專(zhuān)利名稱(chēng)：一種包括酵母細(xì)胞中表達(dá)的hpv16型l1和e7靶抗原的嵌合蛋白疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是生物疫苗技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用HPV16L1、HPV16E7的嵌合型蛋白為靶抗原，適當(dāng)比例配伍，制備HPV疫苗，用于預(yù)防HPV弓丨起的部分疾病。
背景技術(shù)：
子宮頸癌是婦女常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居 女性惡性腫瘤第二。據(jù)世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)，每年約有50萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例，每天有600名婦女死于宮頸癌，其中80%在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)每年約新發(fā)病例13. 15萬(wàn)，占世界新發(fā)病例的1/3。大量研究資料表明高危險(xiǎn)人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染是引發(fā)宮頸癌的重要原因之一。HPV是一種嗜黏膜和皮膚上皮DNA病毒，20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)生與HPV有關(guān)，20世紀(jì)80年代宮頸癌活組織檢查發(fā)現(xiàn)HPV16。HPV感染大多數(shù)由低危型的如HPV-6和HPV-Il感染，造成良性生殖器疣；而高危型HPV與肛門(mén)及生殖器區(qū)域的癌前病變及惡性病變有關(guān)。對(duì)多數(shù)患者來(lái)說(shuō)，生殖道HPV存留可達(dá)年，直到出現(xiàn)另一新型別的HPV感染才自然消退研究顯示，HPV16和HPV18會(huì)存留更長(zhǎng)時(shí)間周期持續(xù)HPV感染是宮頸上皮。近年來(lái)宮頸癌發(fā)病出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，這主要與HPV感染增多有關(guān)。因此，研發(fā)安全、有效、經(jīng)濟(jì)的宮頸癌疫苗迫在眉睫，具有重大的經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。研究證明90%左右的宮頸癌的組織可以檢測(cè)到HPV16亞型，HPV16型與鱗癌有著密切關(guān)系，而90%的宮頸癌為鱗癌，所以HPV16是女性宮頸癌發(fā)病的主要原因。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是現(xiàn)目前廣泛應(yīng)用的異源蛋白真核表達(dá)系統(tǒng)，其具有穩(wěn)定性好、表達(dá)高效、分泌量大、規(guī)?；菀缀统杀镜土葍?yōu)點(diǎn)，且具有糖基化等翻譯后修飾功能。HPV晚期基因編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白LI及次要蛋白L2構(gòu)成了病毒衣殼，二者比例約5 I。單獨(dú)的LI蛋白可以自發(fā)組裝成直徑與HPV成熟病毒大小相近(約55nm)的VLPs，VLPs和天然HPV病毒的形態(tài)相似，都是二十面體結(jié)構(gòu)，只是VLP內(nèi)部無(wú)病毒核酸。L1、L2蛋白既是病毒的主要抗原成分，也是與細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)所在。E7蛋白是HPV16的一種重要的腫瘤排斥抗原，E7蛋白的表位主要集中于第I 60個(gè)氨基酸之間。病毒樣顆粒(VLPs)是不含核酸的空殼蛋白，形態(tài)上天然的病毒顆粒相似，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性。人類(lèi)乳頭狀瘤病毒(HPV) 16型早期蛋白E7被證實(shí)不僅對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和維持惡性過(guò)程起著關(guān)鍵作用，而且還是腫瘤排斥抗原。因此，阻止腫瘤形成的E7疫苗已成為近年研究熱點(diǎn)。疫苗防治HPV相關(guān)疾病是近幾年來(lái)的研究熱點(diǎn)。由于目前無(wú)法通過(guò)組織培養(yǎng)獲得大量的HPV病毒，并且考慮到HPVE6、E7基因的潛在致癌性，因此，不能通過(guò)減毒活疫苗或滅活疫苗等傳統(tǒng)疫苗制備方式獲得HPV疫苗。伴隨分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，目前HPV疫苗研究主要集中在VLPS疫苗、重組病毒疫苗、亞單位疫苗等。VLPS疫苗主要是以HPV衣殼蛋白LI為首選目的蛋白，HPVLI蛋白分別在原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中得以表達(dá)，且可自組裝成VLPS，其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及部分臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LI蛋白裝配成的VLPs具有良好的免疫原性。全世界流行病學(xué)總體調(diào)查研究結(jié)果表明，HPV引起惡性腫瘤的型別在世界各地不盡相同。其中HPV16是最主要的致癌因素，其他型別在世界各地與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性不同。HPV16和HPV18型在各大洲的流行型別占65 75%左右，為HPV感染的主要型別，也是目前兩種HPV疫苗組份型別，其他型別表現(xiàn)的差異較大。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的之一是提供一種兼有治療、預(yù)防人乳頭瘤病毒引起的疾病的新疫苗；本發(fā)明的另一目的是提供制備上述疫苗的方法，以及所述疫苗用于預(yù)防和治療由HPV16弓丨起的感染和疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關(guān)的疾病。本發(fā)明的包含由在畢赤酵母中表達(dá)的人乳頭瘤病毒16型病毒的重組蛋白L1E7的疫苗，是利用基因工程技術(shù)將人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白LI的免疫活性部分和早期基因E7的免疫活性部分融合構(gòu)建為融合基因L1E7，并將該融合基因在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)而得到重組蛋白，將獲得的重組蛋白與佐劑混合，制備出疫苗，所加佐劑為氫氧化鋁。本發(fā)明制備疫苗的方法包括設(shè)計(jì)引物克隆HPV16LI/E7基因及構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒；將構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株，篩選穩(wěn)定高效分泌表達(dá)菌株；發(fā)酵并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；純化目的蛋白；將純化的重組蛋白制成疫苗的步驟，其中在甲醇濃度為1.0%，pH為6. O條件下誘導(dǎo)酵母菌株表達(dá)重組蛋白，所采用的真核表達(dá)質(zhì)粒是pPIC9k-Ll/E7，酵母菌株是畢赤酵母菌株，優(yōu)選為畢赤酵母組氨酸缺陷型GS115菌株,真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株的方法是電轉(zhuǎn)化，所使用的引物是根據(jù)GenBank中HPV16的全序列設(shè)計(jì)的LI上游、LI下游、E7上游、E7下游引物。在pH = 6. O、溫度28 30°C振搖培養(yǎng)畢赤酵母組氨酸缺陷型GS115菌株48h，然后每隔24h添加終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，96h后收樣。收樣后，對(duì)樣品進(jìn)行離心，用玻璃珠破碎細(xì)胞沉淀，然后14000r/min離心2min，收集上清，接著從上清液中純化目的蛋白。將純化的重組蛋白制成疫苗包括向純化的重組蛋白中加入終濃度約為lmg/ml的佐劑氫氧化鋁，充分混合，于4°C保存即得半成品。技術(shù)方案本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，用PCR及基因克隆的方法將HPV16的衣殼蛋白LI活性位點(diǎn)與E7早期基因的主要抗原活性位點(diǎn)融合，再將構(gòu)建的融合基因插到表達(dá)載體pPIC9k中，高效表達(dá)L1-E7重組蛋白，純化后得到的VLPs，將其與佐劑混合，制備出能兼有預(yù)防、治療人乳頭瘤病毒感染的疫苗。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)以HPV16L1、HPV16E7為靶抗原，兼有預(yù)防、治療人乳頭瘤病毒感染的疾病，如宮頸癌、尖銳濕疣。2)酵母細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵，用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(P.Pichia)，相比用桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)，操作簡(jiǎn)單，大大降低成本。3)純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低、適于大規(guī)模生產(chǎn)。純化收率高，使此疫苗在發(fā)展中國(guó)家的應(yīng)用可能性更高，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
具體實(shí)施例方式
例I本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的(I)處理臨床樣品刮取宮頸表層細(xì)胞，離心，用適宜的緩沖液洗滌離心，沉淀備用。若不立即使用，必須存儲(chǔ)于-70°C冰箱或者液氮。(2)參考Genbank，從臨床樣品中分離HPV基因組DNA，確定代表性HPV野生型序列?？紤]用酚抽提法將細(xì)胞懸浮于含有EDTA、SDS和RNAase的抽提液中，然后用蛋白酶K與SDS發(fā)生協(xié)同作用破碎細(xì)胞膜，用酚、氯仿使蛋白變性，去雜質(zhì)。最后用乙醇沉淀基因組DNA。(3)克隆 HPV16LI/E7 基因及構(gòu)建質(zhì)粒 pPIC9k_Ll/E7a)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中HPV16的全序列設(shè)計(jì)引物，LI上游引入6*his標(biāo)簽及SnaBI酶切位點(diǎn)，下游引入HindIII酶酶切位點(diǎn)；E7上游引入HindIII酶切位點(diǎn)，下游引入Not I酶切位點(diǎn)。如下LI 上游 5，CC TACGTA CATCATCATCATCATCAT CAGGTGACTTTTATT3，LI 下游 5，CCC AAGCTT CAGCTIACGTTTTTTGCGTTTAGC3’E7 上游 5，CCCAAGCTT ATGCATGGAG ATACACCTAC3’E7 下游 5，ATAAGAAT GCGGCCGC TTATGGTTTCTGAGAACAGATG3，b)基因擴(kuò)增①LI的擴(kuò)增體系與參數(shù)HPV16cDNA2ul
LI上游引物Iul
LI下游引物Iul
Primerstar 高保真酶 Iul 5 xPSBufFer5ul
dNTP4ul
ddH2036ul, 總體積 50ul上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，具體參數(shù)為①94 °C 5min②94 °C 45s，54°C 45s, 72 °C2min ③ 72°C IOmin0②E7的擴(kuò)增體系與參數(shù)HPV16cDNA2ul
E7上游引物Iul
E7下游引物Iul
Primerstar 高保真酶 Iul 5 xPSBufFer5ul
dNTP4ul
ddH2036ul, 總體積 50ul上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，具體參數(shù)為①94 °C 5min②94°C 45s, 52 °C 45s, 72 °C2min③72°C IOmin0擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖凝膠電泳，得到正確的條帶后，進(jìn)行膠回收。c)擴(kuò)增產(chǎn)物的回收將凝膠中的正確條帶用手術(shù)刀在紫外燈下切下，移入EP管中，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。d)pPIC9k-Ll/E7重組子的構(gòu)建與質(zhì)粒提?、俅竽c桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備②LI回收產(chǎn)物經(jīng)SnaBI和HindIII酶切，E7經(jīng)HindIII和Not I酶切，跑膠，用HiBindTM凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，連接。
LI基因5ul
E7基因5ul
T4連接酶Iul
10xT4Buffer2ul
ddH207ul, 總體積 20ul16°C水浴5小時(shí)。pPIC9k經(jīng)SnaBI和Not I酶切，經(jīng)Ecor I和Not I酶切，跑膠后回收。pPIC9k3ulLI/E77ul
T4連接酶Iul
10xT4Buffer 2ul
ddH207ul, 總體積 20ul16°C水浴5小時(shí)。 把連接產(chǎn)物加入做好的DH5 α中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴3min，加入500ul的LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)I小時(shí)，室溫離心5min吸去500ul的上清，余液混勻，余液均勻涂布于氨芐抗性的LB平板，37 “C過(guò)夜。③堿裂解法大規(guī)模提取質(zhì)粒e)質(zhì)粒的線(xiàn)性化pPIC9k-Ll/E7 經(jīng) Sall 酶切，體系為質(zhì)粒3 Oul
Sail2ul
IOxHBufFer5ulddH2013ul, 總體積 50ul酶切4小時(shí)，回收往酶切體系里加入等體積的酚氯仿抽提，取上清約80ul，加入2倍體積的無(wú)水こ醇和0. I倍體積的pH5. 2的醋酸鈉，置于_20°C半小時(shí)，13000rmp 20min,棄去上清；75%的こ醇300ul洗兩遍，13000rmp 5min,棄去上清,干燥后加35ul的ddH20溶解。(4)將構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k_Ll/E7轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選穩(wěn)定高效分泌表達(dá)菌株a)畢赤酵母感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化i、畢赤酵母感受態(tài)的制備①挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YH)培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30°C、250 300r/min培養(yǎng)過(guò)夜；②取100 500 ill的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28 300C >250 300r/min 培養(yǎng)過(guò)夜，至 0D600 達(dá)到 I. 3 I. 5 ;③將細(xì)胞培養(yǎng)物于4°C，1500g離心5min，用500ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀
重懸；④按步驟3離心,用250ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；⑤按步驟3離心，用20ml的冰預(yù)冷的Imol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；⑥按步驟3離心，用Iml的冰預(yù)冷的Imol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為I. 5ml ;將處理好的酵母菌按每份SOul分裝到滅菌的EP管中，_80°C凍藏ii、畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化取新鮮制備的(或_80°C凍存的)感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，使其完全解凍①將80ul菌體移出至一新的無(wú)菌Eppendorf管中，加入5_20ug線(xiàn)性化質(zhì)粒(5-10ul)，輕彈混勻，盡數(shù)吸出轉(zhuǎn)移到0. 2cm型的電穿孔轉(zhuǎn)化杯中；②轉(zhuǎn)化杯置于冰浴中5 10分鐘，保持低溫。③電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件電壓1509V ;電阻:200 Q ;電容25uF ;脈沖時(shí)間:10ms ；
一次電擊。④電擊后，馬上在電擊轉(zhuǎn)化杯中加入Iml 4°C預(yù)冷的頂?shù)纳嚼娲既芤?用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中；⑤取30°C烘至表面半干的含葡萄糖(MD)培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作涂布平板，400uF/板；將涂好的平板置于30°C正面放置至表面半干，然后倒置培養(yǎng)，4天后觀(guān)察轉(zhuǎn)化子情況。b)重組酵母GS 115陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的高拷貝外源基因整合篩選①將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在含葡萄糖(MD)平板培養(yǎng)板形成的克隆菌，點(diǎn)種在G418濃度在3g/L的YPD培養(yǎng)板上，30°C培養(yǎng)3-4d，篩選鑒定高拷貝外源基因整合菌株。得到陽(yáng)性克隆菌株(即GSl 15高表達(dá)菌)，將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌株接種在不含G418的YPD培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，并加甘油后放_(tái)70°C冰凍保存菌株。②鑒定表型篩選出的轉(zhuǎn)化子需鑒定表型，即確定是甲醇利用正表型Mut+還是甲醇利用慢表型Muts。這兩種不同表型在誘導(dǎo)表達(dá)的件上有差異。可以把轉(zhuǎn)化子同時(shí)點(diǎn)在含葡萄糖(MD)平板和含甲醇(MM)平板上。在MD和麗板上生長(zhǎng)差別不大的轉(zhuǎn)化子為Mut+(能夠快速利用甲醇為碳源)；相反，在MD上生長(zhǎng)快，MM上生長(zhǎng)很慢的轉(zhuǎn)化子為Muts (不能利用甲醇為碳源)。(5)目的蛋白的規(guī)?；l(fā)酵a)種子液的制備取已保存的GS115高表達(dá)菌，YH)板上劃線(xiàn)。于28°C培養(yǎng)約72h，看到菌落長(zhǎng)至直徑2. 5mm左右，挑單菌落接種于含5ml BMGY培養(yǎng)液的50ml離心管中，于28°C振蕩培養(yǎng)36h左右，至0D600 = 2-6。將上述菌液按0. 1% (v/v)接種于含IL BMGY培養(yǎng)液5L三角搖瓶中，于28°C振蕩培養(yǎng)36h左右至0D600 = 2_6。b)發(fā)酵罐高壓滅菌往100L發(fā)酵罐內(nèi)加入40L FM21培養(yǎng)液，打開(kāi)電源、蒸汽及冷卻閥門(mén)，將控制面板調(diào)至滅菌狀態(tài)，設(shè)定好滅菌溫度為121°C，時(shí)間為30min，Control設(shè)為打開(kāi)狀態(tài)。在高壓滅菌時(shí)，轉(zhuǎn)速、pH、溶氧、通氣全部為關(guān)閉狀態(tài)。發(fā)酵罐以P-I-D閉環(huán)控制程序自動(dòng)升溫、高壓和降溫。c)接種高溫滅菌后發(fā)酵罐溫度要降至28°C，用氨水調(diào)pH值至6.0，加入無(wú)菌的40ml PTMI微量元素和18ml Biotin貯備液。用酒精棉將搖瓶的瓶ロ消毒后，將2L的種子液加入發(fā)酵罐，設(shè)定轉(zhuǎn)速600rmp/min、溫度28°C、pH6. 0,通氣,壓カ2km/cm2。d)發(fā)酵階段i、生長(zhǎng)階段只加甘油，①甘油批式階段②甘油補(bǔ)料階段ii、表達(dá)階段③甲醉補(bǔ)料誘導(dǎo)階段姆隔24h以7. 2ml/h/L的速度添加終濃度為1%的甲醇誘導(dǎo)，96h后收樣，離心，細(xì)胞沉淀進(jìn)行玻璃珠破碎后，14000r/min離心2min，取上清。(6)目的蛋白的純化上清經(jīng)純化通過(guò)離子交換，親和，蛋白的透析復(fù)性及濃縮，等多種層析方法純化表達(dá)的重組蛋白。通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)每步結(jié)果并控制最終產(chǎn)品質(zhì)量。①離子交換層析將上清加入已用緩沖液平衡的離子交換柱上，用加了 IOOmM氯化鈉緩沖液以Iml/min的流速洗脫。 ②親和層析將從離子交換得到的樣品調(diào)PH至8. 0，然后加入用緩沖液平衡過(guò)的Ni-NTA親和層析柱，用含咪唑的緩沖液以lml/min的流速洗脫,收集目的蛋白。③蛋白的透析復(fù)性及濃縮
i、蛋白的透析將最后洗脫的蛋白置于處理好的透析袋中密封，放入100倍體積的含有尿素的透析液中，每6小時(shí)更換透析液，經(jīng)4、2、I、0M的尿素梯度進(jìn)行透析，最后透析到磷酸緩沖鹽溶液中。ii、蛋白的濃縮
將透析好的蛋白取出離心(12000rmp 20分鐘，4°C )取上清重新用透析袋密封好，埋于聚こニ醇(PEG 8000)顆粒中，待其濃度至初體積的1/3時(shí)取出，將蛋白離心(12000rmp20分鐘，4°C )取上清，分裝儲(chǔ)存。(7)將純化的重組蛋白按制成疫苗，同時(shí)加入佐劑氫氧化鋁，終濃度約為lmg/ml，充分混合后，于4°C保存。本發(fā)明疫苗制備エ藝的重組蛋白生產(chǎn)收率開(kāi)啟I支工作種子按每100L大罐培養(yǎng)量計(jì)可制造出粗制多糖5mg。實(shí)施例2 PCR鑒定重組子用LI上游引物和E7下游引物以提取的酵母基因組為模板擴(kuò)增，得到結(jié)果，說(shuō)明重組酵母菌GS 115幣pPIC9k-Ll/E7構(gòu)建成功。實(shí)施例3重組酵母GS 115陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的高拷貝外源基因整合篩選鑒定挑選單個(gè)陽(yáng)性菌落，按試劑盒說(shuō)明提取酵母GS 115菌轉(zhuǎn)化的基因組DNA作為模板，用pPIC9k-Ll/E7構(gòu)建引物及條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，PCR產(chǎn)物經(jīng)加核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳分析。實(shí)施例4重組蛋白HPV16LI/E7的表達(dá)優(yōu)化試驗(yàn)中分別從誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇誘導(dǎo)濃度、培養(yǎng)基pH值三方面優(yōu)化表達(dá)。首先分別在6、12、24、36、48、60和72h七個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣跑SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)量，結(jié)果顯示48小時(shí)時(shí)外源蛋白表達(dá)量最高；然后取七個(gè)搖瓶分別按0,0. 2%,0. 4%,0.6%,0.8%U.0%^PI. 2%的終濃度添加甲醇，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)量，結(jié)果顯示甲醇濃度在I. 0%的時(shí)候外源蛋白的表達(dá)量最高；分別在培養(yǎng)基PH值為4. 0,5.0,6.0,7. O、8. 0條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS電泳檢測(cè)，結(jié)果是外源蛋白在pH為6.0的時(shí)候表達(dá)量最大。因此得出將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌于pH = 6. O、溫度28 30°C振搖培養(yǎng)48h，然后每隔24h添加終濃度為I %的甲醇誘導(dǎo)，96h后收樣，離心，細(xì)胞沉淀進(jìn)行玻璃珠破碎后，14000r/min離心2min，取上清的方式最優(yōu)。實(shí)施例5 SDS-PAGE和Western-blot電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物及表達(dá)量的檢測(cè)將最初在MD(含G4180. 5mg/ml)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子，通過(guò)G418濃度梯度0. 5、l、2mg/ml的篩選，最后得到G418抗性菌株I個(gè)。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)的重組菌離心后取上清跑SDS-PAGE電泳,在64KD左右出現(xiàn)蛋白條帶，與推導(dǎo)的蛋白條帶大小一致。Westem_blot結(jié)果顯示，HPV16型pPlC9k-LI/E7融合蛋白得到成功表達(dá)并在64KD處出現(xiàn)特異的條帶，與推導(dǎo)的蛋白條帶大小一致，說(shuō)明在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功的表達(dá)了 pPlcgk-Ll/E7蛋白。經(jīng)Tanon4100分析儀檢測(cè)化學(xué)光密度，重組疫苗中HPV16LI/E7蛋白表達(dá)量為50ng/ul。實(shí)施例6重組蛋白的Western-blot鑒定a)通過(guò)Western-blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白正確性。細(xì)胞裂解后上清經(jīng)12% SDS-PAGE后直接進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，并轉(zhuǎn)移至NC膜，進(jìn)行Western blot分析，分別以抗-HPV16L1和E7單抗(I 3000)為ー抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為ニ抗(I 5000)，Dons/TMB工作液顯色后終止反應(yīng)。 b)重組蛋白結(jié)構(gòu)電鏡分析將L1E7重組蛋白樣品放在銅網(wǎng)/碳網(wǎng)上，用2%磷鎢酸負(fù)染，在電子顯微鏡下觀(guān)察到重組蛋白均能自動(dòng)環(huán)化成ー個(gè)50nm的環(huán)形顆粒結(jié)構(gòu),且形態(tài)和結(jié)構(gòu)與天然HPVLl完全相同，即為病毒樣顆粒。實(shí)施案例7重組蛋白的動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)(I)重組蛋白免疫小鼠血清抗體檢測(cè)重組蛋白與相同體積的佐劑充分混合，呈乳化液，對(duì)照組為佐劑和相同體積的PBS，小鼠左側(cè)腹股溝皮下注免疫小鼠，ニ周后加強(qiáng)ー針，再過(guò)ニ周取血清用酶聯(lián)免疫法分別檢測(cè)L1E7抗體水平。誘發(fā)產(chǎn)生滴度為I : 的L1\E7抗體。表達(dá)的重組蛋白能對(duì)小鼠能長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生體液免疫。(2)重組蛋白抗腫瘤移植實(shí)驗(yàn)a)腫瘤預(yù)防免疫實(shí)驗(yàn)重組蛋白+佐劑和佐劑+PBS接種小鼠，每組20只，注射小鼠腹股溝，每周注射一次，共8周，第8此免疫后對(duì)小鼠進(jìn)行接種腫瘤細(xì)胞2X IO6個(gè)。觀(guān)察腫瘤生長(zhǎng)情況三個(gè)月，免疫了重組蛋白疫苗的那組，腫瘤生長(zhǎng)緩慢質(zhì)量小，而佐劑對(duì)照組生長(zhǎng)快、質(zhì)量大。b)腫瘤治療免疫實(shí)驗(yàn)小鼠注射2 X IO5細(xì)胞，觀(guān)察腫瘤生長(zhǎng)情況三個(gè)月，分2組，每組20只，每只小鼠背部皮下注射IOug重組蛋白+佐劑和佐劑+PBS，每周注射一次，共8周?？梢?jiàn)小鼠免疫了重組蛋白疫苗的一組得到較明顯的抑制腫瘤發(fā)展的效果，而注射PBS的一組沒(méi)有抑瘤作用。
權(quán)利要求
1.制備包含由在酵母中表達(dá)的人乳頭瘤病毒16型病毒的重組蛋白L1E7的疫苗的方法，其包括設(shè)計(jì)引物克隆HPV16LI/E7基因及構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒；將構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株，篩選穩(wěn)定高效分泌表達(dá)菌株；發(fā)酵并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；純化目的蛋白；將純化的重組蛋白制成疫苗的步驟，其特征在于，在甲醇濃度為1.0%，pH為6. O條件下誘導(dǎo)酵母菌株表達(dá)重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于克隆HPV16LI/E7基因的引物為L(zhǎng)I 上游 5，CC TACGTA CATCATCATCATCATCAT CAGGTGACTTTTATT3，；LI 下游 5，CCC AAGCTT CAGCTIACGTTTTTTGCGTTTAGC3，；E7 上游 5’ CCCAAGCTT ATGCATGGAG ATACACCTAC3’E7 下游 5，ATAAGAAT GCGGCCGC TTATGGITTCTGAGAACAGATG3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其中的真核表達(dá)質(zhì)粒是pPIC9k-Ll/E7。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于其中的酵母菌株是畢赤酵母菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于酵母菌為畢赤酵母組氨酸缺陷型GSl15菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株的方法是電轉(zhuǎn)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在pH= 6. O、溫度28 30°C振搖培養(yǎng)畢赤酵母組氨酸缺陷型GSl 15菌株48h，然后每隔24h添加終濃度為I %的甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，96h后收樣。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，收樣后，對(duì)樣品進(jìn)行離心，用玻璃珠破碎細(xì)胞沉淀，然后14000r/min離心2min，收集上清，接著從上清液中純化目的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將純化的重組蛋白制成疫苗包括向純化的重組蛋白中加入終濃度約為lmg/ml的佐劑氫氧化鋁，充分混合，于4°C保存。
10.權(quán)利要求9的方法制備得到的疫苗在制備用于預(yù)防和治療由HPV16引起的感染和疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關(guān)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供一種L1衣殼蛋白和E7多肽組成的L1E7嵌合蛋白疫苗及其制備方法。本發(fā)明采用優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件，用酵母細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵來(lái)表達(dá)嵌合蛋白，能夠大大降低成本；而且，采用的純化工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低、適于大規(guī)模生產(chǎn)HPV16L1/E7蛋白。含晚期結(jié)構(gòu)基因和早期基因的HPV16L1/E7蛋白，除能使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體外，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的E7特異性C TL反應(yīng)和抗腫瘤活性，被認(rèn)為是最有前景的宮頸癌預(yù)防、治療性疫苗，能用于已有HPV16感染的、有或沒(méi)有臨床癥狀的病人。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102614505SQ201110382080
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者侯文禮, 馮曉, 劉瑾, 趙志鵬, 鐘澤榮 申請(qǐng)人:成都康華生物制品有限公司