一種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法
【專利摘要】本發(fā)明在植物乳桿菌胞外多糖的基礎(chǔ)上，通過(guò)磺化反應(yīng)提升了其負(fù)電荷供給能力，以DPPH自由基、OH?自由基、O2?自由基清除能力評(píng)價(jià)，所得磺化產(chǎn)物較植物乳桿菌胞外多糖本身具有更優(yōu)的抗氧化活性。而且此改性方法在各類植物乳桿菌胞外多糖中適用性較寬。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)部分類別的植物乳桿菌胞外多糖磺化反應(yīng)后抗氧化活性提升不明顯的問(wèn)題，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選了適于該改性方法的原料胞外多糖，該多糖的磺化反應(yīng)充分、產(chǎn)物均一、結(jié)構(gòu)明確，同時(shí)具有突出的抗氧化活性。此外，以制備方法所表征的該多糖原料，其產(chǎn)率、純度較高，有利于后續(xù)的改性反應(yīng)。本發(fā)明方法流程較短、成本較低，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，滿足規(guī)?；a(chǎn)的工藝要求，極具推廣潛力。CCTCCNO:M201417020140428
【專利說(shuō)明】
一種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及糖類化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及多糖的化學(xué)改性技術(shù)，具體涉及一種 提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)，泛指乳酸菌代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞 外的糖類化合物。由于乳酸菌胞外多糖具有良好的流變性、而且能賦予發(fā)酵食品良好的口 感和風(fēng)味，因此可作為食品工業(yè)的膠凝劑、穩(wěn)定劑、保鮮劑和乳化劑等，目前已廣泛用于乳 制品、飲料、糕點(diǎn)、糖果、冰激凌等食品的生產(chǎn)。此外，有研究表明EPS具有抗腫瘤、降低膽固 醇、延緩衰老、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等作用，因此EPS可能是乳酸菌益生作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
[0003] 抗氧化活性，是指物質(zhì)消除人體內(nèi)氧自由基的能力。有研究表明，體內(nèi)氧自由基含 量過(guò)高將對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生直接、緩慢的損傷，隨時(shí)間推移將累及器官機(jī)能、加速機(jī)體衰老，甚至 導(dǎo)致病變。因此在飲食環(huán)節(jié)如果能攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)，將有助于降低體內(nèi)氧自由 基含量，起到益生作用。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，公認(rèn)具有較強(qiáng)抗氧化活性(0RAC值3000umol TE/g以上）的保健品主 要來(lái)自于植物提取物，包括藍(lán)莓提取物、葡萄籽提取物、優(yōu)質(zhì)蜂膠、高含量茶多酚的茶葉提 取物、白藜蘆醇、輔酶Q10、枸杞提取物、余甘子提取物等。由于植物產(chǎn)品的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，種 植、采收等環(huán)節(jié)較為復(fù)雜，因此現(xiàn)有技術(shù)中此類產(chǎn)品成本較高。不同于植物產(chǎn)品，微生物的 培養(yǎng)一方面不受地域、空間的限制，另一方面生產(chǎn)效率高、產(chǎn)物容易收獲，培養(yǎng)及純化工藝 也便于標(biāo)準(zhǔn)化，因此如果能開發(fā)一種微生物來(lái)源的抗氧化活性物質(zhì)，不僅為消費(fèi)者提供了 一種新的選擇，同時(shí)將顯著降低生產(chǎn)成本。
[0005] 植物乳桿菌(LactobaciIlus plantarum)，屬同型發(fā)酵乳酸菌，革蘭氏陽(yáng)性，兼性 好氧。有研究表明該菌種所產(chǎn)胞外多糖具有抗致病菌、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡以及抗氧化等作 用，然而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此類胞外多糖本身的抗氧化活性普遍偏低，將其作為抗氧化活性類保健 品，效果難以保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種提尚植物乳桿菌胞外多糖抗氧 化活性的化學(xué)改性方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性較低的技術(shù)問(wèn) 題。
[0007] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是當(dāng)采用磺化方法改性植物乳桿菌胞外多糖時(shí)，不 同類別的植物乳桿菌胞外多糖的磺化效果不均一、部分類別的植物乳桿菌胞外多糖再磺化 后其抗氧化活性提升不明顯。
[0008] 本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是當(dāng)采用磺化方法改性植物乳桿菌胞外多糖時(shí)，適 于磺化的多糖難以制備。
[0009] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問(wèn)題是當(dāng)采用磺化方法改性植物乳桿菌胞外多糖時(shí)，適 于磺化的多糖純度較低。
[0010]為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011] -種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法，包括以下步驟：
[0012] 1)取所述植物乳桿菌胞外多糖，以無(wú)水二甲基甲酰胺溶解；
[0013] 2)15~45min后向其中加入三氧化硫吡啶復(fù)合物至終濃度為5~15mg/mL，反應(yīng)2~ 4h〇
[0014] 作為優(yōu)選，還包括步驟3):利用截留分子量為8~HKDa的透析袋透析步驟2)所得 產(chǎn)物，取透析袋內(nèi)容物干燥。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，透析前先將步驟2)所得產(chǎn)物pH調(diào)至 6.5~7.5再透析；更優(yōu)的，pH值是7.0。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述pH的調(diào)節(jié)是利用 4mol/L的NaOH溶液實(shí)現(xiàn)的。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，所述干燥是冷凍干燥。在此基礎(chǔ)上進(jìn) 一步優(yōu)選的，所述透析的持續(xù)時(shí)間是4~6d;更優(yōu)的，透析的持續(xù)時(shí)間是5d。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟2)中所述反應(yīng)的溫度為75~85 °C，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至20~30 °C;其 中更優(yōu)的反應(yīng)溫度是80°C，更優(yōu)的冷卻溫度是25°C。在此基礎(chǔ)上優(yōu)選的，所述冷卻過(guò)程是通 過(guò)冰水浴方式實(shí)現(xiàn)的。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟1)中溶解于無(wú)水二甲基甲酰胺中的植物乳桿菌胞外多糖終濃度為 3~7mg/mL〇
[0017] 作為優(yōu)選，植物乳桿菌胞外多糖溶解于無(wú)水二甲基甲酰胺之后、加入三氧化硫吡 啶復(fù)合物之前，溶液處于震蕩或攪拌狀態(tài)。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟2)所述反應(yīng)過(guò)程中，溶液處于震蕩或攪拌狀態(tài)。
[0019] 作為優(yōu)選，所述植物乳桿菌胞外多糖是通過(guò)以下方法制備的：
[0020] a)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0021] b)向步驟a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以8~HKDa截留分子 量的透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0022] c)以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶 解步驟b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2~3yg/mL，水解；
[0023] d)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度40~60yg/mL，酶解；
[0024] e)而后加入三氯乙酸至終濃度10~15% (w/v)，20~40min后固液分離取上清，透 析，取透析袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0025] 作為優(yōu)選，步驟a)所述的發(fā)酵液是植物乳桿菌厭氧發(fā)酵22~26h時(shí)的發(fā)酵液;更優(yōu) 的，發(fā)酵時(shí)間是24h。
[0026] 作為優(yōu)選，步驟b)中乙醇的加入量是所述上清液體積的1.5~2.5倍;更優(yōu)的，乙醇 加入量是所述上清液體積的2倍.
[0027]作為優(yōu)選，步驟c)中粗多糖的終濃度為4~6mg/L;更優(yōu)的，是5mg/L。
[0028] 作為優(yōu)選，步驟c)所述水解是在35~39°C條件下持續(xù)4~8h;更優(yōu)的，是在37°C條 件下持續(xù)6h。
[0029] 作為優(yōu)選，步驟d)所述酶解是在35~39°C條件下持續(xù)16~20h;更優(yōu)的，是在37°C 條件下持續(xù)18h。
[0030] 作為優(yōu)選，步驟e)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至4~5,再透析;更優(yōu)的，調(diào)節(jié)pH至4.5; 最優(yōu)的，所述調(diào)節(jié)是利用l〇mol/L的NaOH溶液實(shí)現(xiàn)的。
[0031]在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，步驟a)所述的植物乳桿菌，是保藏編號(hào)為 CCTCC M 2014170的植物乳桿菌。此時(shí)該多糖用于人體具有確切的安全保證 [0032]在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，所述的固液分離，是以10000~HOOOrpm的轉(zhuǎn) 速離心15~25min。
[0033]在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，透析的持續(xù)時(shí)間是60~84h;更優(yōu)的，透析的 持續(xù)時(shí)間是72h。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，透析的過(guò)程中每天更換透析袋外的超純水2次。
[0034] 作為優(yōu)選，步驟a)所述的發(fā)酵液，是以MRS培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的。
[0035] 作為優(yōu)選，步驟a)所述的發(fā)酵液，是在35~39°C條件下發(fā)酵獲得的；更優(yōu)的發(fā)酵溫 度為37°C。
[0036] 作為優(yōu)選，步驟b)所述的干燥是冷凍干燥。
[0037]作為優(yōu)選，步驟c)所述粗多糖溶解液的pH值為7.2~7.8;更優(yōu)的，其pH為7.5。
[0038]作為優(yōu)選，步驟e)中三氯乙酸加入后的終濃度為12% (w/v)，加入三氯乙酸后持續(xù) 30min再進(jìn)行固液分離。
[0039]在以上技術(shù)方案中，保藏編號(hào)為CCTCC M 2014170的生物材料的保藏單位是"中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心"，其地址為"湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)"，該生 物材料的保藏日期為20 14年4月28日，其分類命名是植物乳桿菌（Lactobaci Ilus plantarum)〇 在以上技術(shù)方案中，所述化學(xué)改性，是指通過(guò)化學(xué)反應(yīng)的方式對(duì)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行 修飾，使所得產(chǎn)物具有特定理化性能的方法。在以上技術(shù)方案中，所述三氧化硫吡啶復(fù)合物 又稱為三氧化硫吡啶絡(luò)合物，其分子式為C 5H5NO3S，可自市面購(gòu)得。
[0040]本發(fā)明在植物乳桿菌胞外多糖的基礎(chǔ)上，通過(guò)磺化反應(yīng)提高了其負(fù)電荷供給能 力，以DPPH自由基、(MT自由基、O2洎由基清除能力評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，所得磺化產(chǎn)物較植物乳桿菌胞 外多糖本身具有更優(yōu)的抗氧化活性。而且此改性方法在各類植物乳桿菌胞外多糖中適用性 較寬，效果確切。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)部分類別的植物乳桿菌胞外多糖磺化反應(yīng)后抗氧化活性 提升不明顯的問(wèn)題，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選了適于該改性方法的原料胞外多糖，該多糖的磺化 反應(yīng)充分、產(chǎn)物均一、結(jié)構(gòu)明確，同時(shí)具有突出的抗氧化活性。此外，以制備方法所表征的該 多糖原料，其產(chǎn)率、純度較高，有利于后續(xù)的改性反應(yīng)。本發(fā)明方法流程較短、成本較低，操 作相對(duì)簡(jiǎn)便，滿足規(guī)?；a(chǎn)的工藝要求，極具推廣潛力。
【附圖說(shuō)明】
[0041 ]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中提取、純化的胞外多糖的紅外光譜(FT-IR)圖譜。
[0042]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中胞外多糖改性產(chǎn)物的紅外光譜(FT-IR)圖譜。
[0043]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中，植物乳桿菌胞外多糖及其改性產(chǎn)物的DPPH自由基清除率 檢測(cè)結(jié)果圖。
[0044] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中，植物乳桿菌胞外多糖及其改性產(chǎn)物的0!Γ自由基清除率 檢測(cè)結(jié)果圖。
[0045] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中，植物乳桿菌胞外多糖及其改性產(chǎn)物的02_自由基清除率檢 測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 以下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在 以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0047] 以下實(shí)施例中所使用的近似性語(yǔ)言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語(yǔ)言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確 數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的范圍 內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可以是90至IjllO之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第一數(shù)值到 第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語(yǔ)言 可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0048] 除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0049] 以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑;所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 取平均值;以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
[0050] 實(shí)施例1
[00511 1.1胞外多糖的提取、純化
[0052] 植物乳桿菌在MRS培養(yǎng)基中37°C厭氧培養(yǎng)24h，12000Xg離心20min，棄沉淀，上清 用截留分子量為8-14KDa的透析袋透析3天，每天換超純水2次。冷凍干燥后，用5〇11^1'1^8-HCUlOmM MgS〇4· 7H20(pH 7.5)對(duì)粗多糖進(jìn)行溶解(終濃度為5mg/mL)，采用終濃度為2·5μ g/mL的核酸酶DNAse七7?6-1(05025^8111 &)在37°(：對(duì)核酸進(jìn)行水解611。水解后的粗多糖采 用終濃度為50yg/mL的蛋白酶Pronase E(165921，Roche)在37°C對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解18h。蛋 白酶處理后，用終濃度為12%的三氯乙酸處理30min，12000 Xg離心20min獲得的上清需調(diào) 節(jié)pH至4.0~5.0，繼續(xù)透析3天，每天換水2次，透析袋內(nèi)容物干燥后即為目標(biāo)多糖。
[0053]采用紅外光譜(FT-IR)分析胞外多糖:把固體樣品磨成2μπι以下的粉末，懸浮于易 揮發(fā)的溶劑中，然后將此懸液滴于KBr片基上鋪平，待溶劑揮發(fā)后形成均勻的粉末薄層，再 進(jìn)一步分析。
[0054]該多糖的紅外光譜圖如圖1所示，其紅外吸收光譜具有典型的0-H(34177.12)、C-H (2932.40)和C = 0( 1641)等的伸縮振動(dòng)吸收特征峰。
[0055] 1.2植物乳桿菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)改性
[0056] 取50mg純化的胞外多糖，用IOmL無(wú)水DMF，室溫處理30min，并不斷搖勻，加 IOOmg三 氧化硫吡啶復(fù)合物在80°C持續(xù)攪動(dòng)反應(yīng)3h，接著冰水中冷卻至25°C。用4mol/L的NaOH調(diào)節(jié) pH至7.0，采用截留分子量為S-HKDa的透析袋透析5天，最后冷凍干燥。
[0057] 采用紅外光譜(FT-IR)分析獲得的胞外多糖衍生物:把固體樣品磨成2μπι以下的粉 末，懸浮于易揮發(fā)的溶劑中，然后將此懸液滴于KBr片基上鋪平，待溶劑揮發(fā)后形成均勻的 粉末薄層，再進(jìn)一步分析。
[0058] 改性產(chǎn)物的紅外光譜圖如圖2所示，其紅外吸收光譜除了含有胞外多糖的伸縮振 動(dòng)吸收特征峰外，還含有一個(gè)強(qiáng)烈的〇 = S = 0伸縮振動(dòng)吸收特征峰，表明該改性產(chǎn)物屬于上 述胞外多糖的磺化產(chǎn)物。此外，該圖譜在1243.65CHT1處具有硫酸鹽基團(tuán)特殊吸收峰，該基團(tuán) 能夠在碳原子上提供更多的負(fù)電荷，有利于自由基轉(zhuǎn)化成不活躍成分。
[0059] 1.3改性產(chǎn)物對(duì)DPPH( I，1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除能力的測(cè)定
[0060] 取0 · 5mL的濃度為0、0 · 5、1 ·0、1 · 5、2 · 0和2 · 5mg/mL胞外多糖加入至15mL的離心管 中。每管加3.51^0.2腹〇1/1的0??招容液（用95%的無(wú)水乙醇進(jìn)行溶解），在室溫反應(yīng)301^11， 測(cè)定517nm處的吸光值。DPPH清除率的計(jì)算公式如式（1)所示：
[0061] (1)
[0062] 式（1)中Ao為空白組，Ai為實(shí)驗(yàn)組，Aj為對(duì)照組。
[0063]圖3示出了植物乳桿菌胞外多糖及其改性產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的檢測(cè)結(jié)果， 由圖3可以發(fā)現(xiàn)，胞外多糖磺化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力明顯高于胞外多糖本身，在濃度 為1.0、1.5和2.0mg/mL的條件下，具有顯著差異。
[0064] 1.4改性產(chǎn)物對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定
[0065] 取0 · 5mL的濃度為0、0 · 5丄0丄5、2· 0和2 · 5mg/mL胞外多糖加入至取6個(gè)15mL的離
心管，每管加入l.OmL PBS緩沖液(pH7.4,0.02mol/mL)，接著加入0.5mL 2.5mmol/mL的 1， 10-鄰二氮菲、0.5mL 2.5mmol/mL的硫酸亞鐵和0.5mL 20mmol/mL的雙氧水，最后分別加入 0·5mL的濃度為0、0·5、1·0、1·5、2·0和2· 5mg/mL胞外多糖。37°C反應(yīng)1小時(shí)，測(cè)定536nm處的 吸光值。0?Γ的清除率的計(jì)筧公式如式（2)所示：
[0066] (2)
[0067] 式(2)中Ao為空白組，Ai為實(shí)驗(yàn)組，Aj為對(duì)照組。
[0068] 圖4示出了植物乳桿菌胞外多糖及其改性產(chǎn)物對(duì)(MT自由基清除率的檢測(cè)結(jié)果，由 圖4可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度小于2.Omg/mL時(shí)，改性產(chǎn)物對(duì)0!Γ自由基清除能力顯著優(yōu)于植物乳桿 菌胞外多糖本身，而且即使在〇. 5mg/mL的低濃度條件下，改性產(chǎn)物也表現(xiàn)出了確切的(MT自 由基去除能力。
[0069] 1.5改性產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定
[0070] 取0· ImL的濃度為0、0·5丄0丄5、2·0和2·5mg/mL胞外多糖加入至取6個(gè)15mL的離 心管，再分別加340yL Tri s-HCl緩沖液(50mmol/L，pH8.2)和50yL 25mmo 1/L鄰苯三酚在室 溫反應(yīng)4min，隨后用IOyL 8.0nmol/L的鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)定320nm處的吸光值。f的清除率 的計(jì)算公式如式(3)所示：
[0071] (3)
[0072] 式⑶中Ao為空白組，Ai為實(shí)驗(yàn)組，Aj為對(duì)照組。
[0073] 圖5示出了植物乳桿菌胞外多糖及其改性產(chǎn)物對(duì)Ο2+自由基清除率的檢測(cè)結(jié)果，由 圖5可以發(fā)現(xiàn)，各濃度條件下，改性產(chǎn)物的O 2^自由基清除率均優(yōu)于植物乳桿菌胞外多糖本 身。
[0074] 實(shí)施例2
[0075] -種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法，包括以下步驟：
[0076] 1)取所述植物乳桿菌胞外多糖，以無(wú)水二甲基甲酰胺溶解；
[0077] 2)15min后向其中加入三氧化硫吡啶復(fù)合物至終濃度為5mg/mL，反應(yīng)2h。
[0078]在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0079]還包括步驟3):利用截留分子量為SKDa的透析袋透析步驟2)所得產(chǎn)物，取透析袋 內(nèi)容物干燥。透析前先將步驟2)所得產(chǎn)物pH調(diào)至6.5再透析。
[0080] 步驟2)中所述反應(yīng)的溫度為75°C，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至20°C。
[0081] 步驟1)中溶解于無(wú)水二甲基甲酰胺中的植物乳桿菌胞外多糖終濃度為3mg/mL。
[0082] 所述植物乳桿菌胞外多糖是通過(guò)以下方法制備的：
[0083] a)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0084] b)向步驟a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以SKDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0085] c)以含有40mM Tris-HCl、5mM MgSO4 · 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步驟b) 所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2yg/mL，水解；
[0086] d)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度40yg/mL，酶解；
[0087] e)而后加入三氯乙酸至終濃度10%(w/v)，20min后固液分離取上清，透析，取透析 袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0088]步驟b)中乙醇的加入量是所述上清液體積的1.5倍。
[0089]步驟c)中粗多糖的終濃度為4mg/L。
[0090] 步驟e)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至4，再透析。
[0091]步驟a)所述的植物乳桿菌，是保藏編號(hào)為CCTCC M 2014170的植物乳桿菌。
[0092] 實(shí)施例3
[0093] -種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法，包括以下步驟：
[0094] 1)取所述植物乳桿菌胞外多糖，以無(wú)水二甲基甲酰胺溶解；
[0095] 2) 45min后向其中加入三氧化硫吡啶復(fù)合物至終濃度為15mg/mL，反應(yīng)4h。
[0096]在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0097]還包括步驟3):利用截留分子量為HKDa的透析袋透析步驟2)所得產(chǎn)物，取透析袋 內(nèi)容物干燥。透析前先將步驟2)所得產(chǎn)物pH調(diào)至7.5再透析。
[0098]步驟2)中所述反應(yīng)的溫度為85°C，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至30°C。
[0099] 步驟1)中溶解于無(wú)水二甲基甲酰胺中的植物乳桿菌胞外多糖終濃度為7mg/mL。
[0100] 所述植物乳桿菌胞外多糖是通過(guò)以下方法制備的：
[0101] a)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0102] b)向步驟a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以HKDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0103] C)以含有60mM TriS-HCl、15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步驟 b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度3yg/mL，水解；
[0104] d)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度60yg/mL，酶解；
[0105] e)而后加入三氯乙酸至終濃度15%(w/v)，40min后固液分離取上清，透析，取透析 袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0106] 步驟b)中乙醇的加入量是所述上清液體積的2.5倍。
[0107] 步驟C)中粗多糖的終濃度為6mg/L。
[0108] 步驟e)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至5，再透析。
[0109]步驟a)所述的植物乳桿菌，是保藏編號(hào)為CCTCC M 2014170的植物乳桿菌。
[0110] 實(shí)施例4
[0111] -種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法，包括以下步驟：
[0112] 1)取所述植物乳桿菌胞外多糖，以無(wú)水二甲基甲酰胺溶解；
[0?13 ] 2) 30min后向其中加入三氧化硫吡啶復(fù)合物至終濃度為I Omg/mL，反應(yīng)3h。
[0114] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0115] 還包括步驟3):利用截留分子量為IlKDa的透析袋透析步驟2)所得產(chǎn)物，取透析袋 內(nèi)容物干燥。
[0116] 步驟2)中所述反應(yīng)的溫度為80°C，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至25°C。
[0117] 所述植物乳桿菌胞外多糖是通過(guò)以下方法制備的：
[0118] a)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0119] b)向步驟a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以12KDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0120] c)以含有50mM Tris-HCl、IOmM MgSO4 · 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步驟 b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2.5yg/mL，水解；
[0121] d)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度50yg/mL，酶解；
[0122] e)而后加入三氯乙酸至終濃度12%(w/v)，30min后固液分離取上清，透析，取透析 袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0123] 步驟b)中乙醇的加入量是所述上清液體積的2倍。
[0124] 步驟e)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至4.5，再透析。
[0125] 實(shí)施例5
[0126] -種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法，包括以下步驟：
[0127] 1)取所述植物乳桿菌胞外多糖，以無(wú)水二甲基甲酰胺溶解；
[0128] 2) 40min后向其中加入三氧化硫吡啶復(fù)合物至終濃度為12mg/mL，反應(yīng)3.5h。
[0129] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0130] 還包括步驟3):利用截留分子量為8~HKDa的透析袋透析步驟2)所得產(chǎn)物，取透 析袋內(nèi)容物干燥。透析前先將步驟2)所得產(chǎn)物pH調(diào)至7.2再透析。
[0131] 實(shí)施例6
[0132] -種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法，包括以下步驟：
[0133] 1)取所述植物乳桿菌胞外多糖，以無(wú)水二甲基甲酰胺溶解；
[0134] 2) 20min后向其中加入三氧化硫吡啶復(fù)合物至終濃度為8mg/mL，反應(yīng)2.5h。
[0135] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高植物乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的化學(xué)改性方法，其特征在于包括以下步 驟： 1) 取所述植物乳桿菌胞外多糖，以無(wú)水二甲基甲酰胺溶解； 2) 15~45min后向其中加入三氧化硫吡啶復(fù)合物至終濃度為5~15mg/mL，反應(yīng)2~4h。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)改性方法，其特征在于還包括步驟3):利用截留分子量為 8~14KDa的透析袋透析步驟2)所得產(chǎn)物，取透析袋內(nèi)容物干燥。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化學(xué)改性方法，其特征在于透析前先將步驟2)所得產(chǎn)物pH調(diào) 至6.5~7.5再透析。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)改性方法，其特征在于步驟2)中所述反應(yīng)的溫度為75~ 85°C，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至20~30°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)改性方法，其特征在于步驟1)中溶解于無(wú)水二甲基甲酰 胺中的植物乳桿菌胞外多糖終濃度為3~7mg/mL。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化學(xué)改性方法，其特征在于所述植物乳桿菌胞外多 糖是通過(guò)以下方法制備的： a) 取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清； b) 向步驟a)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以8~14KDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖； c) 以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步 驟b)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2~3yg/mL，水解； d) 而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度40~60yg/mL，酶解； e) 而后加入三氯乙酸至終濃度10~15% (w/v)，20~40min后固液分離取上清，透析，取 透析袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化學(xué)改性方法，其特征在于步驟b)中乙醇的加入量是所述上 清液體積的1.5~2.5倍。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化學(xué)改性方法，其特征在于步驟c)中粗多糖的終濃度為4~ 6mg/L〇9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化學(xué)改性方法，其特征在于步驟e)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至 4~5,再透析。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化學(xué)改性方法，其特征在于步驟a)所述的植物乳桿菌，是保 藏編號(hào)為CCTCC Μ 2014170的植物乳桿菌。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK105859898SQ201610202526
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月5日
【發(fā)明人】魏華, 張志鴻, 萬(wàn)翠香, 許恒毅, 徐鋒, 馮麗霞
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)