一種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的dc-cik治療方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法，步驟如下：CTC細胞分離及培養(yǎng)；輻照處理CTC細胞，制備靶向懸液；分離PBMC，并誘導DC細胞和CIK細胞，進行CTC懸液靶向抗原遞呈；回輸治療：將加有DC和CIK細胞等物質(zhì)的生理鹽水采用靜脈滴注的方式回輸給患者。本發(fā)明設(shè)計出了完美的利用醫(yī)療中檢測和分離循環(huán)腫瘤細胞的技術(shù)，用于結(jié)合現(xiàn)代DC、CIK為基礎(chǔ)的過繼免疫治療技術(shù)，本發(fā)明具有多項優(yōu)點：1、提前檢測循環(huán)腫瘤細胞，提前治療腫瘤的優(yōu)點；2、只需要幾毫升血液即可分離出CTC，靶向抗原獲取容易的特點；3、對于腫瘤術(shù)后不定期進行針對患者特異性的腫瘤治療，具有針對性強且準確的特點。
【專利說明】一種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種腫瘤治療領(lǐng)域，具體是一種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治 療方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤細胞遷移：惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道，血管或體腔等途徑，到達其 他部位繼續(xù)生長，稱腫瘤轉(zhuǎn)移。良性腫瘤無轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其方式有四種： ①直接蔓延到鄰近部位；②淋巴轉(zhuǎn)移：原發(fā)癌的細胞隨淋巴引流，由近及遠轉(zhuǎn)移到各級淋 巴結(jié)，也可能超級轉(zhuǎn)移；或因癌阻礙順行的淋巴引流而發(fā)生逆向轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移癌在淋巴結(jié)發(fā)展 時，淋巴結(jié)腫大且變硬，起初尚可活動，癌侵越包膜后趨向固定，轉(zhuǎn)移癌阻礙局部組織淋巴 引流，可能引起皮膚、皮下或肢體的淋巴水腫；③血行轉(zhuǎn)移：癌細胞進入血管隨血流轉(zhuǎn)移至 遠隔部位如肺、肝、骨、腦等處，形成繼發(fā)性腫瘤；④種植：瘤細胞脫落后種植到另一部位， 如內(nèi)臟的癌播種到腹膜或胸膜上。顯然，惡性腫瘤轉(zhuǎn)移將增加對機體的損害作用，而且影響 轉(zhuǎn)歸。
[0003] 樹突狀細胞（Dendritic cells，DC) :DC 細胞，1973 年 Steiman 和 Cohn 首次從 脾臟中分離出一類與粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞形態(tài)和功都不同的白細胞，因其細胞膜 向外伸出，形成與神經(jīng)細胞軸突相似的膜性樹狀突起，故而命名為樹突狀細胞（dendritic cells，DCs)。它是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞（Antigen presenting cells，APC), 它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激 活初始型T細胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著 密切關(guān)系，大部分實體瘤內(nèi)浸潤的DC數(shù)量多則患者預(yù)后好。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心 是產(chǎn)生以CD8+T細胞為主體的細胞免疫應(yīng)答，這也是DC作為免疫治療手段的基礎(chǔ)。美國杜 克大學遺傳和細胞治療學中心的研究主任埃利-吉爾波瓦說過："DC是激發(fā)機體免疫系統(tǒng) 激發(fā)抵御癌癥侵襲最有效的途徑之一。" "DC作為高度專職化的主要抗原遞呈細胞，在誘導 針對相關(guān)抗原的高效、特異性T細胞免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。"
[0004] CIK細胞（cytokine induced killer):最初是指在正常人體外周血中只占1? 5%的cd3+cd56+的t淋巴細胞。目前國內(nèi)外制備的用于過繼免疫治療的cik細胞，實際 上是體外擴增出的以cd3+cd56+、cd3+cd8+為主的異質(zhì)性細胞群。該細胞群是在多種細胞 因子如il-2、ifn-γ及某些單克隆抗體（anti-cd3mcab)的刺激下，由從外周血、骨髓或臍 血中分離出來的單個核細胞在體外培養(yǎng)擴增而成，具有廣泛的非mhc限制的極強的溶瘤活 性。CIK細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine-Induced Killer，CIK)是一種新型的 免疫活性細胞，CIK增殖能力強，細胞毒作用強，具有一定的免疫特性。由于該細胞同時表達 CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細胞（自然殺傷細胞）樣T淋巴細胞，兼具有T 淋巴細胞強大的抗瘤活性，和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點。該細胞對腫瘤細胞的識別 能力很強，如同"細胞導彈"，能精確"點射"腫瘤細胞，但不會傷及"無辜"的正常細胞。尤其 對手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細胞擴散和復發(fā)， 提高機體免疫力，因此，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。
[0005] 循環(huán)腫瘤細胞：循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumour cell)，通常把進入人體外周 血的腫瘤細胞稱為循環(huán)腫瘤細胞。腫瘤細胞的一個特征是細胞間的黏附力非常弱，因此腫 瘤細胞就有可能從瘤體脫落，如果脫落的部分進入了血液循環(huán)，即可成為循環(huán)腫瘤細胞。此 類細胞可以隨著血液循環(huán)到遠處種植形成轉(zhuǎn)移，也可以與凝血系統(tǒng)作用形成血栓，也有研 究說此類細胞可以刺激人體免疫系統(tǒng)可能對腫瘤的治療有研究意義。
[0006] 早在1896年，Ashworth曾報道1例因癌癥死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤 的細胞，并首次提出循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC)的概念。
[0007] 腫瘤細胞的脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為最終形 成臨床轉(zhuǎn)移灶提供了可能。CTC指自發(fā)或因診療操作進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。隨著腫 瘤細胞的不斷增殖，部分細胞可以通過分泌一種抑制黏附因子表達的物質(zhì)，增加其運動能 力并使之與腫瘤母體脫離。這些脫落的腫瘤細胞再分泌一種蛋白溶解酶，以破壞周邊宿主 結(jié)締組織并進入脈管系統(tǒng)。診療操作也可使腫瘤細胞擴散進入外周血循環(huán)。Louha等報道， 在肝癌患者手術(shù)中牽動肝臟易發(fā)生醫(yī)源性腫瘤細胞擴散，其原因可能是肝臟具有海綿狀結(jié) 構(gòu)，牽動肝臟可使器官伸展和壓縮。
[0008] 進入循環(huán)的腫瘤細胞絕大多數(shù)在短期內(nèi)死亡。宿主的免疫識別和機械殺傷作用以 及腫瘤細胞自身因素，如缺乏變形性以致不能順利通過循環(huán)管道系統(tǒng)，或缺乏形成癌栓能 力等均可導致腫瘤細胞死亡。只有極少數(shù)具有高度活力、高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞在循環(huán) 系統(tǒng)中存活下來，相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。因此，在外周血 中檢測到腫瘤細胞預(yù)示著有可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0009] 隨著對CTC研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)檢測CTC有助于建立個體化的治療方案。 Beitsch等采用流式細胞計數(shù)、免疫化學等方法比較早期及晚期乳腺癌患者CTC的水平，明 確發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌比早期乳腺癌有更多的CTC。通過這種方法能夠篩選出高危患者，決 定是否需要輔助治療。Bela等研究認為，CTC數(shù)量的改變可以反應(yīng)腫瘤對治療的敏感性及 其增殖活性，可為個體化治療提供依據(jù)。最近，Cristofanilli等檢測117例進展期乳腺癌 患者CTC在治療前后的變化情況，發(fā)現(xiàn)CTC水平可以預(yù)測進展期乳腺癌的治療效果。CTC 水平在治療前較低或開始治療之后降低的女性治療效果好，而在治療后CTC水平仍較高的 患者與前者相比，疾病進展迅速，生存期短，治療效果差。傳統(tǒng)的臨床評定療效方法是根據(jù) 腫瘤的大小變化，需要在開始治療之后3?4個月進行，而且需要進行一系列檢查如ECT、 X線等。而Cristofanilli等的研究顯示通過檢測轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者CTC水平可以在最初 治療之后3?4周盡早預(yù)測療效。這對于決定患者的個體化治療具有重要意義。已有研究 表明檢測早期乳腺癌患者骨髓微轉(zhuǎn)移情況可以監(jiān)測輔助治療效果，而在考慮給予輔助治療 的問題上，CTC在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的重要作用可能與骨髓微轉(zhuǎn)移在早期乳腺癌中的作用類 似。目前有學者正研究能否根據(jù)CTC水平改變治療方案藉以提高療效，如根據(jù)其檢測結(jié)果， 結(jié)合病人的具體情況選擇適宜的輔助治療，調(diào)整治療強度、持續(xù)時間，盡量使病人免受不必 要的毒性作用。
[0010] 循環(huán)腫瘤細胞的檢測可有效地應(yīng)用于體外早期診斷，化療藥物的快速評估，個體 化治療包括臨床篩藥、耐藥性的檢測，腫瘤復發(fā)的監(jiān)測以及腫瘤新藥物的開發(fā)等。
[0011] 1、體檢：（體外早期診斷）。對于腫瘤的常規(guī)檢測手段來講，例如影像學。腫瘤在 小于一公分的情況下，醫(yī)生也不認為它是異常。通過國外發(fā)表的文章可以看到，不要說是一 公分，很多腫瘤在一個毫米的情況下已經(jīng)在血液里查到循環(huán)腫瘤細胞，從這個角度講，它對 于早期診斷來講有不可低估的意義。
[0012] 2、輔助診斷手段。從臨床來講，要確定一個病人是不是得了腫瘤，一直是一個很難 明確回答的問題，這就會對很多病人造成誤診。比如說胰腺癌往往發(fā)現(xiàn)確診以后都是晚期 的，為什么會這樣？就是因為在早期的時候，胰腺癌的確診非常困難?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，在很多難 以確診的病人的血液中，如果說能夠檢查到循環(huán)腫瘤細胞，那對于配合醫(yī)生下腫瘤診斷的 結(jié)論是具有積極意義的。
[0013] 3、根據(jù)循環(huán)腫瘤細胞的個數(shù)判斷愈后及存活時間。經(jīng)美國FDA認證的易莫尼康 (Immunicon)公司通過多年的科研，在幾百個病人身上做了大量的科學研究，最終得出結(jié) 論，在治療以后通過計算循環(huán)腫瘤細胞的個數(shù)，可以明確的告訴病人到底能存活半年還是 一年或更長時間。也就是說循環(huán)腫瘤細胞的應(yīng)用使人們第一次可以以一個量化的指標告訴 醫(yī)生和病人他的存活時間。
[0014] 4、個體化治療。個體化治療指的是針對每一個不同的腫瘤病人，醫(yī)生開出不同的 治療方案。目前在醫(yī)院，比如說協(xié)和醫(yī)院，很少做很嚴格的個體化治療方案，一般都是醫(yī)生 根據(jù)經(jīng)驗來決定給病人用何種化療藥物，但有沒有效并不知道。現(xiàn)在國外已經(jīng)開始用一種 新的方法，即把病人體內(nèi)的腫瘤細胞拿出來培養(yǎng)，培養(yǎng)好以后在體外做藥理實驗。因為化療 藥物有多種，究竟哪種最好最有效不應(yīng)該由經(jīng)驗來回答，而是應(yīng)該由事實來說話。把腫瘤細 胞培養(yǎng)好以后，用不同的藥物來處理腫瘤細胞，看哪種化療藥物對腫瘤細胞殺傷作用最大， 然后把殺傷作用最大的藥物用在病人身上，這樣就增加了治療的目的性。隨著CTC捕獲技 術(shù)的成熟，人們開始考慮是否可以把CTC作為個體化治療的基礎(chǔ)，從目前來看這是可行的。 即先將CTC捕獲出來進行培養(yǎng)，培養(yǎng)好了以后進行藥理實驗，在此基礎(chǔ)上還可以做化療藥 效的快速評估。
[0015] 5、快速判斷化療效果。目前不管是國內(nèi)還是國外，給病人上化療藥物以后，一般都 要等三個月才可以去評估病人的治療效果。因為只有經(jīng)過三個月后，腫瘤的大小才能有比 較明顯的變化。通過我們的實驗以及國外發(fā)表的文章可以看出，憑經(jīng)驗給病人上的化療藥 物在很多情況下是無效的。很多情況下，經(jīng)過三個月以后，腫瘤細胞非但沒有減小反而繼續(xù) 長大。這對病人來講就白白耽誤了三個月的時間。三個月對于腫瘤病人來講就意味著有可 能最終死亡。隨著CTC技術(shù)的成熟，病人不用再等三個月，只需等三周，通過測定CTC數(shù)目 的變化，如果CTC數(shù)目是顯著下降的，說明化療藥物是有效的，如果CTC數(shù)目還在增加說明 藥物是無效的，這時醫(yī)生就應(yīng)該采取新的治療方案。
[0016] 6、體內(nèi)耐藥性檢測。很多情況下給病人用化療藥物一開始是有效的，但是過一段 時間后腫瘤病人的發(fā)病并沒有得到控制，這有可能是病人對藥物產(chǎn)生了耐藥性，這一點大 家都可以理解，抗體多了容易產(chǎn)生耐藥。目前來講，對于腫瘤治療病人會不會產(chǎn)生耐藥以及 什么時候產(chǎn)生耐藥是未知的。往往是發(fā)現(xiàn)病人產(chǎn)生耐藥時，病情已得不到控制。隨著CTC 技術(shù)的成熟，我們可以做動態(tài)的觀察，也就是對病人做持續(xù)跟蹤觀察，在動態(tài)的觀察過程中 一旦發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)目顯著增加，醫(yī)生就應(yīng)該及時的更換新的治療方案。
[0017] 7、最后就是檢測腫瘤復發(fā)。這是北京萊爾生物科技有限公司在協(xié)和醫(yī)院及其他醫(yī) 院做臨床實驗以后病人反響最大的地方。目如就全世界來說，腫瘤病人經(jīng)過治療以后，在恢 復的過程中會不會腫瘤復發(fā)？以及什么時候復發(fā)？沒有醫(yī)生也沒有方法可以做出解釋。隨 著CTC技術(shù)的成熟，我們已經(jīng)知道腫瘤的復發(fā)實際上就是腫瘤轉(zhuǎn)移的過程。很多乳腺癌的 病人復發(fā)后會轉(zhuǎn)移到腦部，還有很多結(jié)直腸癌的病人復發(fā)后往往轉(zhuǎn)移到肝臟。這說明即使 原發(fā)部位已經(jīng)切除，腫瘤還會轉(zhuǎn)移到其他部位，這實際上就是一個慢性的腫瘤轉(zhuǎn)移過程。既 然人們已經(jīng)認識到腫瘤復發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移過程是直接相關(guān)的，醫(yī)生就可以通過監(jiān)測CTC直接 監(jiān)測病人是否腫瘤復發(fā)。也就是說腫瘤的復發(fā)不是一夜形成的，它是一個持續(xù)的腫瘤不斷 釋放入血向遠端轉(zhuǎn)移的緩慢的過程。對于治療過的病人，他體內(nèi)的循環(huán)腫瘤細胞應(yīng)該是沒 有或者只有極少的數(shù)目，如果在他今后的生活過程中檢測到循環(huán)腫瘤細胞持續(xù)增多，這就 給病人和醫(yī)生都敲響了警鐘，這時對病人一定要采取適當?shù)闹委煟刂谱TC的增多，因為 CTC的增多很有可能是腫瘤復發(fā)的前兆或復發(fā)的過程。
[0018] 8、另外人們已經(jīng)認識到CTC可以作為藥物靶向治療的一個新的靶向。目前國外很 多大的藥廠都投入巨資開發(fā)腫瘤新藥，在開發(fā)的過程中不僅把實體腫瘤作為靶向治療的一 個靶標，同時也認識到可以把CTC作為藥物治療的對象。
[0019] 現(xiàn)有的CTC利用主要在于臨床檢驗中的用于，為了更好的利用CTC的靶向性，并基 于以上循環(huán)腫瘤細胞在腫瘤發(fā)展和遷移中的重要作用，對其進行靶向殺死可以節(jié)制腫瘤擴 散的產(chǎn)生，同時可以根據(jù)其靶向信息，追蹤和殺死體內(nèi)組織部位的固定腫瘤細胞，起到節(jié)制 和殺死腫瘤的作用。
[0020] DC-CIK聯(lián)合治療是現(xiàn)有過繼免疫治療中的基礎(chǔ)性治療，但存在著靶向性不強，需 要提供充足有效的靶向信息給DC細胞，才能將腫瘤靶向信息充分遞呈給CIK細胞，從而殺 死腫瘤細胞，現(xiàn)有的大部分靶向抗原來源于手術(shù)切除的腫瘤組織塊或者人重組抗原，前者 獲取需要經(jīng)過手術(shù)進行，傷害大，后者價格昂貴，而且存在于人體體內(nèi)抗原結(jié)構(gòu)不一致的可 能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 為了隨時針對腫瘤患者或者術(shù)后患者進行方便的靶向免疫治療，本發(fā)明提供了一 種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法，該方法利用現(xiàn)有的CTC分離技術(shù)，從患者血 液中分離出CTC，在體外培養(yǎng)擴增后，使用輻照后的細胞作為靶向抗原的來源，刺激DC細胞 處理抗原并進行抗原遞呈給CIK，由于CTC的增殖能力強，可以再體外大量培養(yǎng)，從而增強 免疫治療的殺死能力和準確性。
[0022] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0023] -種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法，步驟如下：
[0024] (I)CTC細胞分離及培養(yǎng)；
[0025] (2)輻照處理CTC細胞，制備靶向懸液；
[0026] (3)分離PBMC，并誘導DC細胞和CIK細胞，進行CTC懸液靶向抗原遞呈；
[0027] (3. 1)血液中分離單核細胞
[0028] (3. I. 1)取IOOml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離心管中；
[0029] (3. I. 2) 300g離心lOmin，離心后，將所有的上層血漿轉(zhuǎn)移到2個新的無菌離心管 中，56°C水浴滅活30min，再于400g離心IOmin后，收集上層黃色液體即低血小板血漿，4°C 儲存?zhèn)溆茫?br> [0030] (3. I. 3)向該4個下層含血細胞的離心管中加入注射用生理鹽水，直到每管30ml 混合液，用移液器混勻；
[0031] (3. 1. 4)再取4支含15ml淋巴細胞分離液的50ml離心管，緩慢的將血細胞混合液 用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細胞分離液的上層；
[0032] (3. I. 5) 400g 離心 20 分鐘；
[0033] (3. 1. 6)離心后將中間白膜層吸入到新的50ml離心管中；
[0034] (3. L 7)用注射用生理鹽水補液到45ml后，300g離心5分鐘，清洗單核細胞；
[0035] (3. L 8)重新加入注射用生理鹽水45ml，混勻后離心清洗單核細胞；
[0036] (3. 2)免疫細胞誘導分化及抗原遞呈；
[0037] (3. 2. 1)第0天，離心收集單核細胞，用20ml無血清培養(yǎng)基重懸，在T75培養(yǎng)瓶中 培養(yǎng)2h ;
[0038] (3. 2. 2) 2h后將不貼壁細胞倒入另外一個T175培養(yǎng)瓶中，并用無血清培養(yǎng)液補足 T175培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液到50ml，并加入終濃度lOOOU/ml的白介素2 (IL-2)和終濃度25ng/ml 的抗⑶3單抗；同時，向T75培養(yǎng)瓶中加入DC培養(yǎng)基和2ml輻照處理的CTC細胞懸液；
[0039] (3. 2. 3)第二天，對T175培養(yǎng)瓶進行半量換液；
[0040] (3. 2. 4)第四天，對T75培養(yǎng)瓶中的細胞用DC培養(yǎng)基，進行半量換液，并補加2ml 處理后的CTC細胞懸液；同時，T175培養(yǎng)瓶中補加培養(yǎng)液到IOOml ;
[0041] (3. 2. 5)第六天，向T75培養(yǎng)瓶中，加入終濃度20ng/ml的TNF-α。補加培養(yǎng)液到 300ml ；
[0042] (3. 2.6)第八天，用細胞刮刀刮下T75培養(yǎng)瓶中的DC細胞，加入到CIK細胞中，并 補加5ml處理后的CTC細胞懸液，再將培養(yǎng)液補加到500ml，進行混合擴增培養(yǎng)；
[0043] (3.2.7)第十天，將所有的DC和CIK細胞離心后，用生理鹽水洗2次（300g，離心 5分鐘），最后，加入到注射用生理鹽水中，補加10%人血白蛋白；
[0044] (4)回輸治療：將加有DC和CIK細胞等物質(zhì)的生理鹽水采用靜脈滴注的方式回輸 給患者。
[0045] 作為本發(fā)明進一步的方案：步驟（I)CTC細胞分離及培養(yǎng)的具體步驟為：
[0046] (I. 1)分離出CTC細胞；
[0047] (1. 2)培養(yǎng)方法：
[0048] (1. 2. 1)準備無菌培養(yǎng)液，包括DMEM，10%胎牛血清，1% L-谷氨酰胺和1 %雙抗；
[0049] (1. 2. 2)將分離到的CTC細胞在以上培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，每3天進行一次傳代。
[0050] 作為本發(fā)明進一步的方案：步驟（2)輻照處理CTC細胞，制備靶向懸液的具體步驟 為：
[0051] (2. I) 20mW/cm2 強度微波輻射 CTC 細胞 30min ;
[0052] (2. 2)用注射用生理鹽水清洗2次；
[0053] (2. 3)消化離心收集輻照處理后的CTC細胞，并計數(shù)；
[0054] 使用時用按照2*105個/ml溶液稀釋。
[0055] 本專利利用DC和CIK兩種腫瘤過繼免疫治療中最常用到的高效免疫治療細胞與 分離獲取并經(jīng)過處理的CTC結(jié)合，達到CTC特異性靶向抗原遞呈和殺傷強化的能力。
[0056] DC和CIK是兩類免疫細胞，分別起到不同的免疫效果。DC細胞是樹突狀細胞 (Dendritic cell)的簡寫，1973年Steiman和Cohn首次從脾臟中分離出一類與粒細胞、巨 噬細胞和淋巴細胞形態(tài)和功都不同的白細胞，因其細胞膜向外伸出，形成與神經(jīng)細胞軸突 相似的膜性樹狀突起，故而命名為樹突狀細胞（dendritic cells，DCs)。它是機體功能最 強的專職抗原遞呈細胞（Antigen presenting cells, APC)，它能高效地攝取、加工處理和 遞呈抗原，未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細胞，處于啟動、調(diào) 控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。
[0057] DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，大部分實體瘤內(nèi)浸潤的DC數(shù)量多則患者預(yù) 后好。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心是產(chǎn)生以⑶8+T細胞為主體的細胞免疫應(yīng)答，這也是 DC作為免疫治療手段的基礎(chǔ)。
[0058] 美國杜克大學遺傳和細胞治療學中心的研究主任埃利-吉爾波瓦說過："DC是激 發(fā)機體免疫系統(tǒng)激發(fā)抵御癌癥侵襲最有效的途徑之一。~DC作為高度專職化的主要抗原遞 呈細胞，在誘導針對相關(guān)抗原的高效、特異性T細胞免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。"
[0059] CIK是（cytokine induced killer)的縮寫，最初是指在正常人體外周血中只占 1?5%的cd3+cd56+的t淋巴細胞。目前國內(nèi)外制備的用于過繼免疫治療的cik細胞，實 際上是體外擴增出的以cd3+cd56+、cd3+cd8+為主的異質(zhì)性細胞群。該細胞群是在多種細 胞因子如il -2、ifn-γ及某些單克隆抗體（anti-cd3mcab)的刺激下，由從外周血、骨髓或 臍血中分離出來的單個核細胞在體外培養(yǎng)擴增而成，具有廣泛的非mhc限制的極強的溶瘤 活性。
[0060] CIK細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞（Cytokine-Induced Killer，CIK)是一種 新型的免疫活性細胞，CIK增殖能力強，細胞毒作用強，具有一定的免疫特性。由于該細胞 同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細胞（自然殺傷細胞）樣T淋巴細胞， 兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性，和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點。該細胞對腫瘤細 胞的識別能力很強，如同"細胞導彈"，能精確"點射"腫瘤細胞，但不會傷及"無辜"的正常 細胞。尤其對手術(shù)后或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細胞擴 散和復發(fā)，提高機體免疫力，因此，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫治療的首 選方案。
[0061] 本發(fā)明中循環(huán)腫瘤細胞是腫瘤切除手術(shù)后的患者外周血中分離到的CTC細胞，由 于CTC細胞在手術(shù)前的患者體內(nèi)也存在，所以包括但不限于術(shù)后患者；另外，循環(huán)腫瘤細 胞在手術(shù)前患者身上也存在，所以可以用于已經(jīng)明確發(fā)現(xiàn)有外周血中存在著循環(huán)腫瘤細胞 的患者；其中CTC必須經(jīng)過輻射處理，保證CTC死亡；輻照處理過的CTC被制備成懸液，作 為靶向抗原液使用；CTC懸液用于DC細胞處理并獲取用于靶向抗原的遞呈，遞呈給CIK細 胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明設(shè)計出了完美的利用醫(yī)療中檢測和分離 循環(huán)腫瘤細胞的技術(shù)，用于結(jié)合現(xiàn)代DC、CIK為基礎(chǔ)的過繼免疫治療技術(shù)，本發(fā)明具有多項 優(yōu)點：1、提前檢測循環(huán)腫瘤細胞，提前治療腫瘤的優(yōu)點；2、只需要幾毫升血液即可分離出 CTC，靶向抗原獲取容易的特點；3、對于腫瘤術(shù)后不定期進行針對患者特異性的腫瘤治療， 具有針對性強且準確的特點。

【具體實施方式】
[0062] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0063] -種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法，步驟如下：
[0064] (I)CTC細胞分離及培養(yǎng)；
[0065] (I. 1)分離方法采用下述兩種方法的任意一種現(xiàn)有技術(shù)：
[0066] 方法1 :采用Abonova的captor系統(tǒng)分離捕獲CTC細胞；
[0067] 方法2 :磁性分離循環(huán)腫瘤細胞；取7. 5ml血樣樣品于特定樣品管中，離心分離得 到血液中固態(tài)成分，然后置于CellTracks? AutoPrep? System(NatureGene公司開發(fā)的一 種循環(huán)腫瘤細胞檢測設(shè)備）中；利用結(jié)合有可靶定上皮細胞黏附分子的抗體的流體磁性納 米顆粒，即可將CTC細胞與血液中的其他細胞分離開；
[0068] (1. 2)培養(yǎng)方法：
[0069] (I. 2. 1)準備無菌培養(yǎng)液，包括 DMEM(Hyclone)，10 % 胎牛血清 fetal calf serum(Gibco, nvitrogen，Carlsbad，CA, USA)，1% L-谷氨醜胺 L-glutamin(Sigma)和 1% 雙抗 penicillin-streptomycin (Gibco)；
[0070] (I. 2. 2)將分離到的CTC細胞在以上培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，每3天進行一次傳代；
[0071] ⑵輻照處理CTC細胞，制備靶向懸液；
[0072] (2. I) 20mW/cm2 強度微波輻射 CTC 細胞 30min ;
[0073] (2. 2)用注射用生理鹽水清洗2次；
[0074] (2. 3)消化離心收集輻照處理后的CTC細胞，并計數(shù)；
[0075] 注意：使用時用按照2*105個/ml溶液稀釋；
[0076] (3)分離PBMC，并誘導DC細胞和CIK細胞，進行CTC懸液靶向抗原遞呈；
[0077] (3. 1)血液中分離單核細胞
[0078] (3. I. 1)取IOOml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離心管中；
[0079] (3. I. 2) 300g離心lOmin，離心后，將所有的上層血漿轉(zhuǎn)移到2個新的無菌離心管 中，56°C水浴滅活30min，再于400g離心IOmin后，收集上層黃色液體即低血小板血漿（Poor Platelet Plasma，PPP)，4°C儲存?zhèn)溆茫?br> [0080] (3. I. 3)向該4個下層含血細胞的離心管中加入注射用生理鹽水，直到每管30ml 混合液，用移液器混勻；
[0081] (3. 1. 4)再取4支含15ml淋巴細胞分離液的50ml離心管，緩慢的將血細胞混合液 用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細胞分離液的上層；
[0082] (3. I. 5) 400g 離心 20 分鐘；
[0083] (3. 1. 6)離心后將中間白膜層吸入到新的50ml離心管中；
[0084] (3. L 7)用注射用生理鹽水補液到45ml后，300g離心5分鐘，清洗單核細胞；
[0085] (3. L 8)重新加入注射用生理鹽水45ml，混勻后離心清洗單核細胞；
[0086] (3. 2)免疫細胞誘導分化及抗原遞呈；
[0087] (3. 2. 1)第0天，離心收集單核細胞，用20ml無血清培養(yǎng)基重懸，在T75培養(yǎng)瓶中 培養(yǎng)2h ;
[0088] (3. 2. 2) 2h后將不貼壁細胞倒入另外一個T175培養(yǎng)瓶中，并用無血清培養(yǎng)液補足 T175培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液到50ml，并加入終濃度lOOOU/ml的白介素2 (IL-2)和終濃度25ng/ml 的抗⑶3單抗；同時，向T75培養(yǎng)瓶中加入DC培養(yǎng)基和2ml輻照處理的CTC細胞懸液； [0089] (3. 2. 3)第二天，對T175培養(yǎng)瓶進行半量換液；
[0090] (3. 2. 4)第四天，對T75培養(yǎng)瓶中的細胞用DC培養(yǎng)基，進行半量換液，并補加2ml 處理后的CTC細胞懸液；同時，T175培養(yǎng)瓶中補加培養(yǎng)液到IOOml ;
[0091] (3. 2. 5)第六天，向T75培養(yǎng)瓶中，加入終濃度20ng/ml的TNF-α。補加培養(yǎng)液到 300ml ；
[0092] (3.2.6)第八天，用細胞刮刀刮下T75培養(yǎng)瓶中的DC細胞，加入到CIK細胞中，并 補加5ml處理后的CTC細胞懸液，再將培養(yǎng)液補加到500ml，進行混合擴增培養(yǎng)；
[0093] (3.2.7)第十天，將所有的DC和CIK細胞離心后，用生理鹽水洗2次（300g，離心 5分鐘），最后，加入到注射用生理鹽水中，補加10%人血白蛋白；
[0094] (4)回輸治療：將加有DC和CIK細胞等物質(zhì)的生理鹽水采用靜脈滴注的方式回輸 給患者。
[0095] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論 從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0096] 此外，應(yīng)當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包 含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當 將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以理解的其他實施方式。
【權(quán)利要求】
1. 一種術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法，其特征在于，步驟如下： (l)CTC細胞分離及培養(yǎng)； ⑵輻照處理CTC細胞，制備靶向懸液； ⑶分離PBMC，并誘導DC細胞和CIK細胞，進行CTC懸液靶向抗原遞呈； (3. 1)血液中分離單核細胞 (3. 1. 1)取100ml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml無菌離心管中； (3. 1.2) 300g離心lOmin，離心后，將所有的上層血漿轉(zhuǎn)移到2個新的無菌離心管中， 56°C水浴滅活30min，再于400g離心lOmin后，收集上層黃色液體即低血小板血漿，4°C儲存 備用； (3. 1. 3)向該4個下層含血細胞的離心管中加入注射用生理鹽水，直到每管30ml混合 液，用移液器混勻； (3. 1. 4)再取4支含15ml淋巴細胞分離液的50ml離心管，緩慢的將血細胞混合液用移 液器轉(zhuǎn)移到淋巴細胞分離液的上層； (3. 1. 5)400g 離心 20 分鐘； (3. 1. 6)離心后將中間白膜層吸入到新的50ml離心管中； (3. 1. 7)用注射用生理鹽水補液到45ml后，300g離心5分鐘，清洗單核細胞； (3. 1. 8)重新加入注射用生理鹽水45ml，混勻后離心清洗單核細胞； (3. 2)免疫細胞誘導分化及抗原遞呈； (3. 2. 1)第0天，離心收集單核細胞，用20ml無血清培養(yǎng)基重懸，在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 2h ； (3. 2. 2) 2h后將不貼壁細胞倒入另外一個T175培養(yǎng)瓶中，并用無血清培養(yǎng)液補足T175 培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液到50ml，并加入終濃度1000U/ml的白介素 2 (IL-2)和終濃度25ng/ml的抗 ⑶3單抗；同時，向T75培養(yǎng)瓶中加入DC培養(yǎng)基和2ml輻照處理的CTC細胞懸液； (3. 2. 3)第二天，對T175培養(yǎng)瓶進行半量換液； (3. 2. 4)第四天，對T75培養(yǎng)瓶中的細胞用DC培養(yǎng)基，進行半量換液，并補加 2ml處理 后的CTC細胞懸液；同時，T175培養(yǎng)瓶中補加培養(yǎng)液到100ml ; (3. 2. 5)第六天，向T75培養(yǎng)瓶中，加入終濃度20ng/ml的TNF-α。補加培養(yǎng)液到 300ml ； (3. 2.6)第八天，用細胞刮刀刮下T75培養(yǎng)瓶中的DC細胞，加入到CIK細胞中，并補加 5ml處理后的CTC細胞懸液，再將培養(yǎng)液補加到500ml，進行混合擴增培養(yǎng)； (3. 2. 7)第十天，將所有的DC和CIK細胞離心后，用生理鹽水洗2次（300g，離心5分 鐘），最后，加入到注射用生理鹽水中，補加10%人血白蛋白； (4)回輸治療：將加有DC和CIK細胞等物質(zhì)的生理鹽水采用靜脈滴注的方式回輸給患 者。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法，其特征在于，步 驟（l)CTC細胞分離及培養(yǎng)的具體步驟為： (1. 1)分離出CTC細胞； (1. 2)培養(yǎng)方法： (1. 2. 1)準備無菌培養(yǎng)液，包括DMEM，10%胎牛血清，1 % L-谷氨酰胺和1 %雙抗； (1. 2. 2)將分離到的CTC細胞在以上培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，每3天進行一次傳代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的術(shù)后節(jié)制腫瘤細胞遷移的DC-CIK治療方法，其特征在于，步 驟（2)輻照處理CTC細胞，制備靶向懸液的具體步驟為： (2. 1) 20mW/cm2強度微波輻射CTC細胞30min ; (2. 2)用注射用生理鹽水清洗2次； (2. 3)消化離心收集輻照處理后的CTC細胞，并計數(shù)； 使用時用按照2*105個/ml溶液稀釋。
【文檔編號】A61K35/13GK104288178SQ201410300918
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】易銀沙, 張萬明, 朱海強, 鄒義洲, 許澎, 劉彩云, 袁炳秋, 吳小寧 申請人:長沙贏潤生物技術(shù)有限公司