專利名稱：藥物監(jiān)測方法
專利說明藥物監(jiān)測方法 定性和定量測定法在生命科學的不同領域中具有巨大重要性。本發(fā)明一般涉及測定生物流體中藥物化合物的試劑和方法。特別地，提供了測定存在于樣品中活性成分例如藥物化合物的量或濃度的生物測定法。此外，提供了得到識別化合物的藥物活性代謝物的結合劑的方法。相應的結合劑是藥物監(jiān)測法中有價值的工具。
在藥理學中，使用許多藥物，而不監(jiān)測血中濃度或其它體液，因為其劑量一般可以根據患者接觸該物質的臨床反應改變。然而，該方法因一些藥物而是不可能的或至少是困難的，因為藥物水平不充分會導致治療不足或耐受性，而過度水平可以是毒性的和/或損害組織。治療藥物監(jiān)測是專項于測定血液或其它生物樣品中藥物水平化學分支。其主要著重于具有窄治療指數的藥物，即易于劑量不足或超劑量的藥物。為了提供優(yōu)化的治療，監(jiān)測相應的藥物由此是有益的。通常需要藥物監(jiān)測的相應藥物實例是抗-感染藥例如慶大霉素和萬古霉素；氨基糖苷抗生素；免疫抑制劑例如環(huán)孢素、依維莫司；抗癲癇藥；抗精神病藥例如氯氮平和鋰、抗癌藥、地高辛等。
為了實現治療效果，特別應以提供充分抑制所涉及的酶的劑量施用作為酶抑制劑起作用的藥物。然而，由于患者代謝改變，所以劑量需求也可以在患者之間顯著改變。AEB071是典型和新的蛋白激酶C(PKC)同種型的選擇性和強效抑制劑，其具有的ki值在nM范圍。
前體藥物是以具有較低乃至無藥物活性的形式施用的藥物化合物。一旦施用，前體藥物就在體內被代謝成活性化合物。前體藥物應用背后的原理一般是吸收、分布、代謝和排泄(ADME)優(yōu)化。就前體藥物而言，通常有必要監(jiān)測足量前體藥物被轉化成藥物活性代謝物以得到治療效果。
在藥物監(jiān)測上下文中的術語“母體藥物”通常表示對患者施用時藥物的分子結構。一旦被吸收，母體藥物就可以進行稱作生物轉化(代謝)的化學改變，從而產生稱作代謝物的改變的分子。腸壁和肝包含最高濃度的代謝酶，它們通常被描述為微粒體酶，因為它們集中于細胞內質網內的小囊泡中。然而，酶是遍在的并且在無數其它部位催化生物轉化。
母體藥物及其代謝物可以具有可變程度的藥理學活性，稱作活性或無活性，并且其毒性也可以改變。例如，作為母體因為起作用的鎮(zhèn)靜藥可以被轉化成三種無活性的代謝物，還可以被轉化成有活性的和鎮(zhèn)靜的，而另一種是有活性的和心臟毒性的。此外，這些分子形式各自可以顯示改變的分布和消除模式。這些代謝改變使得藥物化合物的藥物活性濃度的檢測變得困難，因為如果在檢測測定中無活性代謝物得到識別，可能產生錯誤的結果。
為檢測小分子特別設計監(jiān)測/免疫測定法可能是一種挑戰(zhàn)。這種小分子通常缺乏抗原性，使得難以產生例如結合小分子的抗體。為了增加小分子的免疫原性，可以使較大抗原化合物例如蛋白質或多肽類與藥物綴合。
為了監(jiān)測藥物化合物，開發(fā)了監(jiān)測某一濃度藥物在患者中的治療效果的診斷工。大部分已知藥物監(jiān)測方法利用結合藥物化合物的抗體，推定它用于患者樣品中的檢測/監(jiān)測。然而，有效監(jiān)測極為困難，因為藥物活性形式與例如無活性代謝物之間的正確區(qū)分對測定化合物的治療活性濃度而言是重要的。與無活性代謝物相應的交叉反應性相關的問題是現有技術中眾所周知的(例如參見Rentsch等，2006Therapeutic drug monitoring derImmunsuppressiva)。
本發(fā)明的目的在于提供具有低概率檢測藥物化合物無活性代謝物的藥物監(jiān)測法。本發(fā)明的目的還在于提供用于研發(fā)相應特異性藥物監(jiān)測法，特別是用于生產適合結合劑的方法，所述結合劑例如特異性識別所監(jiān)測化合物的活性形式的抗體。本發(fā)明的目的還在于鑒定和提供高概率特異性結合化合物AEB071的藥物活性形式的適合結合劑。相應結合劑可以用于AEB071的藥物監(jiān)測法。
本發(fā)明的第一個實施方案提供了得到至少一種結合劑的方法。該結合劑結合至少一種母體化合物的藥物活性形式的特異性高于結合所述母體化合物的藥物無活性形式，該方法包括 (a)通過屏蔽所述母體化合物的部分所述藥物活性形式制備所述母體化合物的所述藥物活性形式的至少一種衍生物； (b)使用所述衍生物得到結合所述衍生物的一組結合劑； (c)從所述結合劑組中選擇至少一種結合劑，該結合劑結合所述衍生物以及至少一種所述母體化合物的藥物活性形式。
本發(fā)明的一個方面涉及提供至少一種結合劑，它特異性結合藥物化合物的藥物活性形式并且具有結合無活性代謝物的低概率。
為了得到相應的特異性結合劑，本發(fā)明使用得到/獲得相應結合劑的確定方法。根據一個重要的方面，不將母體化合物用于得到所述結合劑，而是使用特別設計的其衍生物。
基于母體化合物的結構設計衍生物，使得它們具有產生結合劑的最高概率，這些結合劑可以識別母體化合物的藥物活性形式，而具有識別母體化合物的藥物無活性代謝物的最低概率。為了達到該效果，使化合物的一些部分與結合劑屏蔽。通過使用相應屏蔽結構，結合劑無法接近分子的屏蔽區(qū)。這具有可以得到定向于非屏蔽的且由此易于接近的分子部分的結合劑的效果。在本發(fā)明的一個實施方案中，分子未屏蔽的部分相當于代謝作用可以使化合物失活這樣的分子位置。因此，可以得到識別相當于分子活性化學結構的化學結構的結合劑。因此，如果代謝變化改變了結合劑所識別的分子部分，則結合劑的結合至少減少或完全被阻止。這種措施確保了結合劑對結合劑所識別的位置上的活性化學結構更具有特異性。
為了證實分子指定位置至少部分被結合劑所識別，可以設計包含屏蔽結構的衍生物，所述屏蔽結構屏蔽所關注的代謝位置。相應衍生物可以用于分析結合劑是否對指定位置具有高度特異性，因為本發(fā)明方法得到的特異性結合劑不應結合或可以以較低特異性結合所述衍生物，其中所述代謝位置被屏蔽。這種衍生物可以構成選擇極具特異性結合劑的有價值的工具。
然后，那些結合劑選自得到的結合劑組，它們結合母體化合物的衍生物和藥物活性形式。這種選擇對消除例如識別屏蔽結構且由此對分子不具有特異性的結合劑而言是重要的。相應選擇例如可以通過如下文進一步詳細描述的競爭性測定法進行。這種方法能夠優(yōu)化對一些化合物、特別是通過使用標準方法產生的小化合物具有特異性的結合劑的產生。
就推定產生對母體化合物的確定活性代謝物具有特異性的結合劑而言(就前體藥物而言)，當設計衍生物與所檢測活性代謝物的化學結構非常類似時，母體化合物的化學結構可以改變。這確保了結合劑識別指定靶標，即活性代謝物的正確化學結構。這種模擬活性代謝物化學結構的修飾的結構在相應的衍生物上未被屏蔽，而是暴露且由此易于接近，從而確保了生成結合劑，它們在母體化合物在體內被轉化成活性代謝物時特異性識別/結合化學改變的這一分子部分。可以從使用相應衍生物得到的結合劑組中選擇特異性識別母體化合物活性，而不是(無活性)的代謝物化學結構的結合劑。
正如一般介紹中概括的，母體化合物可以具有幾種不同的代謝物，一些可能具有活性，一些無活性。根據一個實施方案，選擇的結合劑識別一種以上母體化合物的藥物活性形式，例如母體化合物及其至少一種其它活性代謝物。然而，就一些藥物或應用而言，重要的是區(qū)分母體化合物的不同藥物活性形式且由此區(qū)分例如活性母體化合物及其至少一種其它藥物活性代謝物。就此而言，選擇結合劑，使得它們以較高特異性結合期望的靶標(母體化合物或活性代謝物)。例如，可以通過使用母體化合物和活性代謝物作為競爭靶標的競爭性結合測定法達到這一目的。因此，可以選擇那些描述對指定靶標具有所需的選擇性的結合劑。
就具有一個以上其中化合物可以通過代謝作用失活的位置的母體化合物而言，可以生成至少兩種衍生物，其中各衍生物在分子的不同位置上屏蔽結合。根據潛在代謝位置數量的不同，可以根據可能導致分子失活的代謝位置數量調整衍生物的數量，以得到一種結合劑，它結合至少一種母體化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合所述母體化合物的藥物無活性形式。
“衍生物”意指推定可以通過一個原子被另一個原子或原子團替代由母體化合物產生的化學化合物或分子。例如，可以基于母體化合物結構，通過一種或多種化學反應(例如連接基連接)制備衍生物。然而，根據修飾類型的不同(例如就母體化合物基本化學結構被修飾以模擬藥物活性代謝物而言)，不同合成途徑可能是必要的。本發(fā)明的衍生物包含修飾，其中母體化合物的某一位置被屏蔽，由此通常防止相應得到識別分子屏蔽部分的結合劑結合。
術語“母體化合物的藥物活性形式”意指母體化合物和藥物活性代謝物。那些化合物中的至少一種需要被結合劑識別，例如母體化合物或其活性代謝物。為了研發(fā)特異性識別活性代謝物的結合劑，推定監(jiān)測前體藥物活性特別有用，因為前體藥物通常以無活性(或活性明顯較低)的形式被施用，然后被代謝成治療活性代謝物。母體化合物還可以在分子的幾個不同位置上失活。因此，至少一種母體化合物的藥物活性形式被結合劑識別。它可以是位點特異性的，因為結合劑僅可以識別分子的一個部分(就抗體而言是表位)。如果母體分子在不同代謝位置上失活-未被結合劑識別/結合-則這種失活可能無法被相應結合劑識別。在這種情況下，識別失活可能發(fā)生的分子不同部分的幾種結合劑可以聯用。然而，這取決于母體化合物和它如何被代謝且由此需要基于每種情況評價。
“藥物活性”特別意指化合物的指定治療效果。然而，該術語還包括其它重要藥理學活性，例如毒性效果。這種情況指的是在一些情況中監(jiān)測例如患者的毒性代謝物，且由此特異性識別毒性代謝物的特異性結合劑可能是有用的。
可以通過使用與分子偶合的化學屏蔽結構屏蔽母體化合物以得到衍生物。這種屏蔽結構可以是適合于阻斷分子那些推定被屏蔽這樣的部分的化學基團。這種阻斷基可以是結合一個或多個母體化合物藥物活性形式(包括其中間體，例如氨基內酰胺類、氨基內酯類等)的羥基、氨基或羧基的任意基團，從而防止在這些基團上發(fā)生反應。當所述衍生物用于得到結合劑時，推定在那些屏蔽位置上特別防止了結合劑結合。通常在存在屏蔽結構時，結合劑可以攻擊/識別屏蔽結構，但不是主要的化學結構。適合的屏蔽結構可以包含連接所屏蔽分子位置的載體。
所述偶合可以通過使用連接基結構進行。適合的連接基可以選自與所述載體的氨基反應的?；鶊F；與所述載體上的硫氫基(巰基)、硫代甲基、咪唑基或氨基反應的烷基化基團，最優(yōu)選馬來酰亞胺基；例如與蛋白質羧基反應的酯和酰胺形成基團；與所述肽單元上的硫氫基反應的二硫化物形成基團，例如5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸酯)基團、鄰-吡啶基二硫化物和烷基硫醇基、二羰基，例如環(huán)己二酮基和其它1，2-二酮基；與酚基反應的重氮基。連接基可以被適合的例如具有2-20個C原子、優(yōu)選2-10個C原子的烷基延長。特別適合的連接基用于衍生物A和B(參見下文)中，它們也可以用于得到不同母體化合物的衍生物。
母體化合物可以是小分子。正如介紹中概括的，得到用于檢測小分子的結合劑特別具有挑戰(zhàn)性，因為難以得到針對小分子的結合劑。由于這一原因，所以當獲得抗體時使用載體是有益的。
母體化合物可以選自免疫抑制劑、抗感染藥、抗癲癇藥、抗精神病藥和抗癌藥。這些藥物特別難以給藥，且因錯誤劑量導致的效果可能很嚴重。這種情況特別適用于移植中使用的免疫抑制劑。因此，監(jiān)測相應化合物特別有益。然而，通過本發(fā)明方法可以監(jiān)測任意藥物化合物/用于得到特異性結合劑。
根據一個實施方案，母體化合物是小分子。正如介紹中概括的，小分子難以監(jiān)測。然而，本發(fā)明能夠得到針對小分子的特異性結合劑。根據一個實施方案，小分子是蛋白激酶C(PKC)抑制劑。根據一個也用于所述實施例的實施方案，母體化合物AEB071用作推定監(jiān)測的母體化合物。該化合物具有如下化學結構
該化合物(PKC抑制劑)是具有改善治療窗/特性的免疫抑制劑。
為了得到能夠監(jiān)測樣品中AEB071的適合結合劑，可以使用至少一種衍生物，其具有如下化學結構
屏蔽結構例如載體可以連接例如位置X1和/或X2。就此而言，在不連接屏蔽結構的情況中，X1和/或X2可以是氫。至少一個X1和X2包含相應屏蔽結構。如上所述，偶合可以通過連接基結構進行。
根據一個實施方案，衍生物A和/或B用作生成結合劑的衍生物 衍生物A
衍生物B
在實施本發(fā)明方法時這些衍生物特別用于得到對母體化合物AEB071具有特異性的結合劑。
優(yōu)選通過分析存在母體化合物藥物活性形式是否抑制結合劑結合衍生物選擇本發(fā)明方法的選擇步驟(c)，其中選擇那些具有最高概率結合母體化合物的藥物活性形式的結合劑。進行相應分析的適合方法是使用衍生物的競爭性結合測定法，所述衍生物作為結合配偶體與作為所述結合劑靶標的母體化合物的藥物活性形式競爭。進行相應競爭性結合測定的一個實施方案是免疫測定法，例如ELISA測定法。然而，其它免疫測定法也可以用于這種分析。因此，根據本發(fā)明方法的一個實施方案，進行免疫測定法以測定結合劑的結合特異性。
根據一個特別適合的實施方案，在母體化合物具有一個以上代謝位置的情況中，所述代謝位置可以因代謝作用被失活或化合物較大，由此提供幾個用于結合劑的表位，在步驟(c)中選擇至少一種結合劑，它特異性結合母體化合物的藥物活性形式，得到針對它的衍生物，并且也結合母體化合物的至少一種不同衍生物，該衍生物屏蔽非第一種衍生物的分子的不同部分，但保留作為第一種衍生物暴露的同一分子部分。通過對結合劑與不同衍生物的結合模式進行對比分析，可以確定當母體分子的不同部分與所用各衍生物中的結合屏蔽時，母體分子藥物活性形式的特定部分被結合劑結合/識別。還可以通過生成分子指定/推定代謝位置被屏蔽的衍生物確定或分析化合物的結合區(qū)(即就抗體而言是表位)。對所述屏蔽區(qū)具有特異性的結合劑不結合相應衍生物。因此，這種代謝位置被屏蔽的衍生物可以用于證實得到的結合劑的特異性。
根據一個實施方案，選擇步驟(c)中的結合劑，它區(qū)分AEB071分子及其活性代謝物，具有如下結構 化合物C
正如可以觀察到的，存在于AEB071t中的哌嗪環(huán)上的甲基在化合物C中不存在。如本文所述，可以通過如本文所述在母體化合物AEB071與化合物C之間的競爭性測定選擇適合的結合劑。
可以通過篩選結合劑文庫得到適合的結合劑，以鑒定/得到結合根據本發(fā)明教導制備的衍生物的結合劑。用于相應結合劑文庫的實例例如是展示出結合劑的噬菌體噬菌粒文庫。得到例如體外抗體的方法還描述在Hudson，PJ和Souriau，C.(2003)Engineered antibodies.Nat.Med.9，129-134)中，將該文獻引入本文作為參考。
結合劑可以具有任意結構，條件是它們能夠特異性識別和結合靶標。結合劑可以選自具有結合功能的抗體、抗體片段或其變體，具有提供結合功能的蛋白質骨架的結合劑，例如抗促成素。具有與抗體類似結合功能的結合劑綜述在Hey等Artificial，non-antibody binding proteins forpharmaceutical and industrial application，Trends in Biotechnology，Vol23 No.10，2005年10月，514-522頁中給出，將該文獻引入本文作為參考?？贵w片段是包含至少20種來自所述完整抗體的氨基酸，優(yōu)選至少100種仍然具有結合容量的氨基酸的抗體的任意片段。在優(yōu)選的實施方案中，該抗體片段包含抗體結合區(qū)例如Fab片段，F(ab)2片段，包含多個結合結構域的多鏈抗體(multibodies)例如雙抗體、三鏈抗體或四鏈抗體，單結構域抗體或親和抗體(affibodies)?？贵w變體是具有相同結合功能，但例如改變的氨基酸序列的抗體衍生物或抗體片段。
根據一個實施方案，結合劑是抗體。抗體的應用具有如下優(yōu)點它們易于通過例如對動物施用上述衍生物產生對所述衍生物的特異性免疫原性應答生成。
動物可以選自小鼠、大鼠、家兔、小雞、豚鼠、山羊和綿羊。抗體可以是單克隆或多克隆抗體。得到相應抗體的適合方法描述在Ed Harlow和David Lane的“Antibodies-A laboratory Manual”，1988和/或W.C.Davies的“Monoclonal antibody protocols”，1995中，將這些文獻引入本文作為參考。由于單克隆抗體的較高特異性，所以通常優(yōu)選單克隆抗體?？梢酝ㄟ^從使用所述衍生物免疫接種動物中回收產生至少一種抗體的細胞、使所述產生抗體的細胞無限增殖并且從抗體產生的無限增殖細胞分離單克隆抗體得到單克隆抗體。
可以用于本發(fā)明上下文的適合載體包括蛋白質、糖蛋白、復合多糖體和顆粒。各種蛋白質可以用作載體。這些蛋白質包括但不限于清蛋白和血清蛋白，例如球蛋白、目鏡蛋白、脂蛋白等。示例蛋白包括牛血清清蛋白(BSA)、鑰孔戚血藍蛋白(KLH)、卵清蛋白(ova)、牛血清丙種球蛋白(BGG)和類似蛋白。還可以使用合成載體。適合的多糖例如是淀粉、糖原、纖維素或碳水化合物樹膠可以用作載體。特別優(yōu)選載體在屏蔽中的應用，條件是推定動物免疫接種小分子，因為載體增加化合物的免疫原性。
由于使用上述方法，所以可以得到適合的結合劑，其結合至少一種母體化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合所述母體化合物的藥物無活性形式。本發(fā)明的一個關鍵要素在于設計上文具體描述的衍生物。相應結合劑由此非常適用于高度靈敏性和可靠的藥物監(jiān)測法。設計/選擇本發(fā)明的結合劑，使得它們主要結合母體化合物的活性形式。在一些實施方案中，設計它們，使得其甚至能夠區(qū)分活性代謝物的不同形式。這種特異性是重要的優(yōu)點，因為它防止了偶然檢測到可能干擾得到的藥物監(jiān)測結果的母體化合物的無活性代謝物。
另外，本發(fā)明提供了相應設計的衍生物和得到的結合劑?？梢匀缢龅耐ㄟ^修飾母體化合物，使得母體分子無代謝作用或無相關代謝作用發(fā)生可以使母體化合物失活這樣的部分被屏蔽，得到所述衍生物。這具有獲得針對化合物相關部分的結合劑的效果。根據母體化合物大小的不同，還可以生成幾種衍生物，以便通過生成變體衍生物依次屏蔽母體化合物的所有部分。代謝失活這樣的部分通常保持不被屏蔽。可以通過測試所述結合劑與所述衍生物的交叉反應性選擇特異性結合所有衍生物中易接近(不被屏蔽)的分子部分的結合劑。
本發(fā)明特別提供了具有如下基本結構的AEB071衍生物
其中X1和/或X2模擬屏蔽結構的偶合位置或是氫。至少一個位置X1或X2攜帶屏蔽結構，如上所述，例如載體可以作為屏蔽結構與化學骨架通過連接基結構偶合。發(fā)現在位置X1和/或X2上屏蔽母體分子AEB071產生衍生物，它們能夠生成結合劑，這些結合劑對母體化合物非常具有特異性且由此針對藥物活性化合物。由于這些衍生物的確定屏蔽模式，其中謹慎選擇連接基結構的連接點以保持潛在代謝位置可接近，所以這些衍生物是生成對母體化合物具有特異性的結合劑的有價值的工具。
相應衍生物的確定實例是衍生物A和衍生物B 衍生物A
衍生物B
通過本發(fā)明教導提供的還有具有如下結構的AEB071變體 化合物C
可以使用這種變體-如上所述-以結合使母體化合物AEB071所具有的特異性高于結合活性代謝物化合物C的抗體。為了進行相應測試，例如，可以使用可檢測標記或載體提供這種化合物。
本發(fā)明還提供了通過所述篩選方法得到的結合劑。根據尤其適合于監(jiān)測/檢測母體化合物AEB071的一個實施方案而言，通過使用上述定義的AEB071衍生物之一-特別是衍生物A和/或衍生物B選擇結合劑。根據一個實施方案，所述結合劑結合母體化合物AEB071所具有的特異性高于結合化合物C。優(yōu)選所述結合劑是選自2G8、4G4、3A3或6B11的抗體。本發(fā)明優(yōu)選的抗體是4G4、3A3。
本發(fā)明的另一個方面提供了藥物監(jiān)測方法，其包括 -使推定包含至少一種母體化合物的藥物活性形式的樣品接觸至少一種結合劑； -通過使用至少一種結合劑測定所述母體化合物的所述藥物活性形式的濃度，所述結合劑結合所述母體化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合所述化合物的藥物無活性形式。
可以通過上述方法得到可以用于相應測定法的適合結合劑。上文詳細描述方法的關鍵要素在于適合衍生物的電腦虛擬在先設計，所述衍生物生成識別失活可能發(fā)生所述分子的代謝關鍵部分的結合劑，通過使用競爭性實驗選擇結合所述衍生物和母體化合物藥物活性形式的結合劑，由此得到識別母體化合物藥物活性形式的結合劑。
在本發(fā)明的藥物監(jiān)測法中，可以進行競爭測定以使用靶子化合物作為結合結合劑的配偶體測定濃度，所述配偶體競爭所述結合劑結合存在于生物樣品中的母體化合物的藥物活性形式(如果存在)。如果藥物活性形式在樣品中不存在，則沒有相關結合發(fā)生。所述樣品可以是獲自監(jiān)測患者，例如獲自已經服用AEB071的移植患者的生物樣品。
根據一個實施方案，通過使用標準校準曲線比較從結合測定中得到的結果測定樣品中母體化合物的至少一種藥物活性形式的濃度。可以通過使用連續(xù)稀釋的母體化合物或其活性形式生成校準曲線得到相應標準曲線。然后可以將獲得的生物樣品值與標準曲線比較，由此能夠測定存在于樣品中的母體化合物的藥物活性形式的濃度。
根據一個實施方案，被結合劑識別的母體化合物的藥物活性形式或其衍生物與可檢測標記綴合，并且這種綴合物能夠與存在于樣品中的所述母體化合物的藥物活性形式競爭結合劑的結合。當所述化合物以治療藥物監(jiān)測濃度存在時，所述標記提供所述母體化合物的所述藥物活性形式的信號指示。相應技術的實例例如是熒光偏光免疫測定(FPIA)、克隆的酶供體免疫測定

化學發(fā)光異源免疫測定(CMIA)。當然，其它同源或異源免疫測定也可以用于測定這種樣品中母體化合物的濃度。本文給出的實例由此是非限制性的。
根據一個實施方案，靶標是用于得到結合劑或被具有相同特異性的結合劑識別的其變體。用于與所分析樣品中母體化合物的藥物活性形式競爭結合劑結合的靶標由此可以是用于得到相應結合劑的衍生物。這確保了所述競爭劑被具有最高特異性的結合劑結合。然而，還能夠使用所述衍生物的變體，它被優(yōu)選具有相同特異性的結合劑識別。變體的應用是切實可行的，條件是它例如有利于測定(例如通過使用不同的載體)。
根據一個實施方案，用于進行競爭測定的結合劑攜帶可檢測標記。然后，例如，一旦加入樣品并且在進行適當孵育和洗滌步驟后，就可以通過測定樣品中標記的減少測定樣品中母體化合物的藥物活性形式的濃度。
根據另一個實施方案，將與母體化合物競爭結合劑結合的靶標固定在基質上。所述基質可以具有任意的類型，例如芯片、包含多孔的培養(yǎng)板、柱或任意其它適合的基質。例如，可以將用于得到結合劑的衍生物或仍然被結合且由此被結合劑識別的其變體都固定在所述基質上。使相應制備的基質在推定包含至少一種母體化合物藥物活性形式的樣品存在下接觸結合劑。或者，可以反向進行測定并且將結合劑固定在基質上。
然后，檢測在樣品存在下所述結合劑與固定在基質上的衍生物/靶標結合。為了檢測，可以加入第二種結合劑，它識別第一種結合劑并且攜帶可檢測標記。就此而言，固定結合劑而非衍生物/靶標，將衍生物/靶標加入到測定中并且相應地檢測。通過檢測所述第二種結合劑的所述可檢測標記進行檢測。
因此，根據一個實施方案，藥物監(jiān)測法包括標記的結合劑和/或其中加入第二種結合劑，它識別第一種結合并且其中第二種結合劑攜帶可檢測標記。
可以通過免疫測定法進行檢測。進行相應免疫測定法的適合形式是ELISA。
可以使用藥物監(jiān)測法監(jiān)測的適合的母體化合物如上所述并且可以選自免疫抑制劑、抗-感染藥、抗癲癇藥、抗精神病藥和抗癌藥。
還可以使用本發(fā)明的藥物監(jiān)測法監(jiān)測小分子?？梢韵鄳O(jiān)測的適合的小分子和用于該目的的適合結合劑如上所述；我們參考了上述披露內容。
根據本發(fā)明的一個實施方案，所監(jiān)測的母體化合物是小分子PKC抑制劑AEB071。為了檢測生物樣品中的母體化合物，可以使用一般如上所述的AEB071衍生物，特別是衍生物A和/或衍生物B?？梢匀绫疚乃鰧⒀苌锕潭ㄔ诨|上。衍生物可以包含載體分子。相應的測定法優(yōu)選具有1-500或1-300ng/ml或2-250ng/ml的工作范圍。
優(yōu)選可以通過上述方法得到并且用于本發(fā)明測定法的所述結合劑是選自2G8、4G4、3A3或6B11的抗體。
本發(fā)明還提供了用于測定樣品中至少一種母體化合物的藥物活性形式的濃度的診斷試劑盒，其包含至少一種結合劑，它結合母體化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合母體化合物的藥物無活性形式；和任選用于測定所述樣品中所述母體化合物的所述藥物活性形式濃度的試劑。
適合的結合劑如上所述和如權利要求中所述。所述診斷試劑盒還可以包含基質，其中用于所述結合劑的靶標或結合劑固定在所述基質上?？梢詫⑷缟鲜龊蜋嗬笾兴龅腁EB071衍生物或被具有相同特異性的結合劑識別的其變體固定在基質上。
用于診斷試劑盒的所述結合劑和/或競爭靶標可以攜帶可檢測標記。然而，還可以使用第二種結合劑，它結合攜帶可檢測標記的所述結合劑或競爭靶標。
還提供了基質，它具有如權利要求所定義的衍生物或如權利要求所定義的固定在其上的結合劑。相應的基質用于所述藥物監(jiān)測法。
可以根據本發(fā)明教導使用的標記是產生或可以被誘導產生可檢測信號的任意分子。該標記可以與分析物、免疫原、結合劑、示例地由上述方法產生的結合劑或由此具有特異性的第二種結合劑或另一種分子綴合，所述另一種分子例如可以結合受體的分子例如配體，特別是半抗原。標記的非限制性實例包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制劑、輔酶、催化劑、熒光團、染料、化學發(fā)光劑、發(fā)光劑、致敏物、無磁性或磁性顆粒、固體支持物、脂質體、配體、受體和半抗原放射性同位素。
術語“樣品”或“生物樣品”意指推定包含母體化合物的藥物活性形式的樣品。它包括但不限于來自活物或在先活物的任意量的物質。這種活物包括但不限于人、小鼠、猴子、大鼠、家兔、馬和其它動物。這種物質包括但不限于血液、血清、尿、淚、細胞、器官、組織、骨、骨髓、淋巴、淋巴結、滑液組織、軟骨細胞、滑液巨噬細胞、內皮細胞和皮膚。
本發(fā)明還提供了用于測定樣品中至少一種母體化合物的藥物活性形式的濃度的診斷試劑盒，其包含至少一種結合劑，它結合母體化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合母體化合物的藥物無活性形式，以便測定所述樣品中母體化合物的所述藥物活性形式的濃度。
可以通過上述方法得到結合劑。適合的結合劑還描述在權利要求9-12中。所述診斷試劑盒還可以包括適合的緩沖液、試劑和使用說明書。
根據一個實施方案，診斷試劑盒包含基質，其中用于所述結合劑的靶標或結合劑自身固定在所述基質上。如上所述，可以用于得到結合劑的衍生物可以用作靶標?；蛘?，可以使用被具有相同特異性結合劑識別的其變體。
用于檢測生物樣品中母體化合物濃度的幾種適合的方法如上所述。根據所用檢測方法的不同，結合劑、競爭靶標和/或識別結合劑或競爭靶標的第二種結合劑攜帶可檢測標記。診斷試劑盒特別用于監(jiān)測AEB071。適合的實施方案如上所述并且也可以用于診斷試劑盒。
本發(fā)明還提供了基質，它攜帶上述AEB071衍生物且特別是衍生物A(BJC)和/或衍生物B(BJC)或通過上述篩選方法得到的結合劑。適合的實例如上所述。這些衍生物可任選攜帶適合的載體。
實施例 現在通過實施例，使用為建立藥物監(jiān)測方法生成的針對AEB071的適合結合劑進一步詳細描述本發(fā)明。
1.衍生物的設計 為了得到適合的結合劑，此處生成特異性結合母體化合物AEB071活性形式的抗體、兩種衍生物即衍生物A(BJC)和衍生物B(BJA)(結構如上)。這兩種衍生物是修飾的在兩個不同位上具有活化連接基的AEB071形式。選擇兩種衍生物以便以最高概率生成識別母體化合物AEB071和最低概率識別AEB071的藥物無活性代謝物的抗體。為了得到相應抗體，通過使KLH載體蛋白與相應位點綴合屏蔽分子的一些部分。所述載體防止抗體對屏蔽部分生成和增加免疫原性。通過使用這種原理，可以通過適當設計衍生物預先設計針對相關代謝作用發(fā)生的化合物的潛在決定位置的抗體特異性。衍生物的設計確定了易影響母體化合物的可利用抗原結合位點。
2.對衍生物具有特異性的抗體產生 按照標準方法(參見上文)衍生物的相應綴合物用于家兔和小鼠的各免疫接種。
在家兔中生成多克隆抗血清(pAb)，并且在各加強接種后測試與衍生物綴合物的反應性。最終加強接種對固定化化合物進行親和純化。
類似地，生成針對綴合物的單克隆小鼠抗體(mAb)。由選擇的克隆的雜交瘤細胞系生產抗體。生產針對兩種衍生物的pAb和mAb。
通過直接ELISA方法對pAb血清、雜交瘤上清液和純化的pAb和mAb進行特異性結合抗原分析。
3.AEB071特異性抗體的選擇 選擇那些抗體用于進一步測試，它們在高度稀釋測試下特異性結合母體化合物AEB071的綴合衍生物及其母體化合物。得到的數據顯示mAb和pAb是那些化合物結合測定的高度有效的特異性工具，特別是AEB071在藥物監(jiān)測法中使用它們。
在選擇和純化步驟過程中，測試與母體化合物AEB071結合。該過程通過測試游離藥物AEB071抑制抗體結合BJC或BJA綴合物進行。發(fā)現、相應地選擇展示出被游離藥物AEB071高抑制百分比的抗體。就mAb而言，選擇分別具有不同結合抑制特征的一定范圍的抗體用于進一步評價。
游離藥物AEB071的抑制表明抗體不僅識別所述衍生物或其包含載體的綴合物，而且識別游離藥物且由此識別母體化合物。這對研發(fā)AEB071監(jiān)測法，特別是免疫測定法而言是重要的，其對活性化合物具有特異性。
選擇游離藥物幾乎完全抑制結合這樣的抗體確保了大部分抗體識別母體化合物而非所述衍生物的連接基或載體蛋白。因此，基于AEB071競爭性結合不同綴合或標記BJC或BJA衍生物的監(jiān)測法是切實可行的。相應競爭性方法的適合實例如上所述并且也是眾所周知的。
具有不同抑制特征的抗體生成能夠選擇用于研發(fā)測定法的抗體，這些測定法能夠分析寬范圍的AEB071濃度。此外，獲得各種相應抗體還能夠選擇可以區(qū)分母體化合物與不同活性代謝物這樣的抗體。
合并了游離藥物觀察到的抑制的進行的直接綴合結合測定法顯示基于來自動物或患者的樣品中游離藥物或緊密相關化合物抑制抗-BJC或抗-BJA抗體結合的測定法切實可行，它用于與基于AEB071已知濃度的校準曲線一起定量。按照這種方式可以可靠地測定樣品中化合物的實際濃度。
通過選擇AEB071衍生物與用于抗體的實施的綴合策略和選擇策略，得到有價值的測定工具用于研發(fā)基于抗體結合靶標的新的監(jiān)測法(特別是免疫測定法)，所述靶標被樣品中所述化合物競爭。當然，也可以使用其它競爭性測定方式，它們中的許多是現有技術中公知的。
單克隆和多克隆抗-AEB071抗體的特異性試驗 產生免疫測定，其中將用于獲得抗體的衍生物與培養(yǎng)板的空孔固定。然后加入選擇的抗體與母體分子AEB071。適當洗滌步驟后，提供使用抗-物種PO(過氧化物酶)抗體并且加入相應底物OPD(鄰苯二胺)檢測抗體與固定衍生物的結合。實驗設置如下 NUNC MaxiSorb 74981培養(yǎng)板用于固定衍生物BJA，它攜帶卵清蛋白載體(ova)。該過程通過混合ova-BJA與pH7，41μg/ml PBS緩沖液進行。將該混合物在4℃下靜置過夜。將該混合物加入到培養(yǎng)板的空孔中。加入200μl Pierce PBS SuperBlock并且在室溫下、在黑暗中將相應培養(yǎng)板振搖1小時。然后用300μl洗滌溶液將培養(yǎng)板洗滌3次。
將抗體和合并了AEB071的抗體加入到各孔中(100μl)并且孵育15-30分鐘。使用下列抗體多克隆抗體(家兔)抗-BJA和抗-BJC。單克隆抗體(小鼠)抗-BJA(2G8和4G4)和抗-BJC(3A3，6B11)。在室溫下、在黑暗中振搖下將孵育進行2小時。然后用300μl洗滌溶液將樣品洗滌3次。然后加入100μl抗-物種-PO抗體并且在室溫下、在黑暗中振搖下孵育1小時。然后用300μl洗滌溶液將樣品洗滌3次。
然后加入底物OPD(100μl)。將1片溶于20ml蒸餾水。
在室溫下、在黑暗中振搖下進行孵育20分鐘。
然后加入100μl終止溶液H2SO42N。
在490nm測定溶液的OD。
使用下列設置 1ug/mL ova-BJA 測試的抗體AEB071抗-物種-po抗體OPD + + - + + + - - + + - + - + +NS1 + + + + + + - + + + 得到下列結果+ 0ng/mL +500ng/mL +200ng/mL + 50 未包被AEB071 AEB071 AEB071 ng/mLNS1 AEB0711 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pAbA 2.0280.993 1.166 1.0340.071 抗 包被 包 被 包 被 包被 未包被 -BJA ova-BJA ova-BJAova-BJAova-BJA pAbB 2.7151.536 1.872 2.2940.067 抗 包被 包 被 包 被 包被 未包被 -BJC ova-BJA ova-BJAova-BJAova-BJA 2G8C 1.9110.120 0.152 0.4690.063包被 包 被 包 被 包被 未包被ova-BJA ova-BJAova-BJAova-BJA 4G4D 2.6280.076 0.089 0.2700.065包被 包 被 包 被 包被 未包被ova-BJA ova-BJAova-BJAova-BJA 3A3E 1.6080.118 0.173 0.4150.058包被 包 被 包 被 包被 未包被 ova-BJAova-BJAova-BJAova-BJA 6B11F 2.112 0.205 0.335 0.779 0.059 包 被 包 被 包 被 包 被 未包被 ova-BJAova-BJAova-BJAova-BJA 測定結果也如

圖1中所示，其中顯示以％OD計的AEB071的抑制率(無AEB 071＝100％OD)。經測定使用AEB071小分子包被并非切實可行，因為該化合物不與培養(yǎng)板適當附著(數據未顯示)。然而，使用攜帶載體的原始衍生物包被(例如卵清蛋白)起作用。因此，衍生物-此處的ova-BJA-與培養(yǎng)板附著。
如果使用未包被(NS1)，則不會得到明顯的信號。因此，背景是低的。此外，抗物種綴合抗體(B0和NS2)不會以非特異性方式結合測定物。這對避免背景而言也是重要的。
當加入AEB071時，全部選擇的抗體結合固定化衍生物得到抑制。這表明所用抗體均對AEB071具有特異性。使用抗體4G4得到最佳特異性。
為了建立可以用作測定未知樣品(例如生物樣品)中AEB071濃度的校準曲線，如下表中所述進行連續(xù)稀釋(孔中的終濃度)。如下制備AEB071對緩沖液中4G4和3A3的抑制曲線 1ug/mL ova-BJA 測試的抗體AEB071抗-物種-po抗 OPD 體 4G411-500 10’000 ng/l 2A31 50’000 + + + + +Bn + + - + +B0 + - + + +NS1 + - - + +NS2 - + - + +NS3 - + + +NS4 各孔中的終濃度如下； 4G4 3A3 在ng/ml緩沖液中的AEB071 110’000 150’000 + + 500 + + 250 + + 125 + + 62.5 + + 31.2 + + 15.6 + + 7.8 + + 3.9 + + 2 + + 1 通過使用這種連續(xù)稀釋，當測定OD時得到如圖2中所述的校準曲線。
曲線A是對抗體4G4與AEB071關系得到的結果的代表。曲線B是對抗體3A3與AEB071關系得到的結果的代表。
圖2說明如下 4-P Fity＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+DA B C D R°2 ○曲線A(曲線4G4@AEB071濃度v...2.058 1.218 12.9980.1080.997 □曲線B(曲線3A3@AEB071濃度v...1.144 1.338 15.3460.1390.996 結果表明使用本發(fā)明方法得到的抗體適合于特異性檢測樣品中的AEB071。抗體4G4顯示甚至比仍然展示可接受特異性的3A3更具有特異性。
權利要求
1.得到至少一種結合劑的方法，該結合劑結合至少一種母體化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合所述母體化合物的藥物無活性形式，該方法包括
(a)通過屏蔽所述母體化合物的所述藥物活性形式的部分制備所述母體化合物的所述藥物活性形式的至少一種衍生物；
(b)使用所述衍生物得到結合所述衍生物的一組結合劑；
(c)從所述結合劑組中選擇至少一種結合劑，該結合劑結合所述衍生物以及至少一種所述母體化合物的藥物活性形式。
2.根據權利要求1的方法，其中用屏蔽結構化學修飾衍生物的部分，使得所述母體化合物的所述藥物活性形式的至少一部分接近結合劑，其中所述母體化合物的所述藥物活性形式在哺乳動物中被代謝。
3.根據權利要求1或2的方法，其中制備至少兩種用于得到結合劑的衍生物，其中衍生物各自在不同于另一衍生物的分子位置上攜帶屏蔽結構。
4.根據權利要求1-3中至少一項的方法，其中所述母體化合物是AEB071。
5.根據權利要求4的方法，其中通過使用選自下組化合物的衍生物得到所述結合劑
(a)
其中X1和/或X2獨立地表示屏蔽結構的偶合點或氫，且其中至少一個X1或X2攜帶屏蔽結構；
(b)BJC
(c)BJA
6.根據權利要求1-5中至少一項的方法，其中通過分析存在的至少一種母體化合物的藥物活性形式是否競爭性抑制結合劑與所述衍生物結合進行選擇步驟(c)。
7.根據權利要求1-6中至少一項的方法，其中在選擇步驟(c)中，選擇至少一種選自下組的結合劑
(a)結合劑，其結合
-至少一種母體化合物的藥物活性形式，
-得到的針對它的衍生物，和
-至少一種由母體化合物生成的第二種衍生物，其中母體化合物的不同部分在所述的第二種衍生物中被屏蔽；
(b)結合劑，其結合
-至少一種母體化合物的藥物活性形式，
-得到的針對它、但不針對如下的衍生物，
-至少一種由母體化合物生成的第二種衍生物，其中母體化合物的不同部分在所述第二種衍生物中被屏蔽。
8.根據權利要求1-7中至少一項的方法，其中生成用于母體化合物各潛在代謝位置的衍生物，它可以使母體化合物失活。
9.通過根據權利要求1-8中至少一項的方法得到的結合劑。
10.用于監(jiān)測樣品中AEB071的藥物活性形式的結合劑，可通過下列步驟得到
(a)使用如權利要求13所定義的至少一種衍生物得到一組結合所述衍生物的結合劑；
(b)從所述組結合劑中選擇結合所述衍生物和AEB071的至少一種藥物活性形式的結合劑。
11.根據權利要求10的結合劑，其中該結合劑結合母體化合物AEB071
和代謝物化合物C
和任選如權利要求13所定義的至少一種衍生物。
12.根據權利要求10或11的結合劑，其中該結合劑是選自2G8、4G4、3A3或6B11或其衍生物或片段的抗體，它們識別同一表位。
13.AEB071衍生物，選自
(a)
其中X1和/或X2獨立地表示屏蔽結構的偶合點或氫，且其中至少一個X1或X2攜帶屏蔽結構；
(b)BJC
(c)BJA
14.藥物監(jiān)測方法，包括
-使推定包含母體化合物的至少一種藥物活性形式的樣品接觸至少一種結合劑；
-測定所述母體化合物的所述藥物活性形式的濃度，
其中至少一種結合劑用于測定所述濃度，該結合劑以較母體化合物的藥物無活性形式更高的特異性與所述母體化合物的藥物活性形式結合。
15.根據權利要求14的藥物監(jiān)測方法，包括根據權利要求9-12中至少一項的結合劑。
16.根據權利要求14或15的藥物監(jiān)測方法，其中被結合劑識別的所述母體化合物的衍生物或母體化合物與可檢測標記綴合，其中所述綴合的母體化合物或其衍生物的配置與樣品中存在的所述母體化合物的藥物活性形式競爭結合劑的結合，且其中所述標記提供所述母體化合物的所述藥物活性形式濃度的信號指示。
17.根據權利要求14-16的藥物監(jiān)測方法，其中所述母體化合物是AEB071。
18.根據權利要求17的藥物監(jiān)測方法，其中用作競爭靶標的衍生物是根據權利要求13的衍生物或其被具有相同特異性的結合劑識別的變體。
19.根據權利要求17或18的藥物監(jiān)測方法，其中使用識別母體化合物AEB071和/或其藥物活性形式的結合劑，且其中該監(jiān)測方法具有1-500或1-250ng/ml的工作范圍。
20.用于測定樣品中母體化合物的至少一種藥物活性形式濃度的診斷試劑盒，其包含至少一種結合劑，該結合劑結合母體化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合母體化合物的藥物無活性形式；和任選用于測定所述樣品中所述母體化合物的所述藥物活性形式濃度的試劑。
全文摘要
通過使用所述母體化合物特別的衍生物描述得到至少一種結合劑的方法，該結合劑結合化合物的藥物活性形式所具有的特異性高于結合化合物的藥物無活性形式。本發(fā)明還涉及相應生成的結合劑和衍生物。此外，提供了使用所述結合劑監(jiān)測所述母體化合物藥物活性形式的藥物監(jiān)測方法。
文檔編號G01N33/94GK101809447SQ200880108447
公開日2010年8月18日 申請日期2008年9月26日 優(yōu)先權日2007年9月27日
發(fā)明者P·阿爾貝恩茨, J-M·格勒內, R·希倫布蘭德, F·勒蓋, P·馬爾巴赫, S·馬羅尼, J·舍弗爾 申請人:諾瓦提斯公司