一種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。該方法通過(guò)邊流加培養(yǎng)邊變溫培養(yǎng)的同步培養(yǎng)方式，在提高酵母細(xì)胞生物量的同時(shí)，大幅提高酵母細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖的積累量，顯著提高酵母海藻糖產(chǎn)率，該方法流加培養(yǎng)和變溫培養(yǎng)一步完成，工藝簡(jiǎn)單、操作方便、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低。
【專利說(shuō)明】
一種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海藻糖是一種非還原性的二糖，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，尤其是那些抗脫水作用的生物體，如一些微生物、耐干旱植物甚至低溫休眠的脊椎動(dòng)物等。由于海藻糖能夠保護(hù)細(xì)胞中的生物大分子免受干燥、高溫、冷凍和高滲透壓等惡劣環(huán)境的破壞，而且海藻糖的這種保護(hù)作用不具有特異性，因而具有“生命之糖”之稱。海藻糖在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。
[0003]海藻糖生產(chǎn)方法有:(I)酶合成法，即利用酶制劑所具有的轉(zhuǎn)糖基作用，在離體條件下作用于底物，合成海藻糖。酶合成法雖具有特異性好、轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，但所用酶制劑需要精制，生產(chǎn)成本高；(2)基因工程法，利用基因工程技術(shù)將海藻糖合成酶基因?qū)胫参锘蛭⑸镏校瑥亩没蚬こ涛⑸锘蜣D(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)海藻糖，但轉(zhuǎn)化率低，副產(chǎn)物多，產(chǎn)品分離困難;(3)微生物發(fā)酵法，即利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖，由于酵母菌易繁殖，胞內(nèi)海藻糖含量較高，提取簡(jiǎn)單，而且海藻糖提取后的酵母菌還可以做成酵母膏等附加產(chǎn)品，早期商品化的海藻糖都是從酵母中提取得來(lái)，當(dāng)前，美國(guó)、捷克等國(guó)家主要是利用酵母生產(chǎn)海藻糖。酵母發(fā)酵法也是國(guó)內(nèi)海藻糖生產(chǎn)的重要方法。
[0004]安寧(碩士論文，論文題目“酵母菌生產(chǎn)海藻糖的研究”，2012年)在優(yōu)化條件下，采用補(bǔ)糖工藝和NaCl脅迫方式經(jīng)過(guò)72 h發(fā)酵培養(yǎng)，酵母胞內(nèi)海藻糖含量達(dá)到了22.9%，但是最終酵母生物量只有23.3 g/L，海藻糖產(chǎn)率僅0.075 g/L.h。專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010146889.6，專利名稱為“一種提高酵母細(xì)胞海藻糖含量的方法”公開(kāi)了一種提高酵母細(xì)胞海藻糖含量的方法:第一步，通過(guò)流加葡萄糖和營(yíng)養(yǎng)鹽溶液進(jìn)行流加培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行變溫培養(yǎng)，提高酵母生物量;第二步，離心收集酵母乳，在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下控溫培養(yǎng)酵母乳，提高酵母胞內(nèi)海藻糖含量(16%以上)。該方法將提高酵母生物量與提高酵母胞內(nèi)海藻糖含量分兩步培養(yǎng)完成，并增加了離心收集酵母乳步驟，操作較復(fù)雜；同時(shí)總發(fā)酵時(shí)間(22-23 h)也較長(zhǎng)，因此海藻糖產(chǎn)率仍不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的主要目的在于克服上述不足，通過(guò)邊流加培養(yǎng)邊變溫培養(yǎng)的同步培養(yǎng)方式，在提高酵母細(xì)胞生物量的同時(shí)，大幅提高酵母胞內(nèi)海藻糖含量，顯著提高酵母海藻糖產(chǎn)率。
[0006]—種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法:S卩:通過(guò)碳源、氮源、磷源流加培養(yǎng)，提高酵母細(xì)胞生物量；當(dāng)酵母細(xì)胞達(dá)到一定生物量后，在流加培養(yǎng)的同時(shí)，提高培養(yǎng)溫度進(jìn)行變溫培養(yǎng)，達(dá)到一步培養(yǎng)提高酵母細(xì)胞生物量、胞內(nèi)海藻糖積累量和海藻糖產(chǎn)率的目的。
[0007]—種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法，通過(guò)邊流加碳源、氮源、磷源培養(yǎng)邊變溫培養(yǎng)的同步培養(yǎng)方式，其特征在于:流加碳源、氮源、磷源。流加碳源選自甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖、蔗糖中的一種或其組合;流加氮源選自硫酸銨、氨水、碳酸氫銨中的一種或其組合;流加磷源選自磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀中的一種或其組合。所述的變溫培養(yǎng)為:在培養(yǎng)溫度28_30°C下培養(yǎng)8-10 h，當(dāng)酵母細(xì)胞生物量達(dá)到一定量后，提高培養(yǎng)溫度到32-40°C繼續(xù)培養(yǎng)3-8 ho
[0008]優(yōu)選地，如上所述的一種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法，其特征在于:控制碳源、氮源、磷源流加速度，使酵母細(xì)胞比生長(zhǎng)速率保持在0.04-0.08 h—1。
[0009]本發(fā)明具有以下的有益效果:通過(guò)邊流加培養(yǎng)邊變溫培養(yǎng)的同步培養(yǎng)方式，在提高酵母細(xì)胞生物量(大于60 g/L，折干計(jì))的同時(shí)，顯著提高酵母細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖的積累量(16%以上，折干計(jì))，大幅提高酵母胞內(nèi)海藻糖產(chǎn)率(大于0.6 g/L.h，折干計(jì))。該方法流加培養(yǎng)和變溫培養(yǎng)一步完成，工藝簡(jiǎn)單、操作方便、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低，為酵母發(fā)酵法生長(zhǎng)海藻糖工藝改進(jìn)奠定了基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0010]以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于實(shí)施例所述的范圍，凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011]實(shí)施例1:
(I)種子培養(yǎng):從活化好的斜面培養(yǎng)基上挑取五環(huán)魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii，CCTCC Ν0:Μ 2013310)接入裝有400 ml液體培養(yǎng)基(含糖量30%糖蜜100份，酵母浸膏0.5份，磷酸二氫鉀1.0份，氯化鉀0.05份，硫酸銨0.5份，硫酸鎂0.06份)的培養(yǎng)瓶中，300C ,180 r/min，搖床培養(yǎng)24-30 h，得到液體種子培養(yǎng)液約400 ml。
[0012](2)發(fā)酵培養(yǎng):采用10 L發(fā)酵罐(SGJ-10L/C生物反應(yīng)器，上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司)，將4 L發(fā)酵培養(yǎng)基(含糖量30%糖蜜100份，酵母浸膏0.5份，磷酸二氫鉀1.0份，氯化鉀0.05份，硫酸銨0.5份，硫酸鎂0.06份)一次性加入到發(fā)酵罐中，滅菌處理后，接種(酵母種子液的接種量應(yīng)控制發(fā)酵罐中初始菌體濃度為40-50 g/L)，碳源(糖蜜)、氮源(氨水)、磷源(磷酸二氫鉀)采用流加方式，具體流加方法為:1.5 L糖蜜(含糖量30%)、0.4 L氨水(10%，v/v)、0.3 L磷酸二氫鉀(8%，w/v)從發(fā)酵開(kāi)始到發(fā)酵12 h左右流加完畢，控制流加速度，使酵母細(xì)胞比生長(zhǎng)速率保持在0.04-0.08 h—1。此外，通風(fēng)量控制在0.4-0.8 vvm，轉(zhuǎn)速控制在250-550 r/min，pH控制在5.0左右，發(fā)酵液中乙醇含量控制在0.5%以下。發(fā)酵過(guò)程中溫度控制方法為:30°C培養(yǎng)8 h后，提高發(fā)酵溫度到35°C，在35°C培養(yǎng)8 h后發(fā)酵結(jié)束，總共發(fā)酵時(shí)間16 ho
[0013]發(fā)酵結(jié)束時(shí)，酵母細(xì)胞生物量(大于60g/L，折干計(jì))，胞內(nèi)海藻糖積累量(17%以上，折干計(jì))，海藻糖產(chǎn)率(大于0.64 g/L.h，折干計(jì))。
[0014]實(shí)施例2:
(I)種子培養(yǎng):同實(shí)施例1。
[0015](2)發(fā)酵培養(yǎng):采用10 L發(fā)酵罐(SGJ-10L/C生物反應(yīng)器，上海聯(lián)環(huán)生物工程設(shè)備有限公司)，將4 L發(fā)酵培養(yǎng)基(含糖量30%糖蜜100份，酵母浸膏0.5份，磷酸二氫鉀1.0份，氯化鉀0.05份，硫酸銨0.5份，硫酸鎂0.06份)一次性加入到發(fā)酵罐中，滅菌處理后，接種(酵母種子液的接種量應(yīng)控制發(fā)酵罐中初始菌體濃度為40-50 g/L)，碳源(糖蜜)、氮源(氨水)、磷源(磷酸二氫鉀)采用流加方式，具體流加方法為:1.5 L糖蜜(含糖量30%)、0.4 L氨水(10%，v/v)、0.3 L磷酸二氫鉀(8%，w/v)從發(fā)酵開(kāi)始到發(fā)酵12 h左右流加完畢，控制流加速度，使酵母細(xì)胞比生長(zhǎng)速率保持在0.04-0.08 h—1。此外，通風(fēng)量控制在0.4-0.8 vvm，轉(zhuǎn)速控制在250-550 r/min,pH控制在5左右，發(fā)酵液中乙醇含量控制在0.5%以下。發(fā)酵過(guò)程中溫度控制方法為:30°C培養(yǎng)10 h后，提高發(fā)酵溫度到350C，在35°C培養(yǎng)6 h后發(fā)酵結(jié)束，總共發(fā)酵時(shí)間 16 h0
[0016]發(fā)酵結(jié)束時(shí)，酵母細(xì)胞生物量(大于65 g/L，折干計(jì))，胞內(nèi)海藻糖積累量(16%以上，折干計(jì))，海藻糖產(chǎn)率(大于0.65 g/L.h，折干計(jì))。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法，其特征在于:通過(guò)邊流加碳源、氮源、磷源培養(yǎng)邊變溫培養(yǎng)的同步培養(yǎng)方式，所述的流加碳源優(yōu)選甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖、蔗糖中的一種或其組合;流加氮源優(yōu)選硫酸銨、氨水、碳酸氫銨中的一種或其組合;流加磷源優(yōu)選磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀中的一種或其組合； 所述的變溫培養(yǎng)為:28-30 °C下培養(yǎng)8-10h后，32-40 °C培養(yǎng)3-8h。2.如權(quán)利要求1所述的一種同步培養(yǎng)提高酵母生物量和胞內(nèi)海藻糖含量的方法，其特征在于:控制碳源、氮源、磷源流加速度，使酵母細(xì)胞比生長(zhǎng)速率保持在0.04-0.0Sr1。
【文檔編號(hào)】C12P19/12GK105861344SQ201610370273
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】陳雄, 李欣, 王志, 代俊
【申請(qǐng)人】湖北工業(yè)大學(xué)