一種具備鈣通道抑制功能的動物活性肽的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具備哺乳動物N-型鈣通道抑制功能的活性多肽-蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的鑒定方法。該活性多肽純化凍干粉為類白色疏松體，極易溶解于水，無氣味，水溶液近于無色透明；通過大鼠輸精管實驗鑒定SPAP-XVI的組織水平生物學活性，發(fā)現(xiàn)SPAP-XVI能快速和可逆地抑制低頻率電刺激誘導的大鼠輸精管收縮，抑制呈濃度依賴性，它的半數(shù)有效抑制濃度（IC50）是85±6nM；通過膜片鉗電生理實驗鑒定SPAP-XVI對鈣通道的影響，發(fā)現(xiàn)SPAP-XVI抑制大鼠DRG神經(jīng)元N-型鈣通道具有濃度依賴性和時間依賴性，它的IC50值是60±5nM；10μMSPAP-XVI能夠迅速抑制N-型電流(τon～28.3±2.3s)。SPAP-XVI能夠抑制大鼠DRG神經(jīng)元上GVIA敏感的N-型鈣通道，它的低毒性和可逆性使之有希望成為開發(fā)治療N-型鈣通道相關疾病的模板分子。
【專利說明】一種具備鈣通道抑制功能的動物活性肽的鑒定方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具備哺乳動物N-型鈣通道抑制功能的活性多肽一蜘蛛抑痛 肽-XVI (SPAP-XVI)的鑒定方法。

【背景技術】
[0002] 鈣離子作為細胞內(nèi)重要的第二信使，對于信號傳導、興奮一收縮藕聯(lián)、分泌、突 觸傳遞、基因表達調(diào)控具有非常重要的作用。電壓門控鈣通道廣泛存在于機體的不同類型 組織細胞中，參與神經(jīng)、肌肉、分泌、生殖等系統(tǒng)的生理過程。根據(jù)電壓門控鈣通道的電生理 和藥理學特征，可將電壓門控鈣通道分為低閾值（LVA)和高閾值（HVA)兩大類。其中低閾 值鈣通道主要包括T-型鈣通道，高閾值鈣通道主要包括有N-型、L-型、P/Q-型和R-型四 類。其中N-型鈣通道僅發(fā)現(xiàn)存在于神經(jīng)組織中，主要觸發(fā)遞質(zhì)的釋放，與疼痛的傳遞密切 相關。蜘蛛產(chǎn)生各種作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒素，其神經(jīng)毒素根據(jù)它們的化學結構分為蛋 白多肽類神經(jīng)毒素和多胺類神經(jīng)毒素。其中蜘蛛多肽神經(jīng)毒素最重要，蜘蛛多肽類神經(jīng)毒 素根據(jù)它們的功能和分子特征可分為兩種類型：第一種是低分子量多肽類，它們能與興奮 性細胞膜上的陽離子通道相互作用；第二種是高分子量多肽類，它們與突觸前膜的受體組 分及增強神經(jīng)介質(zhì)的分泌作用密切相關。蜘蛛毒液已成為神經(jīng)毒素的一個重要新來源，而 且蜘蛛毒液中特異性藥物和毒素分子也是我們尋找農(nóng)業(yè)殺蟲劑的較好模式分子。
[0003] SPAP-XVI的分子量約為4437. 4 Da，經(jīng)序列測定，該多肽的一級結構由39個氨基 酸殘基組成，其中含6個半胱氨酸并形成三對二硫鍵。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在于提供一種從蜘蛛毒液中鑒定哺乳動物N-型鈣通道抑制劑蜘蛛抑痛 肽-XVI (SPAP-XVI)的方法。其特征在于： (1) 大鼠輸精管實驗研究SPAP-XVI的組織水平生物學活性：大鼠處死后立即取出長 約2厘米的輸精管，并置于預先用95% 02/5% C02飽和的克氏液，輕柔的擠出輸精管的內(nèi)容 物。將輸精管的兩端分別與34°C恒溫的浴槽的底部和換能器相連接，立即將標本置于浴槽 中，通過分布于浴槽兩端的電極向輸精管施加脈沖電場刺激（波寬：0.14 ms,強度：100 V，周期：15 s)誘導輸精管收縮；平衡30 min后進行SPAP-XVI的藥理學試驗； (2) 膜片鉗電生理活性實驗檢測SPAP-XVI對電壓門控鈣通道的影響： ①急性分離和原代培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞用于膜片鉗電生理活性實驗；SD大白鼠 處死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿與肋骨平面垂直的方向?qū)⒆倒芗糸_，并浸泡在盛有少量 細胞培養(yǎng)液的燒杯中；用鑷子撕破附在椎管內(nèi)壁上的一層黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交 匯處的背根神經(jīng)纖維。在胸腰椎段，可挑選16個左右并置入盛有2 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中； 在解剖顯微鏡下，用維娜斯剪和尖頭鑷子分離出神經(jīng)節(jié)。剝離包在節(jié)外的絮狀物和軸索后， 放入盛有約0.5 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。用吸管吸去液體，將分離好的所有神經(jīng)節(jié)剪碎。剪 碎之后，轉(zhuǎn)入消化液，在34°C、震蕩頻率110 rpm的環(huán)境中進行酶解消化反應20 min ;期間 每隔10 min取出用移液槍吸打數(shù)次；向消化液中加入酶的抑制劑，終止酶解處理過程；無 菌操作將消化得到的細胞液轉(zhuǎn)入離心管中進行離心（800 rpm、5 min)，去上清，加入8 mL含 10%小牛血清的長期培養(yǎng)液；重懸細胞后分成3?4皿，放入培養(yǎng)箱（5%C02、95%空氣）中， 37°C培養(yǎng)3?4 h貼壁； ②膜片鉗電生理活性實驗：膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，采用全細胞膜片鉗技術。 挑選質(zhì)膜光滑可見、胞質(zhì)均勻的DRG細胞作為實驗細胞；電流記錄通過全細胞膜片鉗技術 利用放大器EPC9在電腦上進行。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管。玻璃電極兩步拉制 而成，經(jīng)拋光儀拋光后電極尖端直徑約為3 _，充灌電極液后電極電阻為1-3ΜΩ ;實驗細 胞形成全細胞記錄模式后穩(wěn)定4?6 min;記錄電流經(jīng)EPC-9放大器10 kHz濾波過濾。線 性漏電流和電容電流用p/4程序予以刪除，數(shù)據(jù)和圖形用pulsefit + pulse 8. 0軟件采 集分析；實驗結果用Sigmaplot9. 0軟件進行分析。
[0006] 本發(fā)明所述的SPAP-XVI的化學結構式如圖1所示，其中C為半胱氨酸，I為異亮 氨酸，G為甘氨酸，E為谷氨酸，V為纈氨酸，P為脯氨酸，D為天冬氨酸，N為天冬酰胺，R為 精氨酸，S為絲氨酸，L為亮氨酸，K為賴氨酸，T為蘇氨酸，Η為組氨酸，W為色氨酸，Y為酪 氨酸。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1是蜘蛛抑痛肽-XVI的化學結構。
[0008] 圖2是1 μΜ SPAP-XVI對大鼠輸精管收縮的影響。1 μΜ SPAP-XVI能快速抑制低 頻率電刺激誘導的大鼠輸精管收縮，而且這種抑制作用是可逆的。
[0009] 圖3是SPAP-XVI抑制大鼠輸精管收縮的濃度依從性。濃效曲線均用Hill方程進 行擬合得出IC5Q。方程y=l-(l-/：axV(l + ([X] /IQ。)，中，z代表毒素濃度，IC5Q代表毒 素半數(shù)有效抑制濃度，/?是Hi 11常數(shù)。
[0010] 圖4是10 mM SPAP-XVI對低電壓激活鈣電流的影響。
[0011] 圖5是10 mM SPAP-XVI能明顯抑制高電壓激活鈣電流。
[0012] 圖6是SPAP-XVI不能進一步阻斷GVIA-不敏感的電流。
[0013] 圖7是在細胞外液中存在SPAP-XVI時，GVIA不能抑制電流。
[0014] 圖8是MVIIA可阻斷部分SPAP-XVI不敏感鈣電流。
[0015] 圖9是SPAP-XVI對鈣通道電流-電壓關系（I-V curve)的影響。
[0016] 圖10是SPAP-XVI抑制N-型鈣通道的濃度依賴性。圖中每個點的數(shù)據(jù)來自于5? 8個實驗細胞，用平均值土標準誤（mean土S. E.)來表示。濃度曲線均用Hill方程進行擬 合得出IC5Q。方程y=l-(l-/maxV(l + ([X] /IC5Qn中，z代表毒素濃度，IC5Q代表毒素半 數(shù)有效抑制濃度，~是Hill常數(shù)。
[0017] 圖11是SPAP-XVI抑制N-型鈣通道的時間依從性。

【具體實施方式】
[0018] 為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過大鼠輸精管實驗，大鼠背根神 經(jīng)節(jié)細胞的急性分離和原代培養(yǎng)以及膜片鉗電生理活性實驗來說明SPAP-XVI的鑒定方 法。
[0019] 、實驗材料和方法 1. 1實驗用主要原料 實驗用SPAP-XVI是從蜘蛛粗毒中分離純化而得到，同時通過RP-HPLC和MALDI-T0F 質(zhì)譜儀鑒定，其純度為98%以上；SD實驗大鼠由中南大學湘雅醫(yī)學院動物房提供，體重 160-210 g 之間。
[0020] 1.2大鼠輸精管實驗： 大鼠輸精管標本制備方法：雄性大鼠經(jīng)斷頭處死后立即取出長約2厘米的輸精管， 并置于預先用 95% 02/5% C02 飽和的克氏液（mM:NaCl 119.0，KC1 4.7，CaCl22.5，MgS041· 2, NaHC03 2.5, ΚΗ2Ρ04 1.2，glucose 11，EDTA 0.026, pH 7.3)中，輕柔的擠出輸精管的 內(nèi)容物。將輸精管的兩端分別與32°C恒溫的5 ml浴槽的底部和換能器連接，立即將標 本置于浴槽中，通過lg砝碼定標輸精管的拉伸長度。通過分布于浴槽兩端的電極向輸精 管施加脈沖電場刺激（波寬：0.14 ms，強度：100V，周期：15 s)誘導輸精管收縮。在平衡 30min后進行藥理學試驗。通過測定SPAP-XVI阻斷電刺激誘導的輸精管收縮的時間，確定 SPAP-XVI的生物學活性。
[0021] 1. 3大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞的急性分離和原代培養(yǎng)： 挑選出生4周左右、體重120?200 g的SD大白鼠，斷頸處死后，用剪子迅速取出脊椎 并剪成2?3段，再沿與肋骨平面垂直的方向?qū)⒆倒芗糸_，并浸泡在盛有少量培養(yǎng)液的燒杯 中；用鑷子撕破附在椎管內(nèi)壁上的一層黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交匯處的背根神經(jīng)纖 維。在胸腰椎段，可挑選16個左右并置入盛有2 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；在解剖顯微鏡下，用 維娜斯剪和尖頭鑷子分離出神經(jīng)節(jié)。剝離包在節(jié)外的絮狀物和軸索后，放入盛有約0.5 mL 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。用吸管吸去液體，將分離好的所有神經(jīng)節(jié)剪碎，越碎越好。剪碎之后， 轉(zhuǎn)入消化液，在34°C、震蕩頻率110 rpm的環(huán)境中進行酶解消化反應20 min。期間每隔10 min取出用移液槍吸打數(shù)次；向消化液中加入酶的抑制劑，終止酶解處理過程。無菌操作將 消化得到的細胞液轉(zhuǎn)入離心管中進行離心（800 rpm、5 min),去上清，加入8 mL含10%小牛 血清的長期培養(yǎng)液。重懸細胞后分成3?4皿，放入培養(yǎng)箱（5%C02、95%空氣）中，37°C培 養(yǎng)3?4 h貼壁。使用Ba2+作為Ca2+的電荷替代物，鈣通道電流（ICa)的大小通過測得I Ba值來確定。實驗中的細胞外液（in mM): 160 TEA-C1，10 HEPES，2 BaCl2，10 glucose, 和 200nM TTX，用 TEA-OH 調(diào)節(jié) pH 到 7· 4 ;細胞內(nèi)液（in mM) : 120 CsCl, 5 Mg-ATP，0· 4 Na2-GTP，10EGTA，20HEPES-Cs0H，調(diào)節(jié)pH到7·2。
[0022] 1. 4膜片鉗電生理活性實驗： 膜片鉗實驗均在室溫（25土 1°C )進行，采用全細胞膜片鉗技術。挑選質(zhì)膜光滑可見、胞 質(zhì)均勻的DRG細胞作為實驗細胞。電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用放大器EPC9 (HEKA 公司，German)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8. 0軟件。 玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管(南京泉水教學實驗器材廠)。玻璃電極兩步拉制而成， 經(jīng)拋光儀（Narishige, Japan)拋光后電極尖端直徑約為3 mm,充灌電極液后電極電阻為 1-3ΜΩ。膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，整個實驗過程中溫度的變動最多上下不超過 2°C。采用SigmaPlot 9. 0軟件分析實驗結果。
[0023] 、實驗結果與分析 2. 1 SPAP-XVI對整體動物和大鼠輸精管的影響 小鼠腹腔注射大劑量（5 mg/kg體重)的SPAP-XVI后，未觀察到異常的生理反應。同樣 美洲蜚蠊腹腔注射200 mg/g SPAP-XVI也未發(fā)現(xiàn)異常的生理反應。與空白對照相反，1 μΜ SPAP-XVI能快速抑制低頻率電刺激誘導的大鼠輸精管收縮，而且這種抑制作用是可逆的， 用空白溶液沖洗標本后，輸精管的收縮能在數(shù)分鐘后恢復到對照水平（圖2)。我們進一步 檢測了不同濃度SPAP-XVI對大鼠輸精管收縮的抑制作用，發(fā)現(xiàn)SPAP-XVI對大鼠輸精管收 縮的抑制呈濃度依賴性，它的半數(shù)有效抑制濃度（IC5Q)是85±6 nM (圖3)。上述結果表明 SPAP-XVI能抑制大鼠輸精管交感神經(jīng)末梢上的N-型鈣通道。
[0024] 2. 2 SPAP-XVI對大鼠背根神經(jīng)細胞電壓門控鈣通道的影響 我們選用大鼠背根神經(jīng)神經(jīng)元作為研究對象檢測了 SPAP-XVI對大鼠 DRG細胞電壓門 控鈣通道的作用。根據(jù)生理和藥理學特性電壓門控鈣通道可分為N、L、P/Q、R、T型。根據(jù) 其通道激活電壓閾值可分為兩類：高電壓激活（HVA)鈣通道和低電壓（LVA)激活鈣通道。 其中HVA鈣通道包括：N-，L-，P/Q-，R-型鈣通道，而T-型鈣通道屬于LVA鈣通道。10 μΜ SPAP-XVI對低閾值激活鈣通道沒有明顯影響(見圖4)，但能抑制約45%的高電壓激活鈣通 道(見圖5 )，表明SPAP-XVI能抑制部分高電壓激活鈣通道。為了研究SPAP-XVI對于HAV鈣 通道的選擇性，我們采用各種HAV鈣通道的專一性抑制劑分離電流，如GVIA是一種ω-芋 螺毒素，專一性阻斷Ν-型鈣電流，而nifedipine能專一性抑制L 一型鈣電流，而剩余電流 通過加入Ni2 +阻斷。在本實驗中，細胞外液中加入3 μΜ GVIA能夠阻斷43. 6±3. 8%的N-型 隹丐電流，繼續(xù)加入10 MM nifedipine可進一步抑制41 ±4. 7%的L 一型|丐電流，剩余的|丐電 流為P/Q-型和R-型，可被Ni2+完全抑制。在細胞外液加入3 μΜ GVIA阻斷N-型鈣電流 后，加入10 μΜ SPAP-XVI對于剩余的電流沒有抑制作用，而加入nifedipine和Ni2+時電 流能被完全抑制（圖6);與之類似，在細胞外液中先加入10 μΜ SPAP-XVI后，繼續(xù)加入3 μΜ GVIA對于SPAP-XVI-不敏感的電流沒有影響（圖7)。這一結果表明SPAP-XVI選擇性 阻斷GVIA-敏感的N-型鈣電流。另一種芋螺毒素 MVIIA (ω-con〇toxin MVIIA)，是一種 既能抑制N-型鈣離子通道，同時也能抑制P/Q-型鈣離子通道的抑制劑。采用相同方法比 較了 SPAP-XVI與MVIIA的抑制作用，在先加入10 μΜ SPAP-XVI后，3 μΜ MVIIA能夠繼續(xù) 阻斷部分剩余電流，這與MVIIA的相關研究結果是一致的，MVIIA在較高濃度能夠部分阻斷 P/Q型鈣電流（圖8)，由此推斷SPAP-XVI對于HAV鈣通道選擇性高于MVIIA。在細胞周圍 加入10 μΜ的SPAP-XVI，再以相同的去極化脈沖誘導電流-電壓關系曲線，SPAP-XVI不影 響鈣電流的起始激活電壓、最大電流激活電壓和逆轉(zhuǎn)電位，說明毒素與通道的相互作用沒 有改變通道對離子通透的選擇性（圖9)。
[0025] 鑒于SPAP-XVI專一性阻斷N-型鈣電流，在本實驗中GVIA被用于分離N-型電流， 即每一細胞在測試的最后都加入3 μΜ GVIA完全阻斷N-型電流，以此作為N-型鈣電流被 100%抑制，而不同濃度的SPAP-XVI阻斷強度與它相比得出相對的阻斷比率，通過這種方 法我們獲得了 SPAP-XVI阻斷N-型鈣電流的濃效曲線（圖10)。SPAP-XVI抑制N-型鈣電 流具有濃度依賴性，它的半數(shù)有效抑制濃度（IC5Q)是60 ± 5 nM (圖10)。SPAP-XVI抑制 N-型鈣電流呈現(xiàn)時間依賴性，10 μΜ SPAP-XVI能夠迅速阻斷N-型電流（τ m = 28. 3 ±2. 3 s)，但要相對慢于MAIIA和GVIA的阻斷速率（\分別為17. 4±3. 1 s和15. 4±2. 2s)。 在SPAP-XVI完全阻斷N-型電流后，通過外液灌流2 min內(nèi)能夠恢復至對照的92% ( τ= 64. 8±3. 2 s)，MVIIA完全阻斷通過4 min的灌流能夠恢復約41%的電流，而GVIA的阻斷 效應幾乎不能恢復（圖11)。
[0026] 總之，在本研究中我們從蜘蛛毒液分離和鑒定到了一種新型的鈣通道毒素。 SPAP-XVI能夠阻斷大鼠 DRG神經(jīng)元上GVIA敏感的N-型鈣通道，它的低毒性和可逆性使之 有希望成為開發(fā)治療N-型鈣通道相關疾病的先導分子。 SEQUENCE LISTING 〈110>長沙沁才生物科技有限公司 〈120>蜘蛛抑痛肽-XVI <160> 1 <170> Patentln version 3. 3 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> SPAP-XVI <400> 1 Cys lie Gly Glu Gly Val Pro Cys Asp Glu Asn Asp Pro Arg Cys Cys Ser Gly 15 10 15 Leu Val Cys Leu Lys Pro Thr Leu His Gly lie Trp Tyr Lys Ser Tyr Tyr Cys 20 25 30 35 Tyr Lys Lys
【權利要求】
1.本發(fā)明旨在于提供一種從蜘蛛毒液中鑒定哺乳動物N-型鈣通道抑制劑蜘蛛抑痛 肽-XVI (SPAP-XVI)的方法，其特征在于： (1) 大鼠輸精管實驗研究SPAP-XVI的組織水平生物學活性：大鼠處死后立即取出長 約2厘米的輸精管，并置于預先用95% 02/5% C02飽和的克氏液，輕柔的擠出輸精管的內(nèi)容 物；將輸精管的兩端分別與34° C恒溫的浴槽的底部和換能器相連接，立即將標本置于浴槽 中，通過分布于浴槽兩端的電極向輸精管施加脈沖電場刺激(波寬：0.14 ms,強度：100 V， 周期：15 s)誘導輸精管收縮；平衡30 min后進行SPAP-XVI的藥理學試驗； (2) 膜片鉗電生理活性實驗檢測SPAP-XVI對電壓門控鈣通道的影響： ① 急性分離和原代培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞用于膜片鉗電生理活性實驗：SD大白鼠 處死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿與肋骨平面垂直的方向?qū)⒆倒芗糸_，并浸泡在盛有少量 細胞培養(yǎng)液的燒杯中；用鑷子撕破附在椎管內(nèi)壁上的一層黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交 匯處的背根神經(jīng)纖維；在胸腰椎段，可挑選16個左右并置入盛有2 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中； 在解剖顯微鏡下，用維娜斯剪和尖頭鑷子分離出神經(jīng)節(jié)；剝離包在節(jié)外的絮狀物和軸索后， 放入盛有約0. 5 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；用吸管吸去液體，將分離好的所有神經(jīng)節(jié)剪碎；剪 碎之后，轉(zhuǎn)入消化液，在34°C、震蕩頻率110 rpm的環(huán)境中進行酶解消化反應20 min ;期間 每隔10 min取出用移液槍吸打數(shù)次；向消化液中加入酶的抑制劑，終止酶解處理過程；無 菌操作將消化得到的細胞液轉(zhuǎn)入離心管中進行離心（800 rpm、5 min)，去上清，加入8 mL含 10%小牛血清的長期培養(yǎng)液；重懸細胞后分成3?4皿，放入培養(yǎng)箱（5%C02、95%空氣）中， 37°C培養(yǎng)3?4 h貼壁； ② 膜片鉗電生理活性實驗：膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，采用全細胞膜片鉗技術； 挑選質(zhì)膜光滑可見、胞質(zhì)均勻的DRG細胞作為實驗細胞；電流記錄通過全細胞膜片鉗技術 利用放大器EPC9在電腦上進行；玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管；玻璃電極兩步拉制而 成，經(jīng)拋光儀拋光后電極尖端直徑約為3 mm，充灌電極液后電極電阻為1-3 ΜΩ ;實驗細胞 形成全細胞記錄模式后穩(wěn)定4?6 min ;記錄電流經(jīng)EPC-9放大器10 kHz濾波過濾；線性 漏電流和電容電流用p/4程序予以刪除，數(shù)據(jù)和圖形用pulsefit + pulse 8. 0軟件采集 分析；實驗結果用Sigmaplot9. 0軟件進行分析。
【文檔編號】G01N33/68GK104062433SQ201310302457
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權日:2013年7月19日
【發(fā)明者】鄧梅春, 羅旋 申請人:長沙沁才生物科技有限公司