一株產(chǎn)抗腫瘤活性胞外多糖的植物乳桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株產(chǎn)抗腫瘤活性胞外多糖植物乳桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物乳桿菌是一種兼性厭氧異型發(fā)酵乳桿菌，廣泛存在各種食品中，如蔬菜，肉， 魚類和乳制品等。同時也常見于健康人體的腸道中，每克健康人群糞便中平均含有10 7-109 個植物乳桿菌，對于維持人體腸道微生態(tài)平衡，促進人體健康具有重要作用。但目前植物乳 桿菌的諸多功能及其人體作用機制并不清楚，明確其代謝產(chǎn)物如胞外多糖的功能，是確定 菌株生物活性和開發(fā)功能性食品的基礎(chǔ)。
[0003] 乳酸菌胞外多糖是菌株生長代謝過程中分泌到胞外的大分子多糖?？勺鳛樵龀?劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、膠凝劑、填充劑和持水劑應(yīng)用到食品、醫(yī)藥、石油化工以及生化產(chǎn)品等 領(lǐng)域。胞外多糖還具有多種生理活性，包括降血壓、降膽固醇，抗氧化、抗?jié)?、抗病毒、改?腸道微生態(tài)環(huán)境和增強人體免疫力等。將產(chǎn)胞外多糖菌株加入到乳制品中作為發(fā)酵或輔助 發(fā)酵菌株，可有效改善發(fā)酵乳品的質(zhì)構(gòu)、口感、流變學(xué)特性和風(fēng)味等指標(biāo)，還可進一步提高 產(chǎn)品的營養(yǎng)保健作用。我國的乳酸菌胞外多糖研究起步較晚，與世界發(fā)達國家還存在差距， 已知具有明確生物活性的乳酸菌胞外多糖較少。
[0004] 藏靈姑是我國青海、西藏等地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，有著長時間的食用歷史，其中 含有豐富的乳酸菌和酵母等微生物資源。近年的研究也表明，藏靈姑發(fā)酵食品具有降壓，降 月旨，調(diào)整腸道微生態(tài)平衡等多種作用。藏靈姑發(fā)酵乳的黏稠特性也表明其中可能含有微生 物分泌的增稠大分子。因此如何從中篩選產(chǎn)胞外多糖乳酸菌，開發(fā)自主產(chǎn)權(quán)、功能明確的具 有健康促進作用的菌株對挖掘傳統(tǒng)乳制品的生物活性，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)功能性食品具有 重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)YWll。
[0006] 本發(fā)明提供的物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)YWll，其保藏號CGMCC N0.11863。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備胞外多糖的方法。
[0008] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的植物乳桿菌（Lactobaci llus plantarum)，收集發(fā)酵液，得到胞外多糖。
[0009] 上述方法中，在收集發(fā)酵液后，還包括如下步驟：
[0010] 1)用三氯乙酸水溶液與發(fā)酵液混勻，反應(yīng)，收集反應(yīng)液中的上清液；
[0011] 2)將所述上清液與無水乙醇混勻，靜置，收集沉淀；
[0012] 3)將所述沉淀溶于水中，收集大于8000Da的產(chǎn)物，得到胞外多糖。
[0013] 由上述方法制備的胞外多糖也是本發(fā)明飽和的范圍。
[0014] 上述的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或其培 養(yǎng)液或上述的胞外多糖在制備預(yù)防和/或治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明飽和的范圍。 [0015] 上述的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或其培 養(yǎng)液或上述的胞外多糖在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0016] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤為結(jié)腸癌，所述腫瘤細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種預(yù)防和/或治療腫瘤或抑制腫瘤細(xì)胞生長產(chǎn)品。 [00?8]本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述的植物乳桿菌（L a c t 〇 b a c i 11 u s plantarum)或其發(fā)酵產(chǎn)物或其菌懸液或其培養(yǎng)液或上述的胞外多糖。
[0019] 上述產(chǎn)品中，所述腫瘤為結(jié)腸癌，所述腫瘤細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞。
[0020] 上述產(chǎn)品為藥物。
[0021] YW11于2015年12月11日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱0610：，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為0610：勵.11863，分類 命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) 〇
[0022] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一株新的植物乳桿菌，將其發(fā)酵收集胞外多糖， 檢測胞外多糖能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的生長，對HT-29移植瘤有明顯的抑制作用，且對 荷瘤裸鼠體重、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和心臟指數(shù)均沒有顯著影響，可顯著降低荷瘤裸鼠血清 中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和肌酐(Cr)的水平，恢復(fù)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和尿素氮(BUN)至正常水平， 提高荷瘤裸鼠血液中白細(xì)胞(WBC)和淋巴細(xì)胞(LYM)的數(shù)目，同時提高荷瘤裸鼠血清中超氧 化物歧化酶(S0D)活性，降低丙二醛(MDA)水平，因此證明，植物乳桿菌YW11的胞外多糖具有 較好的抗腫瘤活性，且對機體無毒，可開發(fā)為具有潛在健康功效食品或輔助藥物用于治療 結(jié)腸癌。
【附圖說明】
[0023] 圖1為不同濃度胞外多糖的腫瘤抑制效果。
[0024]圖2為YW11胞外多糖對HT-29荷瘤裸鼠血清生化指標(biāo)的影響。
[0025] 圖3為YW11胞外多糖對HT-29荷瘤裸鼠血清中S0D活性(A)和MDA水平(B)的影響。
【具體實施方式】
[0026] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]實施例1、乳桿菌YW11的獲得
[0029] 一、乳桿菌YW11的分離、純化
[0030]取5g待分離藏靈姑樣品加入45mL無菌生理鹽水中，震蕩混勻后逐級稀釋到適宜濃 度，取50yL稀釋后的菌液涂布于MRS瓊脂平板，于37°C厭氧培養(yǎng)72h。挑取平板上生長的乳酸 菌典型單菌落(圓形，中等大小，凸起，微白色邊緣整齊)于MRS瓊脂培養(yǎng)基上反復(fù)劃線，直至 獲得純培養(yǎng)物為止，得到純化單菌落YW11。
[0031] 二、乳桿菌YW11的鑒定 [0032] 1、表型鑒定
[0033]挑取上述一分離得到的YW11單菌落，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取菌液，涂布于MRS瓊脂 平板，于37°C厭氧培養(yǎng)48-72h，形成乳酸菌典型單菌落（圓形，中等大小，凸起，微白色邊緣 整齊）。
[0034] 2、生理生化鑒定
[0035]挑取上述一分離得到的YW11單菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，其中革蘭 氏染色陽性，細(xì)胞形態(tài)為桿狀或鏈桿狀，同時過氧化氫酶試驗為陰性的菌株，初步鑒定為乳 桿菌。
[0036] 3、API 50 CH鑒定
[0037] 將活化好的上述一分離得到的YW11菌液稀釋到適宜濃度，涂布于MRS瓊脂平板上， 于37°C培養(yǎng)48h，用無菌牙簽挑取菌株單菌落接入API 50 CH液體培養(yǎng)基中制成菌懸液，再 接入到API 50 CH鑒定試劑條中，37°C厭氧培養(yǎng)48h，記錄菌株對49種碳水化合物的發(fā)酵結(jié) 果，將結(jié)果輸入梅里埃公司的鑒定軟件API LAB PLUS(BioM6rieux，F(xiàn)rance)中進行判定。
[0038]根據(jù)下表1中的糖代謝圖譜，鑒定菌株YW11為植物乳桿菌。
[0039] 表1植物乳桿菌YW11的API 50 CH檢測結(jié)果
[0040]
[004,j
[0042] 4、16S rDNA鑒定
[0043] 提取菌株YW11的基因組DNA進行片段擴增。采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物， 正向引物：A27F 5' -AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，反向引物:A1495R 3' -GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5'，1 · 5%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物委 托北京鼎國生物有限公司進行測序，將測序結(jié)果(序列1)與NCBI數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進行 比對。結(jié)果顯示YW11菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中KM265361等植物乳桿菌的16S rDNA序列相似度超 過 99 %。
[0044] 經(jīng)過上述鑒定，YW11為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum) 〇
[0045] YW11于2015年12月11日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱0610：，地