專利名稱：增強(qiáng)含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母菌細(xì)胞的改性領(lǐng)域，具體涉及含脂肪酶酵母細(xì)胞的透性增 強(qiáng)方法，對胞內(nèi)酶具有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用，可保證胞內(nèi)酶對于酯交換、酯合成和 酯水解反應(yīng)催化作用的充分發(fā)揮，并延長酶的使用壽命。
背景技術(shù)：
脂肪酶是一種良好的酯交換、酯合成和酯水解反應(yīng)催化劑。以脂肪酶為催化 劑制備生物柴油，反應(yīng)條件溫和、醇用量少、甘油易回收、無廢物，可以解決 目前化學(xué)法生產(chǎn)生物柴油所用催化劑存在的分離難、耗能多的問題。
以全細(xì)胞作生物催化劑，存在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對底物和反應(yīng)產(chǎn)物的通透屏 障問題，即傳質(zhì)阻力問題。采用細(xì)胞透性化技術(shù)對細(xì)胞壁和膜的通透性處理， 可大大提高細(xì)胞酶活力。細(xì)胞透性化技術(shù)是指在不造成細(xì)胞裂解以及不破壞細(xì) 胞內(nèi)部有機(jī)結(jié)構(gòu)的情況下改變細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，使得小分子物質(zhì)和一 些較大分子物質(zhì)能夠自由地進(jìn)出細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞經(jīng)過透性化處理后，整體結(jié) 構(gòu)仍保持完整，對胞內(nèi)酶仍具有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用，可保證胞內(nèi)酶催化作用的充 分發(fā)揮，延長酶的使用壽命。通過細(xì)胞透性化技術(shù)增強(qiáng)細(xì)胞的通透性，減小 傳質(zhì)阻力，在不提取酶的情況下改善酶的作用效果，進(jìn)而提高生物催化劑的經(jīng) 濟(jì)性和實用性。[3][4]
參考文獻(xiàn)劉幽燕,庾樂，黃林峰，等.生物柴油制備方法的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化 工,2006,26(4): 15-20. Wei Du, Wei Li, Ting Sun, et al. Perspectives for biotechnological production of biodiesel and impacts [J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2008, 79:331—337.)周帥，王鳳山.細(xì)胞透性化技術(shù)及其應(yīng)用.技術(shù)與方法，2008， 28(4): 481-484.高惠玲，袁其朋，周延，等.用透性化細(xì)胞技術(shù)合成海藻糖.微生物學(xué) 通報，2004,31(3): 92-96.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在增強(qiáng)含脂肪酶酵母細(xì)胞的透性，在不提取細(xì)胞內(nèi)酶的情 況下，能夠充分發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)酶活性，以期降低生物催化劑的制備成本。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是提供一種有機(jī)化合物來改善 含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的方法，采用酮、鹵代烴和芳香族化合物為細(xì)胞透性改 善劑，配制一定濃度的細(xì)胞透性改善劑與水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶 酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，再對浸泡的細(xì)胞進(jìn)行收集、清洗并干燥處理，即得 透性改善的有催化活性的細(xì)胞。其方法包括如下步驟
a、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的菌種活化在葡萄糖(20g/L)、酵母粉(10g/L)、 蛋白胨(10g/L)和瓊脂(20g/L)的斜面培養(yǎng)基上，于30。C靜止培養(yǎng)72h;
b、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的液體種子培養(yǎng)在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(5.3 g/L)、酵母粉(生化試劑北京奧博星生物技術(shù)有限公司)(2g/L)、尿素(2g/L) 和MgS04 (0.5g/L)的液體培養(yǎng)基中，于3(TC、 160r/min搖床培養(yǎng)24h;
c、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的發(fā)酵液在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(1.8g/L)， 酵母粉(0.5g/L)、 KH2P04 (2g/L)且pH值自然的液體培養(yǎng)基中，于3(TC、 160 r/min搖床發(fā)酵72 h;
d、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的收集將發(fā)酵液過濾得成熟的濕酵母細(xì)胞，用生理 鹽水洗滌濕細(xì)胞3次；
e、 有機(jī)化合物的選取選擇酮、鹵代烴和芳香族化合物中的一種為細(xì)胞透 性改善劑；
f、 細(xì)胞浸泡根據(jù)所選改善劑的特征，配制1.0 15%濃度的有機(jī)化合物與 水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，在20 4(TC浸 泡15 90min;
g、 收集浸泡處理的細(xì)胞過濾收集浸泡的細(xì)胞，再用去離子水清洗3次；
h、 細(xì)胞干燥于室溫下自然風(fēng)干24 48h。
其中，所述的酮為丙酮、丁酮或異戊酮；所述的鹵代烴為二氯甲烷、三氯甲垸 或四氯化碳；所述的芳香族化合物為甲苯、乙苯或丙基苯。
采用本發(fā)明方法，通過使用對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的組成物質(zhì)有作用的有機(jī)化 合物，在一定的濃度下浸泡經(jīng)液體培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞適當(dāng)時間，即 可得到具有一定脂肪酶活性的透性得以改善的酵母細(xì)胞，其脂肪酶活力比對照組提高4.0 5.0倍。所得透性細(xì)胞可用作脂肪酶催化劑，用于油脂的轉(zhuǎn)酯化、合 成或水解。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，其突出優(yōu)點為本方法操作簡單，在不提取細(xì)胞內(nèi)酶
的情況下，能夠充分發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)酶活性，降低生物催化劑的制備成本，具有很 高的推廣利用價值。
下面結(jié)合實施例和說明書附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1:為應(yīng)用有機(jī)化合物改善含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的工藝流程示意圖。
具體實施方式
實施例l
a、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的菌種活化在葡萄糖(20g/L)、酵母粉(10g/L)、 蛋白胨(10g/L)和瓊脂(20g/L)的斜面培養(yǎng)基上，于30。C靜止培養(yǎng)72h;
b、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的液體種子培養(yǎng)在葡萄糖(100 g/L)、蛋白胨(5.3 g/L)、 酵母粉(2g/L)、尿素(2g/L)和MgS04 (0.5g/L)的液體培養(yǎng)基中，于30'C、 160r/min搖床培養(yǎng)24h;
c、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的發(fā)酵液在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(1.8g/L)， 酵母粉(0.5g/L)、 KH2P04 (2g/L)且pH值自然的液體培養(yǎng)基中，于3(TC、 160 r/min搖床發(fā)酵72 h;
d、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的收集將發(fā)酵液過濾得成熟的濕酵母細(xì)胞，用生理 鹽水洗滌濕細(xì)胞3次；
e、 有機(jī)化合物的選取選擇甲苯為細(xì)胞透性改善劑；
f、 細(xì)胞浸泡配制5.0%的甲苯與水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母 細(xì)胞浸泡于混合液中，于20'C浸泡70min;
g、 收集浸泡處理的細(xì)胞過濾收集浸泡的細(xì)胞，再用去離子水清洗3次；
h、 細(xì)胞干燥于室溫下自然風(fēng)干48h。
i、 酶活力的測定采用酸堿滴定法測定脂肪酸量。脂肪酶活力定義在38'C、 pH6.8的條件下，以每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生l Mmol脂肪酸的所需酶量 定義為l個酶活單位。
所得透性酵母細(xì)胞脂肪酶活力為21.8u/g,比對照提高4.8倍。 實施例2a、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的菌種活化在葡萄糖(20g/L)、酵母粉(10g/L)、 蛋白胨(10g/L)和瓊脂(20g/L)的斜面培養(yǎng)基上，于30'C靜止培養(yǎng)72h;
b、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的液體種子培養(yǎng)在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(5.3 g/L)、酵母粉(2g/L)、尿素(2g/L)和MgS04 (0.5 g/L)的液體培養(yǎng)基中，于 30°C、 160r/min搖床培養(yǎng)24h;
c、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的發(fā)酵液在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(1.8g/L)， 酵母粉(0.5g/L)、 KH2P04 (2g/L)且pH值自然的液體培養(yǎng)基中，于30'C、 160 r/min搖床發(fā)酵72 h;
d、 產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的收集將發(fā)酵液過濾得成熟的濕酵母細(xì)胞，用生理
鹽水洗滌濕細(xì)胞3次；
e、 有機(jī)化合物的選取選擇氯仿為細(xì)胞透性改善劑；
f、 鄰胞浸泡配制1.0%的氯仿與無菌水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶 酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，于l(TC浸泡30min;
g、 收集浸泡處理的細(xì)胞過濾收集浸泡的細(xì)胞，再用去離子水清洗3次；
h、 細(xì)胞干燥于室溫下自然風(fēng)干36h。
i、 酶活力的測定采用酸堿滴定法測定脂肪酸量。脂肪酶活力定義在38"C、 pH6.8的條件下，以每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生l Mmol脂肪酸的所需酶量
定義為l個酶活單位。
所得透性酵母細(xì)胞脂肪酶活力為23.4u/g，比對照提高5.2倍。 實施例3
a d步驟同實施例l;
e、 有機(jī)化合物的選取選擇丙酮為細(xì)胞透性改善劑；
f、 細(xì)胞浸泡配制15%的丙酮與無菌水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶 酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，于37'C浸泡80min;
g、 收集浸泡處理的細(xì)胞過濾收集浸泡的細(xì)胞，再用去離子水清洗3次；
h、 細(xì)胞干燥于室溫下自然風(fēng)干24h。
i、 酶活力的測定采用酸堿滴定法測定脂肪酸量。脂肪酶活力定義在38。C、 pH6.8的條件下，以每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生l )omol脂肪酸的所需酶量 定義為l個酶活單位。
所得透性酵母細(xì)胞脂肪酶活力為20.2u/g，比對照提高4.5倍。
權(quán)利要求
1、一種增強(qiáng)含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的方法，其特征在于采用對酵母細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有改善作用的有機(jī)化合物為細(xì)胞透性改善劑，對培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞浸泡而成；其方法包括如下步驟a、產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的菌種活化在葡萄糖(20g/L)、酵母粉(10g/L)、蛋白胨(10g/L)和瓊脂(20g/L)的斜面培養(yǎng)基上，于30℃靜止培養(yǎng)72h；b、產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的液體種子培養(yǎng)在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(5.3g/L)、酵母粉(2g/L)、尿素(2g/L)和MgSO4(0.5g/L)的液體培養(yǎng)基中，于30℃、160r/min搖床培養(yǎng)24h；c.產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的發(fā)酵液在葡萄糖(100g/L)、蛋白胨(1.8g/L)，酵母粉(0.5g/L)、KH2PO4(2g/L)且pH值自然的液體培養(yǎng)基中，于30℃、160r/min搖床發(fā)酵72h；d、產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞的收集將發(fā)酵液過濾得成熟的濕酵母細(xì)胞，用生理鹽水洗滌濕細(xì)胞3次；e、有機(jī)化合物的選取選擇酮、鹵代烴和芳香族化合物中的一種為細(xì)胞透性改善劑；f、細(xì)胞浸泡根據(jù)所選改善劑的特征，配制1.0～15％濃度的有機(jī)化合物與水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，在20～40℃浸泡15～90min；g、收集浸泡處理的細(xì)胞過濾收集浸泡的細(xì)胞，再用去離子水清洗3次；h、細(xì)胞干燥于室溫下自然風(fēng)干24～48h。其中，所述的酮為丙酮、丁酮或異戊酮；所述的鹵代烴為二氯甲烷、三氯甲烷或四氯化碳；所述的芳香族化合物為甲苯、乙苯或丙基苯。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述一種增強(qiáng)含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的方法，其特征在 于在步驟e中所述選擇有機(jī)化合物為甲苯為細(xì)胞透性改善劑；在步驟f中的細(xì)胞 浸泡條件為配制5.0%的甲苯與水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，于20'C浸泡70min。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述一種增強(qiáng)含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的方法，其特征在 于在步驟e中所述選擇有機(jī)化合物為氯仿為細(xì)胞透性改善劑；在步驟f中的細(xì)胞 浸泡條件為配制1.0%的氯仿與水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，于l(TC浸泡30min。
4、根據(jù)權(quán)利要求l所述一種增強(qiáng)含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的方法，其特征在 于在步驟e中所述選擇有機(jī)化合物為丙酮為細(xì)胞透性改善劑；在步驟沖的細(xì)胞 浸泡條件為配制15.0%的丙酮與水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞 浸泡于混合液中，于37"C浸泡80min。
全文摘要
一種增強(qiáng)含脂肪酶酵母細(xì)胞透性的方法，采用對酵母細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜有改善作用的有機(jī)化合物為細(xì)胞透性改善劑，對培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞浸泡而成；所述有機(jī)化合物的選取酮、鹵代烴和芳香族化合物中的一種為細(xì)胞透性改善劑；配制1.0～15％濃度的有機(jī)化合物與水的混合物，將培養(yǎng)成熟的產(chǎn)脂肪酶酵母細(xì)胞浸泡于混合液中，在20～40℃浸泡15～90min；經(jīng)去離子水洗、風(fēng)干而成。所得透性酵母細(xì)胞脂肪酶活力為對照的4.5～5.2倍，在不提取細(xì)胞內(nèi)酶的情況下，能夠充分發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)酶活性，以期降低生物催化劑的制備成本。
文檔編號C12N1/16GK101613665SQ200910012819
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者孫玉梅, 凱 杜, 珊 王 申請人:大連工業(yè)大學(xué)