一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株及其篩選方法和應(yīng)用
【專利摘要】一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株及其篩選方法和應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。為了實(shí)現(xiàn)紅法夫酵母產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蝦青素，本發(fā)明提供一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株及其篩選方法和應(yīng)用。本發(fā)明的一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株，命名為紅法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)XM?1601，于2016年5月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12413。本發(fā)明的紅法夫酵母發(fā)酵生物量干重達(dá)到65g/L，蝦青素發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到320mg/L，蝦青素含量約為4.92mg/g。本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM?1601廣泛應(yīng)用于動物飼料添加劑、食品添加劑、保健品等領(lǐng)域。CGMCC No.1241320160503
【專利說明】
一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株及其篩選方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株 及其篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蝦青素（3,3二羥基-4,4'-二酮基-β，β'_胡蘿卜素，Astaxanthin)，又名蝦黃素， 是類胡蘿卜素的一種，分子式為C4QH52O4,分子量為596.86，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所不。奸青素具 有促進(jìn)抗體產(chǎn)生、增強(qiáng)宿主免疫功能、抗氧化、淬滅自由基產(chǎn)生的能力，對于提高人體免疫 力、減少疾病具有重要意義，同時蝦青素還具有抑制腫瘤生長、改善視力及生育能力等多方 面的生物學(xué)功能。因此，蝦青素在食品、飼料、漁牧業(yè)、化妝品和醫(yī)藥保健品等方面有著廣闊 的應(yīng)用前景。
[0003] 目前市場上的蝦青素絕大多數(shù)是化學(xué)合成的，動物體對合成蝦青素的利用率很 低，在應(yīng)用和安全性上存在較多的局限性。通過動物和人體試驗(yàn)證明，天然蝦青素?zé)o任何毒 副作用，對人體絕對安全。自然界中產(chǎn)天然蝦青素的微生物主要有近海的雨生紅球藻 (Haematococcus pluvial is)和紅法夫酵母(Phaff ia rhodozyma)。雨生紅球藻的4下青素含 量占細(xì)胞干重最高可達(dá)4%，是蝦青素含量最高的微生物。雖然雨生紅球藻能積累大量的蝦 青素，但雨生紅球藻的生長對氣候條件要求較高，需要強(qiáng)光照、高溫、很大的晝夜溫差、高 鹽、高滲，培養(yǎng)周期較長。紅法夫酵母是眾多產(chǎn)蝦青素的微生物中蝦青素含量僅次于雨生紅 球藻且是唯一可以代謝多種糖類的微生物。相比之下，紅法夫酵母的蝦青素含量雖然不能 和雨生紅球藻相比，但它的一些發(fā)酵經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀(生長快、能利用多種碳氮源、生長條件溫 和)使得它具有良好的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化前景。
[0004] 利用紅法夫酵母進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)目前還處于實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)階段。紅法夫酵母生 產(chǎn)蝦青素的水平主要受兩個因素影響:單位細(xì)胞干重的蝦青素含量和單位發(fā)酵體積的細(xì)胞 干重。目前利用紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的水平普遍偏低，一方面野生型紅法夫酵母的 蝦青素含量一般僅200~500ug/g細(xì)胞菌體，如公開號為CN101818141A的中國專利"紅法夫 酵母菌株的復(fù)合誘變方法"，誘變出的菌株AS2.1557的色素產(chǎn)量為2.63mg/L，細(xì)胞干重為 9.4g/L，含色素280ug/g菌體，經(jīng)過多輪誘變后色素產(chǎn)量為5. lmg/L，細(xì)胞干重為10.9g/L，含 色素468ug/g菌體。另一方面紅法夫酵母的細(xì)胞干重偏低，一般僅10~30g/L發(fā)酵液，如公開 號為CN103820520A的中國專利"一種高產(chǎn)天然蝦青素的發(fā)酵方法"，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下， 紅法夫酵母CGMCC6355菌株在IOL發(fā)酵罐中發(fā)酵36小時，細(xì)胞干重達(dá)到21.7g/L，蝦青素產(chǎn)量 僅達(dá)到 114 · 5mg/L，含5 · 28mg/g 菌體。
[0005] 因此，若想實(shí)現(xiàn)紅法夫酵母產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蝦青素，必須對紅法夫酵母進(jìn)行廣泛深入 的研究，篩選獲得優(yōu)良的高產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母菌株，并優(yōu)化其發(fā)酵生產(chǎn)工藝，提高發(fā)酵 液細(xì)胞生物量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了實(shí)現(xiàn)紅法夫酵母產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蝦青素，本發(fā)明提供一株富含蝦青素的紅法夫酵 母菌株及其篩選方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明的一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株，命名為紅法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma)XM-1601，于2016年5月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC No. 12413。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述的一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)的篩選方法，包括以下步驟：
[0010] 步驟一、對帶有紅法夫酵母的樹葉層、帶有紅法夫酵母的地表水和帶有紅法夫酵 母的地表泥土層分別進(jìn)行預(yù)處理后獲得含有紅法夫酵母菌體的溶液，根據(jù)紅法夫酵母菌體 濃度分別稀釋后涂平板，分離培養(yǎng)基采用YM培養(yǎng)基；
[0011] 步驟二、將步驟一中涂有菌體的平板在12 °C下培養(yǎng)7~10天，挑取其中的紅色菌落 100~1000株分別在含有YM培養(yǎng)基的無菌平板上劃線，22°C培養(yǎng)3~5天，獲得純種紅色單菌 落，從中挑選100~1000株單菌落；
[0012] 步驟三、向IOmL試管中加入3mL YM液體培養(yǎng)基，將步驟二獲得的純種紅色單菌落 分別接種于此試管中，22°C、220rpm搖床培養(yǎng)120h，從中挑選20~50株紅色色素含量較多的 菌株；
[0013]步驟四、向25mL搖瓶中加入IOmL YM液體培養(yǎng)基，將挑選的20~50株菌株分別接 種于此搖瓶中，22°(：、220印111培養(yǎng)2411做種子;取51^種子液以9%接種量接種于含5〇1111^1液 體培養(yǎng)基的250mL滅菌搖瓶中，22°C、220rpm搖床培養(yǎng)120h;
[0014] 步驟五、采用二甲亞砜法檢測蝦青素含量，同時采用干重法測定紅法夫酵母的生 物量干重，從中選取一株蝦青素產(chǎn)量最高的菌株，即為紅法夫酵母菌株XM-1601。
[0015] 作為優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟一中，對帶有紅法夫酵母的樹葉層進(jìn)行預(yù)處理:將帶有 紅法夫酵母的樹葉層在裝有滅菌生理鹽水的燒杯中反復(fù)浸洗，將浸洗液用〇.22um醋酸纖維 膜抽濾脫水，將濾膜上的菌液用IOmL滅菌生理鹽水復(fù)溶，獲得含有紅法夫酵母菌體的溶液。
[0016] 作為優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟一中，對帶有紅法夫酵母的地表水進(jìn)行預(yù)處理:將帶有 紅法夫酵母的地表水用〇.22um醋酸纖維膜抽濾脫水，將濾膜上的菌液用IOmL滅菌生理鹽水 復(fù)溶，獲得含有紅法夫酵母菌體的溶液。
[0017] 作為優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟一中，對帶有紅法夫酵母的地表泥土層進(jìn)行預(yù)處理:將 帶有紅法夫酵母的地表泥土層用滅菌生理鹽水中反復(fù)清洗，將微生物懸浮于滅菌生理鹽水 中，將懸浮液用0.22um醋酸纖維膜抽濾脫水，將濾膜上的菌液用20mL滅菌生理鹽水復(fù)溶，獲 得含有紅法夫酵母菌體的溶液。
[0018] 利用本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)生產(chǎn)?!下青 素的方法，包括以下步驟：
[0019] 步驟一、一級種子
[0020] 將紅法夫酵母菌株XM-1601接種至含有50mL YM液體培養(yǎng)基的250mL滅菌三角瓶 中，20~25°C、180~240rpm搖床培養(yǎng)20~30h;
[0021] 步驟二、二級種子
[0022] 取上述搖瓶菌液IOmL接種至含有IOOmL YM液體培養(yǎng)基的500mL滅菌三角瓶中，接 種量為9%，20~25°C、180~240rpm搖床培養(yǎng)20~30h;
[0023]步驟三、采用IOL發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，加入發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌20~30min，接種二 級種子的量為10%，裝液量為6L，發(fā)酵溫度為(22± 5) °C，通氣量為10L/min，控制溶解氧在 20%以上，發(fā)酵培養(yǎng)24~168h后放罐，獲得富含蝦青素的紅法夫酵母發(fā)酵液。
[0024]作為優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟三中，發(fā)酵過程中控制葡萄糖殘?zhí)菨舛仍?~20g/L，并 用5M NaOH和2M稀硫酸控制pH為5.5。
[0025]作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：（30.0±5)g/L葡萄糖、（5.0±5) g/L 蛋白陳、（5.0±5)g/L 濃縮酵母浸出粉、（3.0±3)g/L MgSO4 · 7H20、（3.0±3)g/L KH2PO4、（ I · 0 ± I )g/L(NH4)2S〇4，pH 5 · 5。
[0026] 作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述微量元素包括：100mg/L CaCl2 · 2H20、100mg/L FeS〇4 · 7H20、20mg/L ZnS〇4 · 7H20、10mg/L MnS〇4· H20、10mg/L CuS〇4 · 5H20、5mg/L CoSO4 · 7H20〇
[0027] 本發(fā)明的一株富含4下青素的紅法夫酵母菌株XM_1601(Phaffia rhodozyma XM-1601)可以應(yīng)用于動物飼料添加劑、食品添加劑、保健品等領(lǐng)域。
[0028]本發(fā)明的有益效果是：
[0029]本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601，在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研 究，形成了一整套小試發(fā)酵生產(chǎn)工藝，紅法夫酵母發(fā)酵生物量干重達(dá)到65g/L，蝦青素發(fā)酵 產(chǎn)量達(dá)到320mg/L，蝦青素含量約為4.92mg/g。與參考的專利文獻(xiàn)技術(shù)相比，紅法夫酵母發(fā) 酵生物量干重提高了 3倍左右，蝦青素發(fā)酵產(chǎn)量提高了 2~3倍。
[0030] 本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601同時擁有較高的單位細(xì)胞蝦青素含量和較高的 單位發(fā)酵液細(xì)胞干重，該菌株及其配套工藝滿足了蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0031] 利用本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601生產(chǎn)蝦青素的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)速度快、培養(yǎng)條 件溫和，細(xì)胞中不但含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類、維生素，而且還含有大量的不飽和脂肪酸及 多種蝦青素前體，并且易于實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，無需光照。
【附圖說明】
[0032]圖1為蝦青素的分子結(jié)構(gòu)。
[0033] 圖2為本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)的形態(tài)特 征。
[0034] 圖3為本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)的菌落 特征。
[0035] 圖4為分光光度計(jì)法測量蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036] 圖5為利用本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)生產(chǎn) 蝦青素的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0038] 本發(fā)明的一株富含4下青素的紅法夫酵母菌株XM_1601(Phaffia rhodozyma XM-1601)，該紅法夫酵母菌株乂]\1-1601(?]1&打丨&1']1〇(1〇2；71]1&乂]\1-1601)于2016年5月3日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 12413。
[0039] 本發(fā)明的一株富含4下青素的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)，生物學(xué)特性包括：
[0040] 1、形態(tài)特征如圖3所示，本發(fā)明的紅法夫酵母菌株乂]\1-1601(?113€;1^31'11〇(1〇2：711^ XM-1601)細(xì)胞呈卵圓形，大?。?~6)μπιΧ(5~12)μπι。以單細(xì)胞為主，還有幾個細(xì)胞連在一 起的，成團(tuán)細(xì)胞用玻璃珠、超聲波均難于打散;有時細(xì)胞呈假菌絲狀，長X寬為(3~5)μπιX (10~17)μπι;細(xì)胞主要以出芽方式繁殖，在普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞不呈紅色，細(xì)胞內(nèi)無紅色 顆粒出現(xiàn)。
[0041 ] 2、菌落特征如圖4所示，本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaff ia rhodozyma XM-1601)細(xì)胞在YM培養(yǎng)基上的菌落大小1~5mm，菌落表面上凸，菌落邊緣整齊;菌落顏色橘 紅至深紅，菌落紅色色度越深越有光澤，其所含蝦青素的量越高。
[0042] 3、蝦青素在本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)細(xì) 胞內(nèi)，本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)細(xì)胞破碎液經(jīng)反復(fù) 離心水洗，沉淀物仍為紅色，這說明蝦青素是胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)。本發(fā)明的紅法夫酵母菌株 XM-1601(Phaffia rhodozyma XM-1601)細(xì)胞含有17%的脂肪酸，蝦青素提取液中含有大 量的脂肪酸，所以蝦青素可能均勻地分布于細(xì)胞脂質(zhì)中。
[0043] 4、生長特性:本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601(Phaffia rhodozyma XM-1601)為 好氧菌株，YM液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)菌生長緩慢，適宜發(fā)酵溫度為22度，過高或過低均會影 響菌體生長速度和蝦青素含量，最適pH為5.0~6.0。
[0044] 實(shí)施例1確定紅法夫酵母菌株的篩選溫度
[0045] 將涂有同樣濃度混合菌液的平板，分別置于18°(：、16°(：、14°(：、12°(：、10°(：的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，觀察紅法夫酵母菌落長成紅色明顯菌落的時間，同時觀察紅法夫酵母以外的雜菌 的菌落數(shù)量。結(jié)果如下表所示：
[0047]紅法夫酵母具有耐低溫的特性，利用低溫篩選紅法夫酵母，可以有效的抑制雜菌 生長，使紅法夫酵母在培養(yǎng)基上更易于被分離，利于紅法夫酵母菌株的大量篩選。特別是當(dāng) 溫度小于12度，微生物的生長普遍受到抑制，生長緩慢，因此，確定使用低溫培養(yǎng)7~10天， 培養(yǎng)溫度控制在12 °C來篩選紅法夫酵母菌株。
[0048]實(shí)施例2低溫培養(yǎng)法篩選分離本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)
[0049]步驟一、對帶有紅法夫酵母的樹葉層進(jìn)行預(yù)處理:準(zhǔn)備滅菌生理鹽水和燒杯，然后 將帶有紅法夫酵母的樹葉層在裝有滅菌生理鹽水的燒杯中反復(fù)浸洗，將浸洗液用〇.22um醋 酸纖維膜抽濾脫水，將濾膜上的菌液用IOmL滅菌生理鹽水復(fù)溶，獲得含有紅法夫酵母菌體 的溶液，根據(jù)紅法夫酵母菌體濃度適當(dāng)稀釋后(稀釋10~1000倍)涂平板，所采用的分離培 養(yǎng)基為YM培養(yǎng)基；
[0050] 對帶有紅法夫酵母的地表水進(jìn)行預(yù)處理:將帶有紅法夫酵母的地表水用0.22um醋 酸纖維膜抽濾脫水，將濾膜上的菌液用IOmL滅菌生理鹽水復(fù)溶，根據(jù)紅法夫酵母菌體濃度 適當(dāng)稀釋后(稀釋10~1000倍)涂平板，所采用的分離培養(yǎng)基為YM培養(yǎng)基；
[0051] 對帶有紅法夫酵母的地表泥土層:將帶有紅法夫酵母的地表泥土層用滅菌生理鹽 水中反復(fù)清洗，將微生物懸浮于滅菌生理鹽水中，將懸浮液用〇.22um醋酸纖維膜抽濾脫水， 將濾膜上的菌液用20mL滅菌生理鹽水復(fù)溶，根據(jù)紅法夫酵母菌體濃度適當(dāng)稀釋后(稀釋10 ~1000倍)涂平板，所采用的分離培養(yǎng)基為YM培養(yǎng)基。
[0052]步驟二、將步驟一中涂有菌體的平板置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，低溫培養(yǎng)7~10天， 培養(yǎng)溫度控制在12°C，利用紅法夫酵母適應(yīng)低溫生長的特性，抑制雜菌生長。
[0053]步驟三、查看平板，根據(jù)紅法夫酵母的菌落形態(tài)初步排除非酵母菌落，將潛在粉紅 色菌落或紅色菌落編號，用接種針從平板上挑取100~1000株紅色菌落分別在含YM培養(yǎng)基 的無菌平板上劃線，將劃線后的無菌平板在22°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天，獲得純種紅色單菌 落，分別用無菌YM斜面培養(yǎng)基保存于4 tC冰箱中備用。
[0054]步驟一和步驟三中，所說的YM培養(yǎng)基的pH為6.0，其配方為：10.Og/L葡萄糖、5.Og/ L蛋白胨、3. Og/L酵母浸粉、3. Og/L麥芽提取物、20.0 g/L瓊脂。
[0055]步驟四、在IOmL試管中添加3mL YM液體培養(yǎng)基，滅菌備用，將上述步驟三獲得的純 種紅色單菌落分別接種于此試管中，22°C、220rpm搖床培養(yǎng)120h，從中挑選20~50株紅色色 素含量較多的菌株。挑選時，將菌株按照紅色色素含量由多到少(菌株顏色由深至淺）的順 序排序，選取前20~50株，紅色色素含量的多少主要以顏色深淺區(qū)別，紅色色素含量越多， 菌株顏色越深。
[0056]步驟五、在25mL搖瓶中加入IOmL YM液體培養(yǎng)基，滅菌備用，將步驟四中獲得的20 ~50株紅色色素較多的菌株接種于此搖瓶中，22°C、220rpm培養(yǎng)24h做種子，然后再取5mL種 子液以9%接種量接種于250mL滅菌搖瓶(裝液量為50mL)中，22°C、220rpm搖床培養(yǎng)120h。 [0057]步驟四和步驟五中，所說的YM液體培養(yǎng)基的pH為6.0，其配方為：50.0 g/L葡萄糖、 5.0g/L蛋白胨、3.0g/L酵母浸粉、3.0g/L麥芽提取物。
[0058]步驟六、上述培養(yǎng)結(jié)束后，采用二甲亞砜法檢測蝦青素含量(實(shí)施例3)，同時采用 干重法測定紅法夫酵母的生物量干重(實(shí)施例4)。
[0059] 由于蝦青素為紅法夫酵母的胞內(nèi)產(chǎn)物，蝦青素含量以及紅法夫酵母生物量干重是 蝦青素高產(chǎn)量的基礎(chǔ)，蝦青素含量以及紅法夫酵母生物量干重是紅法夫酵母菌株篩選的重 要指標(biāo)，因此，以蝦青素產(chǎn)量（由蝦青素含量以及紅法夫酵母生物量干重共同決定，即蝦青 素產(chǎn)量=蝦青素含量X紅法夫酵母發(fā)酵生物量干重)高低為標(biāo)準(zhǔn)來選取紅法夫酵母菌株， 結(jié)合蝦青素含量以及紅法夫酵母生物量干重，從獲得的大量菌株中綜合選取一株蝦青素產(chǎn) 量最高的菌株作為本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM_1601(Phaffia rhodozyma XM-1601)，該菌 株即為研究和生產(chǎn)的出發(fā)菌株。該紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601) 于2016年5月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC Νο·12413〇
[0060] 實(shí)施例3蝦青素含量的檢測
[0061]首先，采用分光光度計(jì)法檢測蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。
[0062]蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測方法為:稱取蝦青素純品（s i gma公司生產(chǎn)的蝦青素純品） 1.00〇11^，無水乙醇溶解（以0.51]11^二氯甲燒助溶)并定容至10〇1]1]^，得到1〇11^/1^下青素標(biāo)準(zhǔn) 品，分別量取奸青素標(biāo)準(zhǔn)品〇11^、0.51111^、11]11^、21111^、31111^、41111^，用無水乙醇定容至1〇1111^，得到濃 度分別為〇mg/L、0.5mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L的奸青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，于分光光度計(jì) 478nm處測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值，空白對照為無水乙醇。如圖4所示，以吸光度值OD 48Q為橫坐 標(biāo)，以蝦青素含量(mg/L)為縱坐標(biāo)，獲得蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液與吸光度值的線性關(guān)系，線性關(guān)系 為Y(蝦青素 mg/L) = 4· 935X-0 · 766(0D4sq)，相關(guān)系數(shù)R2 = 0 · 99929，表明蝦青素含量與OD480 在測定范圍內(nèi)達(dá)到良好的線性關(guān)系；
[0063] 其次，采用二甲亞砜法檢測蝦青素含量:準(zhǔn)確移取ImL實(shí)施例2中獲得的紅法夫酵 母發(fā)酵液于5mL離心管中，1000 Orpm離心5min，棄上清，沉淀用去離子水重懸洗滌兩次，離心 后，往菌體中加 ImL 60°C預(yù)熱的二甲亞砜，振蕩充分搖勻，置于50°C水浴鍋中，水浴加熱破 壁5min，加入2mL無水乙醇，避光靜置萃取10~15min，經(jīng)破壁萃取處理后的色素菌體懸濁 液，1000 Orpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到容量適宜的棕色容量瓶中，所得菌體重復(fù)上述步驟萃 取色素，直到菌體為白色為止，將萃取所得上清轉(zhuǎn)移到同一個容量瓶中。根據(jù)上述得到的 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時采用現(xiàn)有的蝦青素含量計(jì)算公式計(jì)算蝦青素含量，蝦青素含量最高 為4.92mg/g，即每g紅法夫酵母菌株XM-1601菌體中含有奸青素4.92mg。
[0064]實(shí)施例4紅法夫酵母的生物量干重測定
[0065]準(zhǔn)確移取5mL實(shí)施例2中獲得的紅法夫酵母發(fā)酵液于干燥、潔凈的5mL離心管中， 1000 Orpm離心5min，棄上清，沉淀用去離子水洗滌兩次，再用少量的去離子水將沉淀洗到預(yù) 先烘干至恒重的稱量瓶中（未裝有菌液的稱量瓶的恒重為Gl)，將裝有菌液的稱量瓶置于 105°C烘箱中，烘干至恒重，然后置于干燥器中冷卻至室溫，準(zhǔn)確稱重(裝有菌液的稱量瓶的 恒重為G2)，根據(jù)W= (G2-G1 )/5可算出紅法夫酵母發(fā)酵生物量干重W(g/L)，紅法夫酵母發(fā)酵 生物量干重最高為65g/L。
[0066] 實(shí)施例5利用實(shí)施例2篩選出的紅法夫酵母菌株XM_1601(Phaffia rhodozyma XM- 1601)生產(chǎn)蝦青素
[0067] 步驟一、一級種子
[0068] 用接種環(huán)取實(shí)施例2篩選出的紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM- 1601)接種至含有50mL YM液體培養(yǎng)基的250mL滅菌三角瓶中，20~25°C、180~240rpm搖床 培養(yǎng)20~30h(優(yōu)選的，22°C、220rpm搖床培養(yǎng)24h)。
[0069] 步驟二、二級種子
[0070] 取上述搖瓶菌液（即一級種子液）IOmL接種至含有IOOmL YM液體培養(yǎng)基的500mL滅 菌三角瓶中（接種量9% )，20~25°C、180~240rpm搖床培養(yǎng)20~30h(優(yōu)選的，22°C、220rpm 搖床培養(yǎng)24h)。
[0071]步驟一和步驟二中，所說的YM液體培養(yǎng)基的pH為6.0，其配方為:50.0 g/L葡萄糖、 5.0g/L蛋白胨、3.0g/L酵母浸粉、3.0g/L麥芽提取物。
[0072]步驟三、采用10L發(fā)酵罐（上海保興）進(jìn)行發(fā)酵，加入發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌20~ 30min，接種二級種子的量為10%，裝液量為6L，發(fā)酵溫度為（22±5)°C (優(yōu)選發(fā)酵溫度為22 °C)，通氣量為10L/min，控制溶解氧在20%以上，發(fā)酵培養(yǎng)24~168h(優(yōu)選發(fā)酵120h)后放 罐，獲得富含蝦青素的紅法夫酵母發(fā)酵液；發(fā)酵過程中控制葡萄糖殘?zhí)菨舛仍贠~20g/L左 右(優(yōu)選O~l〇g/L，更優(yōu)選O~5g/L)，并用5M NaOH和2M稀硫酸控制pH在5.5左右。從發(fā)酵2411 開始直到發(fā)酵結(jié)束，每間隔12h檢測紅法夫酵母發(fā)酵生物量干重(g/L)(按照實(shí)施例4檢測紅 法夫酵母的生物量干重）以及蝦青素產(chǎn)量(mg/L)，計(jì)算出蝦青素含量(mg/g)(蝦青素含量= 蝦青素產(chǎn)量+紅法夫酵母發(fā)酵生物量干重）。
[0073]所加入的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5 · 5，其配方為：（30 · 0 ± 5)g/L葡萄糖、（5 · 0 ± 5)g/L蛋 白陳、（5.0±5)g/L濃縮酵母浸出粉、（3.0±3)g/L MgS〇4 · 7H20、（3.0±3)g/L ΚΗ2Ρ〇4、（1·0 ±l)g/L(NH4)2S〇4。
[0074] 優(yōu)選的，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:30.0 g/L葡萄糖、5. Og/l蛋白陳、5. Og/L濃縮酵母浸 出粉、3.0g/L MgS〇4.7H20、3.0g/L KH2P〇4、1.0g/L(NH4)2S〇4。
[0075] 所述加入的微量元素包括：100mg/L CaCl2 · 2H20、100mg/L FeS〇4 · 7H20、20mg/L ZnS〇4· 7H20、10mg/L MnS〇4· H20、10mg/L CuS〇4· 5H20、5mg/L C0SO4· 7H20。
[0076] 結(jié)果如圖5所示，本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM_1601(Phaffia rhodozyma XM-1601)，在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究，形成了一整套小試發(fā)酵生產(chǎn)工藝， 紅法夫酵母發(fā)酵生物量干重達(dá)到65g/L，蝦青素發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到320mg/L，通過計(jì)算獲得蝦青 素的含量約為4.92mg/g。該紅法夫酵母菌株XM-1601 (Phaffia rhodozyma XM-1601)同時擁 有較高的單位細(xì)胞蝦青素含量和較高的單位發(fā)酵液細(xì)胞干重，適合于蝦青素工業(yè)化生產(chǎn)的 需要。
[0077] 本發(fā)明的紅法夫酵母菌株XM_1601(Phaffia rhodozyma XM-1601)的用途:該菌株 經(jīng)過培養(yǎng)后富含蝦青素，可以應(yīng)用于動物飼料添加劑，食品添加劑和保健品等領(lǐng)域。
[0078] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株富含奸青素的紅法夫酵母菌株，命名為紅法夫酵母菌株(Phaffia rhodozyma) XM-1601，于2016年5月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 為CGMCC No.12413。2. 權(quán)利要求1所述的一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株的篩選方法，其特征在于，包括 以下步驟： 步驟一、對帶有紅法夫酵母的樹葉層、帶有紅法夫酵母的地表水和帶有紅法夫酵母的 地表泥土層分別進(jìn)行預(yù)處理后獲得含有紅法夫酵母菌體的溶液，根據(jù)紅法夫酵母菌體濃度 分別稀釋后涂平板，分離培養(yǎng)基采用YM培養(yǎng)基； 步驟二、將步驟一中涂有菌體的平板在12 °C下培養(yǎng)7~10天，挑取其中的紅色菌落100 ~1000株分別在含有YM培養(yǎng)基的無菌平板上劃線，22°C培養(yǎng)3~5天，獲得純種紅色單菌落； 步驟三、向10mL試管中加入3mL YM液體培養(yǎng)基，將步驟二獲得的純種紅色單菌落分別 接種于此試管中，22°C、220rpm搖床培養(yǎng)120h，從中挑選20~50株紅色色素含量較多的菌 株； 步驟四、向25mL搖瓶中加入10mL YM液體培養(yǎng)基，將挑選的20~50株菌株分別接種于此 搖瓶中，22°C、220rpm培養(yǎng)24h做種子;取5mL種子液以9 %接種量接種于含50mL YM液體培養(yǎng) 基的250mL滅菌搖瓶中，22°C、220rpm搖床培養(yǎng)120h; 步驟五、采用二甲亞砜法檢測蝦青素含量，同時采用干重法測定紅法夫酵母的生物量 干重，從中選取一株蝦青素產(chǎn)量最高的菌株，即為紅法夫酵母菌株XM-1601。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟一中，對帶有紅法夫酵母的樹葉 層進(jìn)行預(yù)處理:將帶有紅法夫酵母的樹葉層在裝有滅菌生理鹽水的燒杯中反復(fù)浸洗，將浸 洗液用0.22um醋酸纖維膜抽濾脫水，將濾膜上的菌液用10mL滅菌生理鹽水復(fù)溶，獲得含有 紅法夫酵母菌體的溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟一中，對帶有紅法夫酵母的地表 水進(jìn)行預(yù)處理:將帶有紅法夫酵母的地表水用〇.22um醋酸纖維膜抽濾脫水，將濾膜上的菌 液用10mL滅菌生理鹽水復(fù)溶，獲得含有紅法夫酵母菌體的溶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟一中，對帶有紅法夫酵母的地表 泥土層進(jìn)行預(yù)處理:將帶有紅法夫酵母的地表泥土層用滅菌生理鹽水中反復(fù)清洗，將微生 物懸浮于滅菌生理鹽水中，將懸浮液用〇.22um醋酸纖維膜抽濾脫水，將濾膜上的菌液用 20mL滅菌生理鹽水復(fù)溶，獲得含有紅法夫酵母菌體的溶液。6. 利用權(quán)利要求1所述的紅法夫酵母菌株生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 步驟一、一級種子 將紅法夫酵母菌株XM-1601接種至含有50mL YM液體培養(yǎng)基的250mL滅菌三角瓶中，20 ~25°C、180~240rpm搖床培養(yǎng)20~30h; 步驟二、二級種子 取上述搖瓶菌液10mL接種至含有100mL YM液體培養(yǎng)基的500mL滅菌三角瓶中，接種量 為9%，20~25°C、180~240rpm搖床培養(yǎng)20~30h; 步驟三、采用10L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，加入發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌20~30min，接種二級種 子的量為1 〇 %，裝液量為6L，發(fā)酵溫度為（22 ± 5) °C，通氣量為10L/min，控制溶解氧在20 % 以上，發(fā)酵培養(yǎng)24~168h后放罐，獲得富含蝦青素的紅法夫酵母發(fā)酵液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟三中，發(fā)酵過程中控制葡萄糖殘?zhí)菨?度在0~20g/L，并用5M NaOH和2M稀硫酸控制pH為5.5。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：（30.0±5)g/L 葡萄糖、（5.0±5)g/L蛋白陳、（5.0±5)g//L濃縮酵母浸出粉、（3.0±3)g/L MgS〇4 · 7H20、 (3 · 0 ± 3) g/L KH2PO4、（ 1 · 0 ± 1) g/L (NH4) 2SO4，pH5 · 5。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述微量元素包括：100mg/L CaCl2 · 2H20、 100mg/L FeS〇4· 7H20、20mg/L ZnS〇4· 7H20、10mg/L MnS〇4· H20、10mg/L CuS〇4· 5H20、5mg/ L C0SO4 · 7H20〇10. 權(quán)利要求1所述的一株富含蝦青素的紅法夫酵母菌株在動物飼料添加劑、食品添加 劑、保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/02GK105861342SQ201610340242
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】王杰鵬, 郗大興
【申請人】吉林省希瑪生物科技有限公司