專利名稱：Hiv蛋白酶抑制劑在阻斷細(xì)胞遷移和/或侵襲、組織浸潤(rùn)和水腫形成中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人免疫缺陷性病毒(HIV)的蛋白酶抑制劑在抑制正常和/或腫瘤細(xì)胞的組織侵襲中的用途，用于治療相關(guān)疾病，例如與HIV感染有關(guān)或無(wú)關(guān)的卡波濟(jì)氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、腫瘤、血管增殖性、炎性或自身免疫性疾病。
現(xiàn)有技術(shù)HIV病毒蛋白酶的抑制劑是具有已知抗病毒活性的化合物，例如Deeks等人所述(Deeks等人，1997)。利用其抑制病毒成熟并阻斷其復(fù)制的功能，可用于治療罹患獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)患者的HIV感染(Deek等人，1997)。在本說(shuō)明書中，HIV病毒蛋白酶的抑制劑下文也表示為HIV-PI。
卡波濟(jì)氏肉瘤(KS)是與人皰疹病毒8(HHV8)感染有關(guān)的腫瘤，在感染HIV病毒的受試者中(AIDS-KS)特別常見(Ensoli和Stürzl，1998)。在未感染HIV的受試者中也觀察到KS，特別是地中海地區(qū)和意大利(典型KS)、非洲(地方性KS)以及經(jīng)受免疫抑制療法的器官移植個(gè)體(醫(yī)原性KS)(Ensoli和Stürzl，1998)。感染HHV8的受試者產(chǎn)生KS的必要條件似乎是免疫系統(tǒng)失調(diào)(Ensoli和Stürzl，1998)。
很多作者描述了在感染HIV并經(jīng)包含至少一種HIV-PI的抗病毒藥物聯(lián)合治療的患者中(Deeks等人，1997)，KS和淋巴瘤的發(fā)生率降低(International Collaboration on HIV and Cancer，2000)或KS消退(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999)。KS是以血管生成、血管細(xì)胞以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的血管瘤；尤其在同時(shí)感染HIV和HHV-8的同性戀和雙性戀男性中常見并具有侵襲性的(Ensoli和Stürzl，1998)。損傷形成由具有血管生成性、增殖性、水腫形成性、趨化性和炎性作用的細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)。由KS細(xì)胞、活化的內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)組織的免疫細(xì)胞生成這些細(xì)胞因子(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。在血管生成性因子之中，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)在KS損傷中高水平表達(dá)，對(duì)于KS生長(zhǎng)和血管生成是最重要的自分泌和旁分泌因子(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。實(shí)際上，針對(duì)bFGF的抗體或反義寡聚物阻斷裸鼠中接種原代KS細(xì)胞所誘發(fā)的血管生成和KS樣損傷形成，以及KS細(xì)胞的體外生長(zhǎng)(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994b；Barillari等人，1999b)。反之亦然，裸鼠接種bFGF可促進(jìn)KS樣血管增殖性損傷形成(Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)，能模擬細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)作用的HIV-1蛋白質(zhì)Tat可提高其頻率和侵襲性。特別對(duì)于作用于KS而言，Tat要求存在bFGF或炎性細(xì)胞因子，其依次誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和KS細(xì)胞產(chǎn)生bFGF，并作為Tat受體的整聯(lián)蛋白的表達(dá)(Ensoli等人，1990；Barillari等人，1992；Barillari等人，1993；Ensoli等人，1994a；Albini等人，1995；Fiorelli等人，1995；Fiorelli等人，1998；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a和1999b)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是存在于KS中的另一種生長(zhǎng)、血管生成和血管通透性的誘導(dǎo)物，與bFGF協(xié)同作用于KS的血管生成和水腫(Samaniego等人，1998)。KS中存在的、并協(xié)同作用于其形成的其它因子有白細(xì)胞介素(IL)-1、(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)α、干擾素(IFN)γ、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、制瘤素-M以及趨化因子(RANTES、MIP-1α、MIP-1β等)(Ensoli和Stürzl，1998)。特別是炎性細(xì)胞因子，例如IL-1、IL-6、和IFNγ，可誘導(dǎo)KS細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生bFGF和VEGF，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞獲得KS細(xì)胞的表型、變得具有體內(nèi)血管生成性，并誘導(dǎo)小鼠的KS損傷(Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Fiorelli等人，1998；Barillari等人，1999a)。除了促進(jìn)KS生長(zhǎng)以外，bFGF，例如VEGF，能夠激活血管生成所需的全部過(guò)程。血管生成也是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及非瘤性血管增殖性疾病的基礎(chǔ)，常常是慢性炎性疾病的重要組成部分(Carmeliet和Jain，2000)。此外，由活化的內(nèi)皮細(xì)胞、KS細(xì)胞和浸潤(rùn)組織的炎性細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子，例如RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、MCP-1等具有間接的血管生成作用，并作為炎性細(xì)胞的趨化物，因而誘導(dǎo)組織和損傷中的炎性和免疫細(xì)胞(不論受HHV-8感染與否)進(jìn)一步募集和浸潤(rùn)(Ensoli和Stürzl)，1998)。在此方面，血管生成、炎性細(xì)胞的組織浸潤(rùn)以及水腫均需要由特定蛋白酶降解血管基底膜和/或細(xì)胞外基質(zhì)，以便血管周隙的細(xì)胞定向遷移(內(nèi)皮或炎性/免疫細(xì)胞侵襲和遷移)，或促進(jìn)從血流中流出液體(Carmeliet和Jain，2000)。此外，血管生成需要在于內(nèi)皮細(xì)胞增殖的第三個(gè)步驟。
特別是血管基底膜和間質(zhì)組織的降解，由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)介導(dǎo)。MMP本身為腫瘤和轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)、炎性細(xì)胞的組織浸潤(rùn)以及水腫形成所必需(Stetler-Stevenson，1999)。特別是炎性細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，在癌癥、炎癥和自身免疫疾病中具有重要作用，因?yàn)檫@些細(xì)胞產(chǎn)生因子，包括血管生成因子和炎性細(xì)胞因子，旁分泌作用于鄰近細(xì)胞。在MMP當(dāng)中，MMP-2對(duì)于血管生成必不可少，它由bFGF誘導(dǎo)，在KS的原發(fā)損傷及其它腫瘤中高表達(dá)(Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999b；Stetler-Stevenson，1999)，而MMP-9是介導(dǎo)組織中單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的最重要的MMP。抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、侵襲或增殖、或者M(jìn)MP-2和MMP-9或其它MMP的活性，能夠阻斷血管生成，構(gòu)成了當(dāng)前用于抗血管生成和抗腫瘤治療的理論基礎(chǔ)(Stetler-Stevenson，1999；Koivunen等人，1999；Carmeliet和Jain，2000)。此外，在包括感染、多發(fā)性硬化、炎性疾病、免疫疾病和癌癥在內(nèi)的幾種病理?xiàng)l件下，顯示MMP的局部和整體濃度和/或活性顯著改變(Fujimoto等人，1993；Leppert D等人，1998；Leppert等人，2000；)，因此可作為這些疾病診斷、預(yù)后和治療的目標(biāo)。
在感染HIV并經(jīng)HIV-PI治療的個(gè)體中觀察到KS發(fā)生率下降及消退(Lebbé等人；Cattelan等人，1999；International Collaborationon HIV and Cancer，2000)，與該藥物能夠抑制HIV復(fù)制、從而抑制KS強(qiáng)推動(dòng)因子HIV-1Tat蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和釋放有關(guān)(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999a；Barillari等人，1999b)。此外，通過(guò)恢復(fù)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的數(shù)目和功能以及天然殺傷活性，利用HIV-PI治療提高了針對(duì)據(jù)認(rèn)為是KS病因的HHV-8病毒的保護(hù)性免疫反應(yīng)(Ensoli和Stürzl)，1998)。實(shí)際上，HIV-PI治療的患者的HIV(Deeks等人，1997)和HHV-8含量均下降，并重現(xiàn)了針對(duì)HHV-8的免疫應(yīng)答(Blum等人，1997；Rizzieri等人，1997；Lebbé等人，1998；Osman等人，1999；Sirianni等人，1999；Sirianni等人，2000；Wang等人，2000)。
在此方面，現(xiàn)有資料表明，在沒(méi)有HIV的情況下，HIV-PI也可調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞功能和抗原呈遞(André等人，1998，Gruber等人，2001)、降低T細(xì)胞活化以及炎性細(xì)胞因子生成(Tovo，AIDS 2000，Ledru等人，2000)。另外，已經(jīng)表明一種HIV-PI，即利托那韋(ritonavir)，對(duì)蛋白酶體活性具有極大作用，導(dǎo)致通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類的抗原表位加工和呈遞改變(André等人，PNAS，1998；專利申請(qǐng)WO99/63998)。這些資料表明，HIV-PI可能具有免疫調(diào)節(jié)特性(André等人，PNAS，1998；Tovo，AIDS2000；專利申請(qǐng)WO99/63998，專利申請(qǐng)WO0033654)。此外，由于已知蛋白酶體與血管生成有關(guān)(Oikawa等人，1998)，這些資料提示，HIV-PI還可能影響血管生成。另外，最近的資料表明，HIV-PI具有對(duì)包括細(xì)胞活化、存活和增殖在內(nèi)的幾種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)特性(專利申請(qǐng)WO99/63998，專利申請(qǐng)WO0033654)。這些資料提示，蛋白酶抑制劑(包括HIV-PI)、蛋白酶體抑制劑、微生物和病毒蛋白酶抑制劑、以及半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶抑制劑可能用于調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答和代謝，通過(guò)作用于這些細(xì)胞應(yīng)答而治療各種人類疾病。
相反，我們假定由于HIV-PI作用于細(xì)胞侵襲和血管通透性過(guò)程有關(guān)的酶或分子，即與細(xì)胞蛋白酶體無(wú)關(guān)的分子，例如(而不僅僅)MMP，而可能對(duì)這些過(guò)程具有直接和特異性的作用。因此，在HIV-PI治療的個(gè)體中觀察到KS發(fā)生率下降及消退是可能由于HIV-PI抑制內(nèi)皮和KS細(xì)胞侵襲、炎性和/或免疫細(xì)胞的組織浸潤(rùn)以及水腫形成。應(yīng)當(dāng)指出，現(xiàn)有研究無(wú)法預(yù)見HIV-PI的這些作用。實(shí)際上，所有研究一致將HIV-PI治療患者的KS發(fā)生率下降或消退歸因于抑制HIV感染從而降低蛋白質(zhì)Tat的表達(dá)，歸因于免疫系統(tǒng)重建從而使HHV8在血液或損傷中消失，或歸因于HIV-PI的免疫調(diào)節(jié)作用(Blum等人，1997；Rizzieri等人，1997；Lebbé等人，1998；De Milito等人，1999；Cattelan等人，1999；Osman等人，1999；Sirianni等人，1999；Sirianni等人，2000；Wang等人，2000；專利申請(qǐng)WO99/63998，專利申請(qǐng)WO0033654)。相反，我們假想的HIV-PI作用以前從未描述或研究過(guò)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用于通過(guò)抑制或調(diào)節(jié)分子和蛋白水解酶，例如但不限于MMP，阻斷正常、腫瘤炎性或免疫細(xì)胞的遷移和/或侵襲、組織浸潤(rùn)、和/或水腫形成，以治療發(fā)病機(jī)理與上述過(guò)程有關(guān)的各種疾病，包括腫瘤、非瘤性血管增殖性疾病、炎性疾病或自身免疫疾病。
本發(fā)明另一目的在于通過(guò)使用HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)抑制或調(diào)節(jié)分子和蛋白水解酶，例如但不限于MMP，從而阻斷正常、腫瘤、炎性或免疫細(xì)胞遷移和/或侵襲、組織浸潤(rùn)和/或水腫形成的方法。
本發(fā)明另一目的在于HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用于產(chǎn)生能夠通過(guò)抑制分子和蛋白水解酶，例如但不限于MMP，從而阻斷細(xì)胞遷移和/或侵襲以及組織浸潤(rùn)，以引起抗血管生成作用的藥物，用于治療感染或未感染HIV病毒受試者中的腫瘤和非腫瘤性血管增殖性疾病。
本發(fā)明另一目的在于HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用于阻斷感染或未感染HIV病毒受試者中的腫瘤細(xì)胞侵襲。
本發(fā)明另一目的在于HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用于產(chǎn)生具有抗水腫形成活性并能夠阻斷炎性和免疫細(xì)胞的組織浸潤(rùn)的藥物，以治療感染或未感染HIV病毒受試者中的炎性和自身免疫疾病。
本發(fā)明另一目的在于HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用于產(chǎn)生治療感染或未感染HIV病毒受試者中的卡波濟(jì)氏肉瘤的藥物。
本發(fā)明另一目的在于HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)的用途，用于產(chǎn)生能夠通過(guò)抑制分子和蛋白水解酶，例如但不限于MMP，從而阻斷細(xì)胞遷移和/或侵襲以及組織浸潤(rùn)，以引起抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫形成和/或抗炎作用的藥物，用于治療感染HIV病毒受試者中的卡波濟(jì)氏肉瘤、腫瘤和非腫瘤性血管增殖性、炎性和自身免疫疾病。
本發(fā)明另一目的在于化合物的上述用途，這些化合物為Merck，Sharp和Dohme出售的Crixivan(茚地那韋(indinavir))；Roche出售的Invirase或Fortovase(沙奎那韋(saquinavir))；AbbottLaboratories出售的Norvir(利托那韋)；Roche出售的Viracept(那非那韋(nelfinavir))；Glaxo Wellcome出售的Agenerase(安潑那韋(amprenavir))；Abbott Laboratories出售的Kaletra(洛匹那韋(lopinavir)和利托那韋)。
本發(fā)明另一目的在于HIV病毒蛋白酶抑制劑(HIV-PI)以及上述化合物的用途，其相互聯(lián)合和/或聯(lián)合抗炎癥、抗血管生成或抗腫瘤藥物，用于上述適應(yīng)癥。
本發(fā)明另一目的在于上述HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化學(xué)類似物或衍生物的用途，其單獨(dú)、或互相聯(lián)合、和/或與抗炎癥、抗血管生成或抗腫瘤藥物聯(lián)用，因抑制分子和蛋白水解酶，例如但不限于MMP，能夠阻斷正常、腫瘤、炎性或免疫細(xì)胞細(xì)胞侵襲以及組織浸潤(rùn)，從而具有抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫形成和/或抗炎作用。
本發(fā)明的其它目的根據(jù)以下發(fā)明詳述顯而易見。
附圖簡(jiǎn)述

圖1(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋對(duì)主要大血管(humbelical靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞基本的或bFGF誘導(dǎo)的增殖沒(méi)有作用。圖A茚地那韋對(duì)基本的或bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的作用；圖B沙奎那韋對(duì)基本的或bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的作用。
圖2(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋抑制大血管(臍靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)bFGF的遷移。圖A.茚地那韋對(duì)細(xì)胞遷移的作用；圖B沙奎那韋對(duì)細(xì)胞遷移的作用。
圖3(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋抑制大血管(臍靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲。圖A茚地那韋對(duì)細(xì)胞侵襲的作用；圖B沙奎那韋對(duì)細(xì)胞侵襲的作用。
圖4.茚地那韋和沙奎那韋不影響微血管(皮膚的)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)bFGF的增殖。
圖5.茚地那韋和沙奎那韋抑制微血管(皮膚的)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲。
圖6.茚地那韋和沙奎那韋不影響平滑肌細(xì)胞響應(yīng)bFGF的增殖。
圖7.茚地那韋和沙奎那韋抑制平滑肌細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲。
圖8(圖A、B和C).茚地那韋阻斷MMP-2的活化。圖A在茚地那韋存在與否的情況下，經(jīng)bFGF處理與否的內(nèi)皮細(xì)胞上清中的潛伏的MMP-2(72kD)、活化前MMP-2(64kD)或活化MMP-2(62kD)對(duì)應(yīng)的明膠分解活性；圖B潛伏MMP-2的光密度定量；圖C活化的前和活化MMP-2形式的光密度定量。
圖9(圖A、B和C).沙奎那韋阻斷MMP-2的活化。圖A在沙奎那韋存在與否的情況下，經(jīng)bFGF處理與否的內(nèi)皮細(xì)胞上清中的潛伏的MMP-2(72kD)、活化前MMP-2(64kD)或活化MMP-2(62kD)對(duì)應(yīng)的明膠分解活性；圖B潛伏MMP-2的光密度定量；圖C活化的前和活化MMP-2形式的光密度定量。
圖10.茚地那韋和沙奎那韋阻斷前MMP-2自身蛋白水解轉(zhuǎn)化為活性形式。
圖11(圖A和B).沙奎那韋阻斷內(nèi)皮細(xì)胞生成酪蛋白特異性MMP。圖A在沙奎那韋存在與否的情況下，利用bFGF或TPA處理8小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞上清的酪蛋白酶譜(zymography)；圖B在沙奎那韋存在與否的情況下，利用bFGF或TPA處理24小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞上清的酪蛋白酶譜；圖12[(1)(圖a-d)和(2)(圖a-h)].茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠形成bFGF誘導(dǎo)的血管增殖性損傷。A)圖a經(jīng)鹽溶液處理、只接種基質(zhì)膠(matrigel)的典型小鼠的注射部位；圖b經(jīng)鹽水處理、并接種含有bFGF的基質(zhì)膠的典型小鼠的注射部位；圖c經(jīng)茚地那韋處理、并接種含有bFGF的基質(zhì)膠的典型小鼠的注射部位；圖d經(jīng)沙奎那韋處理、并接種含有bFGF的基質(zhì)膠的典型小鼠的注射部位。B)圖a和b經(jīng)鹽水處理、只接種基質(zhì)膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖a100×放大倍數(shù)；圖b100×放大倍數(shù))；圖c和d經(jīng)鹽水處理、并接種bFGF的基質(zhì)膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖c100×放大倍數(shù)；圖d100×放大倍數(shù))；圖e和f經(jīng)茚地那韋處理、并接種bFGF的基質(zhì)膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖e100×放大倍數(shù)；圖f100×放大倍數(shù))；圖g和h經(jīng)沙奎那韋處理、并接種bFGF的基質(zhì)膠的典型小鼠注射部位的顯微形狀(圖g100×放大倍數(shù)；圖h100×放大倍數(shù))。
圖13(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細(xì)胞的侵襲力。圖A茚地那韋對(duì)細(xì)胞侵襲的作用；圖B沙奎那韋對(duì)細(xì)胞侵襲的作用。
圖14.茚地那韋和沙奎那韋不影響內(nèi)皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細(xì)胞的增殖。
圖15.茚地那韋和沙奎那韋抑制內(nèi)皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細(xì)胞的侵襲力。
圖16.茚地那韋和沙奎那韋不影響肝癌(SK-Hep-1)細(xì)胞的增殖。
圖17.茚地那韋和沙奎那韋抑制肝癌(SK-Hep-1)細(xì)胞的侵襲力。
圖18.茚地那韋和沙奎那韋不影響肺癌(A549)細(xì)胞的增殖。
圖19.茚地那韋和沙奎那韋抑制肺癌(A549)細(xì)胞的侵襲力。
圖20.茚地那韋和沙奎那韋不影響乳癌(MDA-MB-468)細(xì)胞的增殖。
圖21.茚地那韋和沙奎那韋抑制乳癌(MDA-MB-468)細(xì)胞的侵襲力。
圖22.茚地那韋和沙奎那韋抑制髓單核細(xì)胞性白血病(U937)細(xì)胞的侵襲力。
圖23(圖a、b、c、d、e和f).茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種KS細(xì)胞誘導(dǎo)的KS樣損傷的發(fā)展。圖a和b經(jīng)鹽水溶液處理的典型小鼠的KS細(xì)胞注射部位的顯微形狀(圖a100×放大倍數(shù)；圖b400×放大倍數(shù))；圖c和d經(jīng)茚地那韋處理的典型小鼠的KS細(xì)胞注射部位的顯微形狀(圖c250×放大倍數(shù)；圖d400×放大倍數(shù))；圖e和f經(jīng)沙奎那韋處理的典型小鼠的KS細(xì)胞注射部位的顯微形狀(圖e250×放大倍數(shù)；圖f400×放大倍數(shù))。
圖24.茚地那韋和沙奎那韋促進(jìn)裸鼠接種KS細(xì)胞誘導(dǎo)的KS樣損傷的消退。
圖25.茚地那韋和沙奎那韋促進(jìn)裸鼠接種內(nèi)皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤血管生成性損傷的消退。
圖26.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肝癌(SK-Hep-1)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。
圖27.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肺癌(A549)細(xì)胞誘導(dǎo)的KS樣損傷的發(fā)展。
圖28.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種乳癌(MDA-MB-468)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。
圖29.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種髓單核細(xì)胞性白血病(U937)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。
圖30.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種T細(xì)胞白血病(Jurkat)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。
圖31.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠接種KS細(xì)胞促進(jìn)的血管通透性和水腫。
圖32(圖A和B).茚地那韋和沙奎那韋阻斷KS細(xì)胞生成炎性細(xì)胞因子，例如IL-6。圖A茚地那韋對(duì)細(xì)胞因子生成的作用；圖B沙奎那韋對(duì)細(xì)胞因子生成的作用。
發(fā)明詳述在描述本發(fā)明主體之前，提供下列定義細(xì)胞侵襲(細(xì)胞的侵襲)-細(xì)胞通過(guò)蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜而在組織或基底膜中移動(dòng)的過(guò)程。
組織浸潤(rùn)-細(xì)胞由于細(xì)胞侵襲而從遠(yuǎn)處遷移，定位于組織中。
水腫-由于浸潤(rùn)或原有細(xì)胞可釋放通過(guò)蛋白酶(包括基質(zhì)金屬蛋白酶)作用改變毛細(xì)血管內(nèi)皮和基底膜結(jié)構(gòu)通透性的因子的活性，而從血液或淋巴管滲出液體。
細(xì)胞外基質(zhì)-由細(xì)胞產(chǎn)生、充滿細(xì)胞間隙的物質(zhì)，以不同數(shù)量存在于各種組織中。
基底膜-由細(xì)胞產(chǎn)生、位于正常內(nèi)皮或上皮之下、使其與下層組織分開的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
基質(zhì)金屬蛋白酶-可以裂解幾乎任何細(xì)胞外基質(zhì)成分的內(nèi)肽酶，分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶素(stromelysin)和間質(zhì)溶素(matrilysin)。
最近的報(bào)告描述了經(jīng)包含至少一種HIV-PI(例如茚地那韋或沙奎那韋)的高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)的HIV1感染病人的KS發(fā)生率下降或消退(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999；International Collaboration on HIV and Cancer，2000)。人們已經(jīng)將這些效果歸因于HIV-PI阻斷HIV病毒復(fù)制、阻斷HHV8病毒復(fù)制和/或重建針對(duì)HHV-8和HIV的免疫應(yīng)答(Blum等人，1997；Rizzieri等人，1997；Lebbé等人，1998；De Milito等人，1999；Cattelan等人，1999；Osman等人，1999；Sirianni等人，1999；Sirianni等人，2000；Wang等人，2000)。另一方面，我們過(guò)去和最近的研究表明，KS細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)和血管生成因子(特別是bFGF)介導(dǎo)KS損傷形成，內(nèi)皮和KS細(xì)胞侵襲、這些細(xì)胞以及炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞的組織浸潤(rùn)、水腫形成以及MMPs的活化或生成增多是KS損傷發(fā)展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1995；Samaniego等人，1997；Ensoli和Stürzl，1998；Fiorelli等人，1998；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a；Barillari等人，1999b；Fiorelli等人，1999)。因此，與學(xué)術(shù)界的一般觀點(diǎn)相反，我們假設(shè)經(jīng)HIV-PI治療的AIDS-KS患者的KS消退是由于HIV-PI作用于與細(xì)胞侵襲、組織浸潤(rùn)以及水腫過(guò)程有關(guān)的、不同于細(xì)胞蛋白酶體的分子和酶，而對(duì)這些過(guò)程產(chǎn)生的直接活性。我們利用體外模型表明，使用與治療患者血漿中相同濃度的茚地那韋和沙奎那韋，可阻斷主要大血管或微血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴或?qū)嶓w腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而不影響這些細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們進(jìn)一步表明，這些HIV-PI抑制MMP-2酶活化或降解酪蛋白的MMP的增加生成。金屬蛋白酶類(MMP)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性(遷移和侵襲)或血管通透性必不可少，因而對(duì)血管生成、水腫以及腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲是必要的(Carmeliet和Jain，2000)。與這些數(shù)據(jù)一致，我們證明茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠接種bFGF、bFGF和VEGF聯(lián)合或原發(fā)的人KS細(xì)胞所誘導(dǎo)的KS樣血管增殖性損傷的發(fā)展，并阻斷bFGF或VEGF在雞尿囊絨膜(CAM)中誘導(dǎo)的血管生成。我們進(jìn)一步證明，茚地那韋或沙奎那韋阻斷裸鼠接種人淋巴和實(shí)體腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。最后，我們表明HIV-PI阻斷裸鼠中KS細(xì)胞促進(jìn)的血管通透性和水腫。此外，它們抑制KS細(xì)胞生成細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子不僅促進(jìn)KS損傷，而且也具有炎癥活性(Ensoli等人，1989；Barillari等人，1992；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Sirianni等人，1998；Samaniego等人，1998；Fiorelli等人，1998；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a)，其中一些還促進(jìn)多中心Castleman病(MCD)和淋巴瘤(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Ramsay等人，1994；Asou等人，1998)。
這些數(shù)據(jù)因此表明，HIV-PI對(duì)KS和淋巴瘤的作用是由于MMP直接阻斷內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，對(duì)于血管生成和水腫具有抑制作用，因而在經(jīng)HIV-PI處理的小鼠模型和/或患者中觀察到抑制損傷形成以及腫瘤發(fā)生率下降。然而HIV-PI的這些作用并非由于抑制正?；蛄鲂约?xì)胞的增殖。重要的是要強(qiáng)調(diào)，這些治療性作用是在缺少HIV和HHV8的情況下獲得的，因此排除了HIV-PI的這些作用可能由HIV-PI對(duì)HIV和/或HHV8的作用來(lái)介導(dǎo)。
因此，我們的研究表明，可以利用HIV-PI調(diào)節(jié)相應(yīng)生物進(jìn)程，或用于治療與細(xì)胞遷移和侵襲、組織浸潤(rùn)以及MMP活性有關(guān)的病理狀況。特別而言，發(fā)現(xiàn)HIV蛋白酶抑制劑是阻斷細(xì)胞侵襲和組織浸潤(rùn)的有效藥物，它們可以阻斷與這些過(guò)程有關(guān)的細(xì)胞金屬蛋白酶的活性，開辟了用于調(diào)節(jié)和治療與上述細(xì)胞應(yīng)答和功能有關(guān)的所有生物進(jìn)程和病理狀況的嶄新領(lǐng)域，包括感染HIV受試者以及未感染HIV受試者的血管生成、非瘤性血管增殖性病變、KS、腫瘤、炎癥和自身免疫疾病。
因此，表現(xiàn)HIV病毒蛋白酶抑制劑(此處為簡(jiǎn)便起見記為HIV-PI)活性的所有化合物、或與其類似、或其衍生的化合物均屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。在這點(diǎn)上，此處作為這些化合物的例子而提及茚地那韋、沙奎那韋、利托那韋、那非那韋、安潑那韋、洛匹那韋。
在感染HIV和未感染HIV的受試者中均可能如下使用HIV-PI化合物-阻斷內(nèi)皮細(xì)胞遷移，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷腫瘤細(xì)胞遷移，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷內(nèi)皮細(xì)胞侵襲，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷腫瘤細(xì)胞侵襲，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷炎性細(xì)胞遷移，具有治療性抗炎癥、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷免疫細(xì)胞遷移，具有治療性抗炎癥和抗自身免疫作用；-阻斷炎性細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，具有治療性抗炎癥、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；-阻斷免疫細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，具有治療性抗炎癥和抗自身免疫作用；-阻斷與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的MMP包括MMP-2、基質(zhì)溶素、間質(zhì)溶素及其它蛋白酶或分子；阻斷活化與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的MMP及其它蛋白酶或分子的酶；阻斷與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的血小板反應(yīng)蛋白及其它分子；-阻斷與血管生成有關(guān)的MMP包括MMP-2、基質(zhì)溶素、間質(zhì)溶素及其它蛋白酶或分子(Carmeliet，Nature2000)；-阻斷活化與血管生成有關(guān)的MMP及其它蛋白酶的酶；-阻斷與血管生成有關(guān)的血小板反應(yīng)蛋白及其它分子；-阻斷與炎性和免疫細(xì)胞遷移以及組織浸潤(rùn)有關(guān)的MMPs包括MMP-2、基質(zhì)溶素、間質(zhì)溶素及其它蛋白酶或分子；-阻斷與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)的MMP包括MMP-2及其它蛋白酶或分子；-阻斷bFGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS作用；-阻斷VEGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；-阻斷bFGF和VEGF的聯(lián)合活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；-阻斷Tat單獨(dú)或在bFGF存在下的活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫和抗炎癥作用；-阻斷與血管生成有關(guān)的血管通透性和水腫；-阻斷與腫瘤有關(guān)的血管通透性和水腫；-阻斷與KS有關(guān)的血管通透性和水腫；-阻斷與炎癥有關(guān)的血管通透性和水腫；-阻斷炎性細(xì)胞因子的生成，具有治療性抗炎癥作用；-阻斷細(xì)胞因子的生成，具有治療性抗水腫形成作用；-阻斷細(xì)胞因子的生成，具有治療性抗血管生成作用；-阻斷細(xì)胞因子的生成，具有治療性抗KS作用；-阻斷細(xì)胞因子生成，具有治療性抗腫瘤作用，-用于治療KS，-治療血管生成，
-治療非腫瘤性血管增殖性疾病(眼睛、腎臟、血管系統(tǒng)、皮膚)，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織形成、沙眼、血管性青光眼、銀屑病、免疫性和非免疫性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、瘢痕瘤，-治療軟組織、軟骨、骨和血液的良性和惡性腫瘤，-治療一般的自身免疫疾病，特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、甲狀腺炎、潰瘍性直腸結(jié)腸炎和克羅恩氏病(Crohn’s disense)、古德帕斯徹氏(Goodpasture’s)綜合征、系統(tǒng)性血管炎、Sjgren氏綜合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變，-治療炎性疾病，特別是與變態(tài)反應(yīng)和病毒性感染、細(xì)菌或寄生物(parasitic agent)有關(guān)的慢性炎癥，包括Castleman氏多中心病。
對(duì)于上述用途，通常指明了顯示抑制HIV病毒蛋白酶活性的所有化合物，特別指明的化合物有茚地那韋、沙奎那韋、利托那韋、那非那韋、安潑那韋、洛匹那韋及其類似或衍生物、單用或彼此聯(lián)用和/或與其它藥物聯(lián)用。
從而可能利用有助于將活性物質(zhì)加工成藥用制劑的一種或多種藥學(xué)可接受的、包含賦形劑和輔料的載體，按常規(guī)方法配制用于本發(fā)明的藥物組合物?？砂匆阎椒ㄖ苽溥@些藥物組合物，例如利用常規(guī)的混合、溶解、?；?、糖衣化、粉化、乳化、膠囊化、包夾或凍干加工。合適的劑型取決于所選給藥途徑。藥物組合物還可能包含適當(dāng)?shù)墓滔嗷蚰z體相載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠以及聚合物，例如聚乙二醇。
本說(shuō)明書提及的已知的HIV-PI的化學(xué)類似物、和/或衍生物、和/或鹽，單用、或彼此聯(lián)用、和/或與其它藥物、或輔藥、或載體、或賦形劑聯(lián)用，均被認(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
對(duì)于上列的各種適應(yīng)癥，本發(fā)明HIV-PI可口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、胸膜內(nèi)、子宮內(nèi)、陰道內(nèi)、局部直腸內(nèi)、透過(guò)粘膜、損傷內(nèi)或透皮給予。劑量和給藥方式取決于所治療的疾病類型。特別而言，考慮低于、等于或高于治療HIV感染病人的常用劑量。例如，劑量為對(duì)于茚地那韋(大約)600mg/天、1200mg/天、2400mg/天或4800mg/天；對(duì)于沙奎那韋(大約)900mg/天、1800mg/天、3600mg/天、7200mg/天。
下文給出的實(shí)施例，也涉及包括的圖表，可用來(lái)驗(yàn)證我們的假設(shè)。我們使用與所治療患者的KS消退有關(guān)的兩種HIV-PI，茚地那韋和沙奎那韋(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999)，其結(jié)構(gòu)類似，但為優(yōu)化其作用而設(shè)計(jì)成不同的化學(xué)取代基。在bFGF和/或VEGF體內(nèi)和體外促進(jìn)的血管生成模型中，研究?jī)煞NHIV-PI對(duì)KS樣損傷形成、KS細(xì)胞體內(nèi)引起的血管通透性以及體外KS細(xì)胞的作用(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a和1994b；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a；Sgadari等人，2000)，對(duì)淋巴或?qū)嶓w腫瘤細(xì)胞系體內(nèi)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)以及體外淋巴或?qū)嶓w腫瘤細(xì)胞系的作用。
給出以下實(shí)施例和圖闡明本發(fā)明，而不應(yīng)認(rèn)為限制其范圍。
材料和方法/附圖詳述圖1.茚地那韋和沙奎那韋對(duì)主要大血管(humbelical靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖或bFGF誘導(dǎo)的增殖沒(méi)有作用。圖A茚地那韋對(duì)主要大血管(humbelical靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖或bFGF誘導(dǎo)的增殖的作用；圖B沙奎那韋對(duì)主要大血管(humbelicBl靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖或bFGF誘導(dǎo)的增殖的作用。
圖形顯示增殖分析結(jié)果，表示為在存在或缺少0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或其重懸緩沖液(緩沖液)的情況下，與bFGF的PBS緩沖液(黑條)、或無(wú)bFGF(單獨(dú)PBS，白條)溫育5天后計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)目。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC，Bio-Whittaker，Verviers，Belgium)一式三份接種于預(yù)先覆蓋明膠的12孔板中(1.5×104細(xì)胞/孔)。次日將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中溫育4小時(shí)，培養(yǎng)于添加10％胎牛血清(FBS)以及含bFGF的PBS緩沖液(10ng/ml)或單獨(dú)PBS緩沖液的RPMI1640培養(yǎng)基中(Life Technologies，Eragny，F(xiàn)rance)。3日后更換培養(yǎng)基、bFGF、PBS緩沖液、茚地那韋、沙奎那韋或HIV-PI重懸緩沖液。培養(yǎng)5日后，如前所述利用臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)對(duì)于所有的體外研究，將純粉劑的茚地那韋或沙奎那韋(分別為Merck Sharpe & Dohme和Roche)重懸于蒸餾水中。LAL檢驗(yàn)藥物不含有內(nèi)毒素(Associatedof Cape Code Inc.，F(xiàn)almouth，MA)。
圖2和3.茚地那韋和沙奎那韋阻斷bFGF誘導(dǎo)的主要大血管(humbelical靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲。
圖2顯示遷移分析的結(jié)果。圖3顯示侵襲分析的結(jié)果。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行兩種分析。結(jié)果表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩沖液(緩沖液)存在下，響應(yīng)含bFGF的PBS緩沖液(黑條)、或單獨(dú)的PBS緩沖液(白條)而遷移(圖2)或侵襲(圖3)的細(xì)胞數(shù)目/孔。圖A茚地那韋對(duì)bFGF誘導(dǎo)的主要大血管(humbelical靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞遷移(圖2)或侵襲(圖3)的作用；圖B沙奎那韋對(duì)bFGF誘導(dǎo)的主要大血管(humbelical靜脈)內(nèi)皮細(xì)胞遷移(圖2)或侵襲(圖3)的作用。
兩種分析是在Boyden槽(Nucleoprobe，Cabin John，MD)中進(jìn)行的，該槽利用由12μm微孔聚碳酸酯濾膜隔成兩部分，涂有膠原IV(Collaborative Biomedical Products)用于遷移，或共同涂有膠原IV和基質(zhì)膠用于侵襲，如前所述(Barillari等人，1999b)。在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋、或其稀釋緩沖液存在下，將HUVEC培養(yǎng)5-6天。收集細(xì)胞，重懸于包含0.01％BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中，在茚地那韋、沙奎那韋或其稀釋緩沖液存在下，一式兩份置于Boyden槽的上層(2×105細(xì)胞/孔)。將bFGF(50ng/ml)放入下層包含0.01％BSA的培養(yǎng)基中，作為趨化物。培養(yǎng)5小時(shí)(遷移)或6小時(shí)(侵襲)后，機(jī)械去除存在于濾膜上表面的未遷移細(xì)胞，將濾膜下表面的遷移細(xì)胞甲醇固定，甲苯胺藍(lán)染色(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。隨機(jī)選取濾膜5-10個(gè)顯微鏡視野(field)的細(xì)胞，如前所述計(jì)數(shù)(Barillari等人，1999b)。
圖4.茚地那韋和沙奎那韋不影響微血管(皮膚的)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)bFGF的增殖。
圖形顯示增殖分析的結(jié)果，表示為在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或其重懸緩沖液(緩沖液)存在下，與bFGF溫育5天后的皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目。人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMVEC，Bio-Whittaker)一式三份接種于包被明膠的12孔板(2×104細(xì)胞/孔)，在補(bǔ)充有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中一直存在bFGF(10ng/ml)，以防止在耗盡該因子24-48小時(shí)之后發(fā)生細(xì)胞凋亡。3日后更換培養(yǎng)基、bFGF、茚地那韋、沙奎那韋(10μM)或HIV-PI重懸緩沖液。培養(yǎng)5天后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料排除法計(jì)數(shù)細(xì)胞，如上所述。兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以表示為在茚地那韋、沙奎那韋或HIV-PI重懸緩沖液存在下，響應(yīng)bFGF而生長(zhǎng)的HDMVEC數(shù)目。
圖5.茚地那韋和沙奎那韋抑制微血管(皮膚的)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲。
圖形顯示利用H-DMVEC進(jìn)行的細(xì)胞侵襲分析的結(jié)果。
數(shù)據(jù)可以表示為在茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)或HIV-PI重懸緩沖液(緩沖液)存在下，響應(yīng)含bFGF的PBS緩沖液(■)或單獨(dú)的PBS緩沖液(□)而侵襲的細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。將無(wú)bFGF時(shí)的基礎(chǔ)侵襲定為100％。顯示了如上所述進(jìn)行的HUVEC Boyden槽分析的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。10mM茚地那韋以及1和10mM沙奎那韋阻斷H-MVDEC具有顯著的統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
圖6和7.茚地那韋和沙奎那韋抑制平滑肌細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲而非增殖。
圖6顯示利用平滑肌細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)分析的結(jié)果，圖7顯示利用平滑肌細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞侵襲分析的結(jié)果。基本上如圖1和3所述進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)可以表示為在茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)或HIV-PI重懸緩沖液(緩沖液)存在下，響應(yīng)含bFGF的PBS緩沖液(■)或單獨(dú)的PBS緩沖液(□)而生長(zhǎng)或侵襲的細(xì)胞的數(shù)目或百分比，如圖所示。將無(wú)HIV-PI時(shí)bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)、或無(wú)bFGF時(shí)的基礎(chǔ)細(xì)胞侵襲定為100％。顯示兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)(平均值)。
圖8和9.茚地那韋和沙奎那韋阻斷潛伏的MMP-2轉(zhuǎn)化為活性形式。圖8茚地那韋對(duì)MMP-2活化的作用。圖A利用含bFGF的PBS溶液(黑條)或單獨(dú)的PBS緩沖液(緩沖液，白條)刺激HUVEC，并在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)或其重懸緩沖液存在下培養(yǎng)24小時(shí)，對(duì)其濃縮上清進(jìn)行的酶譜分析。箭頭表示由于潛伏形式(72kD)、活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)的MMP-2對(duì)應(yīng)的明膠分解活性而形成的脫色區(qū)域。圖B72kD潛伏形式的明膠分解活性對(duì)應(yīng)的脫色區(qū)域的光密度定量；圖C細(xì)胞釋放的活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)MMP-2的明膠分解活性對(duì)應(yīng)的脫色區(qū)域的光密度定量。結(jié)果可以表示為脫色條帶的光密度。圖9沙奎那韋對(duì)MMP-2活化的作用。圖A利用含bFGF的PBS液(黑條)或單獨(dú)的PBS緩沖液(緩沖液，白條)刺激HUVEC，并在0.1、1或10μM沙奎那韋(SAQ)或其重懸緩沖液存在下培養(yǎng)24小時(shí)，對(duì)其濃縮上清進(jìn)行的酶譜分析。箭頭表示由于潛伏形式(72kD)、活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)的MMP-2對(duì)應(yīng)的明膠分解活性而形成的脫色區(qū)域。圖B72kD潛伏形式的明膠分解活性對(duì)應(yīng)的脫色區(qū)域的光密度定量；圖C細(xì)胞釋放的活化前形式(64kD)和活化形式(62kD)MMP-2的明膠分解活性對(duì)應(yīng)的脫色區(qū)域的光密度定量。結(jié)果可以表示為脫色條帶的光密度。
在存在梯度濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩沖液以及有或沒(méi)有bFGF(100ng/ml)的情況下，將HUVEC在添加10％FBS的RPMI1640中培養(yǎng)24小時(shí)。然后利用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，并在相同濃度HIV-PI的存在下，于無(wú)血清培養(yǎng)基中整夜溫育。然后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用Centricon-10(Amicon，Bedford，MA)濃縮。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，利用Bradford分析(Bio-Rad，Hercules，CA)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。然后在酶譜緩沖液(5X)(0.4M Tris-HCI，pH6.8，5％SDS，20％甘油和0.03％溴酚藍(lán))中稀釋等量(5μg)蛋白質(zhì)，上樣包含1mg/ml明膠的9％SDS聚丙烯酰胺凝膠。電泳后將凝膠在2.5％(v/v)TritonX-100中溫育1小時(shí)，以除去SDS，其后利用酶緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，5mM CaCl2，0.02％Brij-35)37℃溫育整晚，如前所述(Kleiner等人，1993)。凝膠然后利用考馬斯藍(lán)G-250染色，在30％甲醇和10％乙酸中脫色。然后利用與裝有Multi-Analyst軟件(Bio-Rad)的Macintosh Performa電腦相連的光密度計(jì)GS-700，定量脫色區(qū)域的光密度。
圖10.茚地那韋和沙奎那韋阻斷前MMP-2自身蛋白水解轉(zhuǎn)化為活性形式。圖形顯示利用佛波酯(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯)(TPA)(50nM)或其重懸緩沖液(緩沖液)刺激HUVEC，并在10μM茚地那韋(IND)、沙奎那韋(SAQ)、或其重懸緩沖液(緩沖液)存在下培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)其上清進(jìn)行的酶譜分析。箭頭表示由于潛伏形式(原MMP2，72kD)、活化前形式(前MMP2，64kD)和活化形式(活化MMP2，62kD)的MMP-2對(duì)應(yīng)的明膠分解活性而形成的脫色區(qū)域。在添加10％FBS的RPMI1640中培養(yǎng)HUVEC24小時(shí)。在分析之前，利用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，在10mM茚地那韋、或沙奎那韋、或其重懸緩沖液存在下，于包含0.01％w/v牛血清白蛋白(BSA)的無(wú)血清培養(yǎng)基中溫育過(guò)夜。細(xì)胞然后在包含0.01％w/vBSA、10mM茚地那韋或沙奎那韋和TPA、或其重懸緩沖液的培養(yǎng)基中溫育8小時(shí)。然后如上所述，利用凝膠酶譜分析細(xì)胞上清等分樣品的MMP-2活性。HT1080是分泌大量MMP-2的腫瘤細(xì)胞系，用作對(duì)照。如圖所示，利用TPA處理HUVEC可誘導(dǎo)原MMP2轉(zhuǎn)化為前MMP2和活化的MMP2。然而，在茚地那韋或沙奎那韋存在下，活化的MMP2的明膠分解條帶的相對(duì)強(qiáng)度比前MMP2降低，表明茚地那韋和沙奎那韋均阻斷MMP-2的自身蛋白水解活化為活化形式。茚地那韋還在TPA存在下抑制細(xì)胞釋放MMP-2的總量。分析的上清量按細(xì)胞總數(shù)歸一化。
圖11.沙奎那韋阻斷內(nèi)皮細(xì)胞生成降解酪蛋白的MMP。HUVEC如圖10所述生長(zhǎng)并處理，只是在無(wú)血清過(guò)夜培養(yǎng)之后，將細(xì)胞在沙奎那韋(SAQ)或重懸緩沖液(緩沖液)存在下，于TPA(50nM)、含不同濃度bFGFPBS緩沖液(0.1或1μg/ml)、單獨(dú)的PBS緩沖液(緩沖液)中培養(yǎng)。細(xì)胞上清的等分樣品按細(xì)胞總數(shù)歸一化，然后如上所述，在包含酪蛋白(2mg/ml)而非明膠的凝膠中，利用凝膠酶譜分析MMP活性。圖A利用在TPA或bFGF存在下培養(yǎng)8小時(shí)后收集的細(xì)胞上清進(jìn)行的酪蛋白酶譜；圖B利用在TPA或bFGF存在下培養(yǎng)24小時(shí)后收集的細(xì)胞上清進(jìn)行的酪蛋白酶譜。酪蛋白由間質(zhì)溶素(MMP-3、MMP-10、MMP-11)和基質(zhì)溶素(MMP-7)特異性裂解(Whittaker和Ayscough，2001)。由于細(xì)胞上清中存在酪蛋白水解活性，導(dǎo)致脫色區(qū)域出現(xiàn)。如圖所示，無(wú)沙奎那韋時(shí)，bFGF以劑量依賴形式誘導(dǎo)釋放酪蛋白降解活性，TPA處理的細(xì)胞最甚。然而，酪蛋白水解條帶的強(qiáng)度下降，表明沙奎那韋(10μM)抑制bFGF或TPA釋放該活性。
圖12.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠形成bFGF誘導(dǎo)的KS樣血管生成性損傷。
(A)圖a雙側(cè)注射基質(zhì)膠中的緩沖液(PBS-0.1％BSA)、并經(jīng)鹽水溶液處理的小鼠，其注射部位的目視形態(tài)(macroscopic appearance)；圖b雙側(cè)注射基質(zhì)膠中的bFGF(1μg)、并經(jīng)鹽水溶液處理的小鼠，其注射部位的目視形態(tài)；圖c雙側(cè)注射基質(zhì)膠中的bFGF(1μg)、并經(jīng)茚地那韋處理(1.4mg/天)的小鼠，其注射部位的目視形態(tài)；圖d雙側(cè)注射基質(zhì)膠中的bFGF(1μg)、并經(jīng)沙奎那韋處理(1mg/天)的小鼠，其注射部位的目視形態(tài)。(B)圖a注射緩沖液、并經(jīng)鹽水溶液處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(100×放大倍數(shù))；圖b注射緩沖液、并經(jīng)鹽水溶液處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(400×放大倍數(shù))；圖c注射bFGF、并經(jīng)鹽水溶液處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(100×放大倍數(shù))；圖d注射bFGF、并經(jīng)鹽水溶液處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(400×放大倍數(shù))；圖e注射bFGF、并經(jīng)茚地那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(100×放大倍數(shù))；圖f注射bFGF、并經(jīng)茚地那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(400×放大倍數(shù))；圖g注射bFGF、并經(jīng)沙奎那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(100×放大倍數(shù))；圖h注射bFGF、并經(jīng)沙奎那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的接種部位的顯微形態(tài)(400×放大倍數(shù))。按表1重點(diǎn)所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
圖13.茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細(xì)胞的侵襲力。圖A茚地那韋對(duì)兩種KS細(xì)胞株(KS3、KS8)的侵襲作用；圖B沙奎那韋對(duì)兩種KS細(xì)胞株(KS8、KS12)的侵襲作用。
圖形顯示對(duì)在茚地那韋、或沙奎那韋、或稀釋緩沖液(對(duì)照)存在下體外培養(yǎng)5-6天的三種原代KS細(xì)胞株(KS3、KS8、KS12)進(jìn)行的侵襲分析結(jié)果。兩種藥物均以劑量依賴方式抑制KS細(xì)胞侵襲基質(zhì)膠(Matrigel)膜的能力。特別而言，與對(duì)照的KS細(xì)胞觀察到的水平相比較，兩種HIV-PI均抑制侵襲(p＜0.05)。
如圖3所述進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，將KS細(xì)胞在茚地那韋或沙奎那韋(1uM)或稀釋緩沖液(鹽水溶液)存在下培養(yǎng)5-6天。收獲細(xì)胞，然后一式兩份(5×105，在包含0.05％BSA的培養(yǎng)基中)接種于Boyden槽上層，始終處于HIV-PI或緩沖液存在下。將bFGF(20ng/ml)置于下層，作為趨化劑。6小時(shí)后，將侵襲基質(zhì)膠膜的細(xì)胞染色，如圖3所述要點(diǎn)計(jì)數(shù)。
圖14和15.茚地那韋和沙奎那韋抑制內(nèi)皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細(xì)胞的侵襲而非增殖。
圖14顯示利用H-UVEC與人肺腺癌細(xì)胞雜交的Ea-hy926細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)分析結(jié)果(Edgell等人，1983)，該細(xì)胞保持內(nèi)皮細(xì)胞的大部分標(biāo)志，用作血管生成性腫瘤模型(Albini等人，1995，Albini等人，1996，Cai等人，1999)。結(jié)果表示為與HIV-PI重懸緩沖液(緩沖液)(□)相比，加入1μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)(■)5天后計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)目?；旧先鐖D1所述要點(diǎn)進(jìn)行分析。在Ea-hy 926細(xì)胞中未加入生長(zhǎng)因子，因其生成因子，以自分泌方式調(diào)解細(xì)胞生長(zhǎng)(Edgell等人，1983，Albini等人，PNAS 1995，Albini等人，Nat Med1996)。圖15顯示侵襲分析的結(jié)果，表示為與HIV-PI重懸緩沖液(緩沖液)(□)相比，在1μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)(■)存在下，響應(yīng)bFGF的侵襲細(xì)胞數(shù)目/視野(field)?；旧先鐖D3的圖例所述進(jìn)行分析。顯示各一式兩份進(jìn)行的兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和變異區(qū)間。沙奎那韋處理對(duì)Ea-hy926細(xì)胞侵襲的阻斷具有顯著統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
圖16.茚地那韋和沙奎那韋不影響肝癌細(xì)胞(SK-Hep-1)的增殖。所示為對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行的典型的細(xì)胞生長(zhǎng)分析的結(jié)果。將人肝癌細(xì)胞(SK-Hep-1；來(lái)自ATCC)一式三份接種于12孔板中(8×104細(xì)胞/孔)。次日將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓6小時(shí)，然后在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或稀釋緩沖液(PBS)存在下，于包含10％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中溫育。每2天更換包含茚地那韋、沙奎那韋或緩沖液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)4天后，如前所述通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)。在所有體外試驗(yàn)中，將不含內(nèi)毒素的純粉末狀HIV-PI(Merck、Sharp & Dohme以及Roche友情贈(zèng)送)重懸于蒸餾水中。重復(fù)分析至少三次。
圖17.茚地那韋和沙奎那韋抑制肝癌(SK-Hep-1)細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲力。
所示為兩次不同實(shí)驗(yàn)中侵襲的肝癌細(xì)胞SK-Hep-1的平均值，表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩沖液(緩沖液)存在下，響應(yīng)bFGF(黑條)、或其稀釋緩沖液(白條)而侵襲的細(xì)胞的平均數(shù)目。在Boyden槽中進(jìn)行侵襲分析。如前所述，聚碳酸酯濾膜(8μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然后覆蓋基質(zhì)膠(Collaborative BiomedicalProducts)(Barillari等人，1999b)。在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(0.1μM、1μM、10μM)或稀釋緩沖液(對(duì)照)存在下，將SK-Hep-1細(xì)胞培養(yǎng)5天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩沖液的0.1％BSA中將2×105細(xì)胞一式兩份接種于Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置于下層，作為趨化劑。培養(yǎng)5小時(shí)后，機(jī)械去除存在于濾膜上表面的非侵襲細(xì)胞，將濾膜下表面的侵襲細(xì)胞在乙醇中固定，甲苯胺藍(lán)染色(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學(xué)顯微術(shù)計(jì)數(shù)10個(gè)濾膜隨機(jī)視野(Barillari等人，1999b)。
圖18.茚地那韋和沙奎那韋不影響肺癌(A549)細(xì)胞的增殖。
所示為對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行的典型的細(xì)胞生長(zhǎng)分析的結(jié)果。將人肺癌細(xì)胞(A549；來(lái)自ATCC)一式三份接種于12孔板中(8×104細(xì)胞/孔)。次日將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓6小時(shí)，然后在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或稀釋緩沖液(PBS)存在下，于包含10％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中溫育。每2天更換包含茚地那韋、沙奎那韋或緩沖液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)4天后，如前所述通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)在所有體外試驗(yàn)中，將不含內(nèi)毒素的純粉末狀HIV-PI(Merck、Sharp & Dohme和Roche友情贈(zèng)送)重懸于蒸餾水中。重復(fù)分析至少三次。
圖19.茚地那韋和沙奎那韋抑制肺癌(A549)細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲力。
所示為兩次不同實(shí)驗(yàn)中侵襲的肺癌細(xì)胞A549的平均值，表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或稀釋緩沖液(緩沖液)存在下，響應(yīng)bFGF(黑條)、或其稀釋緩沖液(白條)而侵襲的細(xì)胞的平均數(shù)。在Boyden槽中進(jìn)行侵襲分析。如前所述，聚碳酸酯濾膜(12μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然后覆蓋基質(zhì)膠(Collaborative Biomedical Products)(Barillari等人，1999b)。將A549細(xì)胞在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(0.1μM、1μM、10μM)或稀釋緩沖液存在下培養(yǎng)5天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩沖液的0.1％BSA中將2×105細(xì)胞一式兩份接種于Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置于下層，作為趨化劑。培養(yǎng)5小時(shí)后，機(jī)械去除存在于濾膜上表面的非侵襲細(xì)胞，將濾膜下表面的侵襲細(xì)胞在乙醇中固定，甲苯胺藍(lán)染色(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學(xué)顯微術(shù)計(jì)數(shù)10個(gè)濾膜隨機(jī)視野(Barillari等人，1999b)。
圖20.茚地那韋和沙奎那韋不影響乳癌細(xì)胞(MDA-MB-468)的增殖。
所示為對(duì)乳癌細(xì)胞進(jìn)行的典型的細(xì)胞生長(zhǎng)分析的結(jié)果。將人乳癌細(xì)胞(MDA-MB-468；ATCC)一式三份接種于12孔板中(8×104細(xì)胞/孔)。次日將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓6小時(shí)，然后在10μM茚地那韋(IND)或沙奎那韋(SAQ)或稀釋緩沖液(緩沖液)存在下，于包含10％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中溫育。每2天更換包含茚地那韋、沙奎那韋或緩沖液的培養(yǎng)基。培養(yǎng)4天后，如前所述通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞(Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994b)在所有體外試驗(yàn)中，將不含內(nèi)毒素的純粉末狀HIV-PI(Merck、Sharp & Dohme和Roche友情贈(zèng)送)重懸于蒸餾水中。重復(fù)分析至少三次。
圖21.茚地那韋和沙奎那韋抑制乳癌(MDA-MB-468)細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲力。
所示為對(duì)乳癌細(xì)胞MDA-MB-468進(jìn)行的典型的侵襲分析的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為在0.1、1或10μM茚地那韋(IND)、或沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩沖液(緩沖液)存在下，響應(yīng)bFGF(黑條)、或其稀釋緩沖液(白條)而侵襲的細(xì)胞的平均數(shù)。在Boyden槽中進(jìn)行侵襲分析。如前所述，聚碳酸酯濾膜(8μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然后覆蓋基質(zhì)膠(Collaborative BiomedicalProducts)(Barillari等人，1999b)。在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(0.1μM、1μM、10μM)或稀釋緩沖液存在下，將乳癌細(xì)胞(MDA-MB-468)培養(yǎng)5天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩沖液的0.1％BSA中將2×105細(xì)胞一式兩份接種于Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置于下層，作為趨化劑。培養(yǎng)5小時(shí)后，機(jī)械去除存在于濾膜上表面的非侵襲細(xì)胞，將濾膜下表面的侵襲細(xì)胞在乙醇中固定，甲苯胺藍(lán)染色(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學(xué)顯微術(shù)計(jì)數(shù)10個(gè)濾膜隨機(jī)視野(Barillari等人，1999b)。重復(fù)分析兩次。
圖22.茚地那韋和沙奎那韋抑制髓單核細(xì)胞性白血病(U937)細(xì)胞響應(yīng)bFGF的侵襲力。
所示為對(duì)髓單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞U937進(jìn)行的典型的侵襲分析的結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為在1或10μM沙奎那韋(SAQ)、或其稀釋緩沖液(緩沖液)存在下，響應(yīng)bFGF(黑條)、或其稀釋緩沖液(白條)而侵襲的細(xì)胞的平均數(shù)。利用1或10μM茚地那韋處理細(xì)胞，也獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)略)。侵襲分析在Boyden槽中進(jìn)行。如前所述，聚碳酸酯濾膜(5μM微孔；Nucleoprobe，Cabin John，MD)首先覆蓋膠原IV，然后覆蓋基質(zhì)膠(Collaborative Biomedical Products)(Barillari等人，1999b)。將髓單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞U937在梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋(1μM、10μM)或稀釋緩沖液存在下培養(yǎng)4天。在包含漸增濃度的茚地那韋、沙奎那韋或稀釋緩沖液的0.1％BSA中將8×105細(xì)胞一式兩份接種于Boyden槽上層。將重組人bFGF(50ng/ml)置于下層，作為趨化劑。培養(yǎng)4小時(shí)后，機(jī)械去除存在于濾膜上表面的非侵襲細(xì)胞，將濾膜下表面的侵襲細(xì)胞在乙醇中固定，甲苯胺藍(lán)染色(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)。如前所述，利用光學(xué)顯微術(shù)計(jì)數(shù)10個(gè)濾膜隨機(jī)視野(BariLLari等人，1999b)。重復(fù)分析兩次。
圖23.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種KS細(xì)胞誘導(dǎo)的KS樣損傷的發(fā)展。
裸鼠接種KS細(xì)胞(3×106)以誘導(dǎo)血管增殖性KS樣損傷形成、或接種重懸緩沖液(對(duì)照)，并在接種細(xì)胞前2天開始，按照?qǐng)D12的要點(diǎn)所述劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。處死時(shí)檢查接種部位存在的肉眼可見的血管增殖性損傷，如圖12和表5的要點(diǎn)所述。圖a經(jīng)鹽水溶液處理的典型小鼠，其H&E染色的KS細(xì)胞接種部位中心區(qū)的顯微形態(tài)(100×放大倍數(shù))；圖b經(jīng)鹽水溶液處理的典型小鼠，其H&E染色的KS細(xì)胞接種部位中心區(qū)的顯微形態(tài)(400×放大倍數(shù))；圖c經(jīng)茚地那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的KS細(xì)胞接種部位中心區(qū)的顯微形態(tài)(250×放大倍數(shù))；圖d經(jīng)茚地那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的KS細(xì)胞接種部位中心區(qū)的顯微形態(tài)(400×放大倍數(shù))；圖e經(jīng)沙奎那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的KS細(xì)胞接種部位中心區(qū)的顯微形態(tài)(250×放大倍數(shù))；圖f經(jīng)沙奎那韋處理的典型小鼠，其H&E染色的KS細(xì)胞接種部位中心區(qū)的顯微形態(tài)(400×放大倍數(shù))；實(shí)驗(yàn)按表5的要點(diǎn)所述進(jìn)行。
圖24.茚地那韋和沙奎那韋促進(jìn)裸鼠接種KS細(xì)胞誘導(dǎo)的KS樣損傷的消退。
茚地那韋和沙奎那韋未經(jīng)任何藥物預(yù)處理，也能促進(jìn)KS消退。裸鼠(10只動(dòng)物/組)接種KS細(xì)胞(KS12細(xì)胞株，3×106)以誘導(dǎo)血管增殖性KS樣損傷形成、或接種其重懸緩沖液(對(duì)照)，從同一天開始，按照表5的圖例的所述劑量，通過(guò)胃內(nèi)管飼法利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。連續(xù)處理5天，直至處死。每日利用卡尺測(cè)量，計(jì)算兩個(gè)較大損傷直徑的乘積，評(píng)價(jià)注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖25.茚地那韋和沙奎那韋促進(jìn)裸鼠接種內(nèi)皮/肺癌雜交(Ea-hy926)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤血管生成性損傷的消退。
為證明茚地那韋和沙奎那韋不經(jīng)藥物預(yù)處理可促進(jìn)KS之外的其它腫瘤消退，使用H-UVEC和人肺腺癌細(xì)胞雜交的Ea-hy926細(xì)胞(Edgell等人，1983)(該細(xì)胞保持大部分內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志，被用作血管生成性腫瘤模型(Albini等人，1995，Albini等人，1996，Cai等人，1999)進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。小鼠下背皮下接種Ea-hy926細(xì)胞(0.2ml 10％FBS的RPMI1640中的3×106細(xì)胞/動(dòng)物)或重懸培養(yǎng)基，如上所述在接種之前與0.2ml耗盡生長(zhǎng)因子的基質(zhì)膠(BD Biosciences，Bedford，MA)混合。從同一天開始，按照?qǐng)D24的圖例所述劑量，通過(guò)胃內(nèi)管飼法以茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。連續(xù)處理5天，直至處死。每天利用卡尺測(cè)量，評(píng)價(jià)注射部位的損傷尺寸。然后將兩個(gè)較大的損傷直徑乘積，計(jì)算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖26.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肝癌(SK-Hep-1)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷肝癌細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。利用肝癌細(xì)胞(SK-Hep-1細(xì)胞系，得自ATCC，5×106細(xì)胞/部位)接種裸鼠(10只動(dòng)物/組)，誘導(dǎo)腫瘤，如圖23要點(diǎn)所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動(dòng)物。在細(xì)胞注射24小時(shí)之前，為增加腫瘤攝取，亞致死照射(400G)小鼠。連續(xù)利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測(cè)量，評(píng)價(jià)注射部位的損傷尺寸。然后將兩個(gè)較大的損傷直徑乘積，計(jì)算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖27.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種肺癌(A549)細(xì)胞誘導(dǎo)的KS樣損傷的發(fā)展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷肺癌細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。利用肺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞系，得自ATCC，5×106細(xì)胞/部位)接種X級(jí)裸鼠(10只動(dòng)物/組)，誘導(dǎo)腫瘤，如圖23要點(diǎn)所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動(dòng)物。連續(xù)利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測(cè)量，評(píng)價(jià)注射部位的損傷尺寸。然后將兩個(gè)較大的損傷直徑乘積，計(jì)算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖28.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種乳癌(MDA-MB-468)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。利用乳癌細(xì)胞(MDA-MB-468細(xì)胞系，得自ATCC，5×106細(xì)胞/部位)接種X級(jí)裸鼠(10只動(dòng)物/組)，誘導(dǎo)腫瘤，如圖23要點(diǎn)所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動(dòng)物。連續(xù)利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測(cè)量，評(píng)價(jià)注射部位的損傷尺寸。然后將兩個(gè)較大的損傷直徑乘積，計(jì)算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖29.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種髓單核細(xì)胞性白血病(U937)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷髓單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。利用髓單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞(U937細(xì)胞系，得自ATCC，處于0.2ml培養(yǎng)基中的5×106細(xì)胞/部位)接種X級(jí)裸鼠(10只動(dòng)物/組)，誘導(dǎo)腫瘤，如圖23圖例所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動(dòng)物。連續(xù)利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測(cè)量，評(píng)價(jià)注射部位的損傷尺寸。然后將兩個(gè)較大的損傷直徑乘積，計(jì)算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖30.茚地那韋和沙奎那韋抑制裸鼠接種T細(xì)胞白血病(Jurkat)細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤損傷的發(fā)展。
茚地那韋和沙奎那韋還有效阻斷T淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。利用白血病細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞系，得自ATCC，20×106細(xì)胞/部位)接種X級(jí)裸鼠(10只動(dòng)物/組)，誘導(dǎo)腫瘤，如圖23圖例所述，每日用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理動(dòng)物。連續(xù)利用HIV-PI或鹽水溶液處理，直至處死。每天利用卡尺測(cè)量，評(píng)價(jià)注射部位的損傷尺寸。然后將兩個(gè)較大的損傷直徑乘積，計(jì)算外部損傷面積。所示為注射部位損傷的平均尺寸(cm2)。
圖31.茚地那韋和沙奎那韋阻斷KS細(xì)胞誘導(dǎo)裸鼠中的血管通透性和水腫。
按如前所述相同的劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液(鹽水)處理裸鼠2天。在第3天接種新安替根(pyrilamine)(80μg處于100ul鹽水溶液中，4mg/kg，Sigma)，以避免因接種影響組胺釋放，然后立即靜脈內(nèi)接種100μl伊文思藍(lán)(Evans blue)(5mg/ml的鹽水溶液)，并皮下接種體外培養(yǎng)的KS細(xì)胞(3×106/小鼠)，其處于存在茚地那韋、沙奎那韋(1μM)或稀釋緩沖液的0.2ml基質(zhì)膠中。每只動(dòng)物對(duì)照地(controlaterally)接種相同體積的稀釋緩沖液和基質(zhì)膠，作為對(duì)照。18小時(shí)后處死動(dòng)物，利用量規(guī)在兩個(gè)最大垂直直徑水平上測(cè)定KS細(xì)胞接種部位傾注染色(staining decanted)的數(shù)量。還在取得接種部位皮膚后評(píng)估傾注染色的數(shù)量，利用甲酰胺56℃抽提24小時(shí)，然后分光光度計(jì)定量(Nakamura等人，1992)。減去對(duì)照部位測(cè)得的光密度后，計(jì)算傾注染色的數(shù)量。如圖所示，利用茚地那韋或沙奎那韋處理，其分光光度計(jì)定量的傾注染色數(shù)量分別減少39.8％(p＜0.05)和44.5％(p＜0.01)，量規(guī)測(cè)量則分別減少43.5％和47.5％。
圖32.茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細(xì)胞體外生成炎性細(xì)胞因子。圖A在茚地那韋存在(IND)或不存在(緩沖液)下培養(yǎng)的KS細(xì)胞上清中的IL-6數(shù)量；圖B在沙奎那韋存在(SAQ)或不存在(緩沖液)下培養(yǎng)的KS細(xì)胞上清中的IL-6數(shù)量。
將細(xì)胞接種于6孔板中，如(Ensoli等人，1990)所述，在濃度為0.1、1和10μM茚地那韋或沙奎那韋或稀釋緩沖液持續(xù)存在下培養(yǎng)5天。第5天，將培養(yǎng)基更換為存在所示濃度茚地那韋或沙奎那韋的包含牛血白蛋白(0.05％重量/體積)的無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24后，ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)檢測(cè)培養(yǎng)上清，測(cè)定培養(yǎng)基中IL-6的數(shù)量。IL-6的數(shù)量表示為pg/ml上清。利用商品化ELISA試劑盒，對(duì)bFGF、VEGF、L-1α和IL-1β進(jìn)行同樣檢測(cè)。茚地那韋和沙奎那韋均降低bFGF、VEGF、IL-1α、IL-1β和IL-6的生成。
實(shí)施例1為檢驗(yàn)為KS發(fā)展所需的哪些過(guò)程受茚地那韋或沙奎那韋抑制，將來(lái)自臍靜脈的原代人大血管內(nèi)皮細(xì)胞在有或沒(méi)有梯度濃度的茚地那韋或沙奎那韋的存在下培養(yǎng)，分析其響應(yīng)bFGF的增殖、遷移和侵襲。HIV-PI的使用濃度與所治療患者的血漿濃度相同(Deeks等人，1997)。
如圖1所示，在任何使用濃度下，HIV-PI對(duì)基礎(chǔ)的或bFGF誘導(dǎo)的大血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖均無(wú)影響。同樣，未觀察到茚地那韋或沙奎那韋對(duì)大血管內(nèi)皮細(xì)胞存活的影響。相反，任何使用濃度下，兩種HIV-PI均抑制bFGF所促進(jìn)的大血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移(圖2)，并完全阻斷其侵襲(圖3)。利用原代人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖4和5)或原代人平滑肌細(xì)胞(圖6和7)獲得相同結(jié)果。
實(shí)施例2內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲由活化的MMP的蛋白質(zhì)水解活性介導(dǎo)，其降解基底血管膜，以致內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲，這正為新血管形成所需(Stetler-Stevenson，1999)。內(nèi)皮細(xì)胞以酶原、原酶釋放MMP。為檢驗(yàn)茚地那韋或沙奎那韋是否對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的MMP活性具有任何影響，利用明膠和酪蛋白酶譜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定明膠分解活性(Kleiner等人，1993)。特別而言，MMP-2對(duì)于血管生成、腫瘤生長(zhǎng)和侵襲具有關(guān)鍵作用。MMP-2酶原(潛伏的MMP-2，72kD)通過(guò)涉及其它蛋白酶的復(fù)雜機(jī)制在細(xì)胞表面蛋白水解活化為64/62kD形式(Stetler-Stevenson，1999)。茚地那韋或沙奎那韋(分別為圖8和9)對(duì)潛伏的MMP-2影響極小或沒(méi)有影響，而兩種HIV-PI均以劑量依賴方式阻斷MMP-2的活化(圖8和9)。將細(xì)胞與所治療患者血漿濃度相同的HIV-PI培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察到這些作用(Deeks等人，1997)。與HIV-PI培養(yǎng)5天后，也觀察到類似作用。為分析與HIV-PI抑制MMP-2活化相關(guān)的步驟，利用佛波酯活化內(nèi)皮細(xì)胞，已知佛波酯非常有效地促進(jìn)MMP-2轉(zhuǎn)化為其活化形式。如圖10所示，這些實(shí)驗(yàn)表明，兩種HIV-PI均通過(guò)抑制前MMP2自身蛋白水解轉(zhuǎn)化為活化形式(62kD)而起作用(Stetler Stevenson，1999)。然而，尚須確定茚地那韋或沙奎那韋抑制潛伏的MMP-2轉(zhuǎn)化為活化形式的確切機(jī)制。實(shí)際上，并未發(fā)現(xiàn)HIV蛋白酶與MMP-2或其它MMP的活性部位序列之間的同源性。然而，已知能夠活化或抑制MMP和/或血管生成的血小板反應(yīng)蛋白，據(jù)發(fā)現(xiàn)與HIV蛋白酶催化部位(Carr等人，1998)存在氨基酸序列同源性(Bein和Simons，2000；Taraboletti等人，2000)。提示HIV-PI可能通過(guò)與血小板反應(yīng)蛋白相互作用而影響MMP活化或細(xì)胞侵襲。
為研究茚地那韋和沙奎那韋對(duì)其它MMP的作用，在有或沒(méi)有HIV-PI存在下利用bFGF或TPA處理內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行酪蛋白酶譜分析。這些實(shí)驗(yàn)表明，沙奎那韋能夠抑制bFGF或TPA誘導(dǎo)的酪蛋白特異性MMP的合成(圖11)。
由于MMP是細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵，這些結(jié)果表明，茚地那韋和沙奎那韋通過(guò)抑制MMP而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。盡管茚地那韋或沙奎那韋可能針對(duì)有關(guān)細(xì)胞侵襲的其它蛋白酶或分子，但MMP-2和酪蛋白特異性MMP代表了該作用的主要典型實(shí)例。
實(shí)施例3已經(jīng)證明MMP-2由bFGF及其它血管生成因子誘導(dǎo)(Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999b；Stetler-Stevenson，1999)，在KS損傷中表達(dá)bFGF和MMP-2(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998)。此外，已知抑制bFGF或MMP活性，特別是MMP-2，通常阻斷血管生成、KS損傷形成以及腫瘤生長(zhǎng)(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Stetler-Stevenson，1999；Koivunen等人，1999；Carmeliet和Jain，2000)。另一方面，細(xì)胞侵襲為正常組織和腫瘤的血管生成所必需。這些數(shù)據(jù)表明，茚地那韋和沙奎那韋對(duì)細(xì)胞侵襲和MMP的抑制應(yīng)該能夠阻斷血管生成。因此，利用裸鼠和尿囊絨膜(CAM)分析，研究茚地那韋和沙奎那韋對(duì)bFGF和/或VEGF誘導(dǎo)的血管生成的作用。
通過(guò)胃內(nèi)管飼法，每日一次利用茚地那韋(1.4mg/天)、沙奎那韋(1mg/天)或鹽水溶液(陰性對(duì)照)處理裸鼠，進(jìn)行2天(Kleiner等人，1993)。然后給小鼠接種處于基質(zhì)膠中的bFGF(1μg)或其稀釋緩沖液(Kleiner等人，1993；Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。每日利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理，再進(jìn)行5天。然后處死小鼠，目視及顯微鏡檢查接種面積是否存在KS樣血管增殖性損傷(Kleiner等人，1993；Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)。與先前結(jié)果一致(Ensoli等人，1994a；Samaniego等人，1998；Barillari等人，1999a)，接種1μg bFGF促進(jìn)71％未處理小鼠發(fā)展血管增殖性損傷(表1和圖12(1))。相反，利用茚地那韋或沙奎那韋處理使形成損傷小鼠的百分比分別下降至28％-25％(p＜0.05)(表1和圖12(1))圖12(1)顯示了這些結(jié)果的一個(gè)實(shí)例。利用茚地那韋或沙奎那韋處理完全阻斷損傷形成或極大減小了損傷尺寸。顯微鏡檢查茚地那韋或沙奎那韋處理小鼠的接種部位，顯示其血管生成和細(xì)胞浸潤(rùn)相比接種bFGF、未經(jīng)HIV-PI處理的小鼠顯著減少(圖12(2))。就總的消退而言，其組織的組織學(xué)形態(tài)與只注射緩沖液的小鼠(陰性對(duì)照)類似或相同(圖12(2))。利用抗FVIII或抗CD31抗體染色、并經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助分析定量，證實(shí)了這一點(diǎn)(表1)。實(shí)際上，HIV-PI處理小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志陽(yáng)性的損傷面積比未處理對(duì)照減少了多達(dá)70％(P＜0.001)(表1)。由于VEGF與bFGF協(xié)同誘導(dǎo)血管生成和KS樣損傷形成，還給小鼠(6只動(dòng)物/組)聯(lián)合接種亞最適量的bFGF(0.1μg)和VEGF(1μg)，如前所述觀察其協(xié)同效應(yīng)(Samaniego等人，1998)，并如上所示經(jīng)HIV-PI處理。聯(lián)合加入兩種因子誘導(dǎo)83％未處理小鼠的損傷發(fā)展，而茚地那韋或沙奎那韋使處理小鼠的損傷形成分別降低到33％和17％(P＜0.05，沙奎那韋)(表2)。因此，兩種HIV-PI均抑制裸鼠中聯(lián)用bFGF和VEGF的協(xié)同效應(yīng)所誘導(dǎo)的血管生成和KS樣損傷發(fā)展。這些結(jié)果表明，HIV-PI具有直接的抗血管生成作用。
使用建立的體內(nèi)CAM分析，測(cè)定血管生成(Ribatti等人，1996)，以證實(shí)HIV-PI具有直接的抗血管生成作用。如表3所示，茚地那韋或沙奎那韋分別阻斷bFGF誘導(dǎo)的血管生成達(dá)到未處理的bFGF對(duì)照的42％和19％，達(dá)到未處理的VEGF對(duì)照的36％和11％(P＜0.05)。值得注意的是，兩種HIV-PI阻斷bFGF誘導(dǎo)的血管生成可與紫杉酚相當(dāng)，紫杉酚是兼有抗腫瘤和抗血管生成活性的細(xì)胞毒類藥物，用于治療KS和實(shí)體腫瘤(Sgadari等人，2000)(表3)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，HIV-PI抑制微血管和大血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和侵襲、平滑肌細(xì)胞侵襲以及MMP活性，導(dǎo)致阻斷體內(nèi)血管生成。
實(shí)施例4KS細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞起源的具有活化表型的轉(zhuǎn)分化細(xì)胞，表達(dá)bFGF和VEGF以及MMP(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1990；Ensoli等人，1994a；Ensoli和Sturzl綜述，1998)。因此這些數(shù)據(jù)表明，HIV-PI可能對(duì)KS細(xì)胞具有對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的類似作用，能夠抑制KS細(xì)胞侵襲。因而在濃度為0.01μM-1μM茚地那韋或沙奎那韋存在下培養(yǎng)KS細(xì)胞5-7天，進(jìn)行粘附、增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。如表4所示，茚地那韋或沙奎那韋不抑制KS細(xì)胞粘附纖連蛋白底物的能力。同樣，利用茚地那韋或沙奎那韋處理KS細(xì)胞7天，對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，細(xì)胞增殖是通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料排除法計(jì)數(shù)活細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定(表4)。
為確定HIV-PI是否影響KS細(xì)胞響應(yīng)血管生成因子而遷移和侵襲基底膜的能力，將利用茚地那韋或沙奎那韋(0.01μM-1μM)處理5天的KS細(xì)胞置于始終存在HIV-PI的Boyden槽上層，而將bFGF置于下層，作為趨化劑。如表4所示，茚地那韋和沙奎那韋對(duì)KS細(xì)胞的遷移均無(wú)任何影響。相反，兩種藥物均以劑量依賴方式抑制KS細(xì)胞侵襲基質(zhì)膠底物的能力。特別是兩種HIV-PI均抑制KS細(xì)胞侵襲30-40％(p＜0.05)(表4和圖13)。
這些數(shù)據(jù)表明，HIV-PI響應(yīng)趨化性刺激而作用于細(xì)胞侵襲的機(jī)理，包括例如抑制MMP，很可能對(duì)許多細(xì)胞類型有效，包括腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例5為驗(yàn)證HIV-PI是否能夠特異性抑制腫瘤細(xì)胞侵襲，對(duì)來(lái)自各種腫瘤的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)。特別研究下列細(xì)胞系來(lái)自H-UVEC和人肺癌細(xì)胞的雜交細(xì)胞Ea-hy926(Edgell等人，PNAS1983)、肝癌細(xì)胞(SK-Hep-1)、肺癌細(xì)胞(A549)、乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468)以及髓單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞(U937)。茚地那韋或沙奎那韋對(duì)這些細(xì)胞系的增殖沒(méi)有明顯作用(圖14，16，18，20)。相比之下，與所治療患者血清濃度相同的兩種HIV-PI均顯著抑制腫瘤細(xì)胞侵襲(圖15、17、19、21、22)。因此這些數(shù)據(jù)表明，HIV-PI抑制正常和腫瘤細(xì)胞侵襲的能力遵從所有細(xì)胞共有的機(jī)制，例如阻斷與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的分子和酶，特別是MMP。
實(shí)施例6這些結(jié)果表明，盡管對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖沒(méi)有作用，HIV-PI可能通過(guò)選擇性阻斷腫瘤發(fā)展、腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移所需的腫瘤細(xì)胞侵襲和腫瘤血管生成而抑制腫瘤生長(zhǎng)(Carmeliet等人，2000)。為此進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，以確定HIV-PI是否有效抑制異種移植腫瘤模型、包括體外試驗(yàn)所用腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)。
首先，在廣泛用于抗KS治療有效性臨床前研究的體內(nèi)模型裸鼠中，研究茚地那韋或沙奎那韋對(duì)接種原代人KS細(xì)胞而促進(jìn)的KS樣損傷形成的作用(Ensoli等人，1994b；Koivunen等人，1999；Sgadari等人，2000)。這些是響應(yīng)KS細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子(例如bFGF和VEGF、IL-1、IL-6等)而形成的暫時(shí)性、鼠源的血管增殖性損傷(Ensoli等人，1989；Ensoli等人，1994a；Ensoli等人，1994b；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1995；Samaniego等人，1997；Sgadari等人，2000)。實(shí)際上，KS至少在初始階段是一種反應(yīng)性血管增殖性疾病，而非真正的腫瘤(Ensoli和Sturzl，1998)。利用上述實(shí)驗(yàn)使用的茚地那韋或沙奎那韋的相同方法和劑量處理動(dòng)物。如表5所示，接種KS細(xì)胞誘導(dǎo)100％的動(dòng)物形成KS樣損傷。茚地那韋或沙奎那韋處理可使形成損傷小鼠的百分比分別減少到43％和25％。肉眼可見未處理小鼠的損傷為鮮紅色、多血管，經(jīng)HIV-PI處理的動(dòng)物則較小、蒼白并處于消退期。類似地，未處理小鼠中損傷的新血管生成增多、梭形細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫以及紅細(xì)胞外滲(圖23)。相比之下，HIV-PI處理小鼠的細(xì)胞注射部位大片壞死，包含高達(dá)總損傷面積的85％，新血管生成和梭形細(xì)胞浸潤(rùn)均顯著減少，主要局限于壞死/消退區(qū)域的外圍(圖23)。
還在接種KS細(xì)胞時(shí)利用HIV-PI處理小鼠，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定HIV-PI在沒(méi)有任何藥物預(yù)處理時(shí)是否也促進(jìn)KS消退。如圖24所示，KS損傷通常隨時(shí)間緩慢消退，經(jīng)HIV-PI處理的小鼠的損傷消退更快，在處死時(shí)，其外表?yè)p傷面積與陰性對(duì)照類似或相同(P＜0.001)。
HIV的Tat蛋白質(zhì)可提高感染HIV-1受試者的KS發(fā)生率和侵襲性(Ensoli等人，1994a)。這是由于Tat誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和KS的粘附、遷移、侵襲和增殖。Tat實(shí)際上協(xié)同增強(qiáng)bFGF對(duì)血管生成和KS的作用(Ensoli等人，1994a；Barillari等人，1999a和1999b)。但是Tat對(duì)KS發(fā)揮作用需要bFGF或炎癥性細(xì)胞因子，因?yàn)樗鼈兛商岣逿at受體在細(xì)胞和組織上的表達(dá)(Barillari等人，1992；Barillari等人，1993；Albini等人，1995；Fiorelli等人，1995；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a；Barillari等人，1999b)。
因此，給裸鼠接種bFGF和Tat，并利用茚地那韋、沙奎那韋或其重懸緩沖液處理，以檢驗(yàn)HIV-PI是否抑制Tat和bFGF對(duì)血管生成和KS的聯(lián)合作用。如表6所示，茚地那韋和沙奎那韋均降低形成KS損傷的裸鼠的百分比(分別為50％和20％)。
這些結(jié)果表明，盡管HIV-PI對(duì)KS細(xì)胞增殖沒(méi)有作用，但由于其作用于細(xì)胞侵襲、MMP活性和血管生成，而能夠抑制反應(yīng)性、增生性腫瘤模型如KS(Ensoli和Sturzl，1998)的形成并誘導(dǎo)其消退。
實(shí)施例7給裸鼠接種Ea-hy926細(xì)胞系，以確定HIV-PI是否可以抑制惡性血管生成性腫瘤的生長(zhǎng)。該細(xì)胞系來(lái)自于H-UVEC和人肺腺癌細(xì)胞的雜交細(xì)胞(Edgell等人，PNAS1983)，保留大部分內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志，可用作血管生成性腫瘤模型(Albini等人，Nat Med1996；Albini等人，PNAS1995；Cai等人，Lab Invest1999)。在接種腫瘤細(xì)胞前2天，開始給予裸鼠HIV-PI。如表7所示，83％未處理的小鼠出現(xiàn)腫瘤，但茚地那韋或沙奎那韋處理的小鼠分別只有33％和25％(P＜0.05)。類似地，兩種HIV-PI處理的小鼠的外表腫瘤面積減少到陰性對(duì)照的大小(P＜0.05)(表7)。經(jīng)組織學(xué)以及抗FVIII-RA或抗CD31抗體染色測(cè)定，所處理動(dòng)物的殘余腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成均較對(duì)照大大下降(P＜0.001)(表7)。不經(jīng)藥物預(yù)處理也觀察到腫瘤生長(zhǎng)抑制(圖25)。實(shí)際上，這些動(dòng)物在處死時(shí)的外部腫瘤大小比未處理對(duì)照減少了50％以上(圖25)。因此，盡管HIV-PI不影響Ea-hy926細(xì)胞增殖，但通過(guò)直接阻斷腫瘤細(xì)胞侵襲和血管生成而抑制血管增殖性腫瘤模型的體內(nèi)生長(zhǎng)。
實(shí)施例8為測(cè)定HIV-PI是否可以抑制惡性實(shí)體腫瘤和淋巴腫瘤的生長(zhǎng)，給裸鼠接種肝癌細(xì)胞(SK-Hep-1)、肺癌細(xì)胞(A549)、乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-468)髓單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞(U937)以及T淋巴性白血病細(xì)胞(Jurkat)。雖然缺少HIV-PI對(duì)這些細(xì)胞系增殖的作用，但茚地那韋或沙奎那韋均顯著抑制所有這些異種移植腫瘤的生長(zhǎng)(圖26-30)。因此，這些數(shù)據(jù)表明，由于HIV-PI抑制MMP活性而阻斷腫瘤和內(nèi)皮細(xì)胞侵襲，從而導(dǎo)致這些藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。
實(shí)施例9既然MMP與血管生成、KS、腫瘤和炎癥性疾病的重要臨床特征血管通透性和水腫形成有關(guān)(Carmeliet等人，2000)，在接種KS細(xì)胞的裸鼠中進(jìn)行血管通透性的實(shí)驗(yàn)。這些細(xì)胞生成具有水腫形成作用的細(xì)胞因子，包括VEGF、bFGF(聯(lián)合VEGF)、IL-1、IL-6等，因而誘發(fā)水腫。按照實(shí)施例6所述劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理裸鼠2天，靜脈內(nèi)接種伊文思藍(lán)(Evanis blue)，然后在茚地那韋或沙奎那韋(1μM)或稀釋緩沖液存在下注射體外培養(yǎng)的KS細(xì)胞。12小時(shí)后處死動(dòng)物，利用卡尺測(cè)量KS細(xì)胞接種部位的染色面積，并利用甲酰胺提取滲出的染料，通過(guò)分光光度術(shù)測(cè)定(Nakamura，Science1992)。如圖31所示，利用茚地那韋或沙奎那韋處理使?jié)B出染料數(shù)量分別減少39.8％(p＜0.05)和44.5％(p＜0.01)，染色面積則分別減少43.5％和47.5％(圖31)。
實(shí)施例10KS細(xì)胞通過(guò)自分泌和旁分泌作用分泌具有炎性、水腫形成、血管生成和增殖活性的細(xì)胞因子(Ensoli和Stürzl，1998)。這些因子介導(dǎo)KS細(xì)胞在裸鼠中誘導(dǎo)KS樣損傷形成(血管生成、細(xì)胞增殖和侵襲、炎性浸潤(rùn)、水腫)、血管通透性和水腫所需的全部過(guò)程。在有或沒(méi)有梯度濃度茚地那韋或沙奎那韋存在下培養(yǎng)KS細(xì)胞，以測(cè)定茚地那韋和沙奎那韋對(duì)細(xì)胞因子生成的作用。將KS細(xì)胞在無(wú)血清以及兩種HIV-PI的持續(xù)存在下培養(yǎng)24小時(shí)后，利用免疫酶試驗(yàn)定量其上清中的bFGF、VEGF、IL-1和IL-6(ELISA)。茚地那韋和沙奎那韋抑制KS細(xì)胞生成IL-1α、IL-1β和IL-6。圖32顯示抑制IL-6便是該作用的實(shí)例，IL-6是由KS細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、血液和組織中的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞生成的典型的炎癥性細(xì)胞因子，還具有血管生成作用(Mateo等人，1994；Cohen等人，1996)。此外，IL-6在多中心性Cstleman’s疾病以及淋巴瘤生長(zhǎng)中具有重要作用(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Asou等人，1998；Ramsay等人，1994)，淋巴瘤是患者經(jīng)HIV-PI治療而發(fā)病率下降的另一類腫瘤(International Collaboration onHIV and Cancer 2000)。
討論這些結(jié)果表明，HIV-PI對(duì)細(xì)胞遷移和/或侵襲具有特異性抑制作用，對(duì)細(xì)胞增殖則不然。這些作用似乎應(yīng)歸于許多不同起源的原發(fā)和腫瘤細(xì)胞類型所通用的機(jī)制，以及針對(duì)與細(xì)胞蛋白酶體無(wú)關(guān)的影響細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵分子。例如，我們的研究表明，HIV-PI的作用與抑制MMP活化或生成有關(guān)，并可能針對(duì)與MMP代謝有關(guān)的其它分子，例如血小板反應(yīng)蛋白。由于這些活性，HIV-PI能夠阻斷需要細(xì)胞遷移、侵襲、和/或MMP活性的若干細(xì)胞過(guò)程，包括血管生成、血管通透性、水腫形成以及反應(yīng)性、增生性腫瘤(例如KS)、或惡性實(shí)體瘤或淋巴瘤的生長(zhǎng)。由于炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞的遷移也需要細(xì)胞侵襲和MMP活性，我們的數(shù)據(jù)表明，HIV-PI可以抑制炎癥反應(yīng)或免疫應(yīng)答期間的組織細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，HIV-PI抑制介導(dǎo)KS形成和其它腫瘤生長(zhǎng)以及與其有關(guān)的炎性浸潤(rùn)的細(xì)胞因子及其它因子的生成。HIV-PI可減少細(xì)胞因子例如IL-6、IL-1、可能與炎癥有關(guān)的其它細(xì)胞因子以及也存在于人或小鼠KS損傷中的細(xì)胞因子的生成，因而還具有抗炎癥作用。所述炎癥性細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)生成血管生成因子(bFGF、VEGF)，也具有體內(nèi)血管生成作用(Barillari等人，1992；Samaniego等人，1995；Fiorelli等人，1995；Samaniego等人，1997；Samaniego等人，1998；Fiorelli等人，1998；Fiorelli等人，1999；Barillari等人，1999a)。特別而言，IL-6在多中心性Cstleman’s疾病以及淋巴瘤生長(zhǎng)中具有重要作用(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Ramsay等人，1994；Asou等人，1998)。
HIV-PI與屬于天冬氨酰蛋白酶家族的HIV蛋白酶的活性部位結(jié)合。最近證明，這些藥物可以抑制真菌天冬氨酰蛋白酶(Cassone等人，1999)。然而，已知與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的蛋白酶均非天冬氨酰蛋白酶，在HIV蛋白酶和涉及這些過(guò)程的蛋白酶(血小板反應(yīng)蛋白除外)的活性部位之間未發(fā)現(xiàn)序列同源性。因此，我們所證明的對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲和MMP的作用完全不可預(yù)見，不能預(yù)期。
實(shí)際上，盡管某些研究提示HIV-PI對(duì)細(xì)胞代謝、蛋白酶體和免疫起作用(Deeks等人，1997；André等人，1998；Weichold等人，1999；Ledru等人，2000；Tovo，2000，專利申請(qǐng)WO99/63998，專利申請(qǐng)WO0033654)，我們證明HIV-PI發(fā)揮直接的抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫和抗炎癥活性，而與已知的天冬氨酰蛋白酶、細(xì)胞蛋白酶體、或HIV-PI對(duì)HIV或HHV-8復(fù)制的作用無(wú)關(guān)。實(shí)際上，用于此研究的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成、KS和腫瘤的體外和體內(nèi)模型沒(méi)有傳染物。
利用茚地那韋和沙奎那韋得到相同結(jié)果，它們與另一HIV-PI共有類似的結(jié)構(gòu)，但每種藥物具有特定的化學(xué)取代基。因此，這些數(shù)據(jù)表明，我們利用茚地那韋和沙奎那韋發(fā)現(xiàn)的HIV-PI活性是所有HIV-PI的共有特性，這與在處理的個(gè)體中觀察到的不同HIV-PI共同作用一致(Lebbé等人，1998；Cattelan等人，1999；InternationalCollaboration on HIV and Cancer，2000)。
在與治療患者血漿相同的藥物濃度下觀察到HIV-PI的上述作用，這些個(gè)體很耐受該藥物濃度。同樣，體外或小鼠中未觀察到茚地那韋或沙奎那韋的毒性作用。雖然先前數(shù)據(jù)表明HIV-PI抑制細(xì)胞蛋白酶體，而蛋白酶體的抑制可誘導(dǎo)增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞程序性死亡(Andre等人，1988，Hannes等人，2000)，但在我們的研究中，茚地那韋和沙奎那韋對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活或生長(zhǎng)沒(méi)有任何影響。相反，它們選擇性抑制細(xì)胞遷移和侵襲，提示HIV-PI并不損害預(yù)先存在的血管或組織。由于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和血管生成不僅對(duì)于KS形成、而且對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要(Carmeliet和Jain，2000；Stetler-Stevenson，1999)，至此為止描述的結(jié)果表明，HIV-PI是有希望的抗血管生成和抗腫瘤藥物。此外，相同結(jié)果表明，HIV-PI阻斷炎癥性細(xì)胞因子和血管通透因子誘導(dǎo)的血管通透性和炎癥、以及在多中心Castleman病以及淋巴瘤生長(zhǎng)中具有關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子的生成(Tosato等人，1993；Peterson和Frizzera，1993；Ramsay等人，1994；Asou等人，1998)。因此可以開發(fā)HIV-PI及其類似或衍生的藥物，以阻斷血管生成、實(shí)體腫瘤和血液腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移、水腫和炎癥作用，從而成功用于治療KS、腫瘤、血管增殖性疾病以及HIV陰性受試者及HIV感染受試者的炎癥性和自身免疫性疾病。
表1.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠形成bFGF誘導(dǎo)的KS樣損傷。
處理注射具有肉眼可見組織染色(面積％±SD)的血管損傷的小鼠數(shù)目/接種FVIII-RA CD31小鼠的數(shù)目(％)鹽水緩沖液 0/22(0) 0.20±0.20.06±0.1鹽水bFGF 20/28(71) 4.32±2.03.45±1.7茚地那韋bFGF 8/28(28)1.32±1.21.00±0.6沙奎那韋bFGF 7/28(25)1.13±0.60.83±0.3給裸鼠接種bFGF(1μg)以誘導(dǎo)形成KS樣血管增殖性損傷、或接種其重懸緩沖液(對(duì)照)，并用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。處死時(shí)檢查接種部位是否存在肉眼可見的血管增殖性損傷，并在蘇木精和伊紅(H&E)染色之后進(jìn)行顯微鏡分析，或冷凍用于內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志FVIII-RA和CD31的組織化學(xué)分析。此處列出了相對(duì)于接種小鼠數(shù)目(No.)的形成損傷的小鼠數(shù)目(No.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。處理動(dòng)物中KS樣損傷數(shù)目降低在統(tǒng)計(jì)上有顯著意義(對(duì)比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，p＜0.05)。通過(guò)測(cè)定FVIII-RA或CD31染色的組織面積，定量血管生成。所示為FVIII-RA或CD31染色的損傷面積的百分比[平均±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)]，如下所述定量。在HIV-PI處理的動(dòng)物的殘留損傷中，F(xiàn)VIII或CD31表達(dá)下降，在統(tǒng)計(jì)上有顯著意義(P＜0.001)。
為進(jìn)行這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將用于HIV感染病人的相同劑型(formulas)的茚地那韋(Merck Sharpe & Dhome Ltd.，Haarlem，NL)或沙奎那韋(Roche，Hertfordshire，GB)溶于鹽水溶液，通過(guò)胃內(nèi)管飼法給予裸鼠(Balb/c nu/nu雌性，Charles River，Calco，Italy，5-6周齡)。為檢測(cè)其毒性，分別按35、70、或17.5mg/Kg/天或18、36或9mg/Kg/天的劑量，每日一次給予0.4ml體積的茚地那韋和沙奎那韋，總共8天。這些劑量分別相當(dāng)于感染HIV患者每日使用的HIV-PI的完整劑量、加倍或減半劑量(Deeks等人，1997)。其中任何劑量均未觀察到器官或全身毒性。從接種bFGF前2天開始，利用70mg/Kg/天的茚地那韋(相當(dāng)于1.4mg/天)或36mg/Kg/天的沙奎那韋(相當(dāng)于1mg/天)處理小鼠，每日一次，總共7天。對(duì)照動(dòng)物利用相同體積的鹽水溶液進(jìn)行處理。第三天，如前所述，在接種之前將稀釋于0.2ml磷酸鹽緩沖液(PBS)-0.1％牛血白蛋白(BSA)的1μg重組bFGF(Roche，Mannheim，Germany)或其重懸緩沖液與0.2ml基質(zhì)膠(CollaborativeBiomedical Products，Bedford，MA)混合，在小鼠下背四分之一處皮下輸注(Ensoli等人，1994a)。4天后處死小鼠，檢查接種部位是否存在肉眼可見的KS樣血管增殖性損傷，組織切片經(jīng)H&E染色后進(jìn)行組織學(xué)檢查。對(duì)于免疫組織化學(xué)分析，冷凍的組織切片經(jīng)冷丙酮固定，用兔抗人FVIII-RA多克隆抗體(Ab)(Dako，Glostrup，Denmark；1∶2000稀釋度)或抗小鼠CD31的大鼠單克隆Ab(BD Biosciences；1∶1000稀釋度)染色。利用彩色CCD相機(jī)(Zeiss)拍攝數(shù)字圖像(200×放大倍數(shù))，并獲得相應(yīng)于完整組織切片的4-9個(gè)顯微鏡視野(每個(gè)視野大約0.15mm2)進(jìn)行分析。染色由KS300(Zeiss)圖像分析軟體定量，表示為陽(yáng)性面積占組織總面積的百分比。
表2.茚地那韋或沙奎那韋抑制bFGF和VEGF聯(lián)合誘導(dǎo)的血管增殖性KS樣損傷的形成。
血管生成因子 處理形成損傷的小鼠數(shù)目/小鼠數(shù)目bFGF0.1μg 鹽水2/4(50％)VEGF1μg 鹽水0/6(0％)bFGF0.1μg+VEGF1μg鹽水5/6(83％)茚地那韋 2/6(33％)沙奎那韋 1/6(17％)給裸鼠接種處于基質(zhì)膠中的緩沖液、bFGF、VEGF(R&D systems，Minneapolis，MN)、或bFGF和VEGF聯(lián)用，并用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理，細(xì)節(jié)如表1要點(diǎn)所述。處死時(shí)檢查注射部位是否存在肉眼可見的血管增殖性損傷，組織經(jīng)H&E染色，進(jìn)行顯微鏡分析。此處列出了相對(duì)于接種小鼠數(shù)目(No.)的形成損傷的小鼠數(shù)目(No.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。經(jīng)過(guò)茚地那韋或沙奎那韋處理，形成血管生成性KS樣損傷的小鼠數(shù)目減少(對(duì)比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢定，P＜0.05)。
表3.在尿囊絨膜分析(CAM)中，茚地那韋和沙奎那韋對(duì)bFGF或VEGF誘導(dǎo)的血管生成的作用。
血管生成因子處理(卵數(shù)) 平均血管(數(shù)目/mm2±SD)緩沖液 鹽水(23)4.39±1.12bFGF鹽水(11)13.50±3.03茚地那韋(11)8.22±2.54沙奎那韋(13)6.08±1.84VEGF鹽水(8) 13.51±2.42茚地那韋(9) 7.70±2.52沙奎那韋(7) 5.39±0.67bFGF紫杉酚(4) 7.71±1.63利用滅菌的1mm3明膠海綿(Gelfoam；Upjohn Co，Kalamazoo，MI)吸附處于5μl PBS中的bFGF或VEGF(分別為1μg或100ng)以及緩沖液、HIV-PI(10μM)或紫杉酚(250nM)(Bristol-Myers Squibb Co.，Princeton，NJ)，按所述進(jìn)行CAM分析(Ribatti等人，Int.J.Dev.Biol.，1996)。每日在Olympus SZX9立體顯微鏡下檢查CAM，直至第12天。使用冷的數(shù)字CCD Hamamatsu ORCA相機(jī)(Hamamatsu PhotonicsItalia，Arese，Italy)，在距海綿邊緣2mm處攝像(1024×1024像素)。利用ImageProPlus4.0圖像軟體(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)，每枚卵3個(gè)隨機(jī)選區(qū)(1mm3)，定量血管數(shù)目。
結(jié)果可以表示為每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下標(biāo)明的CAM數(shù)目的血管平均數(shù)/mm2±SD。所用茚地那韋、沙奎那韋或紫杉酚的劑量與所治療患者血漿中的藥物濃度類似(Sonnichsen，D.S.& Relling，M.V.，Clin.Pharmacokinet.1994，Deeks，S.G等人，JAMA1997)。單獨(dú)給予茚地那韋、沙奎那韋或紫杉酚沒(méi)有毒性，不影響基礎(chǔ)的CAM血管形成(數(shù)據(jù)略)。茚地那韋或沙奎那韋抑制血管形成在統(tǒng)計(jì)上有顯著意義(ANOVA和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)；P＜0.05)。
表4.茚地那韋和沙奎那韋對(duì)體外KS細(xì)胞的作用。
茚地那韋(μM)*沙奎那韋(μM)*KS細(xì)胞0.010.1 1 0.01 0.1 1粘附 ND ND 1.05ND ND 1增殖 1 1.081.111 1.151.25遷移 ND ND 1.03ND ND 1.21侵襲 0.980.74** 0.71** 1 0.79** 0.62***與對(duì)照相比，表達(dá)增加的倍數(shù)(1倍)**p＜0.05ND，未測(cè)定KS細(xì)胞在濃度為0.01μM-1μM的茚地那韋或沙奎那韋存在下培養(yǎng)5-7天，進(jìn)行粘附、增殖、遷移和侵襲分析。茚地那韋或沙奎那韋不抑制KS細(xì)胞粘附纖連蛋白底物的能力。同樣，利用茚地那韋或沙奎那韋處理KS細(xì)胞7天，對(duì)通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料排除法測(cè)定的細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。
茚地那韋和沙奎那韋對(duì)KS細(xì)胞的遷移均無(wú)任何影響。相反，兩種藥物均以劑量依賴方式抑制KS細(xì)胞侵襲基質(zhì)膠膜的能力(p＜0.05)。
基本上如圖2和3要點(diǎn)所述進(jìn)行遷移和侵襲分析。將在茚地那韋或沙奎那韋(0.01μM-1μM)或稀釋緩沖液存在下培養(yǎng)5天的KS細(xì)胞置于Boyden槽上層，其中始終存在HIV-PI，而將bFGF置于下層，作為趨化劑。
表5.茚地那韋或沙奎那韋對(duì)裸鼠接種KS細(xì)胞誘導(dǎo)的血管增殖性KS樣損傷的作用。
處理 注射具有肉眼可見的損傷的小鼠數(shù)目/接種小鼠的數(shù)目(％)鹽水 培養(yǎng)基 0/8(0)鹽水 KS細(xì)胞 14/14(100)茚地那韋 KS細(xì)胞 7/16(43)沙奎那韋 KS細(xì)胞 4/16(25)給裸鼠接種KS細(xì)胞(3×106)以誘導(dǎo)KS樣血管增殖性損傷形成、或接種重懸緩沖液(對(duì)照)，并在接種細(xì)胞前2天開始，按照表1要點(diǎn)所述劑量和方法，利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理，直至5天后處死。處死時(shí)檢查接種部位存在的肉眼可見的血管增殖性KS樣損傷，如表1要點(diǎn)所述。此處列出了相對(duì)于接種小鼠數(shù)目(No.)的形成損傷的小鼠數(shù)目(No.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。HIV-PI處理動(dòng)物中的血管生成性KS樣損傷減少在統(tǒng)計(jì)上有顯著意義(對(duì)比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，p＜0.001)。接種部位的組織學(xué)形態(tài)如圖23所示。
表6.茚地那韋和沙奎那韋阻斷裸鼠聯(lián)合接種bFGF和HIV-1Tat所促進(jìn)的血管增殖性KS樣損傷的形成注射 處理肉眼可見的血管損傷的數(shù)目/注射小鼠的數(shù)目(％)緩沖液鹽水溶液0/18(0％)BFGF+Tat 鹽水溶液7/10(70％)BFGF+Tat 茚地那韋5/10(50％)BFGF+Tat 沙奎那韋2/10(20％)給裸鼠接種bFGF(1μg)和Tat(10μg)以誘導(dǎo)形成KS樣血管增殖性損傷、或接種其重懸緩沖液(對(duì)照)，并用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理。處死時(shí)檢查接種部位存在的肉眼可見的血管增殖性損傷。此處列出了相對(duì)于接種小鼠數(shù)目(N.)的形成損傷的小鼠數(shù)目(N.)，以及形成損傷的小鼠的百分比(％)。
按照表1所述方法和劑量，從接種bFGF和Tat前2天開始，利用茚地那韋和沙奎那韋處理小鼠，總共7天。對(duì)照動(dòng)物利用相同體積的鹽水溶液進(jìn)行處理。第三天，在輸注之前將稀釋于0.2ml PBS-0.1％BSA的1μg重組bFGF和10μg HIV-1Tat、或其重懸緩沖液與0.2ml基質(zhì)膠混合，在小鼠下背四分之一處皮下接種，如前所述(Ensoli等人，Nature1994)。4天后處死小鼠，檢查接種區(qū)域是否存在肉眼可見的KS樣血管增殖性損傷，組織切片經(jīng)蘇木精/伊紅染色后進(jìn)行顯微鏡下檢查。
表7.茚地那韋或沙奎那韋抑制裸鼠接種EA-hy 926細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成性腫瘤形成。
處理注射具有肉眼可見的損 外部損傷大小組織染色(面積％±SD)傷的小鼠數(shù)目/接種(cm2±SD)小鼠的數(shù)目(％)FVIII-RACD31鹽水培養(yǎng)基0/8(0)0.58±0.15 0 0鹽水細(xì)胞 10/12(83.3) 0.71±0.2 2.91±1 2.30±1.7茚地那韋細(xì)胞 4/12(33.3)0.63±0.17 1.01±1.5 0.70±0.6沙奎那韋細(xì)胞 3/12(25) 0.55±0.14 0.71±0.8 0.08±0.1如上所述(參見表1要點(diǎn))，從接種細(xì)胞前2天開始，通過(guò)胃內(nèi)管飼法利用茚地那韋、沙奎那韋或鹽水溶液處理裸鼠，然后皮下注射EA-hy926細(xì)胞(3×106細(xì)胞/部位)(參見圖25要點(diǎn))。注射細(xì)胞5-6天后處死小鼠，利用卡尺測(cè)量注射部位的損傷，H&E染色后進(jìn)行顯微鏡分析或免疫組織化學(xué)分析。HIV-PI處理動(dòng)物中的血管生成性腫瘤損傷的減少在統(tǒng)計(jì)上有顯著意義(對(duì)比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，p＜0.05)。對(duì)FVIII-RA或CD31標(biāo)志進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以后，評(píng)價(jià)腫瘤相關(guān)的血管生成，如表1說(shuō)明所述。所示為利用KS300圖像分析軟件(Zeiss)定量的外部損傷大小(cm2±SD)以及染色的腫瘤組織的百分比(±SD)(參見方法)。在茚地那韋或沙奎那韋處理的小鼠中，仍存在于注射部位出現(xiàn)的殘留損傷面積較小(P＜0.05)，并顯示FVIII或CD31的低表達(dá)(P＜0.001)。
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權(quán)利要求
1.選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的至少一種化合物的用途，用于制備阻斷所需患者中選自正常、腫瘤、炎性或免疫細(xì)胞的遷移/侵襲的藥物。
2.權(quán)利要求1的用途，其中細(xì)胞遷移/侵襲導(dǎo)致組織浸潤(rùn)和/或水腫形成。
3.權(quán)利要求1-2的用途，其中阻斷活性選自阻斷內(nèi)皮細(xì)胞遷移，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷腫瘤細(xì)胞遷移，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；阻斷內(nèi)皮細(xì)胞侵襲，具有治療性抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷腫瘤細(xì)胞侵襲，具有治療性抗KS和抗腫瘤作用；阻斷炎性細(xì)胞遷移，具有治療性抗炎癥、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷免疫細(xì)胞遷移，具有治療性抗炎癥和抗自身免疫作用；阻斷炎性細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，具有治療性抗炎癥、抗自身免疫、抗血管生成、抗KS和抗腫瘤作用；阻斷免疫細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，具有治療性抗炎癥和抗自身免疫作用；阻斷與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的MMP包括MMP-2、基質(zhì)溶素、間質(zhì)溶素及其它蛋白酶或分子；阻斷活化與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的MMP及其它蛋白酶或分子的酶；阻斷與細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)的血小板反應(yīng)蛋白及其它分子；阻斷與血管生成有關(guān)的MMP包括MMP-2、基質(zhì)溶素、間質(zhì)溶素及其它蛋白酶；阻斷活化與血管生成有關(guān)的MMP及其它蛋白酶的酶；阻斷與血管生成有關(guān)的血小板反應(yīng)蛋白及其它分子；阻斷與炎性細(xì)胞和免疫細(xì)胞遷移以及組織浸潤(rùn)有關(guān)的MMP包括MMP-2、基質(zhì)溶素、間質(zhì)溶素及其它蛋白酶或分子；阻斷與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)的MMP包括MMP-2及其它蛋白酶或分子；阻斷bFGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS作用；阻斷VEGF活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；阻斷bFGF和VEGF的聯(lián)合活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫作用；阻斷Tat單獨(dú)或在bFGF存在下的活性，具有治療性抗血管生成、抗腫瘤、抗KS、抗水腫和抗炎癥作用；阻斷與血管生成有關(guān)的血管通透性和水腫；阻斷與腫瘤有關(guān)的血管通透性和水腫；阻斷與KS有關(guān)的血管通透性和水腫；阻斷與炎癥有關(guān)的血管通透性和水腫；阻斷炎性細(xì)胞因子生成，具有治療性抗炎癥作用；阻斷細(xì)胞因子生成，具有治療性抗水腫作用；阻斷細(xì)胞因子生成，具有治療性抗血管生成作用； 阻斷細(xì)胞因子生成，具有治療性抗KS作用；阻斷細(xì)胞因子生成，具有治療性抗腫瘤作用。
4.權(quán)利要求1-2的用途，其中通過(guò)抑制或調(diào)節(jié)分子和蛋白水解酶而獲得阻斷。
5.權(quán)利要求4的用途，其中蛋白水解酶是MMP。
6.權(quán)利要求1-5的用途，其中HIV-PI能夠通過(guò)抑制分子和蛋白水解酶阻斷細(xì)胞侵襲和組織浸潤(rùn)，引起抗血管生成活性，用于治療腫瘤和非腫瘤性血管增殖性疾病。
7.權(quán)利要求1-5的用途，其中HIV-PI能夠阻斷腫瘤細(xì)胞侵襲。
8.權(quán)利要求1-5的用途，其中HIV-PI能夠阻斷炎性和免疫細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，用于治療炎性和自身免疫疾病。
9.權(quán)利要求8的用途，其中HIV-PI具有抗水腫形成活性。
10.權(quán)利要求1-9的用途，其中該藥物具有抗血管生成、抗腫瘤、抗水腫形成和/或抗炎癥活性，用于治療KS、腫瘤和非腫瘤性血管增殖性、炎性和自身免疫疾病。
11.權(quán)利要求1-10的用途，其中該HIV-PI選自下列化合物，即茚地那韋、沙奎那韋、利托那韋、那非那韋、安潑那韋、洛匹那韋和利托那韋、其相應(yīng)衍生物和化學(xué)類似物及其混合物。
12.權(quán)利要求11的用途，其中該HIV-PI與抗炎癥、抗血管生成或抗腫瘤藥物聯(lián)用。
13.權(quán)利要求1-12的用途，用于感染或未感染HIV受試者中。
14.權(quán)利要求1-13的用途，按照選自口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、胸膜內(nèi)、子宮內(nèi)、透過(guò)粘膜、直腸、陰道、損傷內(nèi)或透皮給藥方式給藥。
15.權(quán)利要求1-14的用途，其中選擇以下劑量對(duì)于茚地那韋600mg/天、1200mg/天、2400mg/天和4800mg/天；對(duì)于沙奎那韋900mg/天、1800mg/天、3600mg/天、7200mg/天。
16.調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞遷移和侵襲、組織浸潤(rùn)以及與這些細(xì)胞途徑有關(guān)的分子包括MMP和血小板反應(yīng)蛋白的活性的生物過(guò)程的方法，所述方法包含給予有效量的至少一種選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化合物。
17.治療涉及細(xì)胞遷移和侵襲、組織浸潤(rùn)以及與這些細(xì)胞途徑有關(guān)的分子包括MMP和血小板反應(yīng)蛋白的活性的病理狀況的方法，所述方法包含給予治療有效量的至少一種選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化合物。
18.阻斷所需受試者中正常、腫瘤、炎性或免疫細(xì)胞侵襲、組織浸潤(rùn)和/或水腫形成的方法，所述方法包含給予治療有效量的至少一種選自HIV病毒蛋白酶抑制劑HIV-PI的化合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中通過(guò)抑制或調(diào)節(jié)分子和蛋白水解酶而獲得阻斷。
20.權(quán)利要求19的方法，其中該蛋白水解酶是MMP。
21.權(quán)利要求19的方法，其中該分子是血小板反應(yīng)蛋白。
22.權(quán)利要求18的方法，其中該HIV-PI能夠通過(guò)抑制分子和蛋白水解酶阻斷細(xì)胞侵襲和組織浸潤(rùn)，引起抗血管生成作用，用于治療腫瘤和非腫瘤性血管增殖性疾病。
23.權(quán)利要求18的方法，其中該HIV-PI能夠阻斷腫瘤細(xì)胞侵襲。
24.權(quán)利要求18的方法，其中HIV-PI能夠阻斷炎性和免疫細(xì)胞的組織浸潤(rùn)，用于治療炎性和自身免疫疾病。
25.權(quán)利要求23的方法，其中該HIV-PI具有抗水腫形成活性。
26.權(quán)利要求18的方法，其中該病理狀況選自血管生成、非腫瘤性血管增殖性病變、KS、腫瘤、炎性和自身免疫疾病。
27.權(quán)利要求17的方法，其中該病理狀況選自卡波濟(jì)氏肉瘤、血管生成；眼睛、腎臟、血管系統(tǒng)、皮膚的非腫瘤性血管增殖性疾病，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織形成、沙眼、血管性青光眼、銀屑病、免疫性和非免疫性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、瘢痕瘤；軟組織、軟骨、骨和血液的良性和惡性腫瘤；一般自身免疫疾病，特別是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、甲狀腺炎、潰瘍性直腸結(jié)腸炎和克羅恩氏病、古德帕斯徹氏綜合征、系統(tǒng)性血管炎、Sjgren氏綜合癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變；炎性疾病，特別是與變態(tài)反應(yīng)和病毒感染性、細(xì)菌或寄生物有關(guān)的慢性炎癥，包括Castleman氏多中心病。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)抑制或調(diào)節(jié)分子和蛋白水解酶，例如但不限于MMP，阻斷正常、腫瘤炎性或免疫細(xì)胞的侵襲、組織浸潤(rùn)、和/或水腫形成的方法，用于治療發(fā)病機(jī)理與上述過(guò)程有關(guān)的各種疾病，包括腫瘤、非瘤性血管增殖性疾病、炎性疾病或自身免疫疾病，該方法是基于使用HIV病毒的蛋白酶抑制劑(HIV－PI)。
文檔編號(hào)A61K31/426GK1700916SQ02812126
公開日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2002年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月18日
發(fā)明者B·恩索里 申請(qǐng)人:高等健康研究院