專利名稱：調(diào)節(jié)心臟細(xì)胞中鈣通道活性的方法及其試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及可調(diào)節(jié)心臟細(xì)胞中鈣通道活性的新肽。更具體地，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)心臟鈣通道活性的方法，該方法包括將心臟理阿諾堿受體(RyR2)接觸一定量的足以調(diào)節(jié)所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段，并測(cè)定所述鈣通道活性。本發(fā)明方法用于與心臟功能異常有關(guān)的一系列失調(diào)和疾病的治療，特別是涉及心臟細(xì)胞中減少的心輸出量和/或異常的興奮-收縮偶聯(lián)、鈣超載或鈣滲漏的疾病和失調(diào)的治療。
背景技術(shù)：
在本說明書末尾收集了本申請(qǐng)文件中參考的出版物目錄細(xì)節(jié)。不應(yīng)該將這里談及的現(xiàn)有技術(shù)，包括任意一種或多種現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)視為所述現(xiàn)有技術(shù)是澳大利亞的常識(shí)或形成了澳大利亞常識(shí)的一部分的公知或暗示。
興奮-收縮偶聯(lián)對(duì)于橫紋肌如心肌和骨骼肌發(fā)揮作用連結(jié)電興奮和機(jī)械活性是必要的。興奮-收縮偶聯(lián)的關(guān)鍵成分是二氫吡啶受體(DHPR)--一種橫小管(TT)的電壓依賴性Ca2+通道以及肌漿網(wǎng)(SR)膜的Ca2+釋放通道或理阿諾堿受體(RyR)，其打開以從SR釋放鈣到細(xì)胞質(zhì)中。
在心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中存在RyRs和DHPRs的不同同工型。特別地，在骨骼肌中RyR1和DHPR-同工型3占優(yōu)勢(shì)，在心臟細(xì)胞中RyR2和DHPR-同工型1占優(yōu)勢(shì)。在RyR1和RyR2氨基酸序列間僅有約70％的同一性。
在骨骼肌中，已知DHPRα-1亞基的重復(fù)II和III間138個(gè)氨基酸胞質(zhì)環(huán)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用激活了理阿諾堿受體(RyR1)(Tanabe等，1990，Nature 346567-568)。已經(jīng)確定足以激活骨骼肌RyR1介導(dǎo)的鈣釋放的骨骼DHPR胞質(zhì)環(huán)區(qū)域存在于Thr671到Leu690的20個(gè)氨基酸內(nèi)(E1 Hayek等，1995，J.Biol.Chem.27022116-22118；Dulhunty等，1999，Biophys.J.77189-203；和Gurrola等，1999，J.Biol.Chem.2747879-7886)。在骨骼肌，有4個(gè)DHPR分子位于DHPRs四聯(lián)體構(gòu)型中，在嚴(yán)格的幾何匹配中，與每隔開一個(gè)的RyR1多肽相對(duì)應(yīng)，認(rèn)為這對(duì)于正常的興奮-收縮偶聯(lián)是重要的。在DHPR興奮期間，如通過電刺激興奮期間，該蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能引起導(dǎo)致通道打開的RyR1多肽構(gòu)型轉(zhuǎn)換，因此引起了從SR的鈣流出。因此，骨骼肌中興奮-收縮偶聯(lián)實(shí)質(zhì)上是不依賴于鈣的過程。
相反，心肌中興奮-收縮偶聯(lián)涉及鈣誘導(dǎo)的鈣釋放(CICR)機(jī)理(Niggli，1999，Annu Rev Physiol 61311-335)。心臟DHPR鈣通道興奮后的打開，通過每個(gè)動(dòng)作電位期間激活的依賴于電壓的L-型鈣通道(即心臟DHPRs)引起了小量細(xì)胞外鈣流入到心肌細(xì)胞中。這個(gè)最初信號(hào)作為隨后貯存在SR中細(xì)胞內(nèi)鈣的CICR的觸發(fā)。通過心臟RyR2鈣釋放通道產(chǎn)生從SR的次級(jí)鈣釋放。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，CICR放大了最初信號(hào)觸發(fā)若干倍，放大倍數(shù)與約16∶1的心臟RyR2分子比心臟DHPR的化學(xué)計(jì)算法一致。
盡管心臟CICR需要胞質(zhì)Ca2+的最初升高以觸發(fā)從SR的鈣釋放，但是它似乎沒有變成自動(dòng)維持。這是因?yàn)镃ICR可能僅在超載鈣的心肌細(xì)胞間傳導(dǎo)，而鈣在單個(gè)細(xì)胞中是正常定位的。此外，在約3×10-7M[Ca2+]i和約10-6M[Ca2+]i之間，心肌收縮力隨著[Ca2+]i的增加成比例地增強(qiáng)表明CICR不是全或無應(yīng)答。
與骨骼肌細(xì)胞中興奮-收縮偶聯(lián)相比，盡管在體內(nèi)心臟DHPR和心臟RyR2間是否存在任何直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是未知的，但是在雙雜交測(cè)定中骨骼DHPRα-1亞基的胞質(zhì)環(huán)確實(shí)結(jié)合心臟RyR2(Osterland等，1999，Biophys.J.76A467-(摘要))，并且在表面胞質(zhì)共振研究中骨骼DHPRα-1亞基胞質(zhì)環(huán)的20-mer肽(即Thr671到Leu690)結(jié)合RyR2(O′Reilly和Ronjat，1999，Biophys.J76A466-(摘要))。
有力的使人信服的數(shù)據(jù)表明骨骼和心臟DHPRs和RyRs通道間的關(guān)系是不同的。例如，在缺乏骨骼RyR1但含有骨骼DHPRα-1亞基的dyspedic肌細(xì)胞中表達(dá)的心臟RyR2不能支持骨骼類型的興奮-收縮偶聯(lián)。此外，心臟或骨骼DHPRα-1亞基的重復(fù)II和III間全部的138個(gè)氨基酸胞質(zhì)環(huán)沒有激活分離的RyR2通道(Lu等，1994，J.Biol.Chem.2696511-6516)。并且，盡管骨骼DHPRα-1亞基胞質(zhì)環(huán)的20-mer肽(即Thr671到Leu690)是骨骼肌RyR1通道高親和性激活劑的事實(shí)，但是已經(jīng)表明其不誘導(dǎo)從心臟SR的Ca2+釋放，或不增強(qiáng)結(jié)合心臟RyR2通道的[3H]理阿諾堿(E1Hayek等，1995，上文)。而且，這些可用的數(shù)據(jù)表明骨骼DHPRα-1亞基胞質(zhì)環(huán)的20-mer肽(即Thr671到Leu690)不能激活心臟RyR2通道，例如延長(zhǎng)它們的開放時(shí)間或開放頻率。
Stern(1992，F(xiàn)ASEB J.63092-3100)提出了心臟組織中Ca2+突觸(即定位于進(jìn)入和釋放Ca2+位點(diǎn)附近非常高的Ca2+結(jié)構(gòu)域)功能性地連結(jié)DHPRs和RyRs活性。借助于高的局部Ca2+濃度，每個(gè)Ca2+突觸允許RyR2的局部控制以產(chǎn)生可觀察的高信號(hào)放大，而在整個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞間沒有Ca2+釋放信號(hào)的傳播。結(jié)果，可以用觸發(fā)鈣釋放定量分級(jí)每個(gè)信號(hào)期間收集的釋放單元數(shù)。這個(gè)建議與心肌細(xì)胞刺激期間短期(約50ms)鈣的激發(fā)和有限的空間傳播(約1.5μm)觀察結(jié)果相符(Cheng等，1993，Science 262740-744)。
心肌收縮衰竭是患缺血性心臟病、充血性心力衰竭和系統(tǒng)炎性狀態(tài)如膿毒病患者中發(fā)病和死亡的常見病因。累積的證據(jù)表明收縮衰竭與肌質(zhì)鈣流動(dòng)的調(diào)節(jié)障礙有關(guān)。肌絲降低的Ca2+敏感性或例如由于鈣突觸的退化或破壞、RyR2退化或DHPR退化的鈣信號(hào)傳導(dǎo)的退化可以引起心臟收縮力的衰退。在心臟衰竭或心臟肥大期間不利地影響了幾種Ca2+信號(hào)途徑(具有在心臟衰竭末期觀察到的鈣超載)。已經(jīng)觀察到衰竭或肥大心臟組織中SR中升高的靜止Ca2+濃度、降低的Ca2+瞬變幅度、減緩的張弛和改變的Ca2+泵。
更具體地，與正常心臟比較，肥大和衰竭的心臟顯示了降低的興奮-收縮偶聯(lián)效力(Gomez等，1997，Science 276755-756)。然而，衰竭或肥大心臟中單獨(dú)的DHPRs和RyRs看似正常的，表明這兩種鈣信號(hào)蛋白質(zhì)間的連結(jié)可能是缺陷的。通過應(yīng)用β-腎上腺素能激動(dòng)劑以延長(zhǎng)心臟DHPRs開放時(shí)間，恢復(fù)肥大細(xì)胞或隨后的充血性心力衰竭中正常的興奮-收縮偶聯(lián)支持了該觀點(diǎn)。
此外，衰竭的人心臟中RyR2的超磷酸化引起了缺陷的通道功能。
此外，在急性情況下如心臟病發(fā)作后，通過增強(qiáng)興奮-收縮偶聯(lián)的“心肌變力劑”可以增加心輸出量。在缺血性發(fā)病期間損害了心肌的離散區(qū)域，引起了降低的心輸出量。通過要求保持健康的心肌以更有力的收縮可以維持主要器官如大腦的血液供應(yīng)。目前這是通過模擬β-腎上腺素能刺激和增加cAMP水平以刺激DHPR活性和興奮-收縮偶聯(lián)的藥物完成的。從長(zhǎng)遠(yuǎn)的觀點(diǎn)看，增加的cAMP水平可能變成有毒的，并且引起鈣超載。
發(fā)明概述本申請(qǐng)文件包含用程序PatentIn版本3.1做成的核苷酸和氨基酸序列信息，這里在參考書目后示出了該信息。通過數(shù)字標(biāo)記<210>，隨后通過序列標(biāo)志符(例如，<210>1，<210>2等)確定了序列表中的每種核苷酸或氨基酸序列。分別通過數(shù)字標(biāo)記字段<211>，<212>和<213>中提供的信息表示序列(DNA，蛋白質(zhì)(PRT)等)的長(zhǎng)度、類型和每種核苷酸或氨基酸序列的來源組織。用后面帶有數(shù)字標(biāo)記的描述符“SEQ ID NO”定義本申請(qǐng)文件中參照的核苷酸和氨基酸序列。例如，SEQ ID NO1指標(biāo)明為<400>1的數(shù)字標(biāo)記字段中提供的信息等。
應(yīng)該理解這里SEQ ID NO1中所述共有序列的參考文獻(xiàn)為包括SEQID Nos2-7中所述任何一種或多種氨基酸序列的參考文獻(xiàn)，其中所述SEQID Nos2-7用于編輯共有序列。
在整個(gè)該申請(qǐng)文件中，除非上下文另外要求，將文字“包括”理解為意指包括規(guī)定的步驟或要素或整體，或者一組步驟或要素或整體，但不排除任何其它步驟或要素或整體，或者一組要素或整體。
應(yīng)該理解這里所用術(shù)語(yǔ)“來源于”為表示可以從特定來源獲得的特定整體，雖然該特定整體不必直接來自于該來源。
在進(jìn)行本發(fā)明的工作中，發(fā)明人試圖鑒定調(diào)節(jié)心臟組織中CICR的新方法，以提供心臟衰竭和/或心臟肥大的改進(jìn)治療方案。意外地，盡管確定了心臟DHPRs和心臟RyRs間沒有物理關(guān)系，但是本發(fā)明提供了小片段的骨骼或心臟DHPR多肽，例如小的堿性電荷肽，其能激活心臟RyR2通道。
更具體地，本發(fā)明人已經(jīng)證明骨骼DHPRα-1亞基的胞質(zhì)環(huán)20-mer肽(即Thr671到Leu690)在-40mV(負(fù)電勢(shì)誘導(dǎo)從SR的鈣釋放)產(chǎn)生了RyR2通道的顯著激活，在+40mV產(chǎn)生了強(qiáng)抑制。在顯著低于激活骨骼肌RyR1所需肽濃度的1nM低的肽濃度觀察到了心臟RyR2的激活。此外，在3×10-7M胞質(zhì)Ca2+時(shí)，心臟RyR2通道的抑制顯著大于觀察到的骨骼RyR1通道的抑制。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了調(diào)節(jié)心臟理阿諾堿受體(RyR2)鈣通道活性的方法，該方法包括用適量的足以調(diào)節(jié)所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段，例如堿性電荷片段接觸心臟RyR2。
更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)心臟理阿諾堿受體(RyR2)鈣通道活性的方法，該方法包括用適量的足以調(diào)節(jié)所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段，例如堿性電荷片段接觸心臟RyR2，測(cè)定所述心臟RyR2鈣通道的活性。
從前面討論顯而易見本發(fā)明的一種實(shí)施方案涉及增加心臟RyR2鈣通道活性的方法，該方法包括用適量的足以增加所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段接觸心臟RyR2，以及測(cè)定所述心臟RyR2鈣通道的活性。如這里所示例的，并且本發(fā)明不限于任何理論或作用方式或有效的肽濃度，本發(fā)明人已經(jīng)證明對(duì)于脂質(zhì)雙層中分離的心臟RyR2，通過應(yīng)用達(dá)到約1nM肽到約10μM肽增加了通道打開的頻率和每個(gè)通道打開的期間。在高的肽濃度時(shí)，最初打開的通道活性稍微下降，然而其它通道的活性更顯著，可能反應(yīng)了對(duì)肽敏感的RyR2通道中微不均一性。
從前面討論顯而易見本發(fā)明的另一種實(shí)施方案涉及抑制心臟RyR2鈣通道活性的方法，該方法包括用適量的足以抑制所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段接觸心臟RyR2，測(cè)定所述心臟RyR2鈣通道缺少活性。如這里所示例的，并且本發(fā)明不限于任何理論或作用方式或有效的肽濃度，本發(fā)明人已經(jīng)證明對(duì)于脂質(zhì)雙層中分離的心臟RyR2，通過高于約10μM肽的濃度降低了鈣打開的頻率，特別是在+40mV時(shí)鈣打開的頻率，這可能是在不同于通道激活期間肽結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)結(jié)合RyR2通道小孔內(nèi)的肽的結(jié)果。
本發(fā)明第二方面提供了鑒定心臟RyR2鈣通道肽調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括(i)在適于調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在功能性心臟RyR2鈣通道時(shí)，溫育適量的調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物，并測(cè)定通道活性；(ii)在適于通過所述二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在所述功能性心臟RyR2鈣通道時(shí)，溫育候選肽，并測(cè)定通道活性；(iii)比較在(i)和(ii)時(shí)的活性；和(iv)優(yōu)選(ii)中相對(duì)于(i)具有可比較或增加的調(diào)節(jié)通道活性的肽。
在可替代的實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方面提供了鑒定心臟RyR2鈣通道肽調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括(i)在適于調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在功能性心臟RyR2鈣通道時(shí)，溫育適量的調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物，并測(cè)定通道活性；(ii)在適于通過所述二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于功能性心臟RyR2鈣通道存在時(shí)，溫育候選肽和適量的調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的所述二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物，并測(cè)定通道活性；(iii)比較在(i)和(ii)的活性；和(iv)優(yōu)選(ii)中相對(duì)于(i)具有可比較或增加的通道活性調(diào)節(jié)的肽。
本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了測(cè)定心臟RyR2通道是否打開或具有高的通道打開概率的方法，所述方法包括用適量的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段或其同系物、類似物或衍生物接觸心臟RyR2通道一段時(shí)間，并且在足以出現(xiàn)結(jié)合所述通道條件下進(jìn)行，并測(cè)定所述肽與所述通道的結(jié)合，其中所述肽與所述通道的結(jié)合表示高的通道打開概率，并且其中非特異性肽的結(jié)合表示低的通道打開概率。
本發(fā)明的第四方面提供了人或動(dòng)物受試者心臟功能障礙的治療方法，該方法包括施用有效量的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段或其同系物、類似物或衍生物一段時(shí)間并且在足以出現(xiàn)增加的心臟收縮的條件下，因此矯正所述的心臟功能障礙。
本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了包含二氫吡啶受體多肽片段或其同系物、類似物或衍生物，并包含一種或多種可藥用稀釋劑的藥物組合物，其中所述肽包含在SEQ ID NOs1-10中所示的任一肽的至少約5個(gè)鄰接氨基酸殘基。
表1中定義了整個(gè)申請(qǐng)文件中所用的單個(gè)和三個(gè)字母縮寫。
表1單個(gè)和三個(gè)字母的氨基酸縮寫
附圖簡(jiǎn)述
圖1是表示如下幾種心臟和骨骼DHPR多肽胞質(zhì)環(huán)對(duì)齊氨基酸序列的示意圖人骨骼肌DHPR-3(SEQ ID NO2；Drouet等，1993)；鼠骨骼肌DHPR-3(SEQ ID NO3；Chaudhari，1992)；兔骨骼肌DHPR-3(SEQID NO4；Tanabe等，1987)；兔心臟DHPR-1(SEQ ID NO5)；大鼠心臟DHPR-1(SEQ ID NO6)；和牛蛙骨骼肌DHPR-3(SEQ ID NO7；Zhou等，1998)。根據(jù)所得序列的比較，以粗體形式表示共有序列(SEQID NO1)。也表示了稱為NB(SEQ ID NO8)和A1S(SEQ ID NO9)的非特異性肽的氨基酸序列。
圖2是表示當(dāng)在-40mV測(cè)量時(shí)，于胞質(zhì)(cis)10-7M Ca2+存在的情況下，加到脂質(zhì)雙層中分離的心臟RyR2胞質(zhì)(cis)面的骨骼DHPR胞質(zhì)環(huán)的20-mer肽(SEQ ID NO2)增加了心臟RyR2的活性的示圖。在添加的肽缺乏的情況下(小組A)或者在65nM肽(小組B)或6.5μM肽(小組C)存在的情況下，于-40mV測(cè)定了單通道活性。
在每個(gè)小組的左手側(cè)，表示在-40mV的下降的通道打開，其中通過點(diǎn)線“C”表示零電流(封閉的)水平，通過連續(xù)線“O”表示最大的單通道電導(dǎo)。在肽添加后，雙層中兩個(gè)通道在-40mV是活性的。
在每個(gè)小組的右手側(cè)是在30s記錄期間的所有點(diǎn)的圖示。X軸的數(shù)字表示通道打開的幅度，橫坐標(biāo)表示在每個(gè)幅度總的打開比例。負(fù)數(shù)表示在-40mV的負(fù)(內(nèi)部的)電流。
圖3是表示在+40mV時(shí)，于cis 10-7M Ca2+存在的情況下，加到胞質(zhì)(cis)溶液的骨骼DHPR胞質(zhì)環(huán)的20-mer肽(SEQ ID NO2)增加和然后接著降低了心臟RyR2活性的示圖。在添加的肽缺乏的情況下(小組A)或者在65nM肽(小組B)或32.5μM肽(小組C)存在的情況下，于+40mV時(shí)測(cè)定了單通道活性。
在每個(gè)小組的左手側(cè)，表示在+40mV的上升的通道打開，其中通過點(diǎn)線“C”表示零電流(封閉的)水平，通過連續(xù)線“O”表示最大的單通道電導(dǎo)。在65nM濃度時(shí)，通道大多數(shù)是處于打開的構(gòu)型。相反，在缺乏肽或在32.5μM肽時(shí)，通道大多數(shù)是處于關(guān)閉的構(gòu)型。
在每個(gè)小組的右手側(cè)是在30s記錄期間的所有點(diǎn)的圖示。X軸的數(shù)字表示通道打開的幅度，橫坐標(biāo)表示在每個(gè)幅度總的打開比例。數(shù)值表示在+40mV的通道打開。
圖4是表示在-40mV(小組A)和在+40mV(小組B)時(shí)，胞質(zhì)溶液中肽濃度(即，log10[肽nM])與平均標(biāo)準(zhǔn)化平均電流(橫坐標(biāo))的函數(shù)示圖。標(biāo)準(zhǔn)化平均電流(I’p/I’C)是肽存在情況下的平均電流(即I’p)與對(duì)照條件下肽缺乏情況的平均電流(即I’c)的比率。數(shù)據(jù)表示平均的平均電流±SEM。樣品含有SEQ ID NO2所述的骨骼DHPR胞質(zhì)環(huán)的20-mer肽(n＝8，●)，或者SEQ ID NO8所述的非特異性肽NB(n＝2，▲)，或者SEQ ID NO9所述的非特異性肽A1S(n＝3，■)。大于1.0的標(biāo)準(zhǔn)化平均電流表示肽激活心臟RyR2通道。因此，數(shù)據(jù)表示在+40mV時(shí)，10μM肽(SEQ ID NO2)，或者在-40mV時(shí)更高的濃度，顯著活化心臟RyR2通道。
圖5是增加Ca2+和咖啡因激活的Ca2+從心臟SR囊泡釋放的的題述肽的圖示。顯示了在對(duì)照條件下或隨后20μM Ca2+或2mM咖啡因添加至囊泡外溶液(在零肽濃度時(shí))，和單獨(dú)肽添加到囊泡溶液后(小符號(hào))，或在橫坐標(biāo)所述濃度時(shí)，20μM Ca2+或2mM咖啡因加肽添加到囊泡溶液后(大符號(hào))，最初的Ca2+釋放的速率。給出Ca2+釋放的速率為每分鐘SR囊泡中每毫克蛋白質(zhì)的微摩爾Ca2+。數(shù)據(jù)表示SEQ ID NO2(填充的圓形)，SEQ ID NO8(填充的方形)，SEQ ID NO9(空心的圓形)和SEQ ID NO10(空心的方形)。結(jié)果表示為平均值±sem，每個(gè)濃度至少有5個(gè)觀測(cè)值。
圖6是用100μM cis(胞質(zhì))Ca2+濃度，SEQ ID NO9對(duì)流過摻入脂質(zhì)雙層的RyR通道平均電流影響的示圖。數(shù)據(jù)獲自在-40mV(上圖)和+40mV(下圖)雙層電勢(shì)的60s記錄。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自于6個(gè)試驗(yàn)的平均相對(duì)平均電流(有肽的平均電流除以對(duì)照條件下的平均電流)，并且垂直條表示±sem。肽以濃度依賴的方式明顯地抑制通道活性，在100nM肽時(shí)有最大的影響。100nM肽在+40mV(星號(hào))時(shí)抑制顯著高于在-40mV時(shí)的抑制。
圖7是用100nM cis(胞質(zhì))Ca2+濃度，SEQ ID NO9對(duì)流過結(jié)合進(jìn)入脂質(zhì)雙層的RyR通道平均電流影響的示圖。數(shù)據(jù)獲自在-40mV(上圖)和+40mV(下圖)雙層電勢(shì)的60s記錄。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自于7個(gè)試驗(yàn)的平均相對(duì)平均電流(有肽的平均電流除以對(duì)照條件下的平均電流)，并且垂直條表示±sem。肽以濃度依賴的方式明顯地增加通道活性，在100nM肽時(shí)有最大的影響。在+40mV觀察到了＞100nM肽時(shí)的抑制，該抑制表示一些小孔閉合。
圖8是SEQ ID NO9的肽濃度對(duì)單通道參數(shù)影響的函數(shù)關(guān)系示圖。顯示了在-40mV(左側(cè)小組)和+40mV(右側(cè)小組)時(shí)的數(shù)據(jù)。上圖表示通道打開的概率，第二圖表示平均打開時(shí)間，接著是平均關(guān)閉時(shí)間，最后是通道打開的頻率。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示七個(gè)試驗(yàn)的平均參數(shù)值，垂直條表示±1sem。通道關(guān)閉時(shí)間的減少和隨后頻率的增加極大地有助于打開概率的增加。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)方面提供了調(diào)節(jié)心臟理阿諾堿受體(RyR2)鈣通道活性的方法，該方法包括用適量的足以調(diào)節(jié)所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段接觸心臟RyR2通道。
更具體地，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)心臟理阿諾堿受體(RyR2)鈣通道活性的方法，該方法包括用適量的足以調(diào)節(jié)所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段接觸心臟RyR2通道，并測(cè)定所述心臟RyR2鈣通道的活性。
這里所用術(shù)語(yǔ)“理阿諾堿受體-2通道”或“RyR2通道”或“心臟RyR通道”應(yīng)該理解為意指包含RyR2多肽亞基的鈣通道。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這里提到的“RyR2通道”或“心臟RyR通道”的物理結(jié)構(gòu)。
這里所用術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”應(yīng)該理解為意指增強(qiáng)或抑制RyR2鈣通道的活性。因此，通過“修飾RyR2鈣通道活性”或類似術(shù)語(yǔ)一般意指修飾CICR(即增強(qiáng)或降低)，例如通過修飾心臟RyR2的鈣突觸或鈣敏感性、每個(gè)動(dòng)作電位期間心臟RyR2通道打開的頻率或者單獨(dú)的心臟RyRs的打開時(shí)間。
如上文所述，本發(fā)明清楚地包括增強(qiáng)心臟RyR2鈣通道活性的方法和抑制心臟RyR2鈣通道活性的方法。
心臟RyR2通道可以原位存在于心臟細(xì)胞或在體內(nèi)心肌，然而它也可以是例如插入在脂質(zhì)雙層中分離的RyR2通道，或者備選地，是例如在轉(zhuǎn)染細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞或dyspedic肌細(xì)胞)膜中表達(dá)的重組或重建的RyR2通道?？梢杂美鏐hat等(1997，Biophys.J 731329-1336)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)RyR2通道，這里并入該篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)。優(yōu)選地，心臟RyR2通道在原位心臟細(xì)胞或在體內(nèi)心臟組織。
這里所用術(shù)語(yǔ)“片段”意指肽在生理pH值時(shí)由于相對(duì)高比例的堿性氨基酸殘基例如精氨酸或賴氨酸或半堿性氨基酸殘基組氨酸的存在而具有總體上的正電荷。優(yōu)選地，片段將有至少約25％的堿性氨基酸殘基，更優(yōu)選地至少約50％的堿性氨基酸殘基。
用在進(jìn)行這里所述本發(fā)明中的肽具有來源于心臟或骨骼二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段的至少約5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，所述多肽片段包含氨基酸序列TSAQKXXXEE(R/K)XR(R/K)K(M/L)(A/S)(R/K)XX(SEQ IDNO1)，其中X是任何氨基酸殘基。本發(fā)明清楚地延伸至使用任何來源的與SEQ ID NO1有相似序列的肽，例如合成或天然存在的肽或任何來源于DHPR序列的肽。
為了進(jìn)一步描述本發(fā)明的目的，SEQ ID NO1中所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)于幾種動(dòng)物物種骨骼肌和心肌DHPRs胞質(zhì)II-III環(huán)的20-mer肽共有序列，如圖1所示。如這里所示例的，本發(fā)明人證明了人骨骼肌DHPR-3的一部分胞質(zhì)II-III環(huán)調(diào)節(jié)綿羊RyR2通道活性。圖1中列出的各種DHPRs間密切的序列關(guān)系表示具有SEQ ID NO1序列或基本上與SEQ ID NO1相同序列的肽將調(diào)節(jié)RyR2通道活性。
因此，本發(fā)明清楚地延伸至使用SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的任何或所有同系物、類似物和衍生物的用途。優(yōu)選地，此類同系物、類似物或衍生物將是堿性電荷的肽，更優(yōu)選地其保留有SEQ ID NO1的保守堿性殘基。
甚至更優(yōu)選地，題述序列包含在SEQ ID NO1氨基酸位置11直到15的基序RKRRK。
在本發(fā)明上下文中，SEQ ID NOs1-7任何之一的“同系物”指直接來源于骨骼或心臟DHPR氨基酸序列或來自其它來源如其它物種相似序列的天然或合成的堿性電荷肽，或者備選地，通過篩選RyR2通道調(diào)節(jié)活性的模擬肽獲得的天然或合成的堿性電荷肽，并且其包含基本對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO1或SEQ ID NOs2-7中列出的任何特定氨基酸序列之一的序列。
例如，只要保持肽的總體特性(例如堿性電荷或構(gòu)象)，就可以用具有類似特性，例如疏水性、親水性、疏水力矩、抗原性、電荷或形成α螺旋結(jié)構(gòu)傾向的其它氨基酸置換SEQ ID NOs1-7任何之一的氨基酸。
置換包含氨基酸的改變，其中用不同的天然存在或非常規(guī)的氨基酸殘基置換氨基酸。用另一種類似特性的天然存在的氨基酸置換氨基酸殘基情況的這種置換可以歸類為“保守性的”，例如GlyAla，ValIleLeuMet，AspGlu，LysArg或者AsnGln。通常地，氨基酸置換是單個(gè)殘基的置換，但是也可以是成簇或分散的多個(gè)殘基的置換。
本發(fā)明特別考慮了通過本領(lǐng)域已知的任何方法，例如利用在自動(dòng)肽合成儀中的Fmoc氨基酸的固相方法生產(chǎn)合成肽的同系物?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法進(jìn)行環(huán)化和/或部分純化這種肽，這樣它們基本上不含同種的肽。
SEQ ID NOs1-7任何之一的“類似物”包含與所述序列或其同系物基本相同的氨基酸序列，盡管其中存在一種或多種非天然存在的氨基酸類似物。特別優(yōu)選的類似物包含SEQ ID NOs1-7任何之一的任何肽或非肽模擬物，該肽或非肽模擬物保留所述序列特性，例如電荷分布或構(gòu)象或其它結(jié)構(gòu)特性。本發(fā)明特別考慮了Gurrola等(1999，J.Biol.Chem.2747879-7886)描述的歐前胡素肽和任何合成的非肽模擬物。
與SEQ ID NOs1-7任何之一相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“衍生物”應(yīng)該理解為意指所述序列或其同系物或類似物的任何部分、片段或多肽融合物。衍生物包含修飾的氨基酸序列或肽，其中配體與其中含有的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基連接，所述配體例如脂質(zhì)、脂糖、脂多糖(LPS)、碳水化合物、酶、肽、放射性核素、熒光化合物、可光活化殘基(例如，對(duì)苯甲酰-苯丙氨酸)或葡糖基部分。衍生肽的方法是本領(lǐng)域熟知的。
例如，優(yōu)選的衍生物可以包含SEQ ID NOs1-7任何之一的片段或SEQ ID NOs1-7任何之一的同系物或類似物的片段。氨基酸缺失通常具有約1-15個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)度。優(yōu)選地，對(duì)SEQ ID NO1的N-末端或C-末端制造缺失。
備選地，SEQ ID NOs1-7任何之一的衍生物可以有加到肽或其同系物或類似物N-未端或C-末端的附加氨基酸殘基。一般地，插入要足夠小，如，例如1-4氨基酸殘基的插入以不阻礙進(jìn)入RyR2通道。
優(yōu)選的SEQ ID NOs1-7任何之一的同系物、類似物和衍生物將包含SEQ ID NOs1-7任何之一的至少約5個(gè)鄰接氨基酸，更優(yōu)選地至少約10個(gè)鄰接氨基酸殘基或更優(yōu)選地至少約15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。因此，與SEQ ID NOs2-7任何之一比較，這種同系物、類似物和衍生物可以是全長(zhǎng)或小于全長(zhǎng)的序列。
關(guān)于RyR2通道調(diào)節(jié)活性，除了與SEQ ID NO1具有功能性等效外，優(yōu)選的同系物、類似物或衍生物將包含與SEQ ID NO1有至少約70％同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，與SEQ ID NO1的百分比同一性將是至少約80％，更優(yōu)選地至少約90％，并且甚至更優(yōu)選地至少約95％或至少約98％或99％。在確定是否兩個(gè)氨基酸序列屬于定義的百分比同一性或相似性限制方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道進(jìn)行氨基酸序列的并排比較。在這種比較或?qū)R中，根據(jù)用于進(jìn)行該對(duì)齊的算法，在不相同氨基酸殘基的定位中將出現(xiàn)不同。在本上下文中，涉及兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列間百分比同一性或相似性應(yīng)該分別理解為意指利用任何本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)算法所測(cè)定的所述序列間相同和相似殘基數(shù)。特別地，利用Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Mladison，Wisconsin，United States of America(Devereaux等，1984，Nucl.Acids Res.12387-395)的GAP程序計(jì)算氨基酸同一性和相似性，該程序利用了Needleman和Wunsch的算法(1970，J.MolBiol.48443-453)，或者可替代地，利用Thompson等(1994，Nucl Acids Res.224673-4680)用于多重對(duì)齊的CLUSTAL W算法以最大化相同/相似氨基酸數(shù)并以最小化對(duì)齊中的序列空位數(shù)和/或長(zhǎng)度。
特別優(yōu)選的SEQ ID NO1的同系物、類似物或衍生物將成功地與SEQID NOs2-7任何之一競(jìng)爭(zhēng)對(duì)心臟RyR2通道活性的調(diào)節(jié)。在標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)研究中，在SEQ ID NO2濃縮物存在的情況下，測(cè)定被試驗(yàn)肽的不同濃度的RyR2通道調(diào)節(jié)活性，例如，增強(qiáng)或抑制心臟RyR2通道活性的RyR2通道調(diào)節(jié)活性。例如，可以通過在約10-7M到約10-5M范圍的胞質(zhì)鈣濃度時(shí)，心臟RyR2通道的高親和激活物可通過其成功地增強(qiáng)脂質(zhì)雙層中的通道活性并競(jìng)爭(zhēng)已知激活物肽(例如，約1nM SEQ ID NO2到約100nM SEQ IDNO2)誘導(dǎo)的通道活性增加的能力來確定。類似地，可以通過在約10-7M到約10-5M范圍的胞質(zhì)鈣濃度時(shí)，心臟RyR2通道的高親和抑制劑可通過其成功地抑制脂質(zhì)雙層中的通道活性并在胞質(zhì)Ca2+濃度達(dá)到10-4M競(jìng)爭(zhēng)已知抑制劑肽(例如，32.5μM SEQ ID NO2)誘導(dǎo)的通道活性抑制的能力來確定。
不以任何方式限制本發(fā)明，本發(fā)明人產(chǎn)生了如這里所述的對(duì)應(yīng)于SEQID NO2中所述人骨骼DHPR 20-mer肽序列類似物和衍生物的三種肽。詳述這些肽如下(i)SEQ ID NO8對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的20-mer肽，但是其中用丙氨酸殘基置換絲氨酸687(SEQ ID NO2的殘基17)，如下TSAQKAKAEERKRRKMARGL(SEQ ID NO8)(ii)SEQ ID NO9對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的20-mer肽，但是其中用精氨酸的D-異構(gòu)體置換精氨酸688(SEQ ID NO2的殘基18)，如下TSAQKAKAEERKRRKMSRDGL(SEQ ID NO9)(iii)SEQ ID NO10對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的20-mer肽，但是其中用丙氨酸殘基置換絲氨酸687(SEQ ID NO2的殘基17)，用精氨酸的D-異構(gòu)體置換精氨酸688(SEQ ID NO2的殘基18)，如下TSAQKAKAEERKRRKMARDGL(SEQ ID NO10)在本上下文中，例如，術(shù)語(yǔ)“接觸”可以意指將具有DHPR多肽的堿性肽片段與心臟RyR2通道接觸，使該肽與通道有密切的物理連接，而不必需要肽與通道的實(shí)際結(jié)合。盡管在實(shí)施本發(fā)明中DHPR肽可以結(jié)合RyR2通道，但是這種結(jié)合不是本發(fā)明的必要特征，因?yàn)樗枰闹皇切揎椡ǖ阑钚?。在這方面，本發(fā)明的目的不是實(shí)現(xiàn)與心臟RyR2多肽的結(jié)合，而是調(diào)節(jié)RyR2通道的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道結(jié)合和活性不必是等價(jià)的，因?yàn)镈HPR肽可以結(jié)合RyR2多肽上任何大量不同位點(diǎn)之一，而不必修飾RyR2通道的活性。
優(yōu)選地，該肽與RyR2通道的胞質(zhì)面接觸。
優(yōu)選地，在實(shí)施本發(fā)明方法期間，SEQ ID NOs1-7任何之一或SEQ IDNOs1-7任何之一的同系物、類似物或衍生物，如SEQ ID NOs8-10任何之一結(jié)合RyR2通道中RyR2多肽的一部分。不受任何理論或作用方式限制，在實(shí)施本發(fā)明中所用的肽(或其同系物、類似物或衍生物)可通過結(jié)合通道中RyR2多肽的一個(gè)或多個(gè)負(fù)電荷殘基，例如氨基酸序列FRAEKTYAVKAGRWYFEFEAVTSGDMRVGWSRPGCQP (SEQ IDNO13)中的酸性殘基，可以呈現(xiàn)獲得進(jìn)入RyR2通道的構(gòu)象。
在前述討論之后是測(cè)定心臟RyR2鈣通道的活性，僅僅測(cè)定肽或理阿諾堿與通道或RyR2多肽的結(jié)合是不充分的，盡管其一定可以形成用于確定修飾通道活性的附屬物。確定通道活性的優(yōu)選方法選自(i)利用本領(lǐng)域公知的方法，例如Ahern等(1994，F(xiàn)EBS Lett.352369-374)，Lu等(1994，J.Biol.Chem.2696511-6516)，Laver等(1995，J.Membr.Biol 1477-22)或Dulhunty等(1999)于上文中所述的方法，記錄脂質(zhì)雙層中單個(gè)或多個(gè)RyR2通道打開；(ii)利用本領(lǐng)域公知的方法，例如El-Hayek等(1995，上文)，Gurrola等(1999，上文)或Dulhunty等(1999，見上文)所述的方法，測(cè)定從SR囊泡的鈣釋放；(iii)例如根據(jù)Zaloga等(1997)，通過測(cè)定心臟的收縮性來測(cè)定心臟功能；以及(iv)利用本領(lǐng)域公知的任一測(cè)定血管緊張度的方法，在肽施用后，測(cè)定分離的胸主動(dòng)脈環(huán)的血管緊張度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可通過測(cè)定肽施用對(duì)一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的濃度相關(guān)性易于測(cè)定心臟的功能，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)選自通過dP/dtmax或dP/dtmax值、左心室收縮壓和心率估測(cè)的收縮率。也可以測(cè)定心室顫動(dòng)和或其它的心臟心率失常以定量肽的無益副作用。
在測(cè)定增強(qiáng)的心臟RyR2通道活性中，檢測(cè)增加的通道打開概率(Po)。較高的通道打開概率引起了增加的鈣流出或從SR包括從SR囊泡的釋放，以及增加的心臟收縮性和減少的張馳。也可以增加血管緊張度。
相反，心臟RyR2通道活性的抑制劑將減少通道打開概率，降低從SR的鈣釋放和減少心臟的收縮性。也可以降低血管緊張度。
不排除測(cè)定修飾心臟RyR2通道活性的其它方法。
SEQ ID NOs1-7任何之一或其同系物、類似物或衍生物(如SEQ IDNOs8-10)，特別是SEQ ID NO2在調(diào)節(jié)心臟RYR通道活性的效力證實(shí)了這種序列作為用于篩選具有結(jié)構(gòu)和功能相似性化合物的試劑的用途。這種試劑能進(jìn)行高通量的篩選測(cè)定，其中可以快速篩選數(shù)千種化合物。在脂質(zhì)雙層或在另一合適的分析體系中用分離的心臟RyR2受體可以測(cè)定這里所述的潛在地具有調(diào)節(jié)活性的肽模擬物調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的能力。
因此，本發(fā)明第二方面提供了鑒定心臟RyR2鈣通道的肽或非肽調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括(i)在適于調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在功能性心臟RyR2鈣通道時(shí)，溫育適量的調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物，并測(cè)定通道活性；(ii)在適于通過所述二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在功能性心臟RyR2鈣通道時(shí)，溫育候選的肽或非肽化合物，并測(cè)定通道活性；(iii)比較在(i)和(ii)時(shí)的活性。
優(yōu)選地，所述片段包含SEQ ID NO1肽序列的至少5個(gè)鄰接氨基酸。
優(yōu)選地，選擇對(duì)SEQ ID NO1或SEQ ID NO1同系物、類似物或衍生物具有可比較或增強(qiáng)的通道活性調(diào)節(jié)的肽。通過上文(ii)中相對(duì)于(i)檢測(cè)到的可比較或增加的通道活性調(diào)節(jié)，這種肽是可檢測(cè)的。
例如，可以向功能性受體添加調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的固定量的SEQ ID NO1或其同系物類似物或衍生物。然后在適于待調(diào)節(jié)活性的條件下溫育反應(yīng)混合物，并測(cè)定通道的活性。在平行試驗(yàn)中，在SEQ ID NO1存在時(shí)，于允許活性調(diào)節(jié)的條件下溫育候選肽或非肽化合物與心臟通道，并且測(cè)定該試驗(yàn)樣品相對(duì)于SEQ ID NO1或其同系物、類似物或衍生物活性的通道活性?？梢赃x擇與SEQ ID NO1或其同系物、類似物或衍生物比較，具有可比較或增強(qiáng)的調(diào)節(jié)活性的肽或非肽化合物。
在備選實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方面提供了鑒定心臟RyR2鈣通道肽或非肽調(diào)節(jié)劑的方法，包括(i)在適于調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在功能性心臟RyR2鈣通道時(shí)，溫育適量的調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物，并測(cè)定通道活性；(ii)在適于通過所述二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在功能性心臟RyR2鈣通道時(shí)，溫育候選的肽或非肽化合物和適量的調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的所述二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物，并測(cè)定通道活性；(iii)比較在(i)和(ii)時(shí)的活性。
優(yōu)選地，所述片段包含SEQ ID NO1肽序列的至少5個(gè)鄰接氨基酸。
在本發(fā)明這些方面的最優(yōu)選實(shí)施方案中，所述SEQ ID NO1肽或其同系物或衍生物選自SEQ ID NOs2-10的任何一種或多種。
優(yōu)選地，選擇對(duì)SEQ ID NO1或SEQ ID NO1同系物、類似物或衍生物具有可比較或增強(qiáng)的通道活性調(diào)節(jié)的肽或非肽模擬物等。通過上文在(ii)和(i)比較時(shí)檢測(cè)到的可比較或增加的通道活性調(diào)節(jié)，這些肽或非肽化合物是可檢測(cè)的。
例如，在允許出現(xiàn)調(diào)節(jié)的條件下，可以向功能性受體添加固定量的調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的SEQ ID NO1或SEQ ID NO1同系物、類似物或衍生物。在候選肽存在或缺乏的情況下，測(cè)定通道的活性，并比較樣品的通道活性。可以選擇調(diào)節(jié)SEQ ID NO1或其同系物、類似物或衍生物作用的肽或非肽化合物。
任何依賴于調(diào)節(jié)心臟RyR2通道活性的常規(guī)測(cè)定方法適于該目的。在一個(gè)優(yōu)選的測(cè)定方法中，待測(cè)樣品是在平面脂質(zhì)雙層中的重建RyR2通道或具有功能性心臟RyR2鈣通道的SR囊泡或dyspedic肌細(xì)胞。僅僅利用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以測(cè)定是否特定的候選肽、或非肽化合物調(diào)節(jié)心臟鈣通道的活性。
本發(fā)明清楚地考慮了利用具有一些耐受非特異性的快速，高通量篩選的方法，和/或具有較高特異性的較小規(guī)模功能性篩選，和/或定量的動(dòng)力學(xué)研究以闡述心臟RyR2通道的化學(xué)結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，例如心臟RyR2鈣通道功能激動(dòng)劑或拮抗劑的肽或非肽化合物的確定，或者闡釋通道中所述化合物錨定位點(diǎn)。
優(yōu)選地，本發(fā)明考慮了一種方法，其包括(i)鑒定心臟RyR2鈣通道候選激動(dòng)劑和拮抗劑；(ii)鑒定(i)中實(shí)際上激活或抑制心臟RyR2通道活性的那些化合物；(iii)確定(ii)中對(duì)所述心臟RyR2鈣通道比SEQ ID NOs1-10任何之一具有更高結(jié)合親和性的化合物；和(iv)任選地，確定(iii)中那些化合物和所述心臟RyR2鈣通道間相互作用的位點(diǎn)。
優(yōu)選地利用心肌微粒體制備物中，或者可替代地，利用在CHO細(xì)胞中或其它適合的細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)中表達(dá)的心臟RyR2鈣通道進(jìn)行鑒定心臟RyR2鈣通道候選激動(dòng)劑和拮抗劑的快速、高通量的篩選。這種高通量的篩選有利于與微粒體制備物溫育的，或注射入表達(dá)RyR2通道的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中或與表達(dá)RyR2通道的轉(zhuǎn)染細(xì)胞溫育的大量化合物的篩選。高通量的篩選也有利于文庫(kù)中表達(dá)的大量肽的篩選，其中所述文庫(kù)已經(jīng)轉(zhuǎn)染入表達(dá)RyR2通道的細(xì)胞。
可替代地，或者此外，通過將心臟RyR2蛋白質(zhì)與載體如大量聚合物針結(jié)合鑒定候選激動(dòng)劑和拮抗劑分子，并且使得大量針上的多肽與候選激動(dòng)劑和/或拮抗劑分子接觸用于篩選。可以同位素標(biāo)記被篩選分子使得結(jié)合的簡(jiǎn)便迅速檢測(cè)。可替代地，用于篩選的化合物可以與固相載體，如大量的針結(jié)合，所述用于篩選的化合物與RyR2多肽反應(yīng)。例如，通過同位素標(biāo)記或通過抗體檢測(cè)或另一種報(bào)道試劑的應(yīng)用可以再一次檢測(cè)結(jié)合。
可以通過本領(lǐng)域已知的用于測(cè)定蛋白質(zhì)-配體相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的測(cè)定方法測(cè)定特定化學(xué)化合物對(duì)心臟RyR2鈣通道的結(jié)合親和性。優(yōu)選地，利用例如表面胞質(zhì)共振的結(jié)合測(cè)定法。例如，利用BiacoreTM分析儀可以測(cè)定蛋白質(zhì)的表面胞質(zhì)共振。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，該方法提供了配體與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的開和關(guān)的速率測(cè)定的數(shù)據(jù)。
為了篩選多個(gè)候選化合物，化合物可以與大量聚合針或載體連接。
為了測(cè)定候選化合物和心臟RyR2鈣通道間相互作用的位點(diǎn)，可以測(cè)定候選化合物與多種突變體RyR2多肽的結(jié)合，其中所述突變體RyR2多肽的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)是對(duì)天然蛋白質(zhì)用不同的氨基酸序列缺失或置換，并且比較所述化合物與野生型或非突變體RyR2蛋白質(zhì)的結(jié)合。而且，可以用表面胞質(zhì)共振促進(jìn)結(jié)合親和性的比較。利用提供更強(qiáng)激活劑/拮抗劑活性的相互作用位點(diǎn)的數(shù)據(jù)有利于與此類位點(diǎn)結(jié)合的藥物的合理設(shè)計(jì)，但是藥物具有增強(qiáng)的結(jié)合親和性。
利用這種篩選方法檢測(cè)的化合物最終可以用于例如心臟功能障礙的治療中。
在可替代實(shí)施方案中，通過鑒定與心臟RyR2鈣通道立體結(jié)構(gòu)結(jié)合或連接的化合物，利用合理的藥物設(shè)計(jì)來確定激動(dòng)劑和/或拮抗劑化合物。本發(fā)明清楚地考慮了來源于心臟RyR2鈣通道立體結(jié)構(gòu)的任何化合物，該化合物結(jié)合所述通道，并且激活或抑制心臟RyR2鈣通道活性。
通過與SEQ ID NO1或其同系物、類似物或衍生物溫育來觀察對(duì)心臟RyR2通道打開概率的調(diào)節(jié)證實(shí)此類序列在確定或測(cè)定體外和體內(nèi)心臟RyR2通道的小孔結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)機(jī)制的用途。更具體地，一方面肽與RyR2結(jié)合間的相關(guān)性和通道高的打開概率，以及在通道小孔內(nèi)負(fù)電荷殘基的肽間非特異性結(jié)合的相關(guān)性和低的打開概率使得根據(jù)肽結(jié)合研究的打開概率預(yù)測(cè)成為可能。
因此，本發(fā)明的第三方面提供了測(cè)定心臟RyR2通道是否打開或有高的通道打開概率的方法，所述方法包括用適量的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段或其同系物、類似物或衍生物接觸心臟RyR2通道一段時(shí)間，并且在足以出現(xiàn)對(duì)RyR2結(jié)合的條件下進(jìn)行，并測(cè)定所述肽與RyR2的結(jié)合，其中所述肽與RyR2的結(jié)合表示高的通道打開概率，并且其中非特異性肽與通道小孔的結(jié)合表示低的通道打開概率。
優(yōu)選地，所述片段基本上是SEQ ID NOs1-10的任何一種或多種所定義的肽。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，例如，通過利用放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的肽或用報(bào)道分子標(biāo)記的肽，并且測(cè)定在任何特定肽濃度下與通道結(jié)合的標(biāo)記物或報(bào)道分子的量來測(cè)定肽結(jié)合。用于該目的的優(yōu)選的報(bào)道分子是不妨礙肽結(jié)合通道能力的小分子，例如可光活化化合物。
可替代地，可以通過測(cè)定經(jīng)通道釋放鈣測(cè)定該通道活性從而間接地確定肽結(jié)合。如這里所示例的，在約1nM和約10μM間的肽濃度時(shí)肽產(chǎn)生了高的通道開放概率，而在更高濃度的肽時(shí)產(chǎn)生了低的通道打開概率，特別是對(duì)脂質(zhì)雙層中的通道產(chǎn)生低的通道打開概率。
本發(fā)明的第四方面提供了人或動(dòng)物受試者心臟功能障礙的治療方法，該方法包括施與有效量的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段或其衍生物、同系物或類似物一段時(shí)間，并在足以出現(xiàn)增加的心臟收縮的條件下進(jìn)行，因此矯正所述的心臟功能障礙。
優(yōu)選地，所述片段包含基本上如SEQ ID NOs1-10任何一種或多種所定義肽的至少5個(gè)鄰接氨基酸。
“心臟功能障礙”是指涉及損害的心肌收縮的情況，例如其中的肌絲Ca2+敏感性降低或存在鈣信號(hào)傳導(dǎo)的退化，例如由于鈣突觸的退化或破壞，RyR2的退化或DHPR的退化。這里考慮的根據(jù)本發(fā)明可以治療的心臟功能障礙疾病包括但不限于心肌收縮衰竭、局部缺血性心臟病、系統(tǒng)炎性狀態(tài)如膿毒病、心臟肥大(鈣超載)、心肌病如致心律失常性右心室發(fā)育異常類型-2(ARVD2)以及藥物(例如，可卡因)誘導(dǎo)的心肌病、梗塞、節(jié)律障礙、充血性心力衰竭或心臟病。
“有效量”指足以減輕或逆轉(zhuǎn)功能障礙發(fā)展的肽量。
對(duì)于本發(fā)明該方面的目的，有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于可檢測(cè)到的或不可檢測(cè)到的癥狀的緩解、疾病程度的減輕、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定、疾病發(fā)展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的好轉(zhuǎn)或減輕和癥狀緩解(無論部分還是全部)?！爸委煛币舶ㄅc不接受治療受試者的期望存活比較時(shí)存活的延長(zhǎng)。這里所用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括預(yù)防。
“減輕”疾病指減少了疾病狀態(tài)的程度和/或不期望的臨床表現(xiàn)和/或通過治療減緩或延長(zhǎng)了進(jìn)展的時(shí)間過程。
在預(yù)防的上下文中，“受試者”包括但不限于約40歲或以上普通人群中的個(gè)體；并且特別是具有進(jìn)行性心臟肥大、心肌病、心臟病、高血壓、腎衰竭、血管高血壓、呼吸疾病如肺氣腫或囊性纖維化、慢性哮喘和肺結(jié)核的歷史和體質(zhì)的個(gè)體。適合的個(gè)體也包括器官移植患者。
本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了二氫吡啶受體多肽片段或其同系物、類似物或衍生物修飾心臟理阿諾堿鈣通道活性的用途，因此修飾缺陷性鈣信號(hào)傳導(dǎo)，其中所述二氫吡啶受體多肽片段包含任一個(gè)SEQ ID NOs1-10所述肽的至少約5個(gè)鄰接氨基酸殘基。
優(yōu)選地，所述缺陷的鈣信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)慢性肥大、擴(kuò)張的心肌病或心臟衰竭。
本發(fā)明的第六方面提供了二氫吡啶受體多肽片段或其同系物、類似物或衍生物在制造用于人或動(dòng)物受試者心臟功能障礙治療的藥物的用途，該二氫吡啶受體多肽片段包含任一個(gè)SEQ ID NOs1-10所述肽的至少約5個(gè)鄰接氨基酸殘基。
本發(fā)明涉及任一個(gè)SEQ ID NOs1-10或其同系物、類似物或衍生物所述肽修飾心臟RyR2鈣通道活性的用途，因此修飾慢性未接受治療的動(dòng)物或人受試者中誘導(dǎo)慢性肥大或擴(kuò)張心肌病或者甚至心臟衰竭的缺陷性鈣信號(hào)傳導(dǎo)。
優(yōu)選地，以可以增強(qiáng)收縮力，并進(jìn)一步可以增加心縮期細(xì)胞內(nèi)鈣濃度(即[Ca2+]i)，進(jìn)一步可以降低心舒期[Ca2+]i的劑量施用肽或其同系物、類似物或衍生物。優(yōu)選地，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的體外鈣敏化測(cè)定，與肽缺乏情況下測(cè)定的心縮期[Ca2+]i比較，肽或其同系物、類似物或衍生物誘導(dǎo)至少約3％或5％心縮期[Ca2+]i的增加。優(yōu)選地，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的體外鈣敏化測(cè)定，與肽缺乏情況下測(cè)定的心舒期[Ca2+]i比較，肽或其同系物、類似物或衍生物誘導(dǎo)至少約3％或5％心舒期[Ca2+]i的降低。更優(yōu)選地，在這種標(biāo)準(zhǔn)的體外鈣敏化測(cè)定中，與肽缺乏情況下分別測(cè)定的心縮期[Ca2+]i或心舒期[Ca2+]i比較，增加心縮期[Ca2+]i或降低心舒期[Ca2+]i至少約10％或15％，并且甚至更優(yōu)選地至少約20％，25％，30％，40％或50％。
甚至更優(yōu)選地，施用的肽或其同系物、類似物或衍生物改進(jìn)了心臟收縮的效力。優(yōu)選地，通過在給藥后0.5-1.0小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)至少約5％或10％前負(fù)荷-補(bǔ)充搏功(PRSW)的增加而增強(qiáng)心臟的收縮。更優(yōu)選地，與健康個(gè)體比較，心臟衰竭患者中通過所測(cè)定的PRSW增加而使心臟收縮增強(qiáng)了約15％，20％，30％，40％，50％，55％，60％或70％。
例如，可以立即施與(例如i.p或i.v)已經(jīng)患有或正在患有充血性心力衰竭或心源性休克的患者肽或其同系物、類似物或衍生物。優(yōu)選地，這種立即施用將需要施用合適劑量肽，以在患者已經(jīng)患有心力衰竭如充血性心力衰竭或心源性休克后約1，2，4，8，12或24小時(shí)內(nèi)，或一天以上到約2或3周之間增加RyR2鈣通道活性。
患者已經(jīng)患有慢性心力衰竭后，以適于活化RyR2鈣通道活性的劑量的肽，或其同系物、類似物或衍生物的相對(duì)長(zhǎng)期給藥對(duì)于提供增加的運(yùn)動(dòng)耐力和功能性能力也是有益的。例如，在已經(jīng)患有心力衰竭后，可以有規(guī)律地給患者施用肽至少2，4，6，8，12，16，18，20或24周或者更長(zhǎng)，例如6個(gè)月，1年，2年，3年或更多年以促進(jìn)增加的功能性能力。對(duì)于這種長(zhǎng)期給藥，將優(yōu)選口服劑量的劑型。
不排除以抑制人或動(dòng)物患者中心臟RyR2鈣通道活性的劑量施用肽或其同系物、類似物或衍生物，并且可以適于如需要心臟組織瞬時(shí)張馳的情況下。
可以通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中標(biāo)準(zhǔn)的藥物方法測(cè)定肽、同系物、類似物或衍生物的毒性和治療效力，例如測(cè)定LD50(群體中50％的致死劑量)和ED50(群體中50％治療有效的劑量)。毒性和治療效果間的劑量比率是治療指數(shù)，并且該指數(shù)可以表達(dá)為比率LD50/ED50。優(yōu)選SEQ ID NOs1-7中任何之一或其同系物、類似物或衍生物中具有高治療指數(shù)的氨基酸序列。
雖然顯示毒副作用或有高LD50值的肽、同系物、類似物或衍生物是不太期望的，但這種肽可以與將化合物靶向到受侵襲組織位點(diǎn)的遞送系統(tǒng)一起使用，因此最小化對(duì)健康組織的潛在損害。
可以利用獲自細(xì)胞測(cè)定和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)來計(jì)算用于人類的目標(biāo)肽的劑量范圍。Grant等(USSN 6,201,165，于2001年3月13日出版)所述的心臟肥大動(dòng)物模型對(duì)于該目的特別有用。肽、同系物、類似物或衍生物的劑量?jī)?yōu)選位于這樣的濃度范圍內(nèi)，即通過特定途徑給藥后，產(chǎn)生了與ED50一致的循環(huán)濃度并且?guī)缀鯖]有或沒有毒性。劑量范圍可以根據(jù)劑型和給藥途徑在該范圍內(nèi)變化。劑量也可以根據(jù)如個(gè)體的疾病，疾病的嚴(yán)重性，年齡，性別和體重因素而變化。
對(duì)于任何用在本發(fā)明方法中的肽、同系物、類似物或衍生物，可以從基于細(xì)胞的測(cè)定和動(dòng)物模型中最初估測(cè)治療有效的劑量。例如，可以通過動(dòng)物模型中計(jì)算的有效的劑量獲得循環(huán)血漿濃度范圍，包括從基于細(xì)胞的測(cè)定和/或整體動(dòng)物測(cè)定的IC50(即，達(dá)到對(duì)癥狀的半數(shù)最大抑制的肽或非肽化合物的濃度)。這種信息可以用于更精確地測(cè)定人的有用劑量。
也可以通過誘導(dǎo)動(dòng)物模型中的心力衰竭來測(cè)定肽或其同系物、類似物或衍生物的適合劑量，方法為長(zhǎng)期的快速心室起搏，然后以約3.3mL/min的速率灌注不同濃度的肽進(jìn)入右心房，然后記錄壓力-面積的關(guān)系以及對(duì)肽應(yīng)答的動(dòng)脈壓力。也可以利用已知的鈣敏化劑，如Marban等(USSN 6,191,136，2001年2月20日出版)所述敏化劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。也可以測(cè)定心臟養(yǎng)氣消耗。
本發(fā)明的另一方面涉及藥物組合物，其包含二氫吡啶受體多肽片段，其肽包含任一個(gè)SEQ ID NOs1-10或其同系物、類似物或衍生物的至少約5個(gè)鄰接氨基酸殘基和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用診斷和治療的已知原理獲得本發(fā)明方法檢測(cè)到的物質(zhì)在心臟功能障礙治療方面的治療效力。
治療組合物在制造和貯藏條件下必需是無菌和穩(wěn)定的。肽可以制成溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其它適于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)和其合適混合物。例如，通過包衣如卵磷脂的應(yīng)用，在分散情況下通過所需顆粒大小的維持和通過表面活性劑的應(yīng)用可以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。
通過將肽或其同系物、類似物或衍生物與脂質(zhì)或脂糖部分的連接可以實(shí)現(xiàn)吸附增強(qiáng)。
通過在組合物中包含延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鹽或明膠可以引起可注射組合物的吸收延長(zhǎng)。而且，可以通過時(shí)間釋放制劑的形式施用化合物，例如在包含緩釋或控釋聚合體的組合物中優(yōu)選包含疏水和/或兩親化合物?？梢杂帽Ｗo(hù)化合物免遭快速釋放的載體制備肽，如可控的釋放劑型，包括植入和微囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⒖缮锵嗳莸木酆衔锶缫蚁┮宜嵋蚁ァ⒕埕?、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳、聚乙二醇共聚體(PLG)。一般地，此類劑型的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
例如，如果在有玻璃轉(zhuǎn)變穩(wěn)定的玻璃狀基質(zhì)相中分散肽或蛋白質(zhì)藥物，其中所述玻璃轉(zhuǎn)變溫度高于聚(ε-己內(nèi)酯)聚合物的熔點(diǎn)溫度，例如如Wang等(USSN6,187,330)所述，通過冷凍干燥肽的水溶液和適合的熱防護(hù)劑(例如，海藻糖，松三糖，乳糖，麥芽糖，纖維二糖，蜜二糖或棉子糖)產(chǎn)生玻璃狀的基質(zhì)相時(shí)，在融化階段通過在可生物侵蝕、可生物降解的聚(ε-己內(nèi)酯)聚合物基質(zhì)中分散肽、同系物、類似物或衍生物以制備適合的控釋遞送安瓿。
可以通過在適合溶劑中混合所需量的肽、同系物、類似物或衍生物和所需的上述例舉的一種組分或組分組合，隨后通過無菌過濾制備無菌注射溶液。一般地，通過在含有堿性分散介質(zhì)和所需的上述列舉的其它組分的無菌媒介物中摻入活性肽或非肽化合物來制備分散體。在制備無菌注射溶液的無菌粉末時(shí)，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，該干燥方法產(chǎn)生了來源于其前面無菌過濾溶液的活性組分及任何額外的所需組分的粉末。
優(yōu)選地，本發(fā)明的肽、或其同系物、類似物或衍生物制劑為在施用后延長(zhǎng)其半衰期的劑型，特別是將其制成用于慢性疾病治療的劑型。延長(zhǎng)活性肽化合物半衰期的方法包括直接修飾以降低其蛋白水解作用，例如通過交聯(lián)或氨基酸置換以除去已知的蛋白酶位點(diǎn)。備選地，通過將活性成分包封入合適的劑型，例如緩釋劑型可以延長(zhǎng)任何活性組分的半衰期。根據(jù)給藥途徑，可以用保護(hù)肽、同系物、類似物或衍生物免受導(dǎo)致其失活的酶、酸和其它自然條件作用的材料包被肽、同系物、類似物或衍生物。
例如，肽，同系物、類似物或衍生物可以在合適載體或稀釋劑中與酶抑制劑，或合適的載體如脂質(zhì)體共施用而施與受試者?？伤幱孟♂寗┌}水和水緩沖溶液。酶抑制劑包括胰腺胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(DEP)和抑肽酶(trasylol)。脂質(zhì)體包括水包油包水乳劑及常規(guī)的脂質(zhì)體。
也可以在甘油、液體聚乙二醇和其混合物以及在油中制備分散體。在貯藏和使用的普通條件下，這些制品可以含有防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
也參考下面非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明。
實(shí)施例1調(diào)節(jié)心臟RYR2鈣通道活性的20-mer肽材料和方法材料化學(xué)試劑和生物試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich(Castle Hill，澳大利亞)。利用Applied Biosystems 430A肽合成儀合成DHPR II-III環(huán)肽(SEQ IDNos1-7)，利用HPLC和質(zhì)譜法和NMR純化，其純度≥98％。在水中以～2mM母液制備肽，以20μl等份冷凍。利用酸水解，隨后通過標(biāo)準(zhǔn)PTC(苯基硫代甲酰氨基)方法，通過Auspep Pty Ltd測(cè)定精確的母液濃度，并且通過反相HPLC分析。
肽用于研究的特定肽是1.DHPR II-II胞質(zhì)環(huán)的20-mer肽(SEQ ID NO2)Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met Ser Lys Gly Lea2.肽NB(II-III環(huán)B片斷的N-末端部分；Hamilton和lanuzzo，1991；SEQ ID NO11)Gly Leu Pro Asp Lys Thr Glu Glu Glu Lys Ser Val Met Ala Lys Lys Leu Glu Gln Lys3.肽A1S(混雜的20-mer肽；SEQ ID NO12)Thr Arg Lys Ser Arg Leu Ala Arg Gly Gln Lys Ala Lys Ala Lys Ser Glu Met Arg GluSR囊泡制備如Laver等(1995，J.Membr.Biol.1477-22)所述從綿羊心臟分離SR囊泡。
脂質(zhì)雙層基本上根據(jù)Ahern等(1994，F(xiàn)EBS Lett.352369-374)和Laver等(1995，J.Membr.Biol.1477-22)在20℃到25℃進(jìn)行試驗(yàn)。通過1.0ml Delrin杯壁具有約100μm直徑的孔徑(Cadillac Plastics，澳大利亞)，由磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿(5∶3∶2w/w/w)形成雙層(Avanti PolarLipids，Alabaster，Alabama)。向胞質(zhì)(即cis)室添加終池(TC)囊泡(終濃度，10μg/ml)和藥物。利用Axopatch 200A放大器(Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA)控制雙層電勢(shì)，并記錄單通道活性。為了試驗(yàn)?zāi)康?，cis室保持在底面上，并控制腔(即，trans)的電壓。雙層電勢(shì)以常規(guī)的方式表達(dá)為Vcis-Vtrans(即V胞質(zhì)-V腔)。
雙層溶液如上所述形成雙層，利用含有230mM Cs甲烷磺酸鹽(MS)，20mMCsCl，1mM CaCl2和10mM N-tris(羥甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(TES，pH7.4，有CsOH)的cis溶液和含有30mM Cs MS，20mM CsCl，lmMCaCl2和10mM TES(pH7.4)的trans溶液，將囊泡摻進(jìn)雙層中。為了防止多通道摻進(jìn)雙層，當(dāng)觀察通道活性時(shí)，通過cis室的灌注置換cis溶液。除了用1mM BAPTA緩沖的[Ca2+]是3×10-7M外，cis灌注溶液與最初的cis溶液是相同的。在通道摻入后向trans室添加CsMS(200mM)，以產(chǎn)生對(duì)稱的溶液。
記錄單通道活性和數(shù)據(jù)分析向cis室每次添加肽后每30s改變雙層電勢(shì)，進(jìn)行2分鐘以上，。向trans室添加200mM CsMS后，記錄對(duì)照活性2分鐘。每等份肽(每個(gè)通道中檢測(cè)6種不同的肽濃度)的cis添加后，記錄活性2分鐘。將肽灌注出cis室，記錄恢復(fù)。最后將通道暴露于30μM釕紅。
在1kHz過濾電流(8-電極低通Bessel，-3dB)，并且在5kHz數(shù)字化。對(duì)單通道記錄的分析(利用PW Gage和M Smith研究的通道2)產(chǎn)生了通道打開概率(P0)，事件頻率(F0)，打開時(shí)間，關(guān)閉時(shí)間和平均打開或關(guān)閉時(shí)間(T0或TC)及平均電流(I’)。在約20％最大電流，而不是通常的50％時(shí)，事件鑒頻器設(shè)定在基線噪音以上，這樣在分析中包括這種對(duì)次級(jí)傳導(dǎo)和最大傳導(dǎo)水平的打開。分析在+40mV和-40mV時(shí)的通道活性，分析連續(xù)活性的多于兩個(gè)30s期間。
統(tǒng)計(jì)分析平均數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。根據(jù)需要對(duì)單獨(dú)或成對(duì)的數(shù)據(jù)，用單邊或兩邊學(xué)生T試驗(yàn)(one sided or two sided Students T-test)測(cè)定對(duì)照和試驗(yàn)數(shù)值間差異的顯著性。
實(shí)施例2調(diào)節(jié)心臟RyR2鈣通道活性的20-mer肽結(jié)果當(dāng)濃度為10-7M cis Ca2+，向通道的胞質(zhì)(cis)側(cè)添加20-mer肽(SEQID NO2)觀察心肌RyRs活性的增加。在+40mV或-40mV雙層電勢(shì)時(shí)約450pS的Cs+傳導(dǎo)和在試驗(yàn)最后30μM釕紅阻斷通道的能力確定單通道為RyRs。
圖2所示是在-40mV和圖3所述是在+40mV時(shí)心臟RyRs強(qiáng)烈地被20-mer肽(SEQ ID NO2)激活的一個(gè)試驗(yàn)的記錄。肽添加前，通道活性由短暫的間歇性打開組成(圖2，小組A；圖3，小組A)。在添加65nM肽(SEQ ID NO2)的10s內(nèi)，在-40mV時(shí)，通道打開增加。
雙層中第二通道的打開伴隨著事件頻率的增加，非常長(zhǎng)打開的出現(xiàn)(圖2，小組B)。當(dāng)肽濃度增加到6.5μM SEQ ID NO2，在-40mV時(shí)，RyR2通道活性稍微下降，盡管第二通道活性更顯著。如圖2小組C所示，通道特別是在65nM肽時(shí)顯示了高的打開概率(Po)(如果通道充分打開，所期望的主要的電流水平，O)。
記錄表明單通道活性的增加與單通道傳導(dǎo)中任何變化無關(guān)。
當(dāng)雙層電勢(shì)是+40mV時(shí)，在65nM 20-mer肽(SEQ ID NO2)時(shí)通道活性也增加了(圖3，小組B)。然而，通道活性的增加小于-40mV時(shí)觀察到的相同通道活性的增加(圖2，小組B)。
雖然在-40mV雙層電勢(shì)的通道活性在較高肽濃度時(shí)增加，但是在+40mV時(shí)由于低的傳導(dǎo)水平，在約100nM肽濃度以上時(shí)通道打開開始下降，并且在10μM肽時(shí)觀察到僅僅幾個(gè)短暫的通道打開(圖3，小組C)。不以任何一種理論或作用方式限制本發(fā)明，認(rèn)為其中通道打開大多數(shù)由于次最大傳導(dǎo)的40mV時(shí)活性的降低是由于肽(SEQ ID NO2)與低親和性位點(diǎn)的結(jié)合，所述低親和性位點(diǎn)不同于通道激活期間肽結(jié)合的位點(diǎn)。這些低親和性位點(diǎn)可能在通道孔內(nèi)。
在8個(gè)雙層樣品的8個(gè)中獲得了脂質(zhì)雙層中心臟RyR2通道的相似激活和抑制。沒有進(jìn)行單通道分析，因?yàn)榇蠖鄶?shù)雙層含有一個(gè)以上通道。肽(SEQ ID NO2)添加到cis室后，所有樣品在+40mV和在-40mV有較高的打開頻率。此外，與在10-7M cis Ca2+時(shí)肽缺乏的情況下檢測(cè)到的相比，在肽存在的情況下，在-40mV電勢(shì)時(shí)出現(xiàn)了延長(zhǎng)的通道打開。
平均電流(即，在每個(gè)電勢(shì)和每個(gè)肽濃度時(shí)，將兩個(gè)30s期間的所有數(shù)據(jù)的平均值除以記錄中觀察到的通道數(shù))提供了通道活性的測(cè)定。圖4中平均標(biāo)準(zhǔn)化平均電流表示為肽濃度的函數(shù)。整數(shù)I’p/I’c是肽存在情況下的平均電流與向室添加肽之前平均電流的比率。在-40mV或+40mV的雙層電勢(shì)時(shí)，在10nM肽(SEQ ID NO2)中檢測(cè)到了平均電流的顯著增加(約2倍)。在-40mV時(shí)，50μM肽(SEQ ID NO2)中平均電流的增加進(jìn)一步達(dá)到4倍。相反，+40mV時(shí)10nM肽(SEQ ID NO2)加倍的標(biāo)準(zhǔn)化平均電流保持升高一直到約10μM肽，然后在更高肽濃度(即，約10μM肽和50μM肽之間)時(shí)急劇下降。
也測(cè)定了20-mer肽(SEQ ID NO2)的心臟RyR2通道活化的特異性。在1μM cis肽NB(SEQ ID NO8)或10μM cis肽NB時(shí)，在+40mV或-40mV雙層電勢(shì)時(shí)沒有觀察到修飾的通道活性(n＝3；圖4)。在其它2個(gè)雙層的2個(gè)中(圖4)，為非同源序列、與試驗(yàn)的20-mer肽具有相同等電點(diǎn)的混雜序列(即，肽A1S；SEQ ID NO9)以較高濃度(即，1μM cis肽或10μM cis肽)存在時(shí)降低了心臟RyR2通道活性。
數(shù)據(jù)提供了20-mer肽(SEQ ID NO2)的活化反映了對(duì)心臟RyR2通道的結(jié)合的強(qiáng)有力的支持。
不以任何方式限制本發(fā)明，并非意料之外的是，在+40mV時(shí)，較高濃度的20-mer肽(SEQ ID NO2)和肽AlS抑制心臟RyR活性的能力表明心臟和骨骼RyRs中的孔和其孔腔含有大量的可以與肽中正電荷殘基相互作用的負(fù)電荷位點(diǎn)。在缺乏激活的情況下，肽A1S持續(xù)抑制的事實(shí)進(jìn)一步提供了激活和抑制取決于結(jié)合RyR2通道上兩個(gè)分離位點(diǎn)的20-mer肽(SEQ ID NO2)的證據(jù)。
實(shí)施例3DHPR 20-MER片段衍生物和類似物的功能分析材料和方法肽在該系列試驗(yàn)中檢測(cè)了4種肽，它們是(i)天然DHPR 20-mer肽(SEQ ID NO2)；(ii)SEQ ID NO2肽中將Ser687(殘基17)置換為丙氨酸殘基以產(chǎn)生SEQ ID NO8；(iii)SEQ ID NO2肽中將Arg688(殘基18)置換為D異構(gòu)體以產(chǎn)生SEQ ID NO9；和(iv)SEQ ID NO2肽中Ser687突變?yōu)楸彼?，Arg688置換為D異構(gòu)體以產(chǎn)生SEQ ID NO10。
從心臟SR Ca2+釋放的測(cè)定向比色杯加入心臟SR囊泡(50μg蛋白質(zhì))，至2ml溶液的終體積，含有(以mM為單位)100，KH2PO4(pH＝7)；4，MgCl2；1，Na2ATP；0.5，antipyrylazo III。利用Cray50或者Cray100分光光度計(jì)在710nm監(jiān)測(cè)囊泡外[Ca2+]。在790nm的相同試驗(yàn)表明不依賴于[Ca2+]改變的OD沒有改變，該[Ca2+]改變將改變710nm測(cè)定的Ca2+釋放速率。用4個(gè)3μl等份的5mM CaCl2將Ca2+加載囊泡，到7.5μM Ca2+的最終濃度。然后添加毒胡蘿卜素(200nM)以阻斷SR Ca2+ATPase。最后單獨(dú)添加肽，或者添加肽和20μM Ca2+或2mM咖啡因。在毒胡蘿卜素存在的情況下，在激活劑添加前立即測(cè)定Ca2+釋放速率，在激活劑添加后立即測(cè)定Ca2+最初速率。然后添加特異的RyR活性阻斷劑5μM釕紅以證實(shí)Ca2+釋放是通過RyR通道進(jìn)行的。在試驗(yàn)最后添加Ca2+離子載體A23187(3μg/ml)以測(cè)定保留在SR囊泡中Ca2+的量。當(dāng)完成Ca2+釋放時(shí)，離子載體添加后Ca2+的瞬態(tài)表明含有不能通過RyR通道釋放的鈣的囊泡部分(推定囊泡來源于缺乏RyR通道的縱向SR)。結(jié)果表明僅僅10-20％的心臟SR制備物含有RyR的可調(diào)型貯藏。在從3個(gè)不同綿羊心臟制備物分離的囊泡上重復(fù)試驗(yàn)。
單通道試驗(yàn)在缺乏BAPTA的情況下，cis溶液中Ca2+的濃度通過向cis溶液添加CaCl2至100nM緩沖，或者調(diào)整Ca2+的濃度至100μM。
實(shí)施例4DHPR 20-MER肽片段衍生物和類似物的功能分析結(jié)果概述實(shí)施例4的試驗(yàn)包括測(cè)定所有化合物對(duì)心臟SR囊泡Ca2+釋放。此外，單心臟RyR通道暴露于肽SEQ ID NO9。所有的肽均顯著地增加了Ca2+激活的Ca2+釋放速率或咖啡因激活的Ca2+釋放速率。在缺乏激活的Ca2+或咖啡因的情況下，肽SEQ ID NO9和10在＞30μM的高濃度時(shí)勉強(qiáng)增加了Ca2+釋放速率，并且也增強(qiáng)了Ca2+激活的Ca2+釋放和咖啡因激活的Ca2+釋放。在脂質(zhì)雙層試驗(yàn)中，肽SEQ ID NO9在低濃度(1-10nM)時(shí)增加了心臟RyR的活性，但是在高濃度時(shí)，于+40mV下以電壓-和Ca2+-依賴的方式阻斷了通道孔。因此，在適合的生理?xiàng)l件下，二氫吡啶受體片段肽能結(jié)合并激活心臟Ca2+釋放通道和心臟SR的Ca2+釋放。
肽對(duì)心臟SR Ca2+釋放的作用在其它激活因子缺乏的情況下，測(cè)定SEQ ID Nos2，8，9和10從心臟SR釋放Ca2+的能力。向囊泡外溶液添加肽，并且在肽添加后立即測(cè)定最初的Ca2+釋放速率。在圖5中所示的是4種肽的平均數(shù)據(jù)(小符號(hào))。在30μM和50μM濃度時(shí)觀察到所有肽釋放速率的少量增加。
檢測(cè)了肽對(duì)Ca2+激活的Ca2+釋放和咖啡因激活的Ca2+釋放的作用。Ca2+激活是心臟收縮期間RyR激活的主要體內(nèi)機(jī)理。Ca2+激活機(jī)理與從SR囊泡的Ca2+激活和咖啡因激活的Ca2+釋放有關(guān)，因?yàn)榭Х纫虻闹饕饔檬寝D(zhuǎn)換Ca2+激活曲線至更低的Ca2+濃度。在咖啡因存在的情況下，約100nM的靜息Ca2+濃度激活Ca2+釋放。20μM Ca2+和2mM咖啡因誘導(dǎo)的Ca2+釋放的最初速率是相似的，在這些試驗(yàn)中每毫克SR蛋白質(zhì)每分鐘約釋放10μmoles的Ca2+。肽對(duì)Ca2+誘導(dǎo)的Ca2+釋放和咖啡因誘導(dǎo)的Ca2+釋放作用也是相似的，在圖5中示出了兩種激活方法獲得的數(shù)據(jù)以平均數(shù)據(jù)一起進(jìn)行的分組。清楚地，當(dāng)將4種肽的每一種肽加入到囊泡外溶液中時(shí)，它們都能增加從心臟SR囊泡的Ca2+/咖啡因激活的Ca2+釋放。在所有試驗(yàn)中，通過添加釕紅終止Ca2+釋放，表示釋放是通過RyR通道進(jìn)行的。具有4種肽的每一種肽的Ca2+釋放的最大速率比對(duì)照大2到2.5倍，在20-30μM肽時(shí)達(dá)到Ca2+釋放的最大速率。四種肽存在雙階段作用，因?yàn)樵谳^高肽濃度時(shí)，Ca2+釋放的速率傾向于下降。
在從心臟SR釋放Ca2+和增加Ca2+/咖啡因激活的Ca2+釋放方面所有的肽都顯示了相似的效力。可能是從非Ca2+/咖啡因激活通道的釋放太小了而不能獲得肽間的差異。不以任何方式限制本發(fā)明，肽對(duì)Ca2+/咖啡因激活的Ca2+釋放作用間的這種相似性已經(jīng)反映了在單獨(dú)具有激活劑的情況下，RyR通道接近最大打開的事實(shí)，因此限制了肽進(jìn)一步激活它們的能力。
肽SEQ ID NO9對(duì)單心臟RyR通道活性的作用檢測(cè)了脂質(zhì)雙層中SEQ ID NO9對(duì)單心臟RyR通道活性的作用。最初向具有100μM cis Ca2+的心臟RyR通道胞質(zhì)(cis)側(cè)添加肽。肽不能激活通道(圖6)。
當(dāng)向雙層溶液添加肽SEQ ID NO9時(shí)誘導(dǎo)的心臟RyR活性的降低在+40mV時(shí)比-40mV時(shí)要大，因此其與通過肽SEQ ID NO2進(jìn)行的骨骼RyR通道依賴電壓(即，依賴電流方向)的阻斷是相似的?；钚缘慕档团c進(jìn)入離子通道并與孔內(nèi)負(fù)電荷相作用的正電荷SEQ ID NO9肽相符。當(dāng)電流從cis到trans并且攜帶肽進(jìn)入孔時(shí)，阻斷增加，但是當(dāng)電流從trans到cis并且傾向于從孔中帶走肽時(shí)，阻斷部分反轉(zhuǎn)。
利用2mM BAPTA緩沖的100nM肽的cis Ca2+濃度。肽SEQ ID NO9對(duì)心臟通道的強(qiáng)烈激活均引起了正和負(fù)電勢(shì)時(shí)，相對(duì)平均電流的10-20倍的增加(圖7)。僅僅用10nM肽就使活性顯著增加，用100nM肽觀察到了最大的激活。在+40mV、較高肽濃度(1和10μM)時(shí)相對(duì)平均電流的下降表明肽的殘余阻斷作用。
測(cè)定了該肽對(duì)心臟RyRs的平均單通道參數(shù)的作用，圖8所示是平均數(shù)據(jù)。在-40mV時(shí)肽誘導(dǎo)了約50倍增加的打開概率，在+40mV時(shí)肽誘導(dǎo)了約10倍增加的打開概率。該活性的增加是由于在兩個(gè)電勢(shì)時(shí)平均打開時(shí)間增加了8倍以及在+40mV和-40mV時(shí)，平均關(guān)閉時(shí)間分別降低80或170倍和事件頻率的相應(yīng)增加。因此肽對(duì)通道門的主要作用是對(duì)平均關(guān)閉次數(shù)的作用。
因此，DHPR II-III環(huán)SEQ ID NO2肽可以激活心臟RyR通道并從心臟SR囊泡釋放Ca2+。不僅天然肽釋放Ca2+，具有增加的螺旋結(jié)構(gòu)，并且優(yōu)選含有RKR RK序列的幾種其它肽顯示了對(duì)Ca2+釋放的相同作用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解除了特別說明以外，這里描述的本發(fā)明是易于變化和修改的。也要理解本發(fā)明包括所有的此類變化和修改。本發(fā)明也包括本申請(qǐng)文件中單獨(dú)或一起引用的或標(biāo)明的所有步驟、特征、組合物和化合物，和所述步驟或特征的所有聯(lián)合或任何兩個(gè)或多個(gè)聯(lián)合。
本發(fā)明不限于這里描述的特定實(shí)施方案的范圍，實(shí)施方案僅僅用于示例性目的。功能性等同的產(chǎn)品、組合物和方法清楚地在這里所述本發(fā)明范圍內(nèi)。
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序列表<110>澳大利亞國(guó)立大學(xué)<120>調(diào)節(jié)心臟細(xì)胞中鈣通道活性的方法及其試劑<130>2533538/TDO<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>PRT<213>合成的DHPR 20-mer肽共有序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(21)<223>在第6位和第8位的Xaa為任一氨基酸，優(yōu)選地為Ala或Glu；在第7位的Xaa為任一氨基酸，優(yōu)選地為Glu或Lys；在第11、14和18位的Xaa為Arg或Lys；在第12位的Xaa為任一氨基酸，優(yōu)選地為Arg或Glu；在第16位的Xaa為Met，Leu，Ile或Val；在第17位的Xaa為Ala或Ser；在第18位的Xaa為L(zhǎng)ys或Arg；在第18位的Xaa為為任一氨基酸，優(yōu)選地為Gly，Thr，Ala；在第19位的Xaa為為任一氨基酸，優(yōu)選地為L(zhǎng)eu，Ala或Asn。
<400>1Thr Ser Ala Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Arg Ser Lys1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20<210>2<211>20<212>PRT<213>合成的鼠骨骼DHPR 20-mer肽<400>2Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met1 5 10 15Ser Lys Gly Leu20
<210>3<211>20<212>PRT<213>合成的鼠骨骼DHPR 20-mer肽<400>3Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met1 5 10 15Ser Lys Gly Leu20<210>4<211>20<212>PRT<213>合成的兔骨骼DHPR 20-mer肽<400>4Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met1 5 10 15Ser Arg Gly Leu20<210>5<211>20<212>PRT<213>合成的兔心臟DHPR 20-mer肽<400>5Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu1 5 10 15Ala Arg Thr Ala20<210>6<211>20<212>PRT<213>合成的大鼠心臟DHPR 20-mer肽<400>6Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu1 5 10 15Ala Arg Thr Ala20
<210>7<211>20<212>PRT<213>合成的牛蛙骨骼DHPR 20-mer肽<400>7Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu1 5 10 15Ala Arg Ala Asn20<210>8<211>20<212>PRT<213>合成的人骨骼DHPR 20-mer肽衍生物<400>8Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met1 5 10 15Ala Arg Gly Leu20<210>9<211>20<212>PRT<213>人骨骼DHPR 20-mer肽類似物<220>
<221>MISC FEATURE<222>(1)..(20)<223>X為Arg的D異構(gòu)體<400>9Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met1 5 10 15Ser Xaa Gly Leu20<210>10<211>20<212>PRT<213>人骨骼DHPR 20-mer肽類似物
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>X為Arg的D異構(gòu)體<400>10Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met1 5 10 15Ala Xaa Gly Leu20<210>11<211>20<212>PRT<213>合成肽NB<400>11Gly Leu Pro Asp Lys Thr Glu Glu Glu Lys Ser Val Met Ala Lys Lys1 5 10 15Leu Glu Gln Lys20<210>12<211>20<212>PRT<213>合成肽A1S<400>12Thr Arg Lys Ser Arg Leu Ala Arg Gly Gln LysAla Lys Ala Lys Ser1 5 10 15Glu Met Arg Glu20<210>13<211>37<212>PRT<213>合成的RyR2肽<400>13Phe Arg Ala Glu Lys Thr Tyr Ala Val Lys Ala Gly Arg Trp Tyr Phe1 5 10 15Glu Phe Glu Ala Val Thr Ser Gly Asp Met Arg Val Gly Trp Ser Arg20 25 30
Pro Gly Cys Gln Pro3權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)心臟理阿諾堿受體鈣通道活性的方法，該方法包括將心臟理阿諾堿通道接觸一定量的足以調(diào)節(jié)所述理阿諾堿通道活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段或其衍生物、同系物或類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括測(cè)定所述心臟理阿諾堿鈣通道活性的額外步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述調(diào)節(jié)是正調(diào)節(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中以約1nm至約10μM的濃度范圍應(yīng)用所述片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述調(diào)節(jié)是負(fù)調(diào)節(jié)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中以大于約10μM的濃度應(yīng)用所述片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段包含下列肽序列的至少5個(gè)鄰接的氨基酸殘基Thr Ser Ala Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Arg Ser LysXaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ ID NO1)
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQ ID NO3)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerArg Gly Leu(SEQ ID NO4)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO5)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO6)(v) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu AlaArg Ala Ash(SEQ ID NO7)
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述肽序列包含基序RKRRK。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一或其衍生物、同系物或類似物(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQ ID NO2)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met AlaArg Gly Leu(SEQ ID NO8)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerXaa Gly Leu(SEQ ID NO9)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met AlaXaa Gly Leu(SEQ ID NO10)
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含至少10個(gè)鄰接氨基酸殘基，且更優(yōu)選地包含至少15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述片段為堿性電荷片段。
13.一種鑒定心臟理阿諾堿鈣通道肽或非肽調(diào)節(jié)劑的方法，包括(i)在適于調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在功能性心臟理阿諾堿鈣通道時(shí)，溫育一定量的調(diào)節(jié)心臟理阿諾堿通道活性的二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物，并測(cè)定通道活性；(ii)在適于通過所述二氫吡啶受體多肽或其同系物、類似物或衍生物調(diào)節(jié)鈣通道活性的條件下，于存在所述功能性心臟理阿諾堿鈣通道時(shí)，溫育候選肽或非肽化合物，并測(cè)定通道活性；(iii)比較在(i)和(ii)時(shí)的活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述調(diào)節(jié)是正調(diào)節(jié)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中以約1nm至約10μM的濃度范圍應(yīng)用所述的片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述調(diào)節(jié)是負(fù)調(diào)節(jié)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中以大于約10μM的濃度應(yīng)用所述片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段包含下列肽序列Thr Ser Ala Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Arg Ser LysXaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ ID NO1)
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQ ID NO3)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerArg Gly Leu(SEQ ID NO4)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO5)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO6)(v) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu AlaArg Ala Asn(SEQ ID NO7)
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述肽序列包含基序RKRRK。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一或其衍生物、同系物或類似物(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQID NO2)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lts Met AlaArg Gly Leu(SEQ ID NO8)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerXaa Gly Leu(SEQ ID NO9)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met AlaXaa Gly Leu(SEQ ID NO10)
22.根據(jù)權(quán)利要求13-21中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含至少10個(gè)鄰接氨基酸殘基，且更優(yōu)選地包含至少15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述片段為堿性電荷片段。
24.包括下列步驟的一種方法(i)鑒定心臟理阿諾堿鈣通道的候選激動(dòng)劑和拮抗劑；(ii)確定(i)中實(shí)際上激活或抑制心臟理阿諾堿通道活性的那些化合物；(iii)確定(ii)中對(duì)所述心臟理阿諾堿鈣通道較SEQ ID NOs1-10中任何之一具有更高結(jié)合親和性的化合物；和(iv)任選地，確定(iii)中那些化合物和所述心臟理阿諾堿鈣通道間相互作用的位點(diǎn)。
25.一種確定心臟理阿諾堿通道是否打開或有高的通道打開概率的方法，所述方法包括將心臟理阿諾堿通道接觸一定量的二氫吡啶受體多肽片段一段時(shí)間，在足以產(chǎn)生與理阿諾堿結(jié)合的條件下進(jìn)行，并測(cè)定所述肽與理阿諾堿的結(jié)合，其中所述肽與理阿諾堿的結(jié)合表示高的通道打開概率，且其中肽與通道孔的非特異性結(jié)合表示低的通道打開概率。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述片段包含下列肽序列的至少5個(gè)鄰接氨基酸殘基Thr Ser Ala Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Arg Ser LysXaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ ID NO1)
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQ ID NO3)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerArg Gly Leu(SEQ ID NO4)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO5)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO6)(v) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu AlaArg Ala Asn(SEQ ID NO7)
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述肽序列包含基序RKRRK。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一或其衍生物、同系物或類似物(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQ ID NO2)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met AlaArg Gly Leu(SEQ ID NO8)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerXaa Gly Leu(SEQ ID NO9)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met AlaXaa Gly Leu(SEQ ID NO10)
30.根據(jù)權(quán)利要求25-29中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含至少10個(gè)鄰接氨基酸殘基，且更優(yōu)選地包含至少15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述片段為堿性電荷片段。
32.一種對(duì)人或動(dòng)物受試者心臟功能障礙的治療方法，該方法包括施用有效量的二氫吡啶受體多肽片段一段時(shí)間并在足以出現(xiàn)增強(qiáng)的心臟收縮的條件下施用，由此矯正所述的心臟功能障礙。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述心臟功能障礙為心肌收縮衰竭、局部缺血性心臟病、系統(tǒng)炎性狀態(tài)如膿毒病、心臟肥大(鈣超載)、心肌病如致心律失常性右心室發(fā)育異常類型-2(ARVD2)以及藥物(例如可卡因)誘導(dǎo)的心肌病、梗塞、節(jié)律障礙、充血性心力衰竭或心臟病。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的方法，其中所述片段包含下列肽序列的至少5個(gè)鄰接氨基酸殘基Thr Ser Ala Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Arg Ser LysXaa Xaa Xaa Xaa Xaa(SEQ ID NO1)
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQ ID NO3)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerArg Gly Leu(SEQ ID NO4)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO5)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Arg Lys Lys Leu AlaArg Thr Ala(SEQ ID NO6)(v) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu AlaArg Ala Asn(SEQ ID NO7)
36.根據(jù)權(quán)利要求32或33的方法，其中所述肽序列包含基序RKRRK。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述肽序列對(duì)應(yīng)于下列肽序列的任何之一或其衍生物、同系物或類似物(i) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerLys Gly Leu(SEQ ID NO2)(ii) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met AlaArg Gly Leu(SEQ ID NO8)(iii)Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met SerXaa Gly Leu(SEQ ID NO9)(iv) Thr Ser Ala Gln Lys Ala Lys Ala Glu Glu Arg Lys Arg Arg Lys Met AlaXaa Gly Leu(SEQID NO10)
38.根據(jù)權(quán)利要求32-37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含至少10個(gè)鄰接氨基酸殘基，更優(yōu)選地包含至少15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述片段為堿性電荷片段。
40.二氫吡啶受體肽片段或其同系物、類似物或衍生物的用途，用于修飾心臟理阿諾堿鈣通道活性，因此修飾缺陷性鈣信號(hào)傳導(dǎo)，其中所述二氫吡啶受體肽片段包含SEQ ID NOs1-10所示的任一肽的至少約5個(gè)鄰接氨基酸殘基。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的用途，其中所述肽包含至少10個(gè)鄰接氨基酸殘基，更優(yōu)選地包含至少15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41的用途，其中所述缺陷性鈣信號(hào)傳導(dǎo)誘發(fā)慢性肥大、擴(kuò)張的心肌病或心臟衰竭。
43.根據(jù)權(quán)利要求40或41的用途，其中所述肽或其同系物、類似物或衍生物以增強(qiáng)收縮力，并進(jìn)一步增強(qiáng)心縮期細(xì)胞內(nèi)鈣濃度(即[Ca2+]i)和進(jìn)一步降低心舒期[Ca2+]i的劑量施用。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的用途，其中所述肽或其同系物、類似物或衍生物與心縮期[Ca2+]i比較，誘導(dǎo)至少約3％或5％的心縮期[Ca2+]i的增加。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的用途，其中所述肽或其同系物、類似物或衍生物與心舒期[Ca2+]i比較，誘導(dǎo)至少約3％或5％的心舒期[Ca2+]i的降低。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或45的用途，其中分別相對(duì)于心縮期[Ca2+]i或心舒期[Ca2+]i，所述心縮期[Ca2+]i增加或心舒期[Ca2+]i降低了至少約10％或15％，且更優(yōu)選地至少約20％，25％，30％，40％或50％。
47.根據(jù)權(quán)利要求40-46中任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述施用的肽誘導(dǎo)心臟收縮效力的改進(jìn)。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中在施用后0.5-1.0小時(shí)內(nèi)，通過誘導(dǎo)前負(fù)荷-補(bǔ)充搏功增加至少約5％或10％而增強(qiáng)所述心臟收縮。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的用途，其中所述心臟收縮增強(qiáng)了約15％，20％，30％，40％，50％，55％，60％或70％。
50.二氫吡啶受體多肽片段或其同系物、類似物或衍生物用于制備治療人或動(dòng)物受試者心臟功能障礙的藥物的用途，該二氫吡啶受體多肽片段包含SEQ ID NOs1-10所示的任一肽的至少約5個(gè)鄰接氨基酸殘基。
51.根據(jù)權(quán)利要求51的用途，其中所述心臟功能障礙為心肌收縮衰竭、局部缺血性心臟病、系統(tǒng)炎性狀態(tài)如膿毒病、心臟肥大(鈣超載)、心肌病如致心律失常性右心室發(fā)育異常類型-2(ARVD2)以及藥物(例如可卡因)誘導(dǎo)的心肌病、梗塞、節(jié)律障礙、充血性心力衰竭或心臟病。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51的用途，其中所述肽包含至少10個(gè)鄰接氨基酸殘基，且更優(yōu)選地包含至少15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。
53.一種藥物組合物，其包含二氫吡啶受體多肽片段或其同系物、類似物或衍生物以及包含一種或多種可藥用載體和/或稀釋劑，其中所述肽段包含SEQ ID NOs1-10所示的任一肽的至少約5個(gè)鄰接氨基酸殘基。
54.根據(jù)權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述肽包含至少10個(gè)鄰接氨基酸殘基，且更優(yōu)選地包含至少15-20個(gè)鄰接氨基酸殘基。
55.當(dāng)根據(jù)權(quán)利要求32-39中任意一項(xiàng)所述方法使用時(shí)的權(quán)利要求53或54的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及可調(diào)節(jié)心臟細(xì)胞中鈣通道活性的新肽。更具體地，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)心臟鈣通道活性的方法，該方法包括將心臟理阿諾堿受體(RyR2)接觸一定量的足以調(diào)節(jié)所述RyR2活性的二氫吡啶受體(DHPR)多肽片段，并測(cè)定所述鈣通道活性。本發(fā)明方法用于與心臟功能異常有關(guān)的一系列失調(diào)和疾病的治療，特別是涉及心臟細(xì)胞中減少的心輸出量和/或異常的興奮－收縮偶聯(lián)、鈣超載或鈣滲漏的疾病和失調(diào)的治療。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1516596SQ02812056
公開日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2002年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月17日
發(fā)明者A·F·杜爾漢提, A F 杜爾漢提, M·G·卡薩羅托, 卡薩羅托 申請(qǐng)人:澳大利亞國(guó)立大學(xué)