瑞夫茲氏病家族中挑選出來的葛瑞夫茲氏病患者成員（一個家族只納 入一位病患）。第一階段研究出現(xiàn)正面跡象后再額外加入21名抗甲狀腺藥物導致無顆粒性 白血球癥病患作為病例組而進入第二階段研究，另再納入共546位無親屬關系的葛瑞夫茲 氏病患做為對照組。采用QUANTO軟件來計算，并以不同的次要等位基因頻率(Minor Allele Frequency，MAF)及勝算比（Odds Ratio,OR)作計算，本案帶有的樣本數(shù)量對于偵測重要基 因變異具統(tǒng)計效力。
[0028] 實施例二直接人類白血球表面抗原(HLA)基因型鑒定
[0029]直接偵測HLA基因型或是其內部的特殊區(qū)域可用來判定一基因標記是否存在。從 患者體內取得檢體并制備其基因體DNA來測定一等位基因的存在已屬習知技術，例如美國 Gentra Systems公司所生產的PUREGENE DNA純化系統(tǒng)，其系用以測定指定基因標記內一段 區(qū)域上的核苷酸。測定特定區(qū)域的方法亦為習知技術，例如序列特異性寡核苷酸(Sequence Specific 01igonucleotide，SS0)雜交試驗、實時聚合酶鏈式反應(real-time PCR)，或是 經結合的序列特異性寡核苷酸-酵素連結免疫吸附試驗等。
[0030] 由聚合酶鏈式反應取得的DNA產物可用序列特異性探針來偵測，如：TaqMan、 Beacon、Scorpions的水解性探針或是雜交探針。這些探針被設計成可與指定區(qū)域結合。該 聚合酶鏈式反應產物可藉由DNA黏合物，如SYBR l; Green來偵測。
[0031] 本發(fā)明中使用四種HLA基因型鑒定方法，包括：（l)Dynal RELI SS0基因型鑒定套 組(Dynal公司生物技術有限公司，現(xiàn)為Life Technologies公司所有）；（2)Gold SSP HLA-DPB1 高分辨率套組（Invitrogen公司，現(xiàn)為Life Technologies所有；（3)LABType SS0套組 (One lambda公司）；和(4)SeCore HLA基因型鑒定套組(Life Technologies公司）。前三種 方法被應用到第一階段21位無顆粒性白血球癥病例組的其中2名和所有的662位對照組，第 四種方法(SeCore HLA基因型鑒定試劑)則用在所有的42位無顆粒性白血球癥病例組(包括 第一和第二階段)和546位第二階段的對照組。除了有2位無顆粒性白血球癥病患接受了一 個以上的基因型鑒定方法分析之外，本案還隨機選擇24個第一階段的對照組也使用SeCore HLA的基因型鑒定，以確保不同方法下所得到的基因型鑒定結果是一致的。
[0032] Dynal RELI SS0基因型鑒定系依據制造商的說明進行。簡要地說，使用特定基因 座引子的聚合酶鏈式反應(PCR)，分別用于擴增第一類(HLA-A，-B和-C)基因的外顯子2和外 顯子3或是第二類(-DQB1和-DRB1)基因的外顯子2。隨后將PCR產物和預先以線性數(shù)組固定 在尼龍膜的序列特異性寡核苷酸(SS0)探針進行雜交(HLA-A:48個探針，-B:61個探針，-C: 37個探針，-DQB1:41個探針和-DRB1:60個探針）。最后使用模式匹配程序解譯基因型。
[0033]由于Dynal公司RELI SS0系統(tǒng)缺乏DPB1基因型鑒定套組，故本案使用制造商建議 的"Go 1 d SSP HLA-DPB1高分辨率組"序列特異性引物(SSP)的擴增方法來分析HLA-DTO1。簡 單地說，對每個DNA樣本進行48PCR反應，經PCR擴增和電泳后，陽性擴增的型態(tài)用UniMatch 軟件（Inv i trogen公司）來分析HLA-DPB1基因型。
[0034] LABType SS0的基因型鑒定系根據制造商的方案進行。簡言之，將PCR產物結合到 熒光編碼的微球探針(HLA-A: 58/61/63個探針，-B: 100個探針，-C: 56個探針，-DPB1:40個探 針，-DQB1:37個探針和-DRB1:70個探針）。接著用流式分析器來確定每個微球體的熒光強度 (LABType視覺軟件;One lambda公司），最后根據反應型態(tài)確認HLA基因型。
[0035] SeCore HLA基因型鑒定如下進行。根據制造商的說明使用SeCore HLA基因型鑒定 套組(Life Technologies公司）決定HLA-A，HLA-B，HLA-C和HLA-DPB1 上外顯子2,外顯子3和 外顯子4的基因多型性，HLA-DRB1外顯子2的基因多型性，和HLA-DQB1外顯子2和外顯子3的 基因多型性。簡單地說，經過基因座特異性聚合酶鏈式反應擴增，將PCR產物用核酸外切酶 I和蝦堿性磷酸酶處理，以除去過量的dNTP和引子。每個外顯子的測序反應使用Big Dye terminator vl.l循環(huán)測序套組雙向進行，用ABI 3730自動測序儀(應用生物系統(tǒng)公司）進 行測序。等位基因的指定由選定的序列與IMGT/HLA數(shù)據庫的已知等位基因序列的所有組合 以uTYPE序列分析軟件(Life Technologies公司)進行比較。在出現(xiàn)基因型歧義的雜合個體 的情況下，即幾 個不同基因型組合卻產生相同的測序結果，等位基因的指定依照中國臺灣 人口中最常見的情況。
[0036]此外，測定等位基因的存在亦可藉由使用由生物檢體（如:血液、唾液、尿液，或毛 發(fā))制備的基因組DNA來直接測定該基因內的區(qū)域或核苷酸。該等位基因亦可利用如血清學 或微細胞毒性方法測定，亦可藉由檢測等位基因的等效基因標記（equivalent genetic marker)來測定，例如：單核苷酸多型性（single nucleotide polymorphism, SNP)、微衛(wèi)星 標記(microsatellite marker)，或任何種類的基因多樣性標記。
[0037] 本案由6個人類白血球表面抗原基因（HLA-A，-B，-C，-DPB1，-DQB1及-DRB1)直接基 因型鑒定的數(shù)據進行分析，在第一階段的研究中（21位無顆粒性白血球癥病患以及662位葛 瑞夫茲氏病患對照組），本案發(fā)現(xiàn)兩個顯著的相關信號，分別是在HLA-B*38:02(P值=1.59 X10-9)以及HLA-DRB1*08:03(P值=1.24X10-5)。而第二階段研究（21位無顆粒性白血球癥 病患以及546位葛瑞夫茲氏病患對照組）則重現(xiàn)了第一階段研究的相關信號:HLA-B*38:02 (P值=1.59 X 10-27)及HLA-DRB1*08:03 (P值=3.91 X 10-5)。兩階段合并分析(42位無顆粒性 白血球癥病患以及1208位葛瑞夫茲氏病患對照組)可以看到更強的相關信號:HLA-B*38:02 (P 值= 6.75X 10-32)及 HLA-DRB1*08:03(P 值= 1·83Χ10-9)，詳如下表一所示。 表一、第一階段、第二階段及整體的相關性研究結果
Chr.:染色體;RAF:高危險等位基因頻率;0R:勝算比;CI:信賴區(qū)間。 a物埋位置依NCBI build 37.1進行標志。 1生算比以等位基因相關性測試計算。 CP值利用Cochran-Armitage趨勢檢定計算。
[0038] HLA-B*38:02等位基因型頻率在無顆粒性白血球癥患者為29.8%，遠高于葛瑞夫 茲氏病患對照組的3.3%以及一般中國臺灣人族群的3.3% ALA-DRBNOS: 03等位基因型頻 率在無顆粒性白血球癥患者為28.6%，遠高于葛瑞夫茲氏病對照組的8.4%以及一般中國 臺灣人族群的8.6%。帶有HLA-B*38:02或HLA-DRB1*08:03而發(fā)生無顆粒性白血球癥的風險 對比起不帶這等位基因型的人的勝算比（odds ratio)分別是21.48(95%信賴區(qū)間為11.13 ~41.48)及6.13(95%信賴區(qū)間為3.28~11.46)。同時帶有此兩種等位基因型的個案對比 起不帶這等位基因型的人的勝算比更高達48.41(?值=3.32\爪 21，95%信賴區(qū)間為21.66 ~108.22)。
[0039]參考圖1所示，上方圖示X軸代表染色體的區(qū)域，左側Y軸代表全基因體相關研究所 得的-logioP值。點的顏色顯示rsl7193122或rsll6869525與其位于4Mb區(qū)域內相鄰的單核苷 酸多型性標記之間的連鎖不平衡，其中rsl7193122系與30~32Mb單核苷酸多型性標記比 較，rsll6869525系與32~34Mb單核苷酸多型性標記比較。虛線表示統(tǒng)計上有意義的門坎值 (9.56χ 10-8)。右側Y軸顯示單核苷酸多型性標記的重組率，其以1000基因組計劃的亞洲祖 系族群數(shù)據進行計算。圖1下方圖標為依據相關區(qū)域的r2值所繪的連鎖不平衡圖譜，該數(shù)據 系以本發(fā)明的969個樣本進行基因型鑒定而得。本圖譜系使用Haploview軟件4.2版描繪，且 r2(x100 )值記載于方塊圖形中。由此可知這兩個等位基因并非出于同一個連鎖不平衡區(qū)域 (linkage disequilibrium block)中。
[0040] 本案另發(fā)現(xiàn)!11^-八*02:03、!11^-〇07:02及!11^-0981*06:01也帶有和無顆粒性白 血球癥的顯著相關信號(P值=4.22 X 10-8,4.09 X 10-6及1.29 X 10-6)。根據本案的資料分析 這幾個等位基因分別和HLA-B*38:02或HLA-DRB1*08:03具有連鎖不平衡的情形，因此并非 獨立相關信號。
[0041 ] 實施例三全基因體SNP基因型鑒定
[0042]全基因體基因型鑒定的分析使用具有642,832個單核苷酸多型性（SNP)標記的 AfTymetrix Axiom全基因體CHB 1數(shù)組板(博奧生物有限公司）進行。由Axiom GT1演算全基 因體基因型，然后針對個人和SNP進行系統(tǒng)的質量控制，其方式為移除漏失樣本大于1%的 SNP、并非體染色體(autosomal)、次要等位基因頻率(MAF)小于1 %或是對照組有表現(xiàn)出哈 迪-溫伯格平衡顯著偏差（P值小于IX 1〇_5)者。本案刪除了病患和對照組中基因型call rates有顯著差異(P值小于IX 10-6)者。樣本過濾上生成的基因型數(shù)組小于95%的位點被排 除在外。雜合率計算，偏差超過6個標準偏差的也被排除在外。X染色體SNP的雜合被用來驗 證樣本來源的性別，沒有出現(xiàn)性別不匹配。PLINK版本1.07軟件被用來識別基因是否從同一 個體(或同卵雙胞胎)或是一、二、三等親屬而來。這些判斷是基于從身份血統(tǒng)狀態(tài)發(fā)現(xiàn)隱藏 關聯(lián)的證據。篩選后，本案總共在42位抗甲狀腺藥物導致的無顆粒性白血球癥病患和927位 葛瑞夫茲氏病患對照組個案中保留了 522，980個單核苷酸多型性(SNP)標記。
[0043] 利用Affymetrix Axiom全基因體CHB 1數(shù)組板(在體染色體共522,980個質量可靠 的單核苷酸多型性標記)進行研究顯示許多處相關信號。參考表1、圖1及圖2所示，其中圖2 系以Manhattan plot顯不以Cochran-Armitage Test分析522,980個單核苷酸多型性標記 的趨勢，所得的全基因體P值(-l〇g1QP值）。該分析系來自于42位無顆粒性白血球癥患者以及 927位葛瑞夫茲氏病患對照組。同一染色體上的單核苷酸多型性標記以同顏色標示。其中該 橫線的P值等于9.56 X 10Λ系作為本發(fā)明全基因體統(tǒng)計上有意義的門坎值。
[0044] 經過分析比對，本發(fā)明確認在人類白血球表面抗原基因區(qū)域有兩組彼此獨立的相 關信號，且每一組都個別有許多單核苷酸多型性標記，其中第一組信號可用rsl7193122作 為代表(第一階段P值=8.18 X 10_8,第二階段P值=1.15 X 10_24,整體P值=4.29 X 10_27)。第 二組信號可用rsl 16869525作為代表(第一階段P值=3.88 X 10-5，第二階段P值=8.24 X 10-5,整體P值=1.27 X 10-8)。本案亦發(fā)現(xiàn)一組人類白血球表面抗原區(qū)域以外的另一相關信 號，位于染色體3ql3，可用rs56343172作為代表(第一階段Ρ值=1.71 X 10_5，第二階段Ρ值= 7.32X10-4,整體 P 值=7.75X10-8)。
[0045] 本案發(fā)現(xiàn)HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03具有獨立的致病效果，且在人類白血球 表面抗原基因的相關信號是從兩個完全不同的基因型鑒定平臺所得到的相同結果。如圖1 所示，在由單核苷酸多型性標記所得到的第一組信號（可由rsl7193122、rsl40833037或 rs34531986代表)系與HLA-B*38:02有連鎖不平衡，而且其相關信號在回歸分析中如果已經 帶有HLA-B*38:02項目的話就會消失，代表此一組單核苷酸多型性標記得到的相關信號與 HLA-B*38:02是同一個信號。同樣的，第二組單核苷酸多型性標記信號（可由rsll6869525、 rsll7921525或 rsll7968912代表)則與 HLA-DRB1*08:03 是同一信號。
[0046]本發(fā)明所提供的所有單核苷酸多型性(SNPs)的rsID，其序列及所含單核苷酸變異 的位置及其變異堿基系于本發(fā)明申請前已公開于美國國家生物技術信息中心(Nat ional Center for Biotechnology Information，NCBI)的單核苷酸多型性數(shù)據庫（SNP database，dbSNP)中。
[0047] 更進一步分析，雖然HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03有時會同時出現(xiàn)在延伸性的 人類白血球表面抗原基因連鎖不平衡區(qū)塊上，但是本發(fā)明根據三點證據可以證明此二等位 基因代表兩個獨立相關信號。首先，參考圖1，根據無顆粒性白血球癥患者及葛瑞夫茲氏病 患對照組的連鎖不平衡區(qū)塊的分析，明顯可以看到這兩個等位基因是在不同的連鎖不平衡 區(qū)塊;第二，根據回歸分析模型，這兩個等位基因型顯現(xiàn)獨立效果；第三，在帶有HLA-B*38: 〇2的個案中（在無顆粒性白血球癥患者中有25人，而在葛瑞夫茲氏病患對照組中有77人）， 帶有HLA-DRB1*08:03的比例還是在無顆粒性白血球癥患者比在葛瑞夫茲氏病患對照組中 為尚。
[0048] 另一方面，本案發(fā)現(xiàn)HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03具有主要致病效果。就HLA-B* 38:02而言，在無顆粒性白血球癥患者中有59.52%帶有此等位基因，而在葛瑞夫茲氏病患 對照組中只有6.41 %帶有此等位基因，計算出來的疾病風險勝算比為21.48(P值=6.28 X 10一 18,95%信賴區(qū)間為11.13~41.48)。就HLA-DRB1*08:03而言，在無顆粒性白血球癥患者 有52.38 %帶有此等位基因，而在葛瑞夫茲氏病患對照組中只有15.22 %帶有此等位基因， 計算出來的疾病風險勝算比是6.13(P值=1.35X 10-8,95%信賴區(qū)間為3.28~11.46)。就同 時分析HLA-B*38:02及HLA-DRB1*08:03而言，在無顆粒性白血球癥患者有38.10%同時帶有 此二等位基因，而在葛瑞夫茲氏病患對照組中只有1.26%同時帶有此等位基因，計算出來 的疾病風險勝算比是48.41(P值=3.32X10- 21，95%信賴區(qū)間為21.66~108.22)。根據本案 數(shù)據所建構出的邏輯斯回歸（logistic regression)模型如下：logit(Ji)=-4.4936+ 2.6382 XHLA-B*38:02+1.2857父!11^-01^1*08:03，其中兩等位基因都是根據加成性 (additive)模型，其中π代表無顆粒型白血球癥的可能性。根據此模型，貝lj在接收器運作指 標（receiver operating characteristic，R0C)曲線的曲線下面積為81.22%。
[0049] 實施例四資料分析
[0050] 本案使用PLINK版本1.07軟件并使用多維尺度(MDS)及GCTA主成分分析(PCA)來獲 得969個案的人口結構。使用MDS和PCA將所有969個樣本(42位抗甲狀腺藥物導致的無顆粒 性白血球癥病患和927位對照組病患）和國際HapMap計劃中的281個亞洲參照樣本一起進行 分析，并沒有發(fā)現(xiàn)異常值?；蚪M膨脹因子(λ)的數(shù)值為1.01，這說明群體分層的效果在本 發(fā)明研究樣本中可以忽略不計。質量控制后，所有的GWA分析是由抗甲狀腺藥物導致無顆粒 性白血球癥病患和對照組病患使用五個單點方法之間的比較其等位基因/基因型的頻率： 基因型、等位基因型、Cochran-Armitage趨勢測試并考慮迭加效應或有效等位基因攜帶者。 以Bonferroni對SNP的數(shù)目（522,980)校正后的全基因體顯著性閾值的？值設定為9.56父 10- 8。由于對照組的數(shù)量龐大，每個抗甲狀腺藥物導致無顆粒性白血球癥個案依其年齡和性 別隨機匹配10位對照組病患作配對分析。潛在的遺傳異質性調整透過MDS和GCTA確定的前 兩個或前十個主成分作統(tǒng)整。逐步進行的多元回歸分析的方式，并使用SAS/STAT 9.3版作 Cochran-Mantel-Haenszel測試。概似比測試中以P值0.05作為進入或排除標準用于逐步 回歸分析。如圖3所示，分析用以評估邏輯斯回歸模型預測表型的能力，并產生一個組合數(shù) 據集來鑒別實驗組與對照組的接收器運作指標(receiver-operating characteristic， ROC)曲線，計算曲線下的面積。用Hap 1 ονi ew4.2版進行LD評估，曼哈頓和分位-分位圖由R package制作。該實驗模型的敏感度、特異性、正面以及負面預測值分別為61.09% (95%信 賴區(qū)間：45.64~76.42)、92· 13% (95%信賴區(qū)間：90.46~93.60)、21· 67% (95%信賴區(qū)間： 14.67~30.11)以及98.57% (95%信賴區(qū)間：97.68~99.18)。
[0051 ] 實施例五HLA推算（imputation)和關聯(lián)分析
[0052]本案系采用HLA推算法將HLA區(qū)域由全基因體相關研究（Genome-Wide Association Study，GWAS)獨立辨識出來驗證HLA基因型。使用SNP2HLA軟件將亞洲基準 (530個亞洲人)高密度SNP基因型和4位數(shù)的典型HLA等位基因和相應的胺基酸多態(tài)性推算 典型HLA等位基因。選取位于寬的MHC區(qū)域(染色體6:29-35Mb)的SNP基因型推算出兩位數(shù)典 型等位基因、四位數(shù)典型等位基因和8個第I類和第II類HLA基因的胺基酸多態(tài)性(HLA-A， HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1，HLA-DQA1，HLA-DQB1，HLA-DPA1 和HLA-DPB1) JLINK用于執(zhí)行與 HLA-推算的關聯(lián)分析。
[0053] 實施例六三維模型建立
[0054]為了進一步探討人類白血球表面抗原基因蛋白和硫代酰胺類藥物的交互作用機 轉，本發(fā)明進行了三維結構模式的建立。
[0055] !11^-8*38:02和!11^-8*38:01蛋白質的三維結構系使用28〇(，3418，1570,4町6和 114F的roB登錄的ID作為模板而由I-TASSER 4.2進行建模。HLA-DRA/DRB1*08:03的結構是 由MODELLER 9v9基于HLA-DR1 (1AQD的登錄號）的結構構成。蛋白質滴定殘基的質子化狀 態(tài)以PR0PKA在pH7.4確定，氫原子以TOB2PQR 1.9添加。硫代酰胺藥物分子，甲硫咪唑和丙硫 氧嘧啶的初始構造，分別從蛋白質數(shù)據庫的麗Z和3CJ的配體ID衍生出。MarvinSketch 5.1.3被用于在pH7.4下預測質子化狀態(tài)以及加入藥物分子內的氫原子。使用Gaussian03和 6-31G基本設定于哈特里-?？?HF)級進行量子化學計算，約束靜電電位則用來確定原子 電荷。使用AutoDock448進行分子dockings與重新標定的打分函數(shù)(AutoDock4RRP)。以 18,75 M3,5 X18.75A3網格框大小設定為包含該蛋白質的整個結合溝，并且不包含多肽，以 允許藥物分子探索所有可能的結合位點。參考圖4所示，其為硫代酰胺類藥物與人類白血球 表面抗原的蛋白質-配體互動關系。其中（a)為甲硫咪唑與HLA-B*38:02的互動關系；（b)為 丙硫氧嘧啶與HLA-B*38:02的互動關系；（c)為甲硫咪唑與HLA-B*38:01的互動關系；（d)為 丙硫氧嘧啶與HLA-B*38:01的互動關系；（e)為甲硫咪唑與HLA-DRA/DRB 1*08:03的互動關 系；（f)為丙硫氧嘧啶與HLA-DRA/DRB1*08:03復合體的互動關系。結合親和力預測系介于-4 · 48kcal/mol 與_6 · 36kcal/mol之間。
[0056] 參考圖5A和5B所示，其為人類白血球表面抗原及其次-口袋(Sub-pockets)結構的 表面示意圖。其中圖5A為HLA-B*38:02，其口袋(pocket)結構位置系依多肽-HLA-B*15:01復 合物的結晶結構決定。HLA-B*38:01的次口袋(sub-pocket)結構區(qū)域亦位于相似區(qū)域。圖5B 為HLA-DRA/DRB1*08:03，其口袋結構位置系依多肽-HLA-DR1復合物的結晶結構決定。
[0057]對接結果發(fā)現(xiàn)口袋F(pocket F)結構對藥物結合最有利，結合親和性估計介于-4.48和-6.36千卡/莫耳之間。為了進一步證實該藥物分子的結合態(tài)，以Amberer與AMBER parm99SB對蛋白質進行2納秒分子動力學仿真，分子圖形是由PyMOL的1.3和UCSF嵌合1.6.1 制成。
[0058]由這些結合交互作用的模式，本案發(fā)現(xiàn)HLA-B*38:02蛋白的口袋B(p〇Cket B)結構 以及口袋F(pocket F)結構是重要的。而HLA-B*38:02的半胱胺酸67(Cys67)、天冬酰胺77 (Asn77)、蘇胺酸 80(Thr80)及酪胺酸 123(Tyrl23)也會影響結合。而 HLA-DRA/DRB1*08:03 的 天冬酰胺a69 (Asna69)、精胺酸a76 (Arga76)、酪胺酸β37 (Tyrf37)及絲胺酸β57 (Serf57)也 會影響結合的結構與穩(wěn)定。
[0059] 實施例七藥物不良反應風險評估裝置
[0060] 本發(fā)明另一方面提供一種藥物不良反應風險評估裝置，該裝置包括能夠偵測HLA-B*38:02和/或HLA-DRB1*08:03等位基因的探針。此處所述的"探針"指任何可用于探測其 他物質之物。于一較佳實施例中，該探針為可與HLA-B*38:02或HLA-DRB1*08:03等位基因中 特定區(qū)域進行特異性結合的寡核苷酸片段或復合寡核苷酸片段。于一較佳實施例中，該寡 核苷酸片段與一發(fā)色基團或含有配體的分子(如抗原)形成共價鍵結，其針對一受體分子具 有特異性的高親和力（如抗體對抗原的特異性）。于另一較佳實施例中，該探針為一聚合酶 鏈式反應的引物，與另一引物共同用于擴增該等位基因內部的特定區(qū)域。于一較佳實施例 中，該裝置可選擇性地包含一參照探針，該參照探針針對一內部對照的等位基因，其可為任 一普遍存在的等位基因，例如甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)、肌動蛋白等。該參照探針的設計 系為了確認該裝置的效能。于一更佳實施例中，該裝置可進一步包含其他工具或試劑，用以 收集病患的生物檢體，以及制備該生物檢體的基因體DNA、cDNA、RNA或蛋白質。
[0061] 以上所提僅是本案的較佳實施例，并不是用于限定本案的實施范圍；任何在此領 域具有通常知識者，在不脫離本案的精神與范圍下所作的諸般變化與修飾，都不脫如附申 請專利范圍所欲保護者。
【主權項】
1. 一種評估患者針對抗甲狀腺藥物發(fā)展出藥物不良反應風險的方法，該方法包括： 自患者取得生物檢體；以及 偵測該生物檢體中是否存在與該藥物不良反應相關的HLA-B*38:02等位基因或HLA-DRB1*08:03等位基因，若存在該HLA-B*38:02等位基因或該HLA-DRB1*08:03等位基因中的 任意一種，即判定該患者具有針對該抗甲狀腺藥物發(fā)展出該藥物不良反應的風險，其中該 藥物不良反應為無顆粒性白血球癥。2. 如權利要求1所述的方法，其中偵測該HLA-B*38:02等位基因包含偵測該HLA-B*38: 02等位基因的一種等效基因標記。3. 如權利要求1所述的方法，其中偵測該HLA-DRB1*08:03等位基因包含偵測該!11^-DRBl *08:03等位基因的一種等效基因標記。4. 如權利要求1所述的方法，其中該HLA-B*38:02等位基因的存在是以單核苷酸多型性 標記 rsl7193122、rsl40833037或 rs34531986 為代表。5. 如權利要求1所述的方法，其中該HLA-DRB1*08:03等位基因的存在是以單核苷酸多 型性標記 rsll6869525、rsll7921525或 rsll7968912 為代表。6. 如權利要求1所述的方法，若存在該HLA-B*38:02等位基因，即表示該患者發(fā)展出該 藥物不良反應的風險相較不具該等位基因者的勝算比大于20。7. 如權利要求1所述的方法，若存在該HLA-DRB1*08:03等位基因，即表示該患者發(fā)展出 該藥物不良反應的風險相較不具該等位基因者的勝算比大于6。8. 如權利要求1所述的方法，若同時存在該HLA-B*38:02等位基因及該HLA-DRB1*08:03 等位基因，即表示該患者發(fā)展出該藥物不良反應的風險相較不具該兩種等位基因者的勝算 比大于48。9. 如權利要求1 一 8中任一項所述的方法，其中該抗甲狀腺藥物為硫代酰胺類藥物。10. 如權利要求9所述的方法，其中該硫代酰胺類藥物選自：甲硫咪唑、卡比馬唑、丙硫 氧嘧啶及其任意組合。11. 如權利要求1 一 8中任一項所述的方法，其中該生物檢體為核酸。12. 如權利要求1 一 8中任一項所述的方法，其中該生物檢體為基因組DNA。13. 如權利要求1 一8中任一項所述的方法，其中該生物檢體選自：血液、尿液、唾液、毛 發(fā)及其任意組合。14. 如權利要求1 一 8中任一項所述的方法，其中該患者為亞洲人。15. 如權利要求1 一 8中任一項所述的方法，其中該患者為華人。16. 如權利要求2 - 3中任一項所述的方法，其中該等效基因標記選自：限制性片段長度 多態(tài)性、微衛(wèi)星標記、單核苷酸多型性標記及其任意組合。17. -種用以執(zhí)行如權利要求1所述評估方法的裝置，該裝置包含至少一探針，該探針 可偵測該HLA-B*38:02等位基因或該HLA-DRB1*08:03等位基因。18. 如權利要求17所述的裝置，其中該探針可偵測該HLA-B*38 :02等位基因或該!11^-DRBl *08:03等位基因的一種等效基因標記。19. 如權利要求17所述的裝置，其中該探針可偵測單核苷酸多型性標記rsl7193122、 rsl40833037、rs34531986、rsll6869525、rsll7921525Srsll7968912。20. 如權利要求17 -19中任一項所述的裝置，其中該探針包含一寡核苷酸，該寡核苷酸 特異性與該HLA-B*38:02等位基因或該HLA-DRB1*08:03等位基因相結合。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886609SQ201610087573
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年2月16日
【發(fā)明人】張?zhí)焘x, 楊偉勛, 范盛娟, 陳沛隆, 施翔蓉
【申請人】陳沛隆, 中央研究院