對(duì)hpv16 e7具有結(jié)合親和力的多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和力的多肽及其用途。首次揭示了一種對(duì)HPV16的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽；本發(fā)明還提供了該多肽作為藥物或分子靶向試劑的診斷或治療用途。
【專利說明】
對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和力的多肽及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和 力的多肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是一種全球公認(rèn)的主要與人乳頭瘤病毒（HPV)感染相關(guān)的癌癥，死亡率在 全球婦女癌癥中高居第二?，F(xiàn)有技術(shù)中，盡管基于HPV Ll蛋白的宮頸癌預(yù)防性疫苗已經(jīng)商 業(yè)化，但基于HPV及其E7的治療性疫苗，尚處于實(shí)驗(yàn)研究探索階段。而存在的問題是：治療 性疫苗發(fā)揮作用是建立在機(jī)體免疫功能基礎(chǔ)之上，用腫瘤特異性抗原或表位激發(fā)更為強(qiáng)烈 的抗腫瘤特異性免疫效應(yīng)，以達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的；但腫瘤病人往往存在自身免疫功 能低下，或免疫抑制或免疫逃逸等而使治療性疫苗發(fā)揮作用有限，難以達(dá)到預(yù)期的治療目 的。
[0003] 靶向治療是目前宮頸癌治療中最具希望的方法和策略，主要包括下列幾種類型： (1)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)為靶點(diǎn)的治療：EGFR與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，發(fā)揮著調(diào)節(jié)正 常細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲力、促進(jìn)血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，而 使其成為包括宮頸癌在內(nèi)的多種人類腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)。目前，靶向EGFR的腫瘤治 療藥物主要分為兩類：EGFR單克隆抗體和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗劑。其中單克隆抗 體主要為HER2單克隆抗體，包括曲妥珠單抗（赫賽汀，Herceptin)和西妥昔單抗等；而小 分子化合物主要包括吉非替尼、伊馬替尼和埃洛替尼等。（2)以腫瘤血管生成為靶點(diǎn)的治 療：腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管的形成，因而抗血管生成也是腫瘤靶向治療研究的 熱點(diǎn)之一。如①貝伐單抗（rhuMAb-VEGF)，一種人源化單克隆抗體IgGl，通過抑制VEGF生 物活性而抑制血管生成，貝伐單抗單藥治療或與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用均可減少腫瘤血管 生成。②舒尼替尼，一種多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制VEGF R的酪氨酸激酶活性從 而特異性阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0004] 總之，分子靶向治療可最大限度地殺傷腫瘤細(xì)胞，有效地降低腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處 轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生存率并提高患者的總生存時(shí)間。盡管基于單克隆抗體及其小分 子片段的靶向分子治療具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是也存在不足，包括：（1)滲透性不夠：限制抗 體穿透體積大的實(shí)體瘤；（2)靶位點(diǎn)外滲：由于血管透性降低而致抗體在靶位點(diǎn)的外滲； (3)毒副作用：抗體對(duì)正常組織的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生交叉反應(yīng)，降低了靶向效果；(4)體 內(nèi)清除：注入的抗體代謝提高，降低了治療效果；（5)抗體的免疫原性：抗體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 抗人抗體，使治療性抗體失活。由于交叉反應(yīng)及免疫復(fù)合物的形成，使毒副作用產(chǎn)生的毒性 效應(yīng)已經(jīng)成為發(fā)展針對(duì)癌癥治療性抗體的主要障礙，產(chǎn)生肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)毒性而使其功 能降低。如與HER2革El向抗體trastuzumab(Herceptin)相關(guān)的心臟毒性效應(yīng)。用同位素標(biāo) 記抗體進(jìn)行放射性免疫治療也會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制。
[0005] 因此，本領(lǐng)域仍然亟待研究靶向性治療HPV相關(guān)腫瘤疾病的新藥物或新方法，以 改善目前臨床現(xiàn)狀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和力的多肽及其用途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種對(duì)人乳頭瘤病毒16型（HPV16)的E7蛋白具有結(jié) 合親和力的多肽，該多肽是以葡萄球菌A蛋白（SPA)Z段（Z結(jié)構(gòu)域）的氨基酸序列作為骨 架，進(jìn)行12-20個(gè)（較佳地為13-16個(gè)，如14個(gè)、15個(gè)）氨基酸變異后獲得的多肽。
[0008] 在一個(gè)優(yōu)選例中，相對(duì)于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQ ID NO: 5)，所述 的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽在第9-11，13-14,17-18, 24-25， 27-28, 32, 35,43位上發(fā)生氨基酸突變。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，相對(duì)于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，所述的對(duì)人乳頭瘤病 毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽的：
[0010] 第9位氨基酸突變?yōu)镾或W ;
[0011] 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V ;
[0012] 第11位氨基酸突變?yōu)镋、L或W ;
[0013] 第13位氨基酸突變?yōu)镽、I或S ;
[0014] 第14位氨基酸突變?yōu)镾、L、M或A;
[0015] 第17位氨基酸突變?yōu)槲富虺撸?br>[0016] 第18位氨基酸突變?yōu)锳、W、T或Q;
[0017] 第24位氨基酸突變?yōu)镚、R、D或P ;
[0018] 第25位氨基酸突變?yōu)镈、L、HSG;
[0019] 第27位氨基酸突變?yōu)镚、V、ASQ;
[0020] 第28位氨基酸突變?yōu)镽、E或L ;
[0021 ] 第32位氨基酸突變?yōu)長(zhǎng)、V或E ;
[0022] 第35位氨基酸突變?yōu)镚、H、Q或D ;
[0023] 第43位氨基酸突變?yōu)镋或K。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽 的氨基酸序列如SEQ ID N0:2-5任一所示。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽 與人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白相互作用的K d值為1X10 6M至1X10 7M。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，所述的靶 向性分子包括前面任一所述的多肽，以及與該多肽相連接（或偶聯(lián)）的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián) 物包括（但不限于）：半胱氨酸殘基，多肽標(biāo)簽，抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物，或可檢測(cè) 標(biāo)記物（如熒光標(biāo)記，酶，生物素或放射性同位素）。
[0027] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的偶聯(lián)物是肽，所述的偶聯(lián)物與所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16 型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽構(gòu)成融合多肽。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的多肽標(biāo)簽包括但不限于：His標(biāo)簽（如6XHis)，Myc標(biāo) 簽，GST標(biāo)簽，F(xiàn)lag標(biāo)簽。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述酶包括但不限于：堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物包括（但不限于）：毒素； 較佳地，所述毒素是具有抑制人乳頭瘤病毒16型病毒感染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉 毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素或所述毒素的功能性片段；且，所述的腫瘤是人乳頭瘤病 毒16型陽性的腫瘤。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的毒素是綠膿桿菌外毒素 A，或所述毒素的功能性片段是綠 膿桿菌外毒素 A的活性片段PE38KDEL。較佳地，該綠膿桿菌外毒素 A或其功能性片段連接 于所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽的羧基末端（C末端）。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的偶聯(lián)物與所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié) 合親和力的多肽以柔性肽連接，所述柔性肽包括（但不限于）：(Gly 4Ser)313
[0033] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，其編碼前面任一所述的對(duì)人乳 頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽。
[0034] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核苷酸，其編碼所述的靶向人乳頭瘤病毒16型 的靶向性分子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。
[0035] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組載體，該載體包含所述的多核苷酸。
[0036] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含所述的重組載體，或其 包含有或基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0037] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備前面任一所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7 蛋白具有結(jié)合親和力的多肽的方法，所述方法包括：（1)培養(yǎng)所述的細(xì)胞，從而表達(dá)所述的 對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽；（2)分離純化（1)獲得的多肽。
[0038] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和 力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子的用途，用于制備治療人乳頭瘤 病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤的藥物；或
[0039] 用于制備檢測(cè)人乳頭瘤病毒16型病毒感染的檢測(cè)試劑；或
[0040] 用于制備診斷人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤的 診斷試劑。
[0041] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子中，所述的偶聯(lián)物 是抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物或抗腫瘤藥物（如毒素），所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的 E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子用于治療人 乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子中，所述的偶聯(lián)物 是可檢測(cè)標(biāo)記物（如熒光標(biāo)記或酶），所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和 力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子用于診斷人乳頭瘤病毒16型感染 疾病或人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤包括：宮頸癌、頭頸部 腫瘤或外生殖器腫瘤等。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的人乳頭瘤病毒16型感染疾病包括：宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 或外生殖器疣等。
[0045] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，其包含：前面所述的對(duì)人乳頭瘤病毒 16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子；和 藥學(xué)上可接受的載體。
[0046] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒16型感染疾病或 人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤的藥盒，所述的藥盒中包括：所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型 的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，或所述 的藥物組合物。
[0047] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽 或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子是有效量的。
[0048] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種治療人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病 毒16型表達(dá)陽性腫瘤，包括將所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多 肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子給予需要治療的對(duì)象。
[0049] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種診斷人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病 毒16型表達(dá)陽性腫瘤，包括將所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子給予需要治療 的對(duì)象；所述的靶向性分子中，所述的偶聯(lián)物是可檢測(cè)標(biāo)記物（如熒光標(biāo)記或酶）。
[0050] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0051] 圖1、各Zhpv16e7以及Zwt序列的對(duì)比。本發(fā)明的多肽Zhpv16e7中被修飾的氨基酸位點(diǎn) 在圖中己用黑體標(biāo)出（SEQ ID N0:l-4)。
[0052] 圖2、實(shí)施例1中產(chǎn)生的一個(gè)融合多肽的重組質(zhì)粒構(gòu)建圖（A)和氨基酸序列示意圖 ⑶。
[0053] Zhpv16e7代表具有選自SEQ ID NO : 1-5任一序列的HPV16E7結(jié)合結(jié)構(gòu)域，6xHis代表 六組氨酞標(biāo)記，HM代表NdeI (CATATG)翻譯的氨基酸，LE代表XhoI (CTCGAG)翻譯的氨基酸。
[0054] 圖3、pET21a(+)/affibody的重組質(zhì)粒電泳圖。
[0055] Ml :DNA marker ; 1-5 分別為 pET21a (+)/ZHPV16E7:127、pET21a (+)/ZHPV16E7:301、 pET21a(+)/ZHPV16E7:3S4、pET21a(+)/ZHPV16E7:745及 pET21a(+)/Z wt的重組質(zhì)粒。
[0056] 圖4、Affibody重組蛋白原核表達(dá)（A)及純化⑶的SDS-PAGE電泳分析。
[0057] A中：M :蛋白marker ; 1-2分別為BL21 (DE3)菌株和pET21 (+)空載體轉(zhuǎn)染 的 BL21(DE3)菌株，3-8 分別為 pET21a(+)/ZHPV16E7:127、pET21a(+)/ZHPV16E7: 3(n、pET21a(+)/ ZHPV16E7:384、pET21a ⑴/ZHPV16E7:745及 pET21a ⑴/Z wt的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 BL21 (DE3)菌株。
[0058] B 中：M :蛋白 marker ; 1_5 分力U為純化后 Zhpv16 E7:127，Zhpv16 E7:301，Zhpv16 E7:384，Zhpv16 E7:745及Zwt affibody重組融合蛋白。
[0059] 圖 5、HPV16E7 重組蛋白的 SDS-PAGE 電泳及 Western Blot 分析。
[0060] M :marker ;1· E. coli. BL21(DE3)菌株；2.重組質(zhì)粒 pET21a(+)/HPV16E7 蛋白表 達(dá)；3.純化后HPV16E7重組融合蛋白。A :SDS-PAGE ;B Western Blot分析，一抗為His單 抗（I: 10000) ;C :Western Blot分析，一抗為宮頸癌患者血清（1:500)。
[0061] 圖6、Zhpv16 E7結(jié)合多肽在ProteOn XPR36儀器上的SPR檢測(cè)。
[0062] A、B、C、D、E 分力丨」為 Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745及 Z wt蛋白與革巴蛋 白HPV16E7的親和力分析。
[0063] 圖7、Zhpv16 E7結(jié)合多肽與HPV16 E7天然蛋白親和力的細(xì)胞免疫熒光方法鑒定。
[0064] A :ZHPV16 E7:127結(jié)合多肽的間接免疫熒光檢測(cè)；B :ZHPV16 E7:3M蛋白的間接免疫熒光檢 測(cè)；C :ZHPV16 E7:3S4蛋白的間接免疫熒光；D :ZHPV16 E7:745蛋白的間接免疫熒光檢測(cè)；E :HPV16E7 兔抗體為一抗的間接免疫熒光檢測(cè)。
[0065] 圖8、Dylight755標(biāo)記的Zhpv16 E7:3S4結(jié)合多肽SDS-PAGE電泳及熒光分析。
[0066] A 為 Zhpv16 E7:3S4多肽 SDS-PAGE 電泳分析；B 為標(biāo)記 Dylight755 的 Z HPV16 E7:3S4多肽 SDS-PAGE電泳的熒光分析。
[0067] 圖9、Dylight755標(biāo)記的Zhpv16 E7:3S4多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向的成 像分析。A為Dylight755標(biāo)記的Zhpv16 E7:3S4多肽各時(shí)間點(diǎn)分別在負(fù)載Siha、Caski、HeLa229 和A375細(xì)胞荷瘤裸鼠體內(nèi)的熒光成像；B為各時(shí)間點(diǎn)分別在負(fù)載Siha、Caski、HeLa229和 A375細(xì)胞（按照自上而下的次序）荷瘤裸鼠體內(nèi)的平均熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0068] 圖10、Dylight755標(biāo)記的Zhpv16 E7:3S4多肽在荷瘤裸鼠各臟器和腫瘤組織中的成像 分析。Al-Dl為在注射Dylight755標(biāo)記的Z hpv16 E7:3S4多肽24h后，在荷載腫瘤的裸鼠各主 要組織臟器中的熒光分布；A2-D2為相應(yīng)腫瘤組織及各臟器的平均熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0069] 圖11、四種Zhpv16 E7結(jié)合多肽對(duì)Siha細(xì)胞的IC50分析。A、B、C、D分別為ZHPV16E7:127、 ZhPV16 E7:301' Zhpv16 E7:384^- Z hpv16 ￡7:745 蛋白對(duì)Siha細(xì)胞的IC50分析。
[0070] 圖12、不同濃度Zhpv16 E7結(jié)合多肽對(duì)Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。A、B、C、D分別為 不同濃度的 ZhPV16 ￡7:127'' Zhpv16 ￡7:300 Zhpv16 E7 ； 384及 Z HPV16 E7 ;745蛋白對(duì)Siha細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作 用。
[0071] 圖 13、pET21a(+)/ZHPV16 E7affitoxin 重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。
[0072] 圖 14、Zhpv16 E7 affitoxin 蛋白 SDS-PAGE 電泳和 WB 鑒定。
[0073] A :1，BL21(DE3)菌株；2, pET21a(+)載體轉(zhuǎn)化的 BL21(DE3) ;3-7 分別為 pET21a(+)/HPV16 E7affitoxinl27, 301，384, 745 和 Zwt affitoxin 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 BL21(DE3)菌株；
[0074] B :ZHPV16 E7 affitoxinl27, 301，384, 745 和 Zwt affitoxin 純化蛋白 SDS-PAGE 電泳 圖；1-5 分別為 Zhpv16 E7affitoxinl27, 301，384, 745 和 Zwt affitoxin ;
[0075] C :為 Zhpv16 E7 affitoxinl27, 301，384, 745 Western blot 分析（一抗為 His 單抗），1為BL21 (DE3)菌株，2為pET21a⑴載體轉(zhuǎn)化的BL21 (DE3)，3-6分別為Zhpv16 E7affitoxinl27, 301, 384, 745 ；
[0076] D :為 Zwt affitoxin 蛋白 Western blot 分析（一抗為 His 單抗），1 為 BL21 (DE3) 菌株，2 為 pET21a(+)載體轉(zhuǎn)化的 BL21(DE3)，3 為 Zwt affitoxin 蛋白。
[0077] E :HPV16 E7_afTitoxin 蛋白 Western blot 分析（一抗為兔抗 SPA-Z 多 抗），1為BL21 (DE3)菌株2為pET21a⑴載體轉(zhuǎn)染的BL21 (DE3)，3-6分別為HPV16 E7affitoxinE127, 301，384, 745。
[0078] F :為 Zwt affitoxin 蛋白 Western blot 分析（一抗為兔抗 SPA-Z 多抗），1 為 BL21(DE3)菌株，2 為 pET21a(+)載體轉(zhuǎn)化的 BL21(DE3)，3 為 Zwt affitoxin 蛋白。
[0079] 圖15、Zhpv16 E7 affitoxin與HPV16 E7天然蛋白親和力的細(xì)胞免疫熒光鑒定。A : Zhpv16 E7 affitoxinl27蛋白；B :ZHPV16 E7 affitoxin301 蛋白；C :ZHPV16 E7 affitoxin384蛋白； D :ZHPV16 E7 affitoxin 745 蛋白。
[0080] 圖 16、Zhpv16 E7 affitoxin 蛋白在 ProteOn XPR36 儀器上的 SPR 檢測(cè)。A、B、C、D、 E 分別為 Zhpv16 E7 affitoxinl27、301、384、745及Zwtaf?itoxin蛋白蛋白與靶蛋白HPV16E7 的親和力分析。
[0081] 圖 17、Zhpv16 E7 affitoxin384 對(duì) Caski 細(xì)胞⑷和 Siha 細(xì)胞⑶的 IC50 分析。
[0082] 圖18、ZHPV16 E7 affitoxin384對(duì)四種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
[0083] 圖19、不同濃度Zhpv16e7 affitoxin384對(duì)Siha(A)和Caski⑶細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作 用。
[0084] 圖 20、血漿中 ZHPV16E7:384⑶與 Zhpv16e7 affitoxin384(A)半衰期檢測(cè)。
[0085] 圖21、Zhpv16 E7 affitoxin384對(duì)Balb/c荷瘤裸鼠的抑瘤作用效應(yīng)。
[0086] A :五組小鼠在接種Siha的同時(shí)，尾靜脈注射4mg/kg濃度的Zhpv16e7 affitoxin384 或Zhpv16e7:384、PE38KDEL蛋白、Zwt affitoxin蛋白及PBS，每隔3天注射一次，共6次，圖中 箭頭所示。
[0087] B :五組小鼠在接種Siha后，待腫瘤長(zhǎng)至100~200mm3大小時(shí)，尾靜脈注射4mg/kg 濃度的 Zhpv16e7 Affitoxin384 或 ZHPV16E7:384、PE38KDEL 蛋白、Zwt affitoxin 蛋白及 PBS，每 隔3天注射一次，共6次，圖中箭頭所示。
【具體實(shí)施方式】
[0088] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次揭示了一種對(duì)人乳頭瘤病毒16型（HPV16)的E7 蛋白具有結(jié)合親和力的多肽；本發(fā)明還提供了該多肽作為藥物或分子靶向試劑的診斷或治 療用途。
[0089] 如本文所用，所述的"對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和力的多肽"是指以葡萄球菌A蛋 白Z段的氨基酸序列作為骨架，進(jìn)行10-20個(gè)氨基酸變異后獲得的多肽，且該多肽能夠特異 性結(jié)合HPV16 E7、具有極少或沒有非特異性結(jié)合。
[0090] 如本文所用，所述的"本發(fā)明的多肽"、"對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和力的多肽"、 "HPV16 E7 結(jié)合多肽"、"ZHPV16E7 affibody 多肽"、"Zhpv16e7 affib〇dy"、"ZHPV16E7"、"affib〇dy 蛋 白"、"affibody重組蛋白"、"Zhpv16 E7重組蛋白"可以互換使用。
[0091] 如本文所用，所述的"靶向性分子"是指將本發(fā)明的對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和力 的多肽與其它功能性偶聯(lián)物連接后獲得的、可以靶向HPV16 E7的分子。所述的偶聯(lián)物可以 是半胱氨酸殘基，多肽標(biāo)簽，抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物，酶或可檢測(cè)標(biāo)記物等。
[0092] 如本文所用，所述的"融合多肽"是所述的"靶向性分子"的下位概念，是指本發(fā)明 的對(duì)HPV16 E7具有結(jié)合親和力的多肽與其它功能性肽（例如毒素蛋白或功能性蛋白片段） 連接后獲得的、可以靶向HPV16 E7的分子。
[0093] HPV16型感染是致宮頸癌的主要型別。HPV感染宿主細(xì)胞后，其病毒基因整合到宿 主染色體，進(jìn)而使宿主細(xì)胞發(fā)生突變并發(fā)展為腫瘤，其致癌的主要關(guān)鍵分子之一是HPV基 因早期區(qū)（E)編碼的E7蛋白，E7蛋白主要通過其氨基端的保守序列LXCXE與抑癌蛋白pRb 結(jié)合，使正常狀態(tài)下與Rb結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F解離出來，并滅活pRb蛋白，解離的E2F即可 激活基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了眾多細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞過度增殖惡性轉(zhuǎn)化。高危型 HPV E7蛋白是HPV所致宮頸癌的腫瘤原性蛋白，持續(xù)并穩(wěn)定地在宮頸癌及其癌前病變組織 中呈高表達(dá)，而在正常組織中不存在。綜合考慮上述因素，本發(fā)明人選擇HPV16 E7作為靶 抗原。本發(fā)明人以葡萄球菌A蛋白的Z結(jié)構(gòu)域（Zwt，SEQ ID NO: 1)作為支架，將其表面氨基 酸殘基模擬抗體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)突變，通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建突變文庫，以HPV16 E7 作為靶抗原對(duì)該文庫進(jìn)行親和篩選，經(jīng)過大量的篩選工作，最終獲得了對(duì)于HPV16 E7具有 高度親和力的多肽。
[0094] 本發(fā)明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列作為骨架，進(jìn)行14-20 個(gè)（較佳地為14個(gè)）氨基酸變異后獲得的多肽。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明的多肽相 對(duì)于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQ ID N0:5)，在第9-11，13-14，17-18,24-25， 27-28, 32, 35,43位上發(fā)生氨基酸突變。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有SEQID NO: 2-5任一所 示的氨基酸序列。
[0095] 本發(fā)明還涵蓋了在所述HPV16 E7結(jié)合多肽的氨基酸序列任一末端或兩端加入額 外的氨基酸殘基而形成的多肽。這些額外的氨基酸殘基可以在多肽結(jié)合HPV16 E7時(shí)起作 用，但是也可同樣用于其它目的，如涉及該多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定、偶聯(lián)或檢測(cè)的一種或幾 種。這些額外的氨基酸殘基可以包括一或多種為了化學(xué)偶聯(lián)目的而添加的氨基酸殘基。如 在多肽鏈的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一個(gè)半胱氨酸殘基等。這種額外 的氨基酸殘基也可以包括用于多肽純化或檢測(cè)的一個(gè)"標(biāo)記"，如與標(biāo)記抗體相互作用的六 組氨酸肽（His 6)標(biāo)記，或"myc"標(biāo)記或"flag"標(biāo)記。此外，其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的替 代方式也包含在本發(fā)明中。
[0096] 所述"額外的氨基酸殘基"也可構(gòu)成具有預(yù)期功能的一個(gè)或多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域，如與 第一個(gè)、HPV16E7結(jié)合結(jié)構(gòu)域相同的結(jié)合功能，或者其它結(jié)合功能，或是一種酶促功能，或是 一種熒光功能，或是其組合。
[0097] 本發(fā)明也包含在所述的HPV16 E7結(jié)合多肽基礎(chǔ)上，經(jīng)修飾進(jìn)而增加其在堿性條件 下的穩(wěn)定性的多肽。這種穩(wěn)定性包括用對(duì)于堿性條件較不敏感的氨基酸殘基定點(diǎn)取代在沒 有修飾的序列中出現(xiàn)的任何天冬酞胺殘基。由于在不同的反應(yīng)之間親和層析柱要經(jīng)受頻繁 的強(qiáng)堿處理以進(jìn)行洗脫，這種對(duì)堿降低敏感性的特性，有利于使用本發(fā)明的多肽作為親和 層析中的親和配體，能夠延長(zhǎng)親和層析基質(zhì)的使用壽命。
[0098] 本發(fā)明也包含在本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽基礎(chǔ)上，進(jìn)行其它修飾后獲得的多 肽。這些修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn) 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶（如哺乳動(dòng) 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。
[0099] 本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽可以與偶聯(lián)物連接，從而構(gòu)成功能性的靶向性分子， 這種連接可通過化學(xué)鍵（包括肽鍵）相連或吸附；所述的化學(xué)鍵是共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。作 為一種優(yōu)選方式，通過肽鍵連接，從而形成融合多肽。
[0100] 所述的HPV16 E7結(jié)合多肽與偶聯(lián)物之間可以直接相連接，或者通過多肽連接子 (連接肽）連接。所述的連接子例如包括1-30個(gè)氨基酸；較佳地為1-20個(gè)氨基酸。連接 肽的設(shè)置基本上不影響融合蛋白中各多肽的活性。較佳地，可以利用柔性肽（61 745虹)3進(jìn) 行連接。其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的連接肽也可應(yīng)用于本發(fā)明。
[0101] 在"異源"融合多肽中，所述HPV16 E7結(jié)合多肽構(gòu)成了第一個(gè)結(jié)構(gòu)域或第一個(gè)部 分，第二和其它部分具有除了結(jié)合HPV16 E7外的其它功能，這些可預(yù)期的結(jié)果也在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。該融合多肽的第二和其它部分可能包含對(duì)除了 HPV16 E7外的其它靶分子具有 親和力的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可能與SPA結(jié)構(gòu)域相關(guān)，但在1到大約20個(gè)位置 具有取代突變。結(jié)果是融合多肽有至少一個(gè)HPV16 E7結(jié)合結(jié)構(gòu)域和至少一個(gè)與所述其它 靶分子具有親和力的結(jié)構(gòu)域。這擴(kuò)展了本發(fā)明的多肽的應(yīng)用，如作為治療制劑或作為捕獲、 檢測(cè)或分離試劑。
[0102] 本發(fā)明融合多肽第二和其它部分的其它選擇包括用于治療性應(yīng)用的一或多種部 分。在治療性應(yīng)用中，其它分子也可以通過其它方法共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)到本發(fā)明的多肽上。 作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，將改造的銅綠假單胞菌外毒素 PE38KDEL通過柔性肽連接于 HPV16 E7結(jié)合多肽的C-末端，構(gòu)成融合蛋白。非限制性例子包括用本發(fā)明多肽引導(dǎo)效應(yīng) 酶（例如羧肽酶）而進(jìn)行"ADEPT〃（抗體介導(dǎo)的酶前藥治療，antibody-directed enzyme prodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞和其它組分的蛋白質(zhì)；包括細(xì) 胞因子，如IL-2、IFNy、IL-12、TNFa、IPlO ;包括促凝血因子，如組織因子、von Willebrand 因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物堿；包括毒性小分子，如 auri statin類似物、阿霉素等。同時(shí)，為了更方便摻入放射性核素（如6SGa、76Br、 111 In、"Tc、 124I、125I)用于診斷或放射性核素（如9°Y、 mI、mAt)用于治療，可以考慮上述列舉的額外的 氨基酸（特別是六組胺酸標(biāo)記和半胱氨酸），其目的是將放射性同位素的鰲合劑偶聯(lián)到多 妝序列。
[0103] 本發(fā)明還涵蓋了在所述的HPV16 E7結(jié)合多肽上連接一個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記物（如熒光 標(biāo)記，生物素或放射性同位素），從而可基于本發(fā)明的多肽的特異性，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)HPV16感染 或HPV16感染相關(guān)疾病的目的。
[0104] "HPV16 E7結(jié)合親和力"是指可以例如通過利用表面等離子共振（surfaceplasmon resonance)技術(shù)如Biocore*?裝置進(jìn)行檢測(cè)的一種多肽特性。HPV16 E7結(jié)合親和力可以通 過一個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，其中將HPV16 E7固定在該裝置的感應(yīng)芯片上，然后將含有待測(cè)多肽 的樣品通過該芯片?；蛘?，也可以將待檢測(cè)的多肽固定在該裝置的感應(yīng)芯片上，然后將含 有HPV16 E7的樣品通過該芯片。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用所獲得的感應(yīng)圖像建立多肽的 HPV16 E7結(jié)合親和力的至少一種定性測(cè)量方法。如果需要定量測(cè)量方法，例如為了建立相 互作用間的某個(gè)Kd值，也可以使用表面等離子共振方法。例如，結(jié)合值可以利用Biocore li 2000裝置（Biocore AB)進(jìn)行測(cè)定。HPV16 E7固定于該裝置的感應(yīng)芯片上，而親和力待檢 測(cè)的多肽樣品通過連續(xù)稀釋制備并以隨機(jī)順序進(jìn)行注射。然后可從結(jié)果中計(jì)算Kd值。在 本發(fā)明的實(shí)施例中，所述的多肽的K d值達(dá)到I X 10 6M至I X 10 7M。
[0105] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽或靶向性分子或融合多肽的分 離的核酸，也可以是其互補(bǔ)鏈。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR擴(kuò)增的方法分別 獲得。
[0106] 本發(fā)明還提供了包含編碼所述核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸 分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達(dá)。如本文所用，"操作 性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線 性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制以編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作 地連于編碼序列。
[0107] 在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞的克隆和表達(dá)的載體，如Pouwels等，克隆載體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中所描述的。
[0108] 此外，含有所述核酸序列的重組細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原 核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等；例如可為大腸桿菌細(xì) 胞（E. coli)，如大腸桿菌HMS174 (DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、 昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0109] 生產(chǎn)本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本 發(fā)明中。所述方法包括培養(yǎng)含有相應(yīng)多肽的編碼核酸的重組細(xì)胞，獲得產(chǎn)物多肽?？蓪⑸?述制備獲得的多肽純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。
[0110] 基于要表達(dá)多肽的信息和目前重組表達(dá)蛋白質(zhì)的技術(shù)水平，結(jié)合本發(fā)明揭示的內(nèi) 容，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于制備本發(fā)明的多肽。例如，表達(dá)未被修飾的Z結(jié)構(gòu)域的質(zhì)?？梢杂?作起始材料。使用已知技術(shù)，所需的取代突變可以被引入這個(gè)質(zhì)粒中以獲得本發(fā)明的表達(dá) 載體。
[0111] 當(dāng)使用化學(xué)多肽合成方法制備本發(fā)明的多肽或靶向性分子或融合蛋白時(shí)，上述多 肽中的任何天然產(chǎn)生的氨基酸殘基都可以被任何相應(yīng)的、非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基或其衍 生物所取代，只要產(chǎn)物多肽的功能基本不被損害。
[0112] 本發(fā)明還涉及所述的HPV16 E7結(jié)合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的 應(yīng)用，包括應(yīng)用于治療、診斷和/或檢測(cè)。
[0113] 本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽可作為HPV16 E7抗體在不同應(yīng)用中的一種替代物。 作為非限制性的實(shí)例，其可用于治療特征以HPV16 E7表達(dá)或HPV16感染為特征的疾病，例 如腫瘤（如宮頸癌，頭頸部腫瘤）等。通過結(jié)合胞內(nèi)HPV16 E7以抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，用于 相關(guān)疾病的體內(nèi)和體外診斷。本發(fā)明的多肽可作為一種檢測(cè)試劑、一種捕獲試劑或者分離 試劑，而且還可直接用作為一種治療制劑或者將其它治療制劑靶向HPV16 E7蛋白的手段。 體外使用本發(fā)明的多肽的方法可以不同方式進(jìn)行，如微量滴定板、蛋白陣列、生物傳感器表 面和組織切片等等。為了使本發(fā)明多肽適用于特異的用途，在不偏離本發(fā)明的范圍的情況 下，可以對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行修飾和/或添加。在下面詳細(xì)描述了這些修飾和添加，其可能 包括在同一多肽鏈中包含的額外的氨基酸，或者標(biāo)記和/或治療制劑，其化學(xué)修飾或以其 它方式結(jié)合本發(fā)明的多肽。另外，本發(fā)明還涵蓋了保留了結(jié)合HPV16 E7能力的該多肽的片 段。
[0114] 本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽可以作為治療制劑，其治療作用基于至少一種以下機(jī) 制：（i)加強(qiáng)化療作用，施用本發(fā)明的多肽與目前和將來的化療治療協(xié)同作用。阻斷胞內(nèi)的 HPV16 E7蛋白對(duì)抑癌基因 pRb的破壞作用；（ii)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。可能在細(xì)胞內(nèi)存在 以下機(jī)制：當(dāng)結(jié)合多肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與HPV16 E7蛋白結(jié)合時(shí)，阻斷了 HPV16 E7與pRb的結(jié) 合，從而阻斷了細(xì)胞生長(zhǎng)增殖信號(hào)。
[0115] 本發(fā)明多肽的HPV16 E7結(jié)合特性以及用該多肽生產(chǎn)靶向性分子（包括融合蛋白） 和/或標(biāo)記的結(jié)合分子的穩(wěn)定性意味著該多肽也可以用于將其它活性物質(zhì)靶向腫瘤部位， 這些腫瘤包括表達(dá)HPV16 E7的細(xì)胞。因此，本發(fā)明的另一方面是提供了本文所述的HPV16 E7結(jié)合多肽與一種具有抗癌活性的物質(zhì)偶聯(lián)的應(yīng)用，以將所述物質(zhì)運(yùn)送到表達(dá)HPV16 E7 的細(xì)胞，產(chǎn)生靶細(xì)胞的損傷或凋亡。
[0116] 這種抗癌活性的物質(zhì)可能是通過融合或通過化學(xué)鍵偶聯(lián)到HPV16 E7結(jié)合多肽上 的蛋白質(zhì)，如選自用于"ADEPT"（antibody-directed enzyme prodrug therapy)應(yīng)用的效 應(yīng)酶；用于募集免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞和其它組分的蛋白；細(xì)胞因子，如IL-2、IFNy、IL-12、 TNFa a、IP 10等；促凝血因子，如組織因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白 A、假單胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物堿等。或者，所述活性物質(zhì)也可能是細(xì)胞 毒性藥物，如auristatin類似物或阿霉素或放射性同位素（如 9°Y、131I、211At等），這種同位 素可與HPV16 E7結(jié)合多肽直接結(jié)合，或通過一種鰲合劑，如熟知的鰲合劑DOTA或DTPA而 與HPV16 E7結(jié)合多肽結(jié)合。
[0117] 在相關(guān)方面，本發(fā)明還提供了一種在體內(nèi)將具有抗癌活性的物質(zhì)導(dǎo)向表達(dá) HPV16E7細(xì)胞的方法，包括施用給患者本文所述的所述活性物質(zhì)與與HPV16 E7結(jié)合多肽的 偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物在前文已被適當(dāng)描述。
[0118] 本發(fā)明還包括使用所述的與HPV16 E7結(jié)合的多肽檢測(cè)樣品中的HPV16 E7蛋白。 例如，這種檢測(cè)可以用來診斷特征為表達(dá)HPV16 E7的疾病情況。檢測(cè)HPV16 E7的存在可以 在體內(nèi)也可以在體外進(jìn)行。體內(nèi)診斷的優(yōu)選選擇是使用正電子放射X線斷層攝影術(shù)，PET。 被檢測(cè)的樣品可以例如是生物學(xué)液體樣品或組織樣品?，F(xiàn)在的普遍方法是用針對(duì)與HPV16 E7的抗體，這種方法可以適用于本發(fā)明的與HPV16 E7結(jié)合多肽，這種方法是組織化學(xué)方法 檢測(cè)與HPV16 E7的存在，用來鑒定新鮮、冷凍或福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品中與 HPV16 E7蛋白的表達(dá)。為了檢測(cè)HPV16 E7,本發(fā)明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其 中其它結(jié)構(gòu)域是報(bào)告酶或熒光酶?；蛘?，其也可以是被一個(gè)或多個(gè)熒光制劑和/或放射性 同位素標(biāo)記的，任選通過鰲合劑標(biāo)記。合適的放射性同位素包括 68GaJ6 Br、mIn、99TC、124I 和125I等。
[0119] 本發(fā)明還包括將所述的HPV16 E7結(jié)合多肽應(yīng)用于檢測(cè)生物學(xué)液體樣品中 HPV16E7。這個(gè)方法包括以下步驟：（1)提供被檢測(cè)患者的生物學(xué)液體樣品，（2)將本文所述 的HPV16 E7結(jié)合多肽在能使所述多肽與樣品中存在的任何HPV16 E7結(jié)合的條件下加入樣 品中，（3)除去非結(jié)合的多肽，及（4)檢測(cè)結(jié)合的多肽。被檢測(cè)到的結(jié)合的多肽的量與樣品 中存在的HPV16 E7量相關(guān)。在步驟（2)中，HPV16 E7結(jié)合多肽可以以任何適宜的形式加 入到樣品中，包括例如這樣的情況，當(dāng)HPV16 E7結(jié)合多肽被固定在一種固體支持物上，通過 其使樣品接觸，或HPV16 E7結(jié)合多肽存在于溶液中。
[0120] 所述的HPV16 E7結(jié)合多肽的其它應(yīng)用還包括：檢測(cè)樣品中HPV16 E7的方法，包括 如下步驟：（1)提供一種懷疑含有HPV16 E7的組織樣品，例如冷凍切片或用福爾馬林包埋 的組織切片，（2)在適宜條件下加入本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽到所述樣品中，所述條件 為益于所述多肽與樣品中存在的任何HPV16 E7結(jié)合，（3)除去未結(jié)合的多肽，及（4)檢測(cè) 結(jié)合的多肽。檢測(cè)到的結(jié)合的多肽的量與樣品中存在的HPV16 E7的量相關(guān)。
[0121] 本發(fā)明還提供了一個(gè)診斷組織樣品中HPV16 E7表達(dá)的試劑盒，包括與報(bào)告酶（如 堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶）融合的、本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽、檢測(cè)酶活性的試劑、 和陽性和陰性對(duì)照組織切片。
[0122] 本發(fā)明還提供了一個(gè)診斷組織樣品中HPV16 E7表達(dá)的試劑盒，包括通過抗體檢測(cè) 的與標(biāo)記（如flag標(biāo)記或myc標(biāo)記）融合的本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽、一個(gè)特異于標(biāo) 記的一抗、特異于一抗并與報(bào)告酶偶聯(lián)的二抗、檢測(cè)酶活性的試劑，和陽性和陰性對(duì)照組織 切片。
[0123] 診斷應(yīng)用的一個(gè)領(lǐng)域就是在體內(nèi)檢測(cè)癌細(xì)胞或其聚集物。本發(fā)明提供了一個(gè)進(jìn)行 這種診斷的試劑盒，該試劑盒包括標(biāo)記有一個(gè)鰲合物的、本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽、一種 診斷用放射性同位素（非限制性的例子是6SGa、76B r、mIn、MTc、124I和125I等），以及用于分 析摻入效率的試劑。
[0124] 如上所述，本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽將活性物質(zhì)靶向表達(dá)HPV16 E7的細(xì)胞如某些類型的癌癥細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一個(gè)用于此目的的試劑盒，該試 劑盒包括用一個(gè)鰲合物標(biāo)記的本發(fā)明的HPV16 E7結(jié)合多肽、一個(gè)治療性放射性同位素（非 限制性的例子是9°Y、mI、mAt)，以及用于分析摻入效率的試劑。
[0125] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含：有效量的本發(fā)明所述的對(duì)人乳頭瘤病毒 16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽或靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，和藥學(xué)上 可接受的載體。
[0126] 如本文所用，"藥學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良 副反應(yīng)（如毒性）的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"指 用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身 并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所 熟知的。在 Remington' s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J· 1991)中可找到 關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、 鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕 劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。
[0127] 可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動(dòng)物給藥的劑型，所述劑型包括但不限 于：注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑。
[0128] 在使用時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有 結(jié)合親和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳動(dòng)物（如人），其中該安全有效量通常至少約1 微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1 微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況 等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0129] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0130] 實(shí)施例1、HPV16E7結(jié)合多肽的文庫構(gòu)建及篩選研究
[0131] 構(gòu)建噬菌體展示HPV16 E7結(jié)合多肽的隨機(jī)組合文庫，即許多不同的SPA結(jié)構(gòu)域相 關(guān)多肽的文庫，從該文庫中篩選HPV16 E7結(jié)合多肽，并對(duì)其親和性進(jìn)行了鑒定。
[0132] 1、HPV16 E7結(jié)合多肽的隨機(jī)組合噬菌體展示文庫的構(gòu)建和鑒定
[0133] 根據(jù)野生型SPA-Z的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)（Nilsson B等，Protein Eng. 1987 ; 1 (2) : 107-113)，針對(duì)其三個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)對(duì)應(yīng)的編碼序列設(shè)計(jì)隨機(jī)引物，利用PCR方法擴(kuò)增 獲得可導(dǎo)致隨機(jī)氨基酸突變的SPA編碼序列，命名為SPA-N。
[0134] 2、pCANTAB5E/SPA-N 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0135] 選擇以M13噬菌體系統(tǒng)（購自北京寶科維食安生物公司）進(jìn)行親和體的表達(dá)，因 此以PCANTAB5E (購自北京寶科維食安生物公司）為載體，通過Sfi I和Not I將獲得的 SPA-N編碼序列克隆至pCANTAB5E載體的Sf i I/Not I位點(diǎn)內(nèi)，構(gòu)建pCANTAB5E/SPA-N重組 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli TGl細(xì)胞中，涂布2YT-A平板，37°C培養(yǎng)過夜。即為初級(jí)庫，標(biāo) 記為affibody初級(jí)庫備用。結(jié)果隨機(jī)挑取平板上長(zhǎng)出的28個(gè)單克隆菌落，將提取質(zhì)粒用 Sfi I和Not I雙酶切鑒定為陽性克隆，經(jīng)測(cè)序和分析其隨機(jī)性。
[0136] 結(jié)果：根據(jù)測(cè)序結(jié)果，送測(cè)序的28個(gè)克隆中有測(cè)序結(jié)果的為26個(gè)克隆，其中連接 成功21個(gè)克隆，隨機(jī)性完全不同，故重組率為21/26 = 88%;多樣性為21/21 = 100%。同 時(shí)，取上述轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)的菌液，用2 X YT培養(yǎng)液倍比稀釋（1:10,1: IO2……），涂布SOB-AG平 板，計(jì)算平板上的單菌落數(shù)，推算庫容。通過增加連接轉(zhuǎn)化次數(shù)累計(jì)庫容，多次連接轉(zhuǎn)化后 使克隆數(shù)達(dá)到2. 4X IO5個(gè)Z蛋白變體（affibody分子），其在第9、10、11、13、14、17、18、24、 25、27、28、32、35和43位具有隨機(jī)的氨基酸殘基。
[0137] 3、HPV16 E7結(jié)合多肽的篩選和滴度測(cè)定
[0138] 將純化的HPV16 E7蛋白包被96孔酶標(biāo)板，經(jīng)封閉、加噬菌體文庫（初級(jí)庫）孵育、 再加入E. coli TG137°C，輕搖溫育；取100 μ 1，用2*YT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液 100 μ 1涂布SOB-AG平板，30°C過夜，計(jì)數(shù)結(jié)合噬菌體感染菌落數(shù)，計(jì)算HPV16E7結(jié)合噬菌體 滴度；結(jié)果平板可見菌落，滴度是1〇 2;此時(shí)完成第一輪淘洗，另部分菌液加10 w輔助噬菌體 M13K07(購自北京寶科維食安生物公司）和卡那霉素培養(yǎng)過夜，離心后取上清經(jīng)0. 22 μπι濾 膜過濾，獲得HPV16 Ε7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為一級(jí)affibody庫。重復(fù)上述4輪 富集篩選，分別獲得HPV16 E7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為二級(jí)，滴度分別為I X IO6; 在二級(jí)庫的基礎(chǔ)上再重復(fù)上述4輪富集篩選，為三級(jí)文庫，滴度為I X 108。同時(shí)設(shè)置不加噬 菌體的空白對(duì)照作同步篩選。
[0139] 4、HPV16 E7結(jié)合多肽單克隆噬菌體的制備及ELISA鑒定
[0140] ELISA用于篩選表達(dá)HPV16 E7結(jié)合affibody分子的噬菌體。將lOμg/ml的 HPV16E7蛋白以200 μ 1/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C過夜；PBS洗滌，用2%脫脂奶粉封閉2h ; 洗滌，取四輪篩選后獲得的噬菌體與等體積的3 %脫脂奶粉混勻，200 μ 1/孔，37°C，2h。洗 滌，加入 1:10000 稀釋的 HRP/anti-M13 酶標(biāo)二抗（兔抗 M13, Abcam#ab6188)，200 μ 1/ 孔， 37°C，Ih ;洗滌，加入 OPD 顯色液 200 μ 1/ 孔，37°C，15min ;2M H2S0450 μ 1/ 孔，終止反應(yīng)；置 酶標(biāo)儀（ELx800TM，ΒΙ0-ΤΕΚ，Winooski，USA)讀取 0D490 值。
[0141] 在四輪淘選循環(huán)中選擇結(jié)合抗原的affibody分子，經(jīng)過這四輪選擇循環(huán)，進(jìn)一步 用噬菌體ELISA檢測(cè)以分析其HPV16 E7結(jié)合活性，用高于0. 5的0D490的ELISA值為選擇 標(biāo)準(zhǔn)，鑒定編碼HPV16 E7結(jié)合多肽的噬菌體，選擇高于這個(gè)ELISA信號(hào)值的150個(gè)克隆，并 與另外隨機(jī)挑選12個(gè)無 ELISA值的克隆進(jìn)行DNA序列分析。
[0142] 5、HPV16 E7親和體分子的序列檢測(cè)及篩選
[0143] 共150個(gè)單克隆送中國(guó)上海生工公司測(cè)序，測(cè)序引物為CATATGGTTGACAACAAATTCA ACAAAGAA(SEQ ID NO: 12)。測(cè)序結(jié)果用DNA STAR軟件分析對(duì)標(biāo)準(zhǔn)序列SPA-Z與SPA-N進(jìn) 一步分析其三個(gè)螺旋區(qū)的隨機(jī)性和多樣性。結(jié)果獲78個(gè)完全正確克隆序列，有部分序列完 全重復(fù)，兼并重復(fù)序列后獲得65個(gè)序列完全正確的克隆。
[0144] 根據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，在上述測(cè)序正確的65個(gè)克隆中，選擇與HPV16 E7蛋 白結(jié)合活性最強(qiáng)的4個(gè)單克隆噬菌體（即呈現(xiàn)HPV16 E7親和體分子的單克隆噬菌體）的 DNA序列（分別為 ZhPV16E7 :127、Zhpv16E7 :301、Zhpv16E7 :384、ZhPV16E7 :745 )作為靶目標(biāo)進(jìn)行研究，氨基酸序 列為SEQIDN0:1、2、3、4，如圖1，它們的編碼序列如SEQIDN0:6-9)。下一步用于HPV16 E7結(jié)合親和體的分子克隆和表達(dá)及功能檢測(cè)。
[0145] 本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，將構(gòu)建的affibody隨機(jī)肽庫，展示在噬菌體表面， 以HPV16 E7蛋白為靶標(biāo)蛋白，進(jìn)行HPV16 E7親和體的篩選。經(jīng)過四輪淘洗，每輪均經(jīng)過： 親和-洗滌-擴(kuò)增，且靶蛋白HPV16 E7蛋白的濃度隨著淘洗次數(shù)的增加而降低，50 μ g/ ml、30 μ g/ml、15 μ g/ml、10 μ g/ml從而能更好的篩選出親和力高的親和體，而隨著每輪的 大量擴(kuò)增，親和體每輪均會(huì)有IO2的選擇性富集。經(jīng)ELISA進(jìn)一步篩選出OD值讀數(shù)較高 (A49Q>0. 5)的單克隆測(cè)序，將測(cè)序完整正確的HPV16 E7 affibody序列通過NTI軟件比對(duì)分 析，而后隨機(jī)挑取親和力較高的4個(gè)單克隆進(jìn)行下一步的研究，此4個(gè)克隆的氨基酸序列分 析與標(biāo)準(zhǔn)的野生型比對(duì)，三個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)可變區(qū)域出現(xiàn)了約13-14個(gè)氨基酸的改變。。
[0146] 實(shí)施例2、HPV16E7結(jié)合多肽重組質(zhì)粒構(gòu)建和原核蛋白表達(dá)及純化
[0147] 如前選擇了具有較高ELISA讀數(shù)的4個(gè)克?。▓D1中的affibody Zhpv16 E7:127、 ZhPV16E7:301 ' Zhpv16 E7:384' Zhpv16 e7：745 )，為了對(duì)篩選的affibody分子進(jìn)行功能檢測(cè)，對(duì)其進(jìn)行重 組質(zhì)粒構(gòu)建、原核蛋白的表達(dá)及其鑒定，并制備純化蛋白。
[0148] I. pET21a(+)/affibody的重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定
[0149] 參照 affibody 基因序列（GenBank :GY324633. 1)設(shè)計(jì) PCR 引物，上游引物 5'GGGA ATTCCATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA 3'（SEQ ID NO: 13,下劃線表示 Ned I 酶切位點(diǎn)）， 下游引物 5' CCGGAATTCCGTTTCGGAGCCTGAGCGT3' (SEQ ID NO: 14,下劃線表示 Xho I 酶切位 點(diǎn)）；以篩選的測(cè)序正確四級(jí)庫單克隆affibody ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhpV16 E7: 745 為模板，通過 PCR 擴(kuò)增 affibody 目的基因 （SEQ ID N0:6-9)，同時(shí)將 affibody Zwt(SEQ ID NO: 1)經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后全序列（SEQ ID NO: 10)合成作為陰性對(duì)照。將PCR擴(kuò)增的 目的基因經(jīng)Nde I和Xho I克隆至pET21a⑴載體，構(gòu)建pET21a(+)/ZHPV16 E7的重組質(zhì)粒， 并經(jīng)測(cè)序鑒定（圖2,圖3)。
[0150] 2.原核蛋白生產(chǎn)
[0151] 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E. coli)BL21(DE3)中，37°C，培養(yǎng)16h;加 0. 8mM異 丙基硫代-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)(默克公司，德國(guó)）IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6h表達(dá)帶有 His標(biāo)簽的Zhpv16e7 affibody及Zwt affibody蛋白。經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白，用鎳螯合親 和層析膠體（Ni-NTA Agarose) (QIAGEN公司，美國(guó)）親和層析法純化并經(jīng)SDS-PAGE分析鑒 定。
[0152] 結(jié)果，利用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了 pET21a(+)/Zhpv16 E7重組質(zhì)粒，并采用原核 表達(dá)系統(tǒng)制備了純化的Zhpv16 E7:127、ZHPV16 E7:3Q1、ZHpV16 E7:384、ZHPV16 E7: ?ms及ZWTaf f ibody重組融合 蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析（圖4)證實(shí)，出現(xiàn)考馬斯亮藍(lán)濃染的條帶分子質(zhì)量約7. 8kDa， 與預(yù)期Zhpv16 E7 affibody多肽的分子質(zhì)量大小一致。本發(fā)明選擇pET21a(+)載體，在設(shè)計(jì) 上利用其多克隆位點(diǎn)的起始酶位點(diǎn)為NdeI (CATATG)，其密碼子ATG即為目的蛋白翻譯的氨 基酸（M)起始密碼子，這樣利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白即為全長(zhǎng)的目的蛋白Z hpv16 E7而不 帶載體蛋白片段，避免了載體蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。
[0153] 實(shí)施例3、Zhpv16 E7 affibody多肽與HPV16 E7蛋白的結(jié)合
[0154] 為鑒定Zhpv16 E7 affibody多肽與HPV16 E7蛋白結(jié)合的特異性，利用表面等離子共 振技術(shù)（SPR)分析師選的四個(gè) Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745分子及其對(duì)照 Zwt affibody與靶蛋白HPV16 E7的特異性結(jié)合。
[0155] HPV16 E7蛋白的制備：用PCR方法從宮頸癌組織中擴(kuò)增HPV16 E7基因，克隆至 pET21a(+)載體，構(gòu)建pET21a(+)/HPV16 E7重組質(zhì)粒，并且測(cè)序鑒定；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大 腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)重組蛋白，用Ni-NTA親和層析法純化并經(jīng)SDS-PAGE 及Western blot分析鑒定（參見王冰冰等，HPV16型E7重組蛋白的表達(dá)及其多克隆抗體 的制備；細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014(2) :167-170)。結(jié)果，成功制備了HPV16 E7純化蛋白 及其多克隆抗體，并進(jìn)行了特異性驗(yàn)證（圖5 A-C)。
[0156] Zhpv16 E7 affibody多肽的傳感器分析：在ProteOn XPR36系統(tǒng)儀器（Bio-Rad公司） 進(jìn)行HPV16 E7蛋白和Zhpv16 E7 affibody多肽之間相互作用的親和力分析，即利用表面等離 子共振技術(shù)（SPR)分析上述帶有His標(biāo)簽的Zhpv 16 E7:127' Zhpv16 E7:301' Zhpv16 ￡7:384' Zhpv16 e7：745 及Zwt affibody分子（作為對(duì)照）與HPV16 E7之間的相互作用。根據(jù)操作手冊(cè)，在不同的 流動(dòng)池上通過偶聯(lián)于GLH芯片將HPV16 E7重組蛋白固定，進(jìn)行與篩選多肽之間的親和力測(cè) 定。第6個(gè)流動(dòng)池表面被激活和失活以作為注射時(shí)的空白對(duì)照。affibody分子分別進(jìn)行六 個(gè)不同梯度濃度稀釋與HPV16 E7重組蛋白結(jié)合，即Zhpv16 E7:127濃度為I. 0nM、2. 0nM、4. OnM、 8· 0ηΜ、16· 0ηΜ、32· 0ηΜ、64·0ηΜ，Zhpv16 四:301濃度為 0·7ηΜ、1·4ηΜ、2·8ηΜ、5·6ηΜ、11·2ηΜ、 22·4ηΜ、44·8ηΜ，ΖΗΡν?6 四:384濃度為 0·6ηΜ、1·2ηΜ、2·4ηΜ、4·8ηΜ、9·6ηΜ、19·2ηΜ、38·4ηΜ， Zhpvi6 Ε7:745濃度為 1· !ηΜ、2· 2ηΜ、4· 45ηΜ、9· 1ηΜ、18· 3ηΜ、36· 5ηΜ、73· 2ηΜ 及 Zwt affibody 分 子濃度為 1. 0ηΜ、2. 0ηΜ、4. 0ηΜ、8. 0ηΜ、16. 0ηΜ、32. 0ηΜ、64. ΟηΜ，所有的分析在 25°C進(jìn)行，流 速為30 μ 1/min，注射標(biāo)本的容量為200 μ 1，并以流速30 μ 1/min隨機(jī)順序注射，隨后用 HCl (BI0-RAD 貨號(hào)：#176-2250100mM HC1)洗滌 6min (解離），利用 ProteOn Manager?軟件 (BIO-RAD)的1 :1朗繆爾結(jié)合模型分析結(jié)合曲線（感應(yīng)圖）。
[0157] 采用表面等離子共振技術(shù)（SPR)檢測(cè)，分析重復(fù)兩次檢測(cè)的結(jié)果，親和力平衡解 離常數(shù)KD均值， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: ?ms及Zwt affibody分子分別的為 1. 91X10 6mol/L、l. 18X10 7mol/L、l. 73X 10 6mol/L、5. 02X 10 5mol/L及 4. 63X 10 2mol/L。 結(jié)果，純化的 ZhPV16 E7:127、ZHPV16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: 745蛋白分子與HPV16 E7重組蛋白具 有相互作用的能力，如圖6A-E顯示，較Zwt affibody分子解離常數(shù)KD值相差1000至10000 倍。經(jīng)篩選獲得的 ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16E7:384、Zhpv16 E7: 745均能與HPV16E7重組蛋白結(jié) 合，結(jié)合的親和力均已經(jīng)達(dá)到nmo I/L級(jí)水平，與此同時(shí)野生型的Zwt affibody分子和HPV16 E7重組蛋白幾乎沒有結(jié)合力，表明篩選出的4個(gè)affibody分子與HPV16 E7重組蛋白具有 較高的特異親和力，同時(shí)表明原核誘導(dǎo)表達(dá)的Zhpv16 E7 affibody分子與HPV16 E7重組蛋白 均具有生物活性。
[0158] 因此，本發(fā)明的 Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745蛋白分子與 HPV16E7 革巴蛋白分子具有相互結(jié)合和識(shí)別能力。從蛋白水平驗(yàn)證了Zhpv16 E7:127、ZHPV16 E7:3Q1、ZHPV16 E7:3S4、 Zhpv16 E7:745分子與HPV16E7靶蛋白之間的親和力。
[0159] 實(shí)施例4、Zhpv16 E7 affibody多肽與表達(dá)HPV16 E7蛋白細(xì)胞的結(jié)合
[0160] 為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的Zhpv16 E7 affibody多肽與HPV16E7靶蛋白的親和力，利 用表達(dá)HPV16 E7的宮頸癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，即人宮頸癌細(xì)胞系Siha(ATCC:HTB-35， 表達(dá)HPV16E7的宮頸癌細(xì)胞）、Caski(ATCC:CRL-1550，表達(dá)HPV16和18E7的宮頸癌 細(xì)胞）和HeLa229 (ATCC :CCL-2 HPV 18陽性的宮頸癌細(xì)胞），并利用黑色素瘤細(xì)胞系 A375(ATCC:CRL-1619, HPV陰性的黑色素瘤細(xì)胞）作為對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證ZHPV16E7:127、Zhpv16 E7:3〇n Zhpv16 E7:384' Zhpv16 E7. 745蛋白分子與HPV16 E7蛋白分子之間的結(jié)合。
[0161] 細(xì)胞培養(yǎng)：人宮頸癌細(xì)胞系Caski、Siha、HeLa229及黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)胞培 養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清，2. 05mM L-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及IOOyg/ ml鏈霉素）。細(xì)胞在37°C含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24h，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行免疫熒 光檢測(cè)。
[0162] 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)：將滅菌的蓋玻片放入六孔板中，將培養(yǎng)至24h的Caski、Siha、 拖1^229、4375細(xì)胞調(diào)整數(shù)目為1\10 6/孔，5%〇)2、37°(：培養(yǎng)2411至單層細(xì)胞。加入終濃 度為 50 μ g/ml Zhpv16 E7 affibody 多肽于上述含 10% FBS 培養(yǎng)基中，5% C02、37°C培養(yǎng) 6h， 吸出培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS洗滌；采用2%多聚甲醛固定單層細(xì)胞10min，PBST洗滌3次，加入 0. 3% Triton X-100打孔lOmin，洗滌后加入10% FBS+1640培養(yǎng)基37°C封閉lh，洗滌；分 別加入鼠抗His單克隆抗體（ABR公司，美國(guó)，I :2000)、兔抗SPA血清（1:500)及HPV16E7 兔血清抗體（I :500)，置37°C lh，洗滌后加 FITC-羊抗兔IgG二抗（上海聯(lián)科生物技術(shù)公 司，中國(guó)）和PI (索萊寶公司，北京）2 μ 1/孔lh，避光，洗滌后加蓋玻片并用緩沖甘油封片， 共聚焦熒光顯微鏡（Leica TCS SP2microscope德國(guó)）觀察并拍片（400X)。
[0163] 用純化的 ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7: 745孵育HPV16 E7蛋白表達(dá)陽 性宮頸癌Caski、Siha細(xì)胞6h后，分別用His單克隆抗體、SPA兔血清分析重組affibody 蛋白與細(xì)胞株表達(dá)的HPV16 E7重組蛋白的識(shí)別和結(jié)合能力，同時(shí)設(shè)置HPV16 E7蛋白表達(dá) 陰性的人黑色素瘤A-375細(xì)胞株和HPV18 E7陽性的宮頸癌HeLa229細(xì)胞株作為對(duì)照，與此 同時(shí)設(shè)置HPV16 E7兔血清抗體作為陽性對(duì)照。
[0164] 結(jié)果顯示， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7:745 蛋白孵育的Siha、Caski細(xì) 胞株的細(xì)胞核膜和細(xì)胞漿內(nèi)核周可見多個(gè)強(qiáng)綠色的點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀熒光蛋白（圖7A-D)，與 HPV16 E7兔血清抗體孵育的結(jié)果一致（圖7 E)，而HeLa229細(xì)胞和A375細(xì)胞株均未見明 顯的熒光團(tuán)塊（圖7A-E)。表明， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZHpV16 E7: 745重組蛋白能特 異性識(shí)別細(xì)胞中天然表達(dá)HPV16 E7蛋白，本發(fā)明制備的 ZhPV16 E7:127' Zhpv16 ￡7:301' Zhpv16 ￡7:384' Zhpv16 E7:745重組蛋白和活細(xì)胞表達(dá)的HPV 16 E7蛋白有很強(qiáng)的特異結(jié)合能力。
[0165] 上述結(jié)果進(jìn)一步從細(xì)胞水平驗(yàn)證了 ZhPV16 E7:127、ZHPV16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: 745重 組蛋白與HPV16 E7蛋白具有很強(qiáng)的靶向結(jié)合特異性和親和力。
[0166] 實(shí)施例5、ZHPV16 E7 affibody多肽在宮頸癌細(xì)胞荷瘤裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向
[0167] 在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中，選擇上述affibody分子中的Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽作 為檢測(cè)對(duì)象，用近紅外熒光染料DyLight755 NHS Ester(Thermo Fisher公司，美國(guó)，貨號(hào) 62278)標(biāo)記 ZHPV16E7:3S4 affibody 多肽，并將其注射到攜帶 Siha、Caski、HeLa229 及 A375 移 植腫瘤的小鼠體內(nèi)，進(jìn)行Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽生物分布研究，并對(duì)裸小鼠成像定位以 研究標(biāo)記多肽的靶向特性。
[0168] 動(dòng)物腫瘤模型的制備：選擇6-7周齡BALB/c-nu小鼠（購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 有限責(zé)任公司，合格證SCXK (滬）2012-0002)，體重為15-18g)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng) 狀態(tài)良好的Siha、Caski、HeLa229及A375用EDTA(胰酶）消化后，用含10%血清細(xì)胞培養(yǎng) 液進(jìn)行吹打、收集，常溫1000轉(zhuǎn)/min離心3min，將離心細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液重懸并計(jì) 數(shù)，配制成IX l〇7ml，取0. 2ml于背部近右前臂或下肢近腹股溝皮下注射接種裸鼠。每隔3 天觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)力、反應(yīng)、飲食、體重及皮下接種區(qū)域外觀及觸感，并以電子游 標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體大小直徑。待腫瘤長(zhǎng)至300-500mm 3用于Zhpv16 E7 affibody多肽的生物分 布和成像研究。
[0169] 結(jié)果顯示，裸鼠皮下接種上述細(xì)胞均可見明顯的腫瘤生長(zhǎng)，22只裸鼠全部成瘤。3 周后，腫瘤最大直徑達(dá)到300-500mm3時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。
[0170] Zhpv16 E7:3S4多肽近紅外焚光染料Dylight755標(biāo)記及鑒定：按照說明書步驟進(jìn)行 將Dylight755的標(biāo)記并鑒定。即取91yg DyLight755 NHS-Ester染料溶解入273 μ1 DMF有機(jī)溶劑后，加入透析后的Zhpv16 E7:3S4 affibody蛋白（300 μg/ml，共lml)溶液中，避 光，4°C條件下反應(yīng)lh，將反應(yīng)后的溶液避光透析，每隔半小時(shí)更換透析液（磷酸鹽緩沖 液，pH7. 2-7. 4)，2h后收集Dy755-ZHPV16E7:3S4,光蛋白，取樣測(cè)蛋白濃度為100 μ g/ml，采用 SDS-PAGE 電泳進(jìn)行鑒定。分別取 Dy755 標(biāo)記的 ZHPV16E7:3S4(Dy755-ZHPV16E7:3S4) 1 μ g、0. 5 μ g 和 0. 1 μ g，用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 μ 1，同時(shí)取10 μ I Dy755_DMF染料做陰性對(duì)照，分別加 入10 μ 1蛋白loading buffer中，于冰上避光條件下電泳，并將凝膠放于活體成像儀（CRi Maesro 2.10，in-vivo fluorescenceimaging system)中，激發(fā)光濾片為 671_705nm，發(fā)射 光濾片為750 longpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波長(zhǎng)間隔IOnm每次曝光 5000ms收集圖像信息，用Maesro軟件進(jìn)行圖像處理及分析。經(jīng)鑒定的Dy755-Z HPV16E7:3S4分 裝于棕色離心管，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0171] 結(jié)果顯示，標(biāo)記蛋白 Dy755-ZHPV16E7:3S4經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，1. 0 μ g、0. 5 μ g 和 0. 1 μ g的泳道在相對(duì)分子質(zhì)量為7. 8 kDa處出現(xiàn)單一的染色條帶，但Dylight755染料無條 帶（圖8A)，經(jīng)小動(dòng)物活體成像儀掃描，在相應(yīng)1. 0 μ g和0. 5 μ g位置處均出現(xiàn)單一的熒光 條帶（圖8B)。表明，近紅外熒光染料Dylight755標(biāo)記Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽成功。
[0172] Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽在腫瘤細(xì)胞異種移植物的裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向 作用：待裸鼠的腫瘤長(zhǎng)至300-500mm3時(shí)將裸鼠帶出SPF屏障系統(tǒng)，用10%水合氯醛腹腔注 射誘導(dǎo)麻醉，待其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后經(jīng)尾靜脈注射10 μ g Dy755-ZHPV16E7:3S4熒光蛋白，置 于小動(dòng)物活體成像儀（CRi Maesro 2. 10, in-vivo fluorescence imagingsystem)中成像， 并用0. 8-1. 0 μ Ι/g水合氯醛維持麻醉狀態(tài)，以保證小鼠在成像過程中處于深度麻醉，在 5min、10min、15min、30min、45min、lh、I. 5h、2h、4h、6h、8h 和 24h 連續(xù)成像觀察（圖 9A-B)。 并于24h后處死并解剖小鼠，取腫瘤組織、肝臟、脾臟、腎臟、和大腦等組織臟器置于成像系 統(tǒng)。成像的激發(fā)光濾片為671-705nm，發(fā)射光濾片為750 longpass，采用8bit和2 X 2模式， 730-950nm波長(zhǎng)間隔IOnm每次曝光5000ms收集圖像信息，并用Maesro軟件進(jìn)行圖像處理 及分析，分別顯示背景自發(fā)熒光和目標(biāo)熒光信號(hào)，然后測(cè)量其熒光值，將背景自發(fā)熒光設(shè)置 為黑色，目標(biāo)熒光信號(hào)設(shè)置為紅色，最后將兩種色彩相疊加。所得數(shù)據(jù)用GraphPAD軟件進(jìn) 行處理。
[0173] 結(jié)果，Siha和Caski荷瘤裸鼠在尾靜脈注射50yg Dy755_ZHPV16E7:3S4熒光蛋白 IOmin后，腫瘤部位即出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，lh-1. 5h熒光信號(hào)最完整，與腫瘤大小對(duì)應(yīng)，8h 時(shí)腫瘤的熒光成像明顯變小，24h時(shí)仍有熒光成像。除腎臟外，腫瘤組織中的熒光強(qiáng)度于 30min時(shí)開始升高，約至6h均顯著高于其他各臟器的熒光強(qiáng)度，盡管至24h熒光強(qiáng)度已經(jīng)減 弱，但仍然高于其他各臟器。HeLa229和A-375對(duì)照組觀察期間均未檢測(cè)到有明顯區(qū)別于背 景熒光的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠肝脾相對(duì)應(yīng)的部位在靜脈注射后Dy755-ZHPV16E7:3S4 熒光蛋白后可見明顯的熒光信號(hào)，隨著染料在小鼠體內(nèi)不斷代謝，信號(hào)逐漸降低，至24h已 經(jīng)減弱消失；而腎臟在靜脈注射后Dy755-Z HPV16E7:3S4焚光蛋白后IOmin直至24h，可見最強(qiáng)的 熒光信號(hào)（圖9)。分析腫瘤組織熒光信號(hào)強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，Siha和Caski細(xì)胞荷瘤小鼠在30min 左右信號(hào)強(qiáng)度最高，之后逐漸降低，分別至6h和8h左右信號(hào)強(qiáng)度最為明顯（圖9)。
[0174] 在尾靜脈注射50 μ g Dy755-ZHPV16E7:3S4熒光蛋白24h時(shí)解剖小鼠，取實(shí)驗(yàn)組和對(duì) 照組的腫瘤、心臟、肺、脾臟、肝臟及腎臟等重要組織器官進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)腫瘤、腎臟、心、腦、 腸、肺、肌肉和骨骼等組織中熒光信號(hào)分布與強(qiáng)度與活體成像結(jié)果基本相一致（圖10A-D)， 且在Siha和Caski荷瘤小鼠中，腫瘤組織的熒光強(qiáng)度與其他各臟器的熒光強(qiáng)度有顯著性差 異（p〈0. 05)，而在HeLa229和A375荷瘤小鼠中腫瘤組織的熒光強(qiáng)度與其他各臟器的熒光強(qiáng) 度無顯著性差異（P>〇. 05)。荷瘤小鼠在觀察期間狀態(tài)良好，未見明顯毒性反應(yīng)。
[0175] 結(jié)果表明，標(biāo)記Dylight755-ZHPV16E7:3S4多肽具有靶向結(jié)合HPV16E7表達(dá)陽性腫瘤的 特性，且沒有嚴(yán)重的毒副作用。
[0176] 實(shí)施例6、Zhpv16 E7 affibody多肽的生物學(xué)功能研究
[0177] 為研究Zhpv16 E7 affibody多肽體外細(xì)胞生長(zhǎng)是否具有抑制作用，本發(fā)明選擇Siha 腫瘤細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。利用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)過程中各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生存率進(jìn) 行檢測(cè)，并利用Grahpad primer5. 0軟件計(jì)算Zhpv16e7 affibody多肽的IC50〇
[0178] 制備Siha腫瘤細(xì)胞懸液并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0. 5X IO4/孔。培養(yǎng)24h后， 加入1 μ g/ml放線菌酮、5%胎牛血清，然后分別加入4個(gè)affibody蛋白即Zhpv16 E7:127、ZHPV16 E7:3〇i、Zjjpvie E7:384、Zfjpvie E7:745,分力lJ設(shè)置 100 l·*· g/ml、50 y g/rnl、25 y g/rnl、10 y g/rnl、I y g/rnl 五個(gè)濃度組，并以Zwt affibody為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照，采用CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8, GC-0030, CN)檢測(cè)細(xì)胞的生存率，即在加入結(jié)合多肽后0、1、3、6、12、24、 36、48和72h，加入CCK-8試劑，10 μ 1/孔，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30min后置于酶標(biāo)儀 A450處讀數(shù)。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活（Cell viability)計(jì) 算方法為：Cell viability (%) = (affitoxin384 組的 OD 值-培養(yǎng)基組 OD 值）/(SPA-Zwt 對(duì)照組OD值-培養(yǎng)基組OD值）X 100% ;同時(shí)用GraphPad primer5. 0軟件來計(jì)算細(xì)胞生 長(zhǎng)存活的IC50值。
[0179] 結(jié)果， ZhPV16 E7:127、 Zhpv16 E7:301、 Zhpv16 E7:384、 Zhpv16 E7:745 多肽對(duì)Siha腫瘤細(xì)胞的 生長(zhǎng)均有抑制作用（圖 12A-D)，其 IC50 分別是 2. 882±0. 661μΜ、3. 876±0. 125μΜ、 2.725±0.358 以]\1和 1.835±0.233 4]\1(圖11厶-0)。顯不，2("16￡7:127、2隱 6￡7:3。1、2隱6四:384、 Zhpv16 Ε7:745對(duì)表達(dá)HPV16 Ε7陽性的宮頸癌細(xì)胞Siha均具有抑制作用，并于6h其抑制細(xì)胞 生長(zhǎng)作用表現(xiàn)為最強(qiáng)，至72h，與Zwt和培養(yǎng)基對(duì)照仍然有顯著性差異（p〈0. 001);同時(shí)顯示， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhpV16 E7: 745多肽對(duì)Siha細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性， 100 μ g/ml、50 μ g/ml和10 μ g/ml組之間的細(xì)胞生存率具有顯著性差異（p〈0. 001)，同時(shí)三 組劑量組與Zwt和培養(yǎng)基對(duì)照組的細(xì)胞生存率比較也具有顯著性差異（p〈0. 001)。
[0180] 以上結(jié)果表明， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: 745多肽具有抑制Siha細(xì) 胞生長(zhǎng)的特性，進(jìn)一步驗(yàn)證了 Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745具有體外 HPV16 E7靶向結(jié)合特異性。
[0181] 實(shí)施例7、Zhpv16 E7 affitoxin蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的保護(hù)作用
[0182] 在本實(shí)施例中，利用Zhpv16 E7的靶向作用，攜帶經(jīng)改構(gòu)具有細(xì)胞毒作用的綠膿桿菌 外毒素 A (pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作為細(xì)胞毒分子（Gao J，et al. Mol Cancer Ther，2008, 7 (10) : 3399-3407)。構(gòu)建 Zhpv16 E7/PE38KDEL 原核表達(dá)載體，并 利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備并純化了 ZHPV16E7/PE38KDEL蛋白，即affitoxin，對(duì)affitoxin與革巴蛋 白HPV16 E7的特異性結(jié)合，及靶向作用進(jìn)行和驗(yàn)證，并將其進(jìn)一步注射到攜帶Siha(ATCC : HTB-35,表達(dá)HPV16的宮頸癌細(xì)胞）、Caski (ATCC :CRL-1550,表達(dá)HPV16和18的宮頸癌細(xì) 胞）、HeLa229(ATCC :CCL-2 HPV 18 陽性的宮頸癌細(xì)胞）和 A-375(ATCC:CRL-1619，HPV16 陰 性的黑色素瘤）移植腫瘤的小鼠體內(nèi)，進(jìn)行腫瘤保護(hù)和治療實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用Zwt affitoxin作 對(duì)照。
[0183] Zhpv16 E7 affitoxin 蛋白的制備和鑒定：選擇 Zhpv16 E7 affibody 作為 HPV16 E7 的 靶向分子，利用柔性肽（Gly4Ser) 3在其C末端連接PE38 (KDEL)，將柔性肽C端連接經(jīng)原核 密碼子優(yōu)化的PE38 (KDEL)的全序列（SEQ ID NO: 11)，PE38 (KDEL)的全序列DNA合成并經(jīng) EcoRI和XhoI位點(diǎn)克隆至pET21a(+)載體，構(gòu)建pET21a(+)/PE38(KDEL)載體，進(jìn)一步通 過分子克隆方法將 ZhPV16 E7:127、 Zhpv16 E7:301、 Zhpv16 E7:384、 Zhpv16 E7: 745及Zwt編碼序列經(jīng)NedI和 EcoRI克隆至pET21a(+)/PE38 (KDEL)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒并測(cè)序鑒定，進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化至大 腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)重組蛋白，用Ni-NTA親和層析法純化并經(jīng)SDS-PAGE 及Western Blot分析鑒定。
[0184] 結(jié)果，成功構(gòu)建了 pET21a(+)/ZHPV16 E7affitoxinl27、301、384、745 及 pET21a(+)/ ZwtafTit〇xin重組質(zhì)粒（圖13);該重組質(zhì)粒在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并獲得純化的 ZHPV16E7affitoxinl27、Zhpv16e7 affitoxin301、Zhpv16e7 affitoxin384、Zhpv16e7 affitoxin745 及Zwtaffitoxin重組蛋白，SDS-PAGE電泳提示該蛋白的分子質(zhì)量約為45 kDa(圖14A、 B) ;Western blot結(jié)果（圖14C、D)顯示，His單抗和兔SPA-Z多抗作為一抗，在分子質(zhì)量 約為 45kDa 均處出現(xiàn)單一條帶，提示 Zhpv16e7 affitoxinl27、Zhpv16e7 affitoxin301、Zhpv16e7 affitoxin384、Zhpv16e7 affitoxin745 及 Zwt affitoxin 重組蛋白能特異性識(shí)別兔 SPA-Z 多克 隆血清抗體。結(jié)果表明，Zhpv16e7 afTitoxinl27、ZHPV16E7 afTitoxin301、ZHPV16E7afTitoxin384、 Zhpv16e7 affitoxin745及Zlrt affitoxin重組純化蛋白制備成功。
[0185] Zhpv16e7 affitoxin蛋白與革巴蛋白結(jié)合特性研究：為驗(yàn)證Zhpv16e7 affitoxin蛋白與 HPV16 E7結(jié)合的特性，采用SPR和細(xì)胞免疫熒光方法進(jìn)一步驗(yàn)證。選擇Siha(HPV16+)、 Caski(HPV16+、HPV18+)、HeLa229(HPV16-、HPV18+)及黑色素瘤細(xì)胞 A375 作為陰性對(duì)照， 方法同實(shí)施例4。即將培養(yǎng)至24h的Caski、Siha、HeLa229、A375細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為 I X IO6/孔，培養(yǎng)24h至單層細(xì)胞，加入終濃度為50 μ g/ml的Zhpv16 E7aff itoxinl27、Zhpv16 E7affitoxin30U Zhpv16 E7affitoxin384、Zhpv16 E7affitoxin745 及 Zwt affitoxin 蛋白，5 % C02, 37°C培養(yǎng)6h，經(jīng)固定、洗滌后，0· 3% Tritonx-100打孔，加入10% FBS+1640培養(yǎng)基37°C 封閉lh，用PBS洗滌3次；分別加入鼠抗His單克隆抗體（ABR公司，美國(guó)，I :2000)、兔抗 SPA血清（1:500)及兔抗PE38KDEL血清（I :5000)，置37°C lh，洗滌后加 FITC-羊抗兔IgG 二抗（上海聯(lián)科生物技術(shù)公司，中國(guó)）和PI (索萊寶公司，北京）2 μ 1/孔lh，避光，洗滌 后加蓋玻片并用緩沖甘油封片，共聚焦熒光顯微鏡（Leica TCS SP2 microscope德國(guó)）觀 察并拍片（40X)。同時(shí)，采用不加 Zhpv16 E7 affitoxinl27、Zhpv16 E7 affitoxin301、Zhpv16 E7 affitoxin384、ZHPV16 E7 affitoxin745 蛋白，以兔 HPV16 E7 血清抗體為一抗（I :5000)作為 陽性對(duì)照。
[0186] 結(jié)果，經(jīng)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察顯示，Zhpv16 E7affitoxinl27、Zhpv16 E7affitoxin301、Zhpv16 E7affitoxin384、Zhpv16 E7 affitoxin745 蛋白 孵育的Siha、Caski細(xì)胞株的細(xì)胞核膜和細(xì)胞漿內(nèi)核周可見多個(gè)綠色的點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀熒 光蛋白，與HPV16 E7兔血清抗體孵育的結(jié)果相一致，而HeLa229細(xì)胞和A375細(xì)胞株均未 見明顯的熒光團(tuán)塊（圖15 A-D)，同時(shí)Zwt affitoxin蛋白孵育的Siha、Caski、HeLa229及 A375 細(xì)胞株均未出現(xiàn)焚光團(tuán)塊。表明，Zhpv16 E7affitoxinl27、ZHPV16 E7affitoxin301、ZHPV16 E7 affitoxin384、ZHPV16 E7 affitoxin745 重組蛋白識(shí)別 HPV16 E7,而不識(shí)別 HPV18 E7,即特異 性識(shí)別活細(xì)胞中天然表達(dá)HPV16 E7蛋白的能力保持不變，且與活細(xì)胞表達(dá)的天然HPV16 E7 蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力。本實(shí)施例進(jìn)一步從細(xì)胞水平驗(yàn)證了 Zhpv16 E7 affitoxinl27、Zhpv16 E7 affitoxin301、ZHPV16 E7 affitoxin384、ZHPV16E7 affitoxin745重組蛋白具有與活細(xì)胞表達(dá) 的HPV16 E7蛋白具有很強(qiáng)的親和力。
[0187] 進(jìn)一步在 ProteOn XPR36 系統(tǒng)儀器（Bio-Rad 公司）進(jìn)行 Zhpv16 E7affitoxin 蛋 白和HPV16E7之間相互作用的親和力分析，即利用表面等離子共振技術(shù)（SPR)分析上述 His 標(biāo)簽的 Zhpv16e7 affitoxinl27、Zhpv16 E7 affitoxin30U Zhpv16 E7 affitoxin384、Zhpv16 E7affitoxin745及Zwt affitoxin分子（作為陰性對(duì)照）與HPV16 E7之間的相互作用。實(shí) 驗(yàn)步驟同實(shí)施例3。
[0188] 結(jié)果，采用表面等離子共振技術(shù)（SPR)分析測(cè)得親和力解離常數(shù)KD值分別的為 1. 36X 10 6mol/L、l. 76X 10 6mol/L、l. 45X 10 6mol/L、3. 90X 10 6mol/L。重復(fù)兩次檢測(cè)。結(jié) 果表明，純化的 Zhpv16e7 affitoxin 127、affitoxin 301、affitoxin 384、affitoxin 745 蛋 白（帶有His6標(biāo)簽）與HPV16E7重組蛋白具有相互作用的能力，如圖16A-D和表2所示， 4個(gè)affitoxin蛋白均能與HPV16 E7重組蛋白結(jié)合，結(jié)合的親和力均已達(dá)到nmol/L級(jí)水 平，而野生型的Zwt affitoxin和HPV16 E7重組蛋白幾乎沒有結(jié)合力，表明篩選出的四個(gè) affibody蛋白與HPV16E7重組蛋白具有較高的特異親和力。
[0189] 結(jié)果表明，本發(fā)明的 Zhpv16e7 affitoxin 127、affitoxin 301、affitoxin 384、 affitoxin 745蛋白分子（帶有His6標(biāo)簽）與HPV16E7靶蛋白分子具有相互結(jié)合和識(shí)別 能力。進(jìn)一步從蛋白水平驗(yàn)證了 Zhpv16e7 affitoxin 127、Zhpv16e7 affitoxin 301、Zhpv16e7 affitoxin 384、Zhpv16e7 affitoxin 745 與 HPV16E7 革巴蛋白之間的親和力。
[0190] Zhpv16e7 affitoxin體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用：為研究Zhpv16e7 affitoxin體外細(xì)胞生 長(zhǎng)抑制作用，選擇Zhpv16e7 affitoxin384蛋白作為研究對(duì)象。同樣選擇Caski、Siha、HeLa229 和A375四種腫瘤細(xì)胞株作為靶細(xì)胞。制備上述四種細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)接種于96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板，0. 5 X IO4/孔。培養(yǎng)24h后，加入1 μ g/ml放線菌酮及5 %胎牛血清，然后加入Zhpvi卿 affitoxin384 蛋白，設(shè)置 100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml 五個(gè)濃度組， 以SPA-ZwtS對(duì)照組（PE38KDEL)，設(shè)置五個(gè)同樣濃度組，同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照，采用CCK-8試 劑盒檢測(cè)細(xì)胞的生存率，在加樣后lh、3h、6h、12h、24h、48h和72h，加入CCK-8試劑10 μ 1/ 孔，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30min后置于酶標(biāo)儀Α450處讀數(shù)。每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔， 并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞存活（Cellviability)計(jì)算方法為：Cell viability(% )= (Zhpv16e7 affitoxin384組的OD值-培養(yǎng)基組OD值）ASPA-Zwt對(duì)照組OD值-培養(yǎng)基組OD 值）X 100% ;同時(shí)用GraphPad primer 5· O軟件來計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)存活的IC50值。
[0191] 結(jié)果如圖17,經(jīng)GraphPad primer 5. 0軟件來計(jì)算Siha和Caski細(xì)胞生長(zhǎng)存活 的 IC50 值，分別為(λ 28 μ M 和(λ 24 μ M。圖 18 顯示，Zhpv16e7 aff itoxin 384 對(duì)表達(dá) HPV16 E7陽性的宮頸癌細(xì)胞Siha和Caski具有較強(qiáng)的殺傷作用，而對(duì)表達(dá)HPV18E7陽性的宮頸 癌HeLa229細(xì)胞及表達(dá)HPV陰性的黑色素瘤細(xì)胞A375均無明顯的殺傷作用。圖19顯示， Zhpv16e7 affitoxin 384作用于Siha和Caski 72h后，其細(xì)胞生存率與對(duì)照細(xì)胞之間比較， Siha與Caski細(xì)胞生存率之間比較無差異（p>0. 05)，Siha和Caski細(xì)胞與HeLa229細(xì)胞 生存率之間比較均有顯著性差異（p〈〇. 05)，而Siha和Caski細(xì)胞與A375細(xì)胞生存率之間 比較也具有顯著性差異（P〈〇. 05)，而HeLa229與A375細(xì)胞生存率之間比較無顯著性差異 (ρ>0· 05)。Zhpv16e7 affitoxin 384 的三個(gè)劑量組（100 μg/ml，10 μg/ml 及 lμg/ml)之間 對(duì)Siha和Caski細(xì)胞生長(zhǎng)率均有顯著性差異（p〈0. 05)，而1 μ g/ml與PE38KDEL與培養(yǎng)基 對(duì)照組之間均無顯著性差異（Ρ〈〇· 05)。Zhpv16e7 affitoxin 384與對(duì)照蛋白PE38KDEL作用 于Siha，其細(xì)胞生存率的比較有顯著性差異（ρ〈0·05);而Zhpv16e7 affitoxin384及PE38KDEL 與培養(yǎng)基對(duì)照之間均無差異（P>〇. 05)。ZHPV16E7affitoxin 384與對(duì)照蛋白PE38KDEL作用于 Caski，其細(xì)胞生存率的比較有顯著性差異（ρ〈0· 05);而Zhpv16e7 affitoxin384及PE38KDEL 與培養(yǎng)基對(duì)照之間均無差異（P>〇. 05)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，Zhpv16e7 affitoxin 384具有 體外HPV16E7靶向結(jié)合和殺傷細(xì)胞的特異性。
[0192] Zhpv16e7 affitoxin384蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)：選擇7周齡BALB/C-nu雌性裸鼠，5只 裸鼠尾靜脈注射 5mg/kg Zhpv16e7 affitoxin384,分別在 lmin、5min、15min、30min、60min、 120min時(shí)尾靜脈取血100 μ l，5h后，麻醉小鼠終末取血。另取5只裸鼠尾靜脈注射4mg/ kg Zhpv16 E7:3S4, 3只裸鼠尾靜脈注射PBS 100 μ 1作為對(duì)照，方法及取血標(biāo)本的時(shí)間點(diǎn)同上。 將血液放37°C水浴箱20min后，1500r，4°C離心10min，收集血清-80度分裝保存。采用 ELISA方法檢測(cè)血清中的affitoxin和affibody濃度。將10 μ g/ml的HPV16E7蛋白包 被96孔酶標(biāo)板4°(：過夜，加入1:50稀釋血清，37°(：孵育21 1，洗滌后加3%脫脂奶粉，37°(：封 閉2h后，加入本室制備的SPA-Z兔血清作為二抗，100 μ 1/孔，37°C lh，洗滌后加入羊抗兔 IgG-HRP (1:5000) 100 μ 1/ 孔，37 °C Ih ;洗滌，加入 TMB 顯色液，100 μ 1/ 孔，37 °C 避光顯色 30min ;置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)讀取吸光度值。重復(fù)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置以包被HPV16E7蛋 白后不加 affibody，并分別以抗16E7的兔血清（1:1000)和SPA-Z兔血清（1:2000)為一 抗作為陽性和陰性對(duì)照。取 〇、〇. I μ g/ml、l μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml 的 affibody 及 affitoxin蛋白，經(jīng)ELISA檢測(cè)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0193] 結(jié)果，以純化的HPV16E7蛋白為包被抗原，采用ELISA法檢測(cè)血清中Zhpv16 E7affibody和Zhpv16 E7 affitoxin濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Zhpv16e7 affibody和Zhpv16e7 affitoxin 的計(jì)算公式分別為 y = 〇· 1295χ-0· 11065, R2= 0· 9942 ;y = 0· 2378χ-0· 141，R2= 0· 9782。 在裸鼠尾靜脈注射后的lmin、5min、15min、30min、60min、120min及300min血液中的含量 分別為 122. 59 μ g/ml、82. 82 μ g/ml、54. 25 μ g/ml、48. 07 μ g/ml、45. 37 μ g/ml、34. 17 μ g/ ml、28. 49 μ g/ml、20. 66 μ g/ml 及 112. 28 μ g/ml、91. 36 μ g/ml、67. 28 μ g/ml、51. 09 μ g/ ml、42. 05 μ g/ml、32. 49 μ g/ml、29. 54 μ g/ml、24. 14 μ g/ml，根據(jù) Graphpad prisimer5. 0 繪制曲線（圖20A，B)計(jì)算，Zhpv16 E7 affibody和Zhpv16 E7 affitoxin的半衰期分別為 6.231 ±0.717min 和 8. 95±0.389min，Zhpv16 E7 affitoxin 比 Zhpv16 E7 affibody 的半衰期約 多2分鐘。
[0194] Zhpv16e7 affitoxin 蛋白的半數(shù)致:死量分析 LD50 :為研究 Zhpv16 E7 affitoxin384 蛋 白急性毒性作用，選擇BALB/c雌鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并計(jì)算其半數(shù)致死量。選擇4w齡BALB/ c雌鼠，18-20g，分為9個(gè)劑量組，每組5-7只，見表3。每只小鼠尾靜脈僅一次給藥，注射 200 μ 1相應(yīng)劑量的Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白。給藥后觀察指標(biāo)：外觀，體征、體重及各劑 量組小鼠死亡時(shí)間，持續(xù)觀察至14天，并用Graphpad Primer5. 0法計(jì)算LD50,重復(fù)三次檢 測(cè)。結(jié)果 Zhpv16 E7 affitoxin384 蛋白致小鼠半數(shù)死亡的 LD50 為：15. 577±3. 738mg/kg。
[0195] 表3、Zhpv16e7 affitoxin384蛋白的急性毒性作用
[0197] Zhpv16 E7 affitoxin蛋白的保護(hù)作用：為檢測(cè)Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對(duì)腫瘤細(xì) 胞致瘤作用的保護(hù)作用，本實(shí)施例采用HPV16 E7陽性的Siha細(xì)胞制備BALB/c裸鼠的腫 瘤模型，具體方法同實(shí)施例5,即選擇4-5周齡BALB/c-nu小鼠，體重為12-15g，飼養(yǎng)于溫 州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)（SPF級(jí)）內(nèi)，共分成5組，即Z HPV16E7affitoxin384蛋白 組，同時(shí)設(shè)置Zhpv16e7: 384、PE38KDEL、Zwt affitoxin及PBS作為對(duì)照組。每組10~12只。 affitoxin384. Omg/kg，同時(shí)設(shè)置PE38KDEL(mg/kg)作為對(duì)照組。將培養(yǎng)48h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 Siha細(xì)胞，配制成所需的細(xì)胞數(shù)即IxlOVml，取0.2ml于裸鼠的背部近左前臂皮下注射，同 時(shí)將各組蛋白（均為4mg/kg)稀釋于0. 2ml的PBS中，在進(jìn)行腫瘤細(xì)胞接種的同時(shí)按組別 經(jīng)尾靜脈注射0. 2ml對(duì)應(yīng)蛋白，PBS組僅注射0. 2ml的PBS。每3天注射1次，共6次。每 3天觀察小鼠生活和精神狀態(tài)等，測(cè)量腫瘤大小并拍照記錄，觀察至60天。處死小鼠，同時(shí) 檢測(cè)小鼠血清測(cè)肝功能。
[0198] 同時(shí)，為檢測(cè)Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對(duì)Siha荷瘤小鼠的治療作用，另選擇4-5 周齡BALB/c-nu小鼠，接種IxioVml Siha細(xì)胞，待腫瘤生長(zhǎng)100~200mm3大小時(shí)，分成上 述同樣5個(gè)組別，每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射4mg/kg蛋白共0. 2ml對(duì)應(yīng)樣品。每3天注射1次， 共6次。同時(shí)每3天觀察小鼠生活和精神狀態(tài)等，測(cè)量腫瘤大小并拍照記錄，觀察至60天。 處死小鼠，同時(shí)檢測(cè)小鼠血清測(cè)肝功能。
[0199] 結(jié)果見圖21A所示，Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞致瘤作用具有一定的保 護(hù)作用，Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白劑量組腫瘤的體積大小與對(duì)照組Zhpv16e7:384、PE38KDEL、 Zwt affitoxin蛋白及PBS組分別在第36天始出現(xiàn)有顯著性差異（p〈0. 01)，而Zhpv16e7:384與 PE38KDEL、Zwt affitoxin蛋白及PBS組分別在第42天始也開始出現(xiàn)顯著性差異（p〈0. 01)， 但PE38KDEL、Zwt affitoxin蛋白及PBS組之間無差異（p>0. 05)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤體 積大小在各組別之間，差異明顯變大，直至60天。肝臟功能檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)均正常。
[0200] Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對(duì)Siha荷瘤小鼠的治療作用結(jié)果見圖21B。Zhpv16 E7affitoxin384 蛋白組與 Zhpv16e7: 384、PE38KDEL、Zwt affitoxin 蛋白及 PBS 對(duì)照組比較，對(duì) 腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用分別在第30或36天始出現(xiàn)有顯著性差異（p〈0. 01)，而ZHPV16E7:384與 Zwt affitoxin蛋白、PE38KDEL蛋白及PBS組比較也于36天始出現(xiàn)顯著性差異（p〈0. 01)， Zwt affitoxin蛋白、PE38KDEL蛋白及PBS組之間比較無顯著性差異（p>0. 05)。隨著時(shí)間 的延長(zhǎng)，腫瘤體積大小在各組別之間，差異明顯變大，直至60天。肝臟功能檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo) 均正常。
[0201] 上述結(jié)果表明，Zhpv16 E7 affitoxin384及Zhpv16e7:384蛋白均具有保護(hù)或抑制腫瘤 細(xì)胞的生長(zhǎng)作用，但以Z hpv16 E7 affitoxin384作用為強(qiáng)。即Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白及 ZHPV16E7:384具有HPV16 E7靶向抑瘤作用。且毒副作用不明顯。
[0202] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特征在于，該多肽是 以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作為骨架，進(jìn)行12-20個(gè)氨基酸變異后獲得的多肽。2. 如權(quán)利要求1所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特 征在于，相對(duì)于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽在第9-11，13-14,17-18, 24-25， 27-28, 32, 35,43位上發(fā)生氨基酸突變。3. 如權(quán)利要求2所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特 征在于，相對(duì)于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽的 第9位氨基酸突變?yōu)镾或W ; 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V ; 第11位氨基酸突變?yōu)镋、L或W ; 第13位氨基酸突變?yōu)镽、I或S ; 第14位氨基酸突變?yōu)镾、L、Μ或A ; 第17位氨基酸突變?yōu)閃或R ; 第18位氨基酸突變?yōu)锳、W、T或Q ; 第24位氨基酸突變?yōu)镚、R、D或P ; 第25位氨基酸突變?yōu)镈、L、Η或G ; 第27位氨基酸突變?yōu)镚、V、Α或Q ; 第28位氨基酸突變?yōu)镽、E或L ; 第32位氨基酸突變?yōu)長(zhǎng)、V或E ; 第35位氨基酸突變?yōu)镚、H、Q或D ; 第43位氨基酸突變?yōu)镋或K。4. 如權(quán)利要求1所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，其特 征在于，該多肽與人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白相互作用的K D值為1 X 10 6M至1 X 10 7M。5. -種靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括權(quán) 利要求1-4任一所述的多肽，以及與該多肽相連接（或偶聯(lián)）的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物包 括：半胱氨酸殘基，多肽標(biāo)簽，抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物，或可檢測(cè)標(biāo)記物。6. 如權(quán)利要求5所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，其特征在于，所述的抑 制人乳頭瘤病毒16型的藥物包括：毒素；較佳地，所述毒素是具有抑制人乳頭瘤病毒16型 病毒感染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素或所述毒素的功 能性片段；且，所述的腫瘤是人乳頭瘤病毒16型陽性的腫瘤。7. -種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-4任一所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7 蛋白具有結(jié)合親和力的多肽。8. -種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分 子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。9. 一種重組載體，其特征在于，該載體包含權(quán)利要求7或8所述的多核苷酸。10. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求9所述的重組載體，或其包 含有或基因組中整合有權(quán)利要求7或8所述的多核苷酸。11. 一種制備權(quán)利要求1-4任一所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和 力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，從而表達(dá)權(quán)利要求1-4任一所述的對(duì)人乳頭瘤病毒 16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽； (2) 分離純化（1)獲得的多肽。12. 權(quán)利要求1-4任一所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽 或權(quán)利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子的用途，用于制備治療人乳 頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤的藥物；或 用于制備檢測(cè)人乳頭瘤病毒16型病毒感染的檢測(cè)試劑；或 用于制備診斷人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性腫瘤的診斷 試劑。13. -種藥物組合物，其特征在于，其包含： 權(quán)利要求1-4所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽或權(quán)利要 求5或6所述的革E1向人乳頭瘤病毒16型的革E1向性分子；和 藥學(xué)上可接受的載體。14. 一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達(dá)陽性 腫瘤的藥盒，其特征在于，所述的藥盒中包括：權(quán)利要求1-4任一所述的對(duì)人乳頭瘤病毒16 型的E7蛋白具有結(jié)合親和力的多肽，或權(quán)利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的 靶向性分子，或權(quán)利要求13所述的藥物組合物。
【文檔編號(hào)】C07K14/31GK105859846SQ201510028505
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月20日
【發(fā)明人】張麗芳, 薛向陽, 朱珊麗, 王樂丹, 朱冠保, 李文姝
【申請(qǐng)人】溫州醫(yī)科大學(xué)