專利名稱：一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實(shí)體多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實(shí)體多糖的制備方法。屬生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
茶樹菇屬擔(dān)子菌綱，糞銹傘科，田菇屬，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年來發(fā)展起來的一種食用菌新品種。茶樹菇營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，含有人體必需的氨基酸，并且有豐富的B族維生素和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等礦質(zhì)元素。中醫(yī)認(rèn)為該菇性平、甘溫、無毒，具有較高的藥用價(jià)值，有清熱、平肝、明目、健脾的功效。是一種集營養(yǎng)、保健、理療于一身的綠色食品。通過熱水浸提獲得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可應(yīng)用于保健品行業(yè)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實(shí)體多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)方案為將樹菇子實(shí)體通過粉碎，脫脂，熱水浸提，乙醇沉淀，脫蛋白，脫色、葡聚糖凝膠柱G-2 00層析、透析后冷凍干燥得到茶樹菇子實(shí)體多糖，最后進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明發(fā)明的一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實(shí)體多糖制備方法，提取得率為3.63g/100g子實(shí)體干重，測(cè)得多糖含量為97. 8%。經(jīng)初步的研究確認(rèn)，基本無毒，具有一定的抗氧化活性?？梢宰鳛樵蠎?yīng)用于保健食品等領(lǐng)域。
具體來說，首先，我們用粉碎機(jī)將市售干燥的茶樹菇子實(shí)體粉碎，然后用有機(jī)溶劑乙醚進(jìn)行脫脂，80°C _95°C熱水浸提，加水量為30倍體積脫脂后產(chǎn)物，總提取時(shí)間為12h，提取3次，提取液濃縮后加入4倍體積無水乙醇在4°C醇析，離心收集沉淀，乙醇，乙醚洗滌后用蒸餾水復(fù)溶，用木瓜蛋白酶和Sevage法聯(lián)合去除游離蛋白，H2O2脫色、葡聚糖凝膠G-200 層析柱純化，蒸餾水透析，冷凍干燥后得到茶樹菇子實(shí)體多糖?？寡趸囼?yàn)將總還原能力， 清除羥基自由基、超氧陰離子、DPPH的能力作為指標(biāo)。
具體實(shí)施方式
下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)例一
IOOg粉碎后的茶樹菇子實(shí)體加入Soxhelt提取器，以乙醚作為溶劑，進(jìn)行回流脫脂8h，收集固形物用熱水浸提，提取溫度80°C _95°C，加水量為30倍體積固形物，總提取時(shí)間為12h，提取3次，提取液濃縮后加入3倍體積95%乙醇在4°C醇析過夜，8000rpm離心得沉淀物，沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后用木瓜蛋白酶和Sevage法聯(lián)合去除游離蛋白，先在5%的糖溶液中加入1% (w/v)的木瓜蛋白酶于58±2°C，pH6.5條件下反應(yīng)4h，然后按發(fā)酵液1/5 的體積加入氯仿，然后加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合后振蕩20min。蛋白質(zhì)與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min，收集上清液，反復(fù)操作8次至氯仿-正丁醇層不渾濁為止。然后在上清液中加入95%乙醇置4°C冰箱過夜，次日離心收集沉淀。沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后將5%的多糖溶液用NaOH調(diào)pH至9. 0，然后滴加20%的H2O2 (用量為多糖溶液體積的15% )，保持PH8. 0-9. OAh后終止反應(yīng)，加入95%乙醇置4°C冰箱過夜，次日離心收集沉淀，用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌數(shù)次。待有機(jī)溶劑揮發(fā)完畢，將沉淀物用蒸餾水完全溶解,用Sephadex G-200凝膠層析對(duì)多糖進(jìn)行純化,流動(dòng)相為O. IM NaCl,流速O. 5mL/min,每管3mL。以苯酚-硫酸法在490nm處檢測(cè)每管的糖濃度，測(cè)定該多糖的純度。多糖復(fù)溶后裝入透析袋中，扎緊袋口，懸浮于蒸餾水中，透析72h，中間每隔12小時(shí)換水一次。冷凍干燥后得到茶樹菇子實(shí)體多糖3. 63g，用苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為97. 8%。
實(shí)例二
將制備得到的茶樹菇子實(shí)體多糖進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，以蒸餾水為空白對(duì)照，以抗壞血酸為陽性對(duì)照，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13. O軟件分析。
I.實(shí)驗(yàn)方法
(I)還原力測(cè)定
在具塞試管中加入適量不同濃度的茶樹菇子實(shí)體多糖樣品(O. 10-1. Omg/mL)、 O. 2mL PBS (2. OM, pH 6. 6)和O. 5mL I %鐵氰化鉀溶液。置50°C恒溫水浴中反應(yīng)20min，迅速冷卻，再加入適量的10% (w/v)三氯乙酸溶液,3000*g離心IOmin,取上清液I. 5mL,加入 O. 2mLl%三氯化鐵溶液和3. OmL去離子水，振蕩均勻，靜置5min，在λ 700處以蒸餾水為空白測(cè)定其吸光值。鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]可被還原試劑還原成亞鐵氰化鉀[K4Fe (CN)6]，亞鐵氰化鉀再和鐵離子作用生成普魯士藍(lán)，在OD7tltol處有最大吸收值，以檢測(cè)其還原力。吸光值越大，說明其還原力越高。
(2)對(duì)羥自由基的清除
在試管中依次加入O. 2mL不同濃度的茶樹菇子實(shí)體多糖樣品(O. 10-1. Omg/mL)，2.O mL 的 EDTA-Fe (O. 15mM)，O. 8mL 水楊酸鈉(2. OmM)，2. OmLH2O2 (6. OmM)，O. 8mL 去離子水。 37°C反應(yīng)60min，于λ 510處測(cè)得不同茶樹菇多糖濃度下的吸光值A(chǔ)1，用水替代茶樹菇多糖時(shí)的吸光值A(chǔ)1,用水代替多糖和H2O2時(shí)測(cè)得空白對(duì)照吸光值A(chǔ)tl.按下式計(jì)算羥自由基(·0Η) 的清除率· OH 清除率(% ) = [ (A1-Aj) / (A0-Aj) ] X 100
(3)對(duì)超氧陰離子的清除
ImL的不同濃度(O. 10-1. Omg/mL)的茶樹菇子實(shí)體多糖樣品以及2mL的 Tris-HCl (16mM, pH 8. O)溶解的 76 μ M 的 NBT 和 394 μ M 的 NADH，加 O. 4mL 的 56 μ M PMS, 振蕩均勻，室溫反應(yīng)5min，用Tris-HCl代替樣品反應(yīng)作為空白對(duì)照，測(cè)定A560nm值。
(4)對(duì)DPPH ·自由基的清除
樣品管中加入O. 5mL不同濃度的子實(shí)體多糖溶液(O. 10-1. Omg/mL)與3. OmL的O.004%溶于95%乙醇的DPPH溶液；對(duì)照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸餾水代替多糖溶液。以上三組置于室溫靜置30min后，用O. 55mL蒸餾水和3. OmL 95%的乙醇調(diào)零，于517nm處測(cè)定吸光值。
結(jié)果顯示
(I)還原力測(cè)定試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組比較，P < O. 01，顯示在還原力方面兩者有高度顯著性差異，表明其具有一定的還原力；試驗(yàn)組不同濃度的多糖之間進(jìn)行比較時(shí)，P > O. 05，表明試驗(yàn)組不同濃度之間的還原力沒有顯著性差異；試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組相比，P< O. 05,表明多糖的還原力不及抗壞血酸。
(2)對(duì)羥基自由基的清除試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組比較，P < O. 05，顯示兩者在對(duì)羥基自由基的清除方面有顯著性差異，表明茶樹菇子實(shí)體多糖具有一定的清除羥基自由基能力；試驗(yàn)組不同濃度的多糖之間進(jìn)行比較時(shí)，當(dāng)濃度大于O. 2mg/mL時(shí)，P < O. 05，表明多糖從O. 2mg/mL開始隨著濃度的升高，其清除羥基自由基的能力增強(qiáng)；試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組相比，P < O. 05，表明多糖對(duì)羥基自由基的清除能力不及抗壞血酸。
(3)對(duì)超氧陰離子的清除能力試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組比較，P < O. 05，顯示兩者對(duì)超氧陰離子的清除率有顯著性差異，前者清除超氧陰離子的能力高于后者；試驗(yàn)組不同濃度的多糖之間進(jìn)行比較時(shí)，P < O. 05，表明隨著多糖濃度的增大，清除能力也相應(yīng)增強(qiáng)，達(dá)到一定濃度時(shí)，趨于穩(wěn)定；試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組相比，P < O. 05，表明多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力不及抗壞血酸。
(4)對(duì)DPPH的清除能力；試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組比較，P < O. 01，顯示兩者在對(duì)DPPH 的清除能力方面有高度顯著性差異，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；試驗(yàn)組不同濃度的多糖之間進(jìn)行比較時(shí)，P > O. 05，表明試驗(yàn)組不同濃度之間對(duì)DPPH的清除能力沒有顯著性差異；試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組相比，P < O. 05，表明多糖對(duì)DPPH的清除能力不及抗壞血酸。
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實(shí)體多糖的制備方法，是茶樹菇子實(shí)體通過粉碎， 脫脂，熱水浸提，離心，上清液濃縮，乙醇沉淀，Sevage法脫蛋白，H2O2脫色，透析后冷凍干燥得到的。提取得率為3. 63g/100g子實(shí)體干重，測(cè)得多糖含量為97.8%。可應(yīng)用于制備具有抗氧化，抗疲勞功能的保健品。
2.如權(quán)利要求I所述的脫脂，其特征在于將茶樹菇子實(shí)體粉碎后加入Soxhelt提取器， 以乙醚作為溶劑，進(jìn)行回流脫脂8h。
3.如權(quán)利要求I所述熱水浸提，其特征在于提取溫度80°C_95°C，加水量為30倍體積固形物，總提取時(shí)間為12h，提取3次。
4.如權(quán)利要求I所述的脫蛋白，其特征在于用木瓜蛋白酶和Sevage法聯(lián)合去除游離蛋白，先在5%的糖溶液中加入1% (w/v)的木瓜蛋白酶于58±2°C，pH6. 5條件下反應(yīng)4h，然后按發(fā)酵液1/5的體積加入氯仿，然后加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合后振蕩20min，蛋白質(zhì)與氯仿_正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min,收集上清液,反復(fù)操作8次至氯仿-正丁醇層不渾濁為止。
5.如權(quán)利要求I所述透析，其特征在于4°C醇析過夜后的離心沉淀物用蒸餾水復(fù)溶后取IOOmL裝入透析袋中，扎緊袋口，懸浮于蒸餾水中，透析72h，中間每隔12h換水一次。
6.如權(quán)利要求I所述的凝膠層析柱純化，其特征在于用的是葡聚糖凝膠G-200填料。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實(shí)體多糖的制備方法。該茶樹菇子實(shí)體多糖為白色或淡黃色粉末，是茶樹菇子實(shí)體通過粉碎，脫脂，熱水浸提，乙醇沉淀，脫蛋白，脫色、葡聚糖凝膠柱G-200層析、透析后冷凍干燥得到的。提取得率為3.63g/100g子實(shí)體干重，用苯酚-硫酸法測(cè)得多糖含量為97.8％，可應(yīng)用于制備具有抗氧化，防衰老功能的保健品。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102911284SQ201210464469
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者鄧超, 陳敬華, 程詠梅, 陳荊曉, 付海田 申請(qǐng)人:江南大學(xué)