專利名稱：細胞遷移測定的制作方法
細月包遷移測定相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2005年9月16日提交的申請?zhí)枮?0〃18,057的美國 臨時專利申請，以及2006年5月17日提交的申請?zhí)枮?0/747,430的 美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，上述申請披露的內(nèi)容全部通過援引加入 本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及血球滲出測定方法。更具體地講，本發(fā)明涉及用 于跨內(nèi)皮遷移測定的組合物，以及制備和使用這些組合物的方法。發(fā)明背景細胞通過血管內(nèi)皮的遷移是像炎癥、動脈硬化和腫瘤轉(zhuǎn)移這些狀 況的病理生理學(xué)上的重要事件。這些年已經(jīng)發(fā)展出了體外測量細胞遷 移的方法。最常用的方法是使用人工屏障(膜)，通常需要對遷移的 細月包進行人工計數(shù)。市場上已有的細胞遷移測定裝置有經(jīng)典Boyden 小室(Boyden chamber )、纟田胞培養(yǎng)插入(cell culture insert)(改良版 Boyden小室)、FluoroBlockTM (BD Biosciences)和Cell Motility HitKitTM(Cellomics)。這些裝置的主要局限性有通量低，細胞人工計數(shù)， 使用為了細胞穿越的生物非相關(guān)材料，以及分析得到的結(jié)果存在困難。最近，致力于模仿遷移細胞的體內(nèi)環(huán)境的多層構(gòu)建物已經(jīng)提出(參 見公布號為WO 2003/027256和WO 2004/046337的國際申請)。然而， 該系統(tǒng)制備復(fù)雜，并且不適合高通量篩選。仍需要改良的、使用簡單的跨內(nèi)皮細胞遷移(Transendothehal Cell Migration, TEM )測定系統(tǒng)，尤其是用于藥物4罙尋業(yè)的高通量篩選。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供用于跨內(nèi)皮細胞遷移測定的組合物和方法。 這些組合物和方法特別適于高通量TEM測定，以及抑制或刺激TEM 進程的介質(zhì)的分析。本發(fā)明的 一方面提供用于檢測細胞遷移的組合物，該組合物含有 含有膠原凝膠的固體層；接觸所述固體層并含有第 一 細胞類型的第一 細胞層；以及接種到所述第一細胞層上的第二細胞類型。固體膠原凝 膠層任選地含有明膠。這方面的一個具體實施方式
提供了在96孔板形 式中的組合物，具有人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的匯合第 一細胞層， 中性粒細胞或者外周血單核細胞(PBMC)作為第二細胞類型。該實施方 式的變化被提供在下面的詳細說明和權(quán)利要求中。本發(fā)明的另 一方面提供了 一種制備用于檢測細胞遷移的物質(zhì)組合 物(composition of matter )的方法，該方法包才舌以下步艱茌在容器內(nèi)；咒 積和固化膠原凝膠以形成含有膠原凝膠的固體層；置第一類型細胞于 所述固體層上并孵育所述第 一細胞類型以形成同所述固體層接觸的匯 合細胞層；以及將第二細胞類型的細胞接種到所述第一細胞層上。提 供了能夠制備所述物質(zhì)組合物的詳細實施方式，包括在96孔板形式(96 well plate format)內(nèi)的所述復(fù)合物，其對于包括TEM在內(nèi)的細胞遷移 的高通量分析是理想的。在形成固體層前任選地將明膠溶液混入膠原 凝膠中。本發(fā)明的另 一方面提供了 一種檢測包括TEM在內(nèi)的細胞遷移的方 法，包括以下步驟孵育所述物質(zhì)組合物；以及在所述組合物的所述 固體層的第一位置檢測遷移細胞。提供了該方法的一些實施方式，其 采用96孔板形式中的組合物，適于利用自動化細胞分析儀進行自動化、 高通量的細胞遷移分析。本發(fā)明的又一方面提供了一種鑒別細胞遷移的介質(zhì)(mediator)的 方法，該方法包括將細胞遷移的候選介質(zhì)加入到所述的物質(zhì)組合物 中；孵育所述組合物；以及測定存在所述候選介質(zhì)的情況下的細胞遷 移，其中相對于缺少所述候選介質(zhì)的組合物在應(yīng)答上的差異鑒別了細 胞遷移的介質(zhì)。該方法的高通量實施為大量的細l包遷移/TEM介質(zhì)的快 速測定提供了一個平臺，是制藥業(yè)的重要技術(shù)(enabler)。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點將在下面的詳細說明中體現(xiàn)出來。附圖簡要說明

圖1表示依照本發(fā)明實施方式的三維的跨內(nèi)皮細胞遷移(TEM) 測定的構(gòu)建。在左側(cè)是該系統(tǒng)側(cè)一見的示意說明。在右邊表示了俯^見的內(nèi)皮細胞(EC)單層的圖。圖2是表示膠原凝膠質(zhì)量對中性粒細胞TEM的影響的圖示。 圖3是表示膠原凝膠質(zhì)量對外周血單核細胞(PBMC)TEM的影響的 圖示。圖4表示膠原凝膠體積對中性粒細胞TEM的影響。圖5表示膠原凝膠體積對PBMC TEM的影響。圖6表示起始細胞密度對中性粒細胞TEM的影響。圖7表示中性粒細胞TEM的時間過程。定量測量了板底以上Z: 120pm在0.5、 1、 1.5和2小時的時點上的遷移細胞。圖8表示PBMCTEM的時間過程。定量測量了板底以上Z: 120 pm在2、 4、 6和8小時的時點上的遷移細胞。圖9表示用IL-8預(yù)浸凝膠層時提高了中性粒細胞TEM。圖10表示1，10-phenathronoline ( 一種MMP隱9抑制劑)抑制中性粒細l包TEM。圖11是貫通凝膠層的一疊21-Z切片的三維圖像重建。 圖12是利用陽性對照(IL-ip刺激)和陰性對照(未用IL-ip刺激)進行 的中性粒細胞TEM的大規(guī)才莫研究。
具體實施方式
我們提供了用于細胞遷移測定的組合物和方法，包括跨內(nèi)皮細胞 遷移(TEM)和血J求滲出測定。為了更4妻近地表示體內(nèi)環(huán)境，已i殳計 出了三維測定系統(tǒng)。該測定系統(tǒng)已經(jīng)提供于能夠自動化高通量篩選的 96孔板形式中，因此滿足了制藥業(yè)中對基于細胞的功能分析的需要。 我們的結(jié)果表明所述測定方法適用于例如炎癥、動脈硬化和肺瘤轉(zhuǎn)移 這些病理生理狀況的研究。它們完全適于高通量篩選測定。這些組合 物和方法還提供了改良的4全測生物學(xué)和細胞分析儀(例如IN Cell Analyzer 3000 )的自動化特征之間在定量分析上的協(xié)同性。它們提供 了用于研究抑制或剌激該進程的介質(zhì)(例如細胞因子或藥物)的獨特 方法。文中所用的術(shù)語"跨內(nèi)皮遷移"(TEM)是指遷移細胞從內(nèi)皮細胞 的上表面到基膜的運動，超出了對趨化因子(當(dāng)這些因子在內(nèi)皮細胞 的基膜的濃度高于上表面時)應(yīng)答的范疇。細胞因子在單個內(nèi)皮細胞之間形成的接合部位之間遷移。通常，TEM發(fā)生在內(nèi)皮細胞被激活時， 例如被TNF、 IL-1或者其它前炎性介質(zhì)激活時。TEM也會內(nèi)源性地 發(fā)生，甚至在內(nèi)皮細胞沒有直接激活的情況下，由于白細胞黏附，TEM 將會沿內(nèi)皮細胞以較低的、強度更小的水平發(fā)生。因此，在體內(nèi)，TEM 發(fā)生在炎癥位點；在體外，會穿過培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，更優(yōu)選地在內(nèi)皮 細胞激活后以及/或者創(chuàng)建了趨化梯度(chemotactic gradient)后發(fā)生。 文中所用的術(shù)語"血球滲出(Diapedesis)，，是指白細胞透過血管 內(nèi)皮層進入間質(zhì)液(IF)的運動。該進程受到趨化因子的驅(qū)動。血球滲 出經(jīng)常發(fā)生在一個區(qū)域受傷或被損壞且需要炎癥反應(yīng)時。組合物圖1提供了依照本發(fā)明的實施方式的三維的跨內(nèi)皮遷移(TEM) 測定模型。左側(cè)是該系統(tǒng)的示意說明。上部的綠點代表熒光標記的白 細胞。褐色帶代表匯合的內(nèi)皮細胞。無底色區(qū)域代表厚約200[Lim的凝 固的膠原凝膠。EC層下分散的綠點代表遷移的細胞。注意，明膠任選 地包含在凝固的膠原凝膠中。注意，膠原凝膠層的厚度根據(jù)成像顯微 鏡的對焦面而定。多數(shù)情況下，約50 - 500 |Lim的膠原層為TEM測定 提供合適的厚度。右側(cè)為內(nèi)皮細胞(EC)單層的照片。在該照片中， 細胞核受到Hoechst染色(藍色)。F-肌動蛋白由Alexa FluorTM 488結(jié) 合的鬼筆環(huán)肽(phalloidin)染色(綠色)。染紅色的表明是一種蛋白， VE釣黏蛋白(VE-Cadherin),其在細胞邊界當(dāng)有緊密的接合形成時進 行表達。我們的系統(tǒng)相對于已有技術(shù)系統(tǒng)的優(yōu)點在于它簡單而高效。它是 可誘導(dǎo)的，并利用人類臍靜脈內(nèi)皮細胞和人類白細胞模擬了體內(nèi)血球 滲出。我們確定了中性粒細胞TEM在2小時內(nèi)達到穩(wěn)定狀態(tài)并表現(xiàn)出 受到MMP-9抑制劑的特異抑制。我們也斷定該系統(tǒng)可用于在膠原凝膠 中加入化學(xué)引誘劑分子的趨化性研究。要注意圖1中的3-D TEM模型圖表示在單容器(vessel)中的構(gòu)建 (setup)。我們在實施例部分詳細描述96孔板形式的開發(fā)。我們確定 了膠原質(zhì)量對中性粒細胞TEM的影響(圖2)和對PBMC TEM(圖3) 的影響。我們證實在正常凝膠負荷條件(loading conditions )下并進行 快速旋轉(zhuǎn)，我們能夠可靠地制出質(zhì)量足夠好的膠原凝膠層。我們也確定了對于標準9 6孔板形式中每個孔的膠原凝膠的工作體積(圖4和5 )。 我們也測驗了最佳的遷移細胞密度，得出的結(jié)論為300,000 - 500,000 細胞/孔之間能夠得到滿意的測定結(jié)果(圖6)。我們注意到膠原凝膠 層中明膠的增加不影響系統(tǒng)的性能。明膠的使用能夠延長凝固的膠原 凝月交在室溫下的貯藏時間。96孔板形式中的TEM才莫型有幾個優(yōu)點。其一，它是可以在96孑L 板的單個孔中完成測定的更緊湊的系統(tǒng)。使用自動化細胞分析儀并用 上合適的圖像分析軟件能夠進行高通量的藥物篩選測定。它也允許在 空間上和時間上和以三維形式(共聚焦顯微鏡的Z-堆疊特征(Z-stacking feature ))進4亍細月包運動的定量測量。測定系統(tǒng)的三層i殳置也 避免了如塑膠多孔膜這類生物不相關(guān)材料的使用。組合物的制備我們提供用于制備實施例部分中的測定系統(tǒng)的詳細材料和方法。 簡要的講，膠原沉積在容器內(nèi)并凝固形成固體層?；蛘咦鳛檫x擇，可 以使用支持3D內(nèi)皮生長和細胞遷移的合成基質(zhì)凝膠。任選地，在膠原 層凝固前，將明膠溶液加入到膠原凝膠中。然后將第一細胞類型(內(nèi) 皮細胞)置于固體層上并進行培養(yǎng)以形成與固體層接觸的匯合細胞層。 然后制備遷移細胞并將其接種到第一細胞類型的匯合層頂部。典型地， 第一細胞類型為內(nèi)皮細l包，例如為HUVEC。也可以-使用其它的原^戈內(nèi) 皮細胞，例如HCAEC (冠狀動脈內(nèi)皮細胞)、HMVEC (肺微血管內(nèi)皮細 胞)或者內(nèi)皮細胞系例如SK-HEP-1 (ATCC HTB-52)。盡管任何遷移細 胞類型都能在該系統(tǒng)中使用或進行試驗，例如中性粒細胞系HL-60 (ATCC CCL-240)、淋巴細胞、月中瘤細胞系例如HT-1080 (ATCC CCL-121) 以及精子，但我們用原代中性粒細胞和PBMC作為遷移細胞進行試驗。為了檢測方便，在對遷移細月包進^^妾種和分析前可以進4亍標i己。 通常用于標記細胞的很廣范的染料也能用于該模型，所用染料例如為 Hoechst、鉤黃綠素(Calcein)、 熒光右旋糖酐 (fluorescein dextran) 和德州紅右旋糖酐(Texas Red dextran )。作為一個例子，我們在我們 的研究中用CellTracker Green (Invitrogen)標記細胞。做為選擇，在固體膠原凝膠層的制備過程中，可以在膠原凝膠中 混入熒光化合物。當(dāng)細胞遷移到凝膠中時，它們暴露于熒光材料。細胞和熒光材料之間的相互作用產(chǎn)生熒光信號，所述相互作用例如為蛋白酶的消化、內(nèi)在化(internalization)或者其它生化反應(yīng)。所述信號然 后被熒光顯微鏡捕獲，并且進行定量測量。這里遷移細胞在測定前不 需要標記。這會使測定更易于操作，更有效，并且更適于高通量應(yīng)用。 因為遷移細l包在^爭內(nèi)皮遷移前不帶標記，因此^又遷移通過內(nèi)皮細J包層 的細胞含有焚光信號。從未遷移的細胞完全不會顯示信號。這消除了 來自未遷移的、預(yù)先標記的細胞的背景，因此提高了測定的準確性和 靈敏性。使用所述組合物的方法我們開發(fā)的細胞遷移測定系統(tǒng)能夠用于細胞遷移研究，也能夠篩 選促進或抑制細胞遷移的介質(zhì)或藥物。當(dāng)用于篩選細胞遷移的介質(zhì)時， 該方法包括以下步驟(a)將細胞遷移的候選介質(zhì)加入所述組合物中， 或者用所述候選介質(zhì)對遷移細胞進行預(yù)處理；(b)孵育所述組合物，包 括接種后的遷移細胞；(c)測定存在所述候選介質(zhì)情況下的細胞遷移； 和(d)與缺少所述候選介質(zhì)的同 一類型的細胞就測量結(jié)果進行比較，測 量的遷移結(jié)果的差異鑒別了細胞遷移的介質(zhì)。我們成功地檢驗了該系統(tǒng)對于刺激或抑制細胞遷移的分子進行篩 選的能力。白介素-l-(3 (IL-ip)是中性粒細胞和PBMC的內(nèi)生的細胞遷 移介質(zhì)。IL-ip明顯地刺激內(nèi)皮細胞以表達進一步增強上述兩種細胞類 型IE爭內(nèi)皮遷移的黏附分子。存在IL-ip時，中性粒細胞TEM發(fā)生得相 對較快，并在約0.5-2小時內(nèi)達到明顯的信噪比(S/N) (IL-1(3刺激對 比未刺激，圖7)。我們也注意到經(jīng)過過4支孵育，中性粒細胞TEMS/N (有/無IL-lp刺激)達到穩(wěn)定狀態(tài)。PBMCTEM發(fā)生的相對較慢，通 常需要6-8小時的孵育時間(圖8)。將IL-ip加入用于HUVEC培養(yǎng)的培養(yǎng)基中并過夜培養(yǎng)時，我們也 檢驗了另一種方法，即引入化學(xué)引誘物。白介素-8(IL-8)是公知的中性 粒細胞強力吸引劑。為了證實IL-8對中性粒細月包TEM的作用，在接種 HUVEC層前，我們用含有IL-8的培養(yǎng)基預(yù)浸月交原凝膠4小時。我們 的結(jié)果表明IL-8的浸漬產(chǎn)生了 TEM作用，類似于HUVEC的IL-ip活 化所起到的作用(圖9)。我們也檢驗了抑制劑并顯示出該系統(tǒng)也能鑒別TEM抑制劑。公知1,10-phenathronolme抑制MMP-9 (基質(zhì)金屬蛋白酶-9)。用 1,10-phenathronoline對中性粒細胞預(yù)處理。整個TEM測定中該抑制劑 持續(xù)存在。圖9和10中(對于圖9，對比IN-和IN+)，我們證明了中 性粒細胞TEM的抑制。另 一個MMP-9抑制劑，強力霉素(doxycyclm), 也進行了測驗并表明抑制TEM。公知遷移細胞釋放的蛋白酶，例如 MMP-9,會促進細胞遷移通過組織。蛋白酶的抑制會導(dǎo)致細胞遷移的 下調(diào)。高通量、三維的細力色遷移測定系統(tǒng)上面描述的組合物已經(jīng)成功地在96孔板平臺中得到實施。具有透 明底部的96孔一反用于該測定， 一個這樣的實例是PerkinElmer的 ViewPlateTM。用自動化的細胞分析儀，例如In Cell Analyzer (GE Healthcare),進行細胞遷移的分析。例如，在某一 Z-plate上產(chǎn)生預(yù)定 觀察區(qū)域的共聚焦圖像。然后這些圖像通過自動分析和定量軟件進行 處理。結(jié)合自動成像和數(shù)據(jù)分析，該測定系統(tǒng)在96孔形式中的實施提 供了高通量的細胞遷移系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠用于大規(guī)模的探尋和評測用 于包括TEM在內(nèi)的細胞遷移的介質(zhì)。除了單個的Z plane圖像采集，該系統(tǒng)也能提供細胞遷移的3-D細 胞圖像。因為進行圖像采集不干擾該測定系統(tǒng)，它也能夠提供時間數(shù) 據(jù)系列。圖11提供了 96孔板的孔的視域(field view )的白細胞TEM 的3-D圖像。該圖像是從通過膠原凝膠層的一疊21個Z-plate圖像切 片(每部分lOjim)重新構(gòu)建而成。該3-D圖像表明凝膠層中白細胞 TEM向下遷移到了凝膠中積聚了較高梯度化學(xué)引謗物的地方。該系統(tǒng)的可靠性通過中性粒細胞TEM的分散圖得到了檢驗，所述 分散圖呈現(xiàn)了 Z:120 處有或無HUVEC激活情況下遷移細胞的數(shù)量 (圖12)。我們看到了緊密-分散分布。這表明處理中的變化很小，并 且兩個處理間的差異是顯著的并可辨別，這就符合了該測定的高通量 目的。需要時，同才羊的測定形式應(yīng)當(dāng)也可以用于384孔形式。實施例提供這些實施例只是出于說明性目的，不應(yīng)解釋為對權(quán)利要求界 定的本發(fā)明的范圍的限定。本說明書下文或其它地方給出的參考文獻都通過援引包含于此。 材泮+和方法表1包含了以下測定中用到的基本材料，以及關(guān)于生產(chǎn)商和相應(yīng) 的目錄編號的信息。另外的材料在隨后的方法中進行說明。表1:試驗部分用到的材料材料供應(yīng)商目錄弁HUVECCAMBREXCC2915EGM-2CAMBREXCC3162纖維粘連蛋白(Fibronectin )BD Bioscknc6S354008VITROGEN-100,I型膠原COHESIONFXP-019CdlTmcker GreenInvitrogenC2925結(jié)合鬼筆環(huán)肽的Alexa Fluor 488InvitrogenA-22284抗人PECAM單克隆(Anti-human PECAM monoclonal)PicrcsMA 3100人血清白蛋白SigmaA 1653RPMI培養(yǎng)基Invitrogen72400-047Cadherin-5,小鼠抗人單克隆抗體BD Biosciences555661小鼠IgGSigmaM 9144ViewPlateTM 96-孔沐反PerkinElmer6005182明膠SigmaG9391黑色膠粘封板劑(Black adhesive plate seal)Perkin Elmer6005189下面的副標題描述了用于制備和實施該測定系統(tǒng)的操作步驟 膠原凝膠層的制備膠原I按照生產(chǎn)商的建議制備。簡要地講，將8ml的膠原與1 ml 的10xPBS和1 ml NaOH (0.1 N)相混合，使用的是保存在4 °C預(yù)冷的 吸液管和反應(yīng)物?？蛇x4奪地，通過加入0.12N HC1將所述混合物的pH調(diào)到7.5.將96-孔板(ViewPlateTM, PerkmElmer Life and Analytical Sciences) 放到冰上，用分步重復(fù)移液器(stepper repeat pipette )( 500或者1000 的移液頭)將40 fil的凝膠(2.5 mg/ml)分配入每個孔。將該板在4 。C 以1,500 rpm旋轉(zhuǎn)2分鐘。該凝膠在無C〇2的培養(yǎng)箱中在37 °C固化， 以在96孔板的孔上構(gòu)建厚的膠原凝膠層(200 pm)。利用這種方法制 備的月交原凝力交進4亍下面的TEM測定。備選地，在向96孔板中分配前加入明膠溶液至膠原凝膠混合物中。 通過向組織級水(tissue grade water )中加入5克粉末并加熱到完全溶解 來制備5%明月交溶液。用10 N NaOH將pH調(diào)到7.2,該溶液121。C高壓滅 菌30分鐘。分裝為1 ml量4。C貯存。每l ml的膠原混合物中加入125 pl的 5%明膠溶液。膠原/明膠混合物以類似于膠原凝膠混合物的方式進行分 裝和固化。具有固化凝膠的板可以立刻用于下述TEM測定。備選地， 該板可用封板劑密封并在潮濕的環(huán)境下以室溫保存，留作后用。培養(yǎng)HU VEC在凝膠上形成匯合單層各孔中的膠原凝膠層被涂敷上200 pl的含有l(wèi) pg/ml的人纖維粘 連蛋白(BD Biosciences)的無血清EGM-2培養(yǎng)基，置于室溫下l小時。移 除含有纖維粘連蛋白的培養(yǎng)基后，將HUVEC細胞(CAMBREX)接種到 凝膠上并在EGM-2培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)3天，細胞濃度為40,000細胞/孔。 從早期傳代(第3到第4代)挑選細胞，70-80y。匯合的HUVEC細胞培養(yǎng) 物。測定的前一天，HUVEC培養(yǎng)基替換為新鮮的單獨的EGM-2培養(yǎng)基 或者含有IO ng/ml IL-1 p (或者TNF-cx或者其它化學(xué)引誘物)的新鮮 EGM-2培養(yǎng)基。該混合物過夜孵育用以刺激TEM。備選地，為了證實IL-8是中性粒細胞TEM的主要化學(xué)引誘物，在 接種遷移細胞前，萬交原凝膠可以用含有200 ng/ml的IL-8的培養(yǎng)基預(yù)浸 4小時。從血樣中分離和標記白細胞中性粒細胞或者外周血單核細胞(PBMC)從血沉椋黃層(blood Buffycoat)中新鮮分離。簡單地講，利用右旋糖酐沉降法除去RBC。 然后用Ficoll-Hypaque離心法分離PBMC。在Ficoll-Hypaque離心的團粒中，通過殘留的RBC的低滲溶解純化中性粒細胞。這些細月包用 CellTracker Green標記，37。C下在含0.5到1pm染料的RPMI中孵 育45分鐘。移除含有染料的RPMI,用無血清RPMI培養(yǎng)基清洗細胞 一次。在含有0.2% HAS (測定用培養(yǎng)基)的RPMI中以2.5xl()6細胞 /毫升重懸所述細胞。執(zhí)4亍并測量TEM測定在測定日，除去用于HUVEC細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，HUVEC單層用 PBS清洗2次并用測定培養(yǎng)基(含有0.2 %HAS的RPMI)清洗一次。 將CellTracker Green標記的500,000 (200 pl)中性粒細胞或PBMC置 于各孔中的HUVEC單層之上。該測定在37°C進一步孵育。孵育時間 的長度根據(jù)主要的細胞類型而定。對于中性粒細胞，孵育時間在2小 時內(nèi)，對于PBMC,可能需要6到10小時。所需的孵育時間過后，獲取已經(jīng)遷移到HUVEC層之下的中性粒細 胞/PBMC細胞的圖像。通常，在單個Z位置就足以獲取圖像并確定在 目標Z位置在凝膠中的遷移細胞的數(shù)目。例如，利用IN Cell Analyzer 3000 (GE Healthcare)的Z-切片特征(Z隱slicing feature )對120 , Z平 面的圖像進行量化。利用目標強度(Object Intensity)分析;f莫型分析圖 像。在多個時間重復(fù)進行該實驗，這樣，圖中的各數(shù)據(jù)點代表6個重 復(fù)的孔的正/負標準差， 一個圖像Z平面/孔。結(jié)果膠原凝膠的制備合適的凝膠制劑是高質(zhì)量TEM測定所必須的。圖2和3表明凝膠 質(zhì)量顯著影響TEM結(jié)果。壞膠(broken gel)是通過插入移液器槍頭穿道的移液l將不同體積的對照凝膠分裝入各孔中。氣泡好像是使得中 性粒細胞和PBMC的TEM測定存在差異的主要因素。相對于正常的對 照膠，壞膠確實影響測定結(jié)果，但是不太顯著。注意，用多管道的移 液器注射凝膠時，小氣泡易于通過外力而帶入凝膠中。我們發(fā)現(xiàn)在4。C 以1,500 rpm轉(zhuǎn)動該板2分鐘會除去大部分氣泡。也要注意，小心地進行清洗操作能夠防止壞膠發(fā)生。由于分析設(shè)備的限制，膠的體積對測定的設(shè)置(setup)也很重要。 IN Cell Analyzer僅能聚焦板底凝膠中限定的200 的Z距。我們的分 析表明40 pi的凝膠體積提供了用于在孔的中心形成膠層的良好凝膠深 度，并且滿足了測定和設(shè)備的要求。圖4和5分別顯示了膠的體積對 中性粒細胞和PBMC TEM的影響。HUVEC培養(yǎng)依照以上的材料和方法部分在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自 CAMBREX的HUVEC。合適的HUVEC培養(yǎng)物匯合單層在膠原凝膠上 生長。這通過鈣粘蛋白-5免疫染色而證實。圖l右側(cè)的彩色圖像表示 有緊密連接的匯合的內(nèi)皮細胞單層。細胞核受到Hoechst染色(藍色)。 F-肌動蛋白由Alexa Fluor 488結(jié)合的鬼筆環(huán)肽(phalloidin )染色(綠 色)。染紅色表明是一種蛋白，即VE4丐黏蛋白(VE-Cadherin),其在 細胞邊界當(dāng)有緊密的接合形成時進行表達。中性粒細^4口 PBMC的接種密度用滴定法測量中性粒細^^和PBMC的接種密度以鑒定出測定所需 的最佳細胞數(shù)目。中性粒細胞的起始細胞密度的分析結(jié)果表示在圖6 中。其表明為獲得合理的信噪(S/N)比，需要300，000-500,000細胞/ 孔的密度。對于PBMC,確定了類似的范圍。中性粒細胞和PBMC TEM的時間過程中性粒細胞TEM發(fā)生得相對比較快，在約0.5-2小時內(nèi)達到明顯 的S/N (IL-1(3刺激對比未刺激)。圖7顯示了中性粒細胞TEM時間過 程測定的結(jié)果。分別在0.5、 1、 1.5和2小時的時點上定量測量了板 底以上Z: 120 (im的遷移細胞。我們也注意到經(jīng)過過夜孵育，中性粒細 胞TEM S/N (有/無IL-1(3刺激)達到穩(wěn)定狀態(tài)。PBMC TEM發(fā)生的相 對4交'隄，通常需要6-8小時的孵育時間。圖8顯示了 PBMCTEM時間 過程測定的結(jié)果。分別在2、 4、 6和8小時的時點上定量測量了板底 以上Z: 120 的遷移細胞。IL-8浸漬增加中性粒細月包TEMIL-8是公知的中性粒細胞強力吸引劑。為了證實IL-8對中性粒細 胞TEM的作用，在開始該測定前，具有一層匯合的HUVEC單層的月交 原凝膠用含有200 ng/ml的IL-8的培養(yǎng)基預(yù)浸4小時。圖9顯示了該研 究的結(jié)果。該結(jié)果表明IL-8的浸漬產(chǎn)生了 TEM作用，類似于HUVEC 的IL-ip活化所起到的作用。IN+/IN-:存在/缺失MMP-9抑制劑(參見 下文)。通過MMP-9抑制劑抑制中性粒細胞TEM該TEM測定前，用1，10-phenathronoline, —種MMP-9抑制劑(12 -1000 ^M)，對中性粒細胞預(yù)處理0.5小時。整個TEM測定中持續(xù)存 在該抑制劑。圖9和10中，證明了中性粒細l包TEM受到抑制。圖10 中的各數(shù)據(jù)點代表6個重復(fù)孔的正/負SD,每個孔在Z: 60um處一個圖 像。另一個MMP-9抑制劑，強力霉素(doxycyclin),也進行了測驗并 表明抑制TEM (數(shù)據(jù)未顯示)。重建的三維TEM圖像96孔板的孔中的白細胞可視3-D細胞圖像表示在圖11中。利用IN Cell Analyzer 3000產(chǎn)生了 Z系列共聚焦圖像部分(sections )。采集了 從0-200 (im,通過凝膠層，每部分為lO(im的總共21個切片的圖像。 利用圖Y象分^斤程序AutoDeblur&AutoVisulize 9.3 (AutoQuant Imaging) 構(gòu)建3-D圖像。注意，圖ll僅表示了孔的一'J、部分，約0.75mm2的視 域(afield view )。該3-D圖像表明凝膠層中的白細胞TEM,向下遷移 到了含有化學(xué)引誘物的膠層中。中性粒細胞TEM的大規(guī)模研究圖12中表示了中性粒細胞TEM的分散圖，所述分散圖呈現(xiàn)了 Z:120 處在有或無HUVEC激活情況下遷移細胞的數(shù)量。緊密-分散 分布表明處理中的變化很小，并且兩個處理間的差異給出了顯著的信 號窗口，這使得該測定能夠用于高通量應(yīng)用。如同每一個都被單獨并特別地通過援引并入本文一樣，文中提及的所有的專利、專利公布和提及的其它公布的參考文獻都全部通過援引并入本文。盡管描述了本發(fā)明的優(yōu)選的說明性實施方式，所述領(lǐng)域 的技術(shù)人員會知道本發(fā)明能夠通過上述實施方式外的其它方式來實 施，上述實施方式僅是出于說明性目的而提供的，并不起限制作用。 本發(fā)明只由后面的權(quán)利要求來限定。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測細胞遷移的物質(zhì)組合物，該物質(zhì)組合物含有(a)含有膠原凝膠或合成基質(zhì)凝膠的固體層；(b)接觸所述固體層并含有第一細胞類型的第一細胞層；以及(c)接種到所述第一細胞層上的第二遷移細胞類型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述細胞遷移為跨內(nèi) 皮遷移(TEM)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述固體層還含有熒 光化合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述固體層還含有化 學(xué)引諸物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)組合物，其中所述化學(xué)引誘物在添 加所述第一細胞層之前加入到所述膠原凝膠中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的物質(zhì)組合物，其中所述化學(xué)引誘物由所 述第 一細胞層的所述第 一細胞類型在細胞因子刺激后釋放出來。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細胞層是匯 合的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細胞類型是 人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細胞類型由 細胞因子刺激。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第二細胞類型選 自由單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、自然殺傷細月包、肺瘤細l包或 者精子組成的組。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第二細胞類型是 中性粒細胞或者外周血單核細胞(PBMC)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其中所述第二細胞類型進 4亍了染料標記。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其位于96孔板形式中。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的物質(zhì)組合物，其中所述第一細胞類型 是HUVEC的匯合層，且其中所述第二細胞類型為中性粒細胞或 PBMC。
15. 才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的物質(zhì)組合物，其位于384孔板形式中。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的物質(zhì)組合物，其還含有用于圖像采集 的自動熒光顯微鏡。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的物質(zhì)組合物，其中所述自動熒光顯微 鏡包括共聚焦顯微鏡和用于自動圖像采集和同時在線分析的軟件。
18. —種制備用于4全測細胞遷移的物質(zhì)組合物的方法，該方法包括 以下步驟(a) 在容器內(nèi)沉積和固化膠原凝膠以形成含有膠原凝膠的固體層；(b) 置第 一 細胞類型的細胞于所述固體層上并孵育所述第 一 細胞 類型以形成同所述固體層接觸的匯合細胞層；以及(c) 將第二細胞類型的細胞接種到所述第 一 細胞層上。
19. 一種檢測細胞遷移的方法，包括以下步驟(a) 孵育4又利要求1所述的組合物；以及(b) 在所述組合物的所述固體層的第 一位置;^全測遷移細胞。
20. —種鑒別細力包遷移的介質(zhì)的方法，包括(a) 將細胞遷移的候選介質(zhì)加入到權(quán)利要求1所述的組合物中；(b) 孵育所述組合物；以及(c) 測定存在所述候選介質(zhì)的情況下的細胞遷移，其中相對于缺少 所述候選介質(zhì)的組合物，在應(yīng)答上的差異鑒別了細胞遷移的介質(zhì)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述固體層還含有明膠。
22. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述沉積步驟還包括將明 膠溶液與所述膠原凝膠混合。
23. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，還含有用于采集圖像的自動 焚光顯微鏡。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述自動熒光顯微鏡包 括共聚焦顯微鏡和用于自動圖像采集和同時在線分析的軟件。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于制備三維跨內(nèi)皮細胞遷移(TEM)測定的組合物和方法。這些組合物和方法特別適于高通量TEM測定，以及抑制或刺激TEM進程的介質(zhì)的分析和鑒定。用于檢測細胞遷移的組合物含有含有膠原凝膠的固體層；接觸所述固體層并含有第一細胞類型的第一細胞層；以及接種到所述第一細胞層上面的第二細胞類型。任選地，膠原凝膠中含有明膠。披露了一種96孔板形式，與高通量的細胞篩選儀結(jié)合能夠進行高通量的TEM測定。
文檔編號C12N5/06GK101263223SQ200680033862
公開日2008年9月10日 申請日期2006年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日
發(fā)明者A·貝萊茨基, P·錢納瓦哈拉, 於利敏, 趙立紅 申請人:通用電氣醫(yī)療集團生物科學(xué)公司