專利名稱：一種基于酵母表面展示的分選酶檢測的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶分析技術領域，具體涉及一種基于酵母表面展示分 選酶底物的分選酶檢測方法。
背景技術：
分選酶的半胱氨酸轉肽酶可將許多革蘭氏陽性菌的表面蛋白錨
定到細胞壁上的關鍵酶。Mazmanian等人發(fā)現(xiàn)它可以通過肽鏈N端部 分固定在細胞膜上，并能識別表面蛋白C端分選信號所含的保守氨基 酸基序LPXTG，從而將表面蛋白錨定到細胞壁上(Staphylococcus aureus sortase， an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall.Science, 1999， 285 (5428): 760 763)。而表面蛋白能在病原菌的 致病性方面起關鍵作用，因此分選酶有可能稱為降低革蘭氏陽性菌致 病性的藥物靶點。建立高效、便捷的分選酶檢測方法，無論在分子生 物學還是藥物篩選領域都將有重大意義，也必將有很好的市場應用前
爭
目前分選酶的檢測方法主要有纖連蛋白結合法、熒光淬滅活性檢 測法和熒光共振能量轉移-HPLC檢測法(FRET-HPLC)。纖連蛋白結 合法通常需要對照菌——獲得分選酶缺失突變株的篩選工作量很大， 同時通過吸光度的改變反應分選酶的活性，精確性較差，不利于酶學 性質(zhì)的研究。熒光淬滅活性檢測法精確性高，操作相對容易，但在進行分選酶抑制劑篩選時，需要大量合成熒光標記多肽底物，成本很高。
FRET-HPLC是通過熒光底物裂解，檢測熒光強度變化和色譜檢測底 物濃度變化相結合的方法。這方法進一步提高了精確性，但依然沒有 解決成本高的問題且操作更復雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、操作簡單的基于酵母表面展 示分選酶底物的分選酶檢測方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案
一種基于畢赤酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測方法，包括 下列步驟
A、根據(jù)金黃色葡萄球菌分選酶的能識別表面蛋白C端分選信
號所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作為模板，引 物為5，-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAG AAGGAGGAATTGGAATTGCTC-3,和
5，-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT03，，劃線部分為底 物QALPETGEE基因，將目的基因QALPETGEE與linker-eGFP基因 融合成QALPETGEE-linker-eGFP;
B、 QALPETGEE-linker-eGFP表達載體的構建分別對表達載體 pKFS和目的基因QALPETGEE-linker-eGFP進行雙酶切，構建表達載 體pKFS- QALPETGEE- linker-eGFP;
C、 表達載體pKFS- QALPETGEE- linker-eGFP轉化至畢赤酵母；
D、 酵母表面蛋白的表達將陽性轉化子分別經(jīng)過YPD和BGMY液體培養(yǎng)基轉接培養(yǎng)，然后在BMMY液體培養(yǎng)基中誘導表達；
E、 酵母表面蛋白的檢測離心收集菌體，PBS反復洗滌菌體，
棄上清，重新懸浮于PBS中；分別用熒光顯微鏡進行定性觀察，用 流式細胞儀eGFP進行定量；
F、 分選酶的表達從金黃色葡萄球菌基因組中克隆分選酶(W")
基因，將分選酶的基因引入pTRX載體中，然后在大腸桿菌BL21中 表達pTRX-w"，通過雙酶切、測序鑒定陽性轉化子，并在LB液體 培養(yǎng)基中用IPTG誘導表達分選酶蛋白；
G、 分選酶活性檢離心沉淀大腸桿菌BL21，經(jīng)過TE buffer洗 滌菌體、裂解buffer重懸、超聲波破碎即得分選酶上清液；培養(yǎng)酵母 菌體，離心，用PBS反復洗滌，備用；加入分選酶及在表面展示的 分選酶底物反應，通過流式細胞儀和熒光分光光度計檢測。
在上述基于畢赤酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測方法，步 驟C所述表達載體pKFS- QALPETGEE- linker-eGFP轉化至畢赤酵母 是將表達載體線性化后，用醋酸鋰法轉化，使基因整合至畢赤酵母 GS115。
YPD液體培養(yǎng)基(1L):蛋白胨2g，酵母抽提物lg，葡萄糖2g。 BMGY液體培養(yǎng)基(1L):酵母抽提物lg，蛋白胨2g， YNB 1.34 g， 磷酸鉀緩沖液100mMpH6.0，生物素4xl()-5g，甘油lg。 BMMY液體培養(yǎng)基(1L):酵母抽提物lg，蛋白胨2g， YNB1.34g， 磷酸鉀緩沖液100mMpH6.0，生物素4xlO'Sg，甲醇0.5g。 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明利用酵母表面展示技術，先將分選酶底物基因與eGFP基 因融合表達，定位到酵母表面，同時用eGFP作為標記取代合成的熒 光標記，通過將分選酶的底物及標記物eGFP展示在酵母表面，根據(jù) 產(chǎn)生游離的eGFP或者表面eGFP減少的量，進行分選酶檢測。利用 流式細胞儀和熒光分光光度計進行分選酶檢測。本發(fā)明利用酵母表面 展示技術，然后用熒光分光光度計和流式細胞儀檢測，所用到的物質(zhì) 價格比較低，大大降低了分選酶活性測定的成本，且操作簡便。


圖1為檢測方法原理示意圖； 圖2為重組酵母顯微A、 B為100X光學顯微鏡；a、 b為熒光顯微圖
A、a為GS115/pKFS-QALPETGEE- linker國eGFP;B、b為GS115/pKFS。
圖3為酵母表面底物與分選酶的相互作用熒光分光光度計檢測圖； 黑色為酵母表面展示底物未與分選酶作用的熒光分光光度計檢測圖； 藍色為酵母表面展示底物與分選酶作用的熒光分光光度計檢測圖。 圖4為重組酵母表面展示eGFP流式細胞儀檢測圖； 灰色為GS115/pKFS;紅色為GS115/pKFS-QALPETGEE- linker-eGFP。 圖5為酵母表面底物與分選酶的相互作用流式細胞儀檢測圖； 紅色為酵母表面展示底物未與分選酶作用的流式細胞儀檢測圖； 綠色為酵母表面展示底物與分選酶作用的流式細胞儀檢測圖。
具體實施方式
實施例1
一種基于酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測方法，它包括下 列步驟
l.根據(jù)金黃色葡萄球菌分選酶的能識別表面蛋白C端分選信號
所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作為模板，引物 為5,隱CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAG AAGGAGGAATTGGAATTGCIC-3 ，和
5'-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG3，，劃線部分為底 物QALPETGEE基因，將目的基因QALPETGEE與linker-eGFP基因 融合成QALPETGEE-linker-eGFP;
2. QALPETGEE- linker-eGFP表達載體的構建分別對表達載體 pKFS (對pPIC9K進行改造，加上了絮凝素基因，命名為pKFS，可 見申請?zhí)枮?00810028631的中國發(fā)明專利)和目的基因 QALPETGEE- linker-eGFP進行雙酶切，構建載體pKFS-QALPETGEE- linker-eGFP。然后16。C進行連接反應，轉入到E.coli ToplO細胞中，進行雙酶切和測序驗證陽性轉化子。
3. 表達載體轉化至畢赤酵母Sacl酶切將表達載體線性化，用醋 酸鋰法轉化，使基因整合至酵母GS115基因組，將轉化子在SD上涂 板培養(yǎng)48h， 30°C。陽性轉化子進行菌落PCR鑒定。
4. 酵母表面蛋白的表達將菌落PCR的陽性轉化子，首先在10ml 的YPD液體培養(yǎng)集中3(TC培養(yǎng)24h，然后以1%的接種量轉接到50ml 的BMGY培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)24h，將所有的菌體轉入已滅菌的50ml離心管中，14°C， 8000r/min離心30min除上清(無菌操作)，用5ml 的BMMY洗滌，然后全部轉入100ml的BMMY液體培養(yǎng)基中，每 天添加0.5% (v/v) ^甲醇誘導表達。離心收集菌體，PBS洗滌菌體， 棄上清，重新懸浮于PBS中。
5. 酵母表面蛋白的檢測14°C， 8000r/min離心沉淀，收集菌體， PBS反復洗滌，棄上清，并使重新懸浮于PBS中，取10pl制片，在 熒光顯微鏡下鏡檢，結果見圖2，陰性對照酵母GS115/pKFS在熒光 顯微鏡下不發(fā)綠色熒光，而重組酵母GS115/pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP在熒光顯微鏡下發(fā)出較強的綠色熒光。則可說明 QALPETGEE- linker-eGFP基因在酵母表面展示成功。
6. 分選酶的表達從金黃色葡萄球菌基因組中克隆分選酶(w") 基因，將分選酶的基因引入pTRX載體中，然后在BL21中37'C， 250r/min表達pTRX-w"，通過雙酶切、測序鑒定陽性轉化子，然后 在LB液體培養(yǎng)基中用IPTG誘導表達分選酶蛋白。
7. 分選酶活性檢4°C， 10000r/min離心2min沉淀大腸桿菌菌 體BL21， TE buffer反復洗滌離心，用裂解buffer重懸且漩渦振蕩混 勻，超聲波破碎即得分選酶上清液。培養(yǎng)144h的酵母菌體，離心， 用PBS反復洗滌，備用。加入分選酶及在表面展示分選酶底物反應， 設同樣的反應體系但不加分選酶做對照。4°C， 11000r/min離心5min 取上清用PBS補足3ml用熒光分光光度計檢測，結果如圖3所示， 反應上清游離的eGFP的熒光強度由189.9增加至273.0，說明與分選 酶反應后生成了部分游離的eGFP則展示在酵母表面的底物可用于分選酶的活性檢測。 實施例2
一種基于酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測方法，它包括下 列步驟
l.根據(jù)金黃色葡萄球菌分選酶的能識別表面蛋白C端分選信號
所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作為模板，引物 為5，-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAG AAGGAGGAATTGGAATTGCIC-3,和
5'-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG3，，劃線部分為底 物QALPETGEE基因，將目的基因QALPETGEE與linker-eGFP基因 融合成QALPETGEE-linker-eGFP;
2. QALPETGE& linker-eGFP表達載體的構建分別對表達載體 pKFS (對pPIC9K進行改造，加上了絮凝素基因，命名為pKFS，可 見申請?zhí)枮?00810028631的中國發(fā)明專利)和目的基因 QALPETGEE- linker-eGFP進行雙酶切，構建載體pKFS-QALPETGEE- linker-eGFP。然后16。C進行連接反應，轉入到E.coli Topl0細胞中，進行雙酶切和測序驗證陽性轉化子。
3. 表達載體轉化至畢赤酵母Sacl酶切將表達載體線性化，用醋 酸鋰法轉化，使基因整合至酵母GS115基因組，將轉化子在SD上涂 板培養(yǎng)48h， 30°C。陽性轉化子進行菌落PCR鑒定。
4. 酵母表面蛋白的表達將菌落PCR的陽性轉化子，首先在10ml 的YPD液體培養(yǎng)集中3(TC培養(yǎng)24h，然后以1%的接種量轉接到50ml的BMGY培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)24h，將所有的菌體轉入已滅菌的50ml 離心管中，14°C， 8000r/min離心30min除上清(無菌操作)，用5ml 的BMMY洗滌，然后全部轉入100ml的BMMY液體培養(yǎng)基中，每 天添加0.5% (v/v)的甲醇誘導表達。離心收集菌體，PBS洗滌菌體， 棄上清，重新懸浮于PBS中。
5. 酵母表面蛋白的檢測14°C， 8000r/min離心沉淀，收集菌體， PBS反復洗滌，棄上清，并使重新懸浮于PBS中，取50(^1充分混勻， 使菌體分開，利用流式細胞儀檢測，結果見圖4。重組酵母 GS115/pKFS-QALPETGE& linker-eGFP的綠色熒光強度明顯偏移了 陰性對照GS115/pKFS的所發(fā)出的綠色熒光強度，則可說明 QALPETGEE- linker-eGFP基因在酵母表面展示成功。
6. 分選酶的表達從金黃色葡萄球菌基因組中克隆分選酶(w") 基因，將分選酶的基因引入pTRX載體中，然后在BL21中37'C， 250r/min表達pTRX-w"，通過雙酶切、測序鑒定陽性轉化子，然后 在LB液體培養(yǎng)基中用IPTG誘導表達分選酶蛋白。
7. 分選酶活性檢4°C， 10000r/min離心2min沉淀大腸桿菌菌 體BL21， TE buffer反復洗滌離心，用裂解buffer重懸且漩渦振蕩混 勻，超聲波破碎即得分選酶上清液。培養(yǎng)144h的酵母菌體，離心， 用PBS反復洗滌，備用。加入分選酶及在表面展示分選酶底物反應， 設同樣的反應體系但不加分選酶做對照。4°C， 11000r/min離心5min 取沉淀用PBS重新溶解通過流式細胞儀檢測，結果如圖5所示，經(jīng) 分選酶作用后的eGFP熒光強度較未與分選酶反應的eGFP熒光強度弱，說明經(jīng)分選酶作用后，有部分的eGFP蛋白脫落，則展示在酵母 表面的底物可用于分選酶的活性檢測。一種基于酵母表面展示的分選酶檢測的方法 SEQUENCE LISTING
<110> 華南理工大學
〈120〉 一種基于酵母表面展示的分選酶檢測的方法
<130>
〈160〉 2
<170> Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 58
<212> 脆 〈213〉人工序列
<400〉 1
cccacgcgta tgcaagcttt gcctgaaact ggtgaagaag gaggaattgg aattgctc 58
〈210〉 2
〈211〉 31
<212> 腿
<213〉 人工序列
<400> 2
cgcgaattct tacttgtaca gctcgtccat g 3權利要求
1、一種基于畢赤酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測方法，其特征在于包括下列步驟A、根據(jù)金黃色葡萄球菌分選酶的能識別表面蛋白C端分選信號所含的保守基序LPXTG，以pcDNA6-myc-his-EGFP作為模板，引物為5’-CCCACGCGTATGCAAGCTTTGCCTGAAACTGGTGAAGAAGGAGGAATTGGAATTGCTC-3’和5’-CGCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’，劃線部分為底物QALPETGEE基因，將目的基因QALPETGEE與linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；B、QALPETGEE-linker-eGFP表達載體的構建分別對表達載體pKFS和目的基因QALPETGEE-linker-eGFP進行雙酶切，構建表達載體pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP；C、表達載體pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP轉化至畢赤酵母；D、酵母表面蛋白的表達將陽性轉化子分別經(jīng)過YPD和BGMY液體培養(yǎng)基轉接培養(yǎng)，然后在BMMY液體培養(yǎng)基中誘導表達；E、酵母表面蛋白的檢測離心收集菌體，PBS反復洗滌菌體，棄上清，重新懸浮于PBS中；分別用熒光顯微鏡進行定性觀察，用流式細胞儀eGFP進行定量；F、分選酶的表達從金黃色葡萄球菌基因組中克隆分選酶基因，將分選酶的基因引入pTRX載體中，然后在大腸桿菌BL21中表達pTRX-srtA，通過雙酶切、測序鑒定陽性轉化子，并在LB液體培養(yǎng)基中用IPTG誘導表達分選酶蛋白；G、分選酶活性檢離心沉淀大腸桿菌BL21，經(jīng)過TE buffer洗滌菌體、裂解buffer重懸、超聲波破碎即得分選酶上清液；培養(yǎng)酵母菌體，離心，用PBS反復洗滌，備用；加入分選酶及在表面展示的分選酶底物反應，通過流式細胞儀和熒光分光光度計檢測。
2、 如權利要求1所述的基于畢赤酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測 方法，其特征在于，步驟C所述表達載體pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP轉化至畢赤酵母是將表達載體線性化后，用醋酸鋰法轉化，使基因整合至畢赤酵母GS115。
3、 如權利要求1所述的基于畢赤酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測方法，其特征在于YPD液體培養(yǎng)基每升液體培養(yǎng)基中含有蛋白胨2g，酵母抽提物lg，葡萄糖 2g;BMGY液體培養(yǎng)基每升液體培養(yǎng)基中含有酵母抽提物lg，蛋白胨2g，YNB 1.34 g，磷酸鉀緩沖液100mMpH6.0，生物素4xl()-5g，甘油1 g; BMMY液體培養(yǎng)基每升液體培養(yǎng)基中含有酵母抽提物lg，蛋白胨2g，YNB 1.34g，磷酸鉀緩沖液100mMpH6.0，生物素4xl()-5g，甲醇0.5mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于畢赤酵母表面展示分選酶底物的分選酶檢測方法，包括下列步驟A.將目的基因QALPETGEE與linker-eGFP基因融合成QALPETGEE-linker-eGFP；B.構建QALPETGEE-linker-eGFP表達載體的構建；C.表達載體pKFS-QALPETGEE-linker-eGFP轉化至畢赤酵母；D.酵母表面蛋白的表達將陽性轉化子分別經(jīng)過YPD和BGMY液體培養(yǎng)基轉接培養(yǎng)，然后在BMMY液體培養(yǎng)基中誘導表達；E.酵母表面蛋白的檢測；F.分選酶的表達；G.分選酶活性檢。本發(fā)明利用酵母表面展示技術，然后用熒光分光光度計和流式細胞儀檢測，所用到的物質(zhì)價格比較低，大大降低了分選酶活性測定的成本，且操作簡便。
文檔編號C12N15/70GK101603075SQ200910040618
公開日2009年12月16日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權日2009年6月26日
發(fā)明者琳 吳, 芳 朱, 影 林, 江彬強, 羅立新 申請人:華南理工大學