專利名稱：：一種檢測細(xì)胞損傷修復(fù)能力的方法及其專用芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞損傷修復(fù)測定技術(shù)，特別提供了一種檢測細(xì)胞損傷修復(fù)能力的方法及其專用芯片。
背景技術(shù)：
：生物體生存的環(huán)境是一個(gè)不斷變化的、存在細(xì)菌、病毒、過敏原等多種致病因素的環(huán)境。連續(xù)的細(xì)胞層在病理因素的持續(xù)作用下易于受損，細(xì)胞脫落形成缺損，而受損后的組織重建和功能重建過程則依賴于細(xì)胞的損傷修復(fù)能力。損傷修復(fù)的過程首先是傷口周圍細(xì)胞向傷口部位發(fā)生極化，并伸出突觸，然后細(xì)胞開始遷移增殖并逐步愈合傷口。上述過程無論在整個(gè)組織還是在單個(gè)細(xì)胞水平上都是類似的。損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被作為研究細(xì)胞極化、組織基質(zhì)重排、預(yù)測細(xì)胞在不同細(xì)胞和不同培養(yǎng)環(huán)境下細(xì)胞的增殖及遷移能力的重要手段。臨床上，細(xì)胞損傷修復(fù)能力的下降是胃、十二指腸潰瘍、氣道高反應(yīng)性、血栓形成等眾多病理過程發(fā)生發(fā)展的重要因素，而提高細(xì)胞損傷修復(fù)的能力也是許多細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)以及藥物發(fā)揮作用的重要途徑。對于細(xì)胞損傷修復(fù)能力的考察也是細(xì)胞學(xué)研究常用實(shí)驗(yàn)之一。傳統(tǒng)的損傷修復(fù)分析按照造成缺損的方法分為機(jī)械損傷和化學(xué)損傷兩種，實(shí)際應(yīng)用中以劃痕法為主，即在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上采用機(jī)械刮擦的方法形成物理刮痕，然后使用顯微鏡觀察相應(yīng)時(shí)間段內(nèi)劃痕的愈合情況，具體的愈合時(shí)間隨不同的細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件以及傷口的區(qū)域大小而變化。劃痕法依賴于手工操作，其傷口區(qū)域的大小及寬度變化較大，初始損傷面積不易控制，拍照時(shí)缺損難以準(zhǔn)確定位，而且劃痕可能會(huì)對周圍的細(xì)胞造成損傷從而影響其遷移的效率，因此這種"劃痕"傷口愈合試驗(yàn)結(jié)果由于細(xì)胞間相互的多因素作用而不夠理想，往往導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不佳，更為重要的是，在實(shí)際應(yīng)用中，這種定性的觀察(而非定量測量)難以被應(yīng)用到高通量的研究中。因此，開發(fā)操作簡便、缺損一致、拍照方便、通量高的損傷修復(fù)定量檢測方法，已成為實(shí)驗(yàn)室技術(shù)發(fā)展的必然。微流控芯片實(shí)驗(yàn)室又稱芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片(Microfluidic)，指的是把化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測、細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)。由于微流控芯片的多維網(wǎng)絡(luò)特征和功能集成特征，已經(jīng)有可能使常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞受激、細(xì)胞標(biāo)記和檢測等過程集成在一塊很小的芯片上完成。因此，微流控芯片技術(shù)與細(xì)胞損傷修復(fù)檢測方法發(fā)展的需求相吻合，有望成為損傷修復(fù)新檢測方法的突破口。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供了一種檢測細(xì)胞損傷修復(fù)能力的方法及其專用芯片。本發(fā)明提供了一種集成化微流控芯片，該芯片由299個(gè)相同的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)單元之間通過一個(gè)公共細(xì)胞進(jìn)樣池相連接；每個(gè)結(jié)構(gòu)單元含有299個(gè)柱形結(jié)構(gòu)、2~99個(gè)擋板結(jié)構(gòu)和一個(gè)廢液池。本發(fā)明提供的集成化微流控芯片，所述的柱形結(jié)構(gòu)大小和形狀均相同，柱形結(jié)構(gòu)之間間隔相同的距離，沿細(xì)胞進(jìn)樣通路兩側(cè)均勻分布；柱形結(jié)構(gòu)的作用是形成相同的細(xì)胞缺損區(qū)，缺損區(qū)大小在顯微鏡拍照視野內(nèi)。本發(fā)明提供的集成化微流控芯片，所述的擋板結(jié)構(gòu)由299個(gè)板狀結(jié)構(gòu)組成，主要起分流作用，使細(xì)胞在灌注時(shí)均勻分布于柱形結(jié)構(gòu)周圍。本發(fā)明還提供了一種利用集成化微流控芯片進(jìn)行檢測細(xì)胞損傷修復(fù)能力的方法，方法過程為將細(xì)胞懸液加入位于芯片中央的公共細(xì)胞進(jìn)樣池中，靜置5-30分鐘，芯片置于顯微鏡下觀察，當(dāng)芯片中細(xì)胞不再流動(dòng)停駐于細(xì)胞培養(yǎng)室中時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，使其液面略高于芯片高度；將接種了細(xì)胞的微流控芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將芯片置于顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁及生長情況；待細(xì)胞貼壁且細(xì)胞密度大于80%后，輕輕將微流控芯片揭去，分別加入含不同藥物的細(xì)胞培養(yǎng)基，立即在顯微鏡下尋找損傷區(qū)域并拍照；拍照后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其后每隔412小時(shí)對缺損區(qū)拍照一次，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察24~72小時(shí)；收集所有時(shí)間點(diǎn)的缺損區(qū)域圖像，采用圖像分析軟件勾畫缺損邊緣并測算缺損面積，以O(shè)h缺損面積為百分之百，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)缺損面積占Oh缺損面積的百分比，以反映缺損愈合情況；繪制時(shí)間與缺損面積的直線回歸圖，作出直線回歸方程，Y=a+bX，損傷修復(fù)指數(shù)(Woundrepairindex,RI)等于回歸方程中b的絕對值，即RI=|b|，以此反映不同處理組中細(xì)胞愈合速度的快慢。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明所述微流控芯片將細(xì)胞培養(yǎng)、缺損區(qū)域形成、損傷修復(fù)過程啟動(dòng)等功能單元集成于一塊芯片上，待細(xì)胞貼壁且密度較高時(shí)，只需將芯片揭去既可自動(dòng)形成缺損區(qū)并啟動(dòng)損傷修復(fù)過程。2.本發(fā)明只需向細(xì)胞進(jìn)樣池滴加高濃度的細(xì)胞懸液，無需額外人為操作，通過柱形結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的阻擋作用即可形成形狀、大小均相同的細(xì)胞缺損區(qū)域。與傳統(tǒng)劃痕法相比，可避免由于缺損的大小和形狀不同產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)誤差。3.本發(fā)明一次滴加細(xì)胞既可形成12個(gè)細(xì)胞缺損區(qū)，通量高且細(xì)胞用量少，每三個(gè)缺損在一個(gè)顯微鏡視野內(nèi)(x40)，拍照易于定位，使用方便快捷。4.本發(fā)明采用的芯片材料底面粘性大，易于與培養(yǎng)皿可逆封接，溶液無滲漏，具有生物相容性，無熒光吸附，且價(jià)格低廉，適合大規(guī)模生產(chǎn)。圖l集成化微流控芯片示意圖，其中l(wèi)為細(xì)胞進(jìn)樣池，2為廢液池；圖2集成化微流控芯片示意圖中一個(gè)結(jié)構(gòu)單元的放大圖，其中1為細(xì)胞進(jìn)樣通路，2為擋板結(jié)構(gòu)，3為柱形結(jié)構(gòu)，4通往廢液池；圖3集成化微流控芯片細(xì)胞灌注過程示意圖，其中A為細(xì)胞灌注前，B為灌注細(xì)胞，C為細(xì)胞貼壁生長至密度大于80%，D為揭去芯片后，形成三個(gè)完全相同的細(xì)胞缺損；圖4人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)損傷修復(fù)過程圖(X40);圖5人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)在重組人表皮生長因子(EGF90ng/ml)作用下的損傷修復(fù)過程圖(X40);圖6人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)在重組人表皮生長因子(EGF90ng/ml)作用下的損傷修復(fù)能力統(tǒng)計(jì)分析圖。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實(shí)施例l將圖1所示的芯片(共有4個(gè)結(jié)構(gòu)單元，每個(gè)結(jié)構(gòu)單元有3個(gè)柱形結(jié)構(gòu)，因此可以同時(shí)生成12個(gè)大小、形狀均相同的細(xì)胞缺損區(qū))接種高濃度(約107/ml)人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)后置于37。C、5%C02培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁且密度大于80%后，輕輕將微流控芯片揭去，對照組加入含12%新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，EGF組加入含90ng/mlEGF及12n/。新生牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，立即在顯微鏡下尋找損傷區(qū)域并拍照。拍照后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其后每隔8小時(shí)拍照一次，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察24小時(shí)。可見EGF(90ng/ml)可顯著促進(jìn)GES-1的損傷修復(fù)速度(見圖4，圖5)。收集所有時(shí)間點(diǎn)的缺損區(qū)域圖像，采用圖像分析軟件勾畫缺損邊緣并測算缺損面積，以O(shè)h缺損面積為百分之百，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)缺損面積占Oh缺損面積的百分比，以反映缺損愈合情況。繪制時(shí)間與缺損面積的直線回歸圖，作出直線回歸方程Y-a+bX(見表l)，損傷修復(fù)指數(shù)(Woundrepairindex,RI)等于回歸方程中b的絕對值，即RI叫bl，以此反映不同處理組中細(xì)胞愈合速度的快慢?？梢奅GF(90ng/ml)可顯著提高GES-1的損傷修復(fù)指數(shù)(見圖6，表l)。表l對照組和EGF組的回歸方程<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2將圖1所示的芯片接種高濃度(約107/ml)體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞后置于37。C、5。/。C02培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁且密度大于80%后，輕輕將微流控芯片揭去，分別加入含不同濃度堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,b-FGF)的細(xì)胞培養(yǎng)基，立即在顯微鏡下尋找損傷區(qū)域并拍照。拍照后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其后每隔8小時(shí)拍照一次，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察24小時(shí)?？梢?^g/L的bFGF可顯著促迸人晶狀體上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)速度，隨著b-FGF濃度的增加，促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。權(quán)利要求1、一種集成化微流控芯片，其特征在于該芯片由2～99個(gè)相同的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)單元之間通過一個(gè)公共細(xì)胞進(jìn)樣池相連接；每個(gè)結(jié)構(gòu)單元含有2～99個(gè)柱形結(jié)構(gòu)、2～99個(gè)擋板結(jié)構(gòu)和一個(gè)廢液池。2、按照權(quán)利要求1所述集成化微流控芯片，其特征在于所述的柱形結(jié)構(gòu)大小和形狀均相同，柱形結(jié)構(gòu)之間間隔相同的距離，沿細(xì)胞進(jìn)樣通路兩側(cè)均勻分布。3、按照權(quán)利要求1所述集成化微流控芯片，其特征在于所述的擋板結(jié)構(gòu)由2~99個(gè)板狀結(jié)構(gòu)組成。4、一種利用權(quán)利要求1所述芯片進(jìn)行檢測細(xì)胞損傷修復(fù)能力的方法，其特征在于方法過程為將細(xì)胞懸液加入位于芯片中央的公共細(xì)胞進(jìn)樣池中，靜置5-30分鐘，芯片置于顯微鏡下觀察，當(dāng)芯片中細(xì)胞不再流動(dòng)停駐于細(xì)胞培養(yǎng)室中時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，使其液面略高于芯片高度；將接種了細(xì)胞的微流控芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將芯片置于顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁及生長情況；待細(xì)胞貼壁且細(xì)胞密度大于80%后，輕輕將微流控芯片揭去，分別加入含不同藥物的細(xì)胞培養(yǎng)基，立即在顯微鏡下尋找損傷區(qū)域并拍照；拍照后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其后每隔412小時(shí)對缺損區(qū)拍照一次，連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察24~72小時(shí)；收集所有時(shí)間點(diǎn)的缺損區(qū)域圖像，采用圖像分析軟件勾畫缺損邊緣并測算缺損面積，以0h缺損面積為百分之百，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)缺損面積占Oh缺損面積的百分比，以反映缺損愈合情況；繪制時(shí)間與缺損面積的直線回歸圖，作出直線回歸方程，Y=a+bX，損傷修復(fù)指數(shù)RI等于回歸方程中b的絕對值，即RI叫b卜以此反映不同處理組中細(xì)胞愈合速度的快慢。全文摘要一種檢測細(xì)胞損傷修復(fù)能力的方法及其專用芯片，該芯片由2～99個(gè)相同的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，這些結(jié)構(gòu)單元之間通過一個(gè)公共細(xì)胞進(jìn)樣池相連接；每個(gè)結(jié)構(gòu)單元含有柱形結(jié)構(gòu)、擋板結(jié)構(gòu)和廢液池。本發(fā)明創(chuàng)造性地將細(xì)胞培養(yǎng)、缺損區(qū)域形成、損傷修復(fù)過程啟動(dòng)等功能單元集成于一塊芯片上，采用柱形結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的阻擋作用以形成形狀、大小均相同的細(xì)胞缺損區(qū)域。與傳統(tǒng)的劃痕法相比，簡化了人為操作，能提供完全相同的初始缺損區(qū)域，減少了細(xì)胞用量，通量高，且損傷修復(fù)過程易于定位拍照。文檔編號C12Q1/02GK101586075SQ20091001240公開日2009年11月25日申請日期2009年7月8日優(yōu)先權(quán)日2009年7月8日發(fā)明者敏張,李艷峰,林炳承,秦建華申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所