專利名稱：低氧親和力的突變型血紅蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及新的突變型血紅蛋白，具體涉及重組突變型血紅蛋白“rHb(α96Val→Trp)”，它的氧親和力低，但在氧結(jié)合中的協(xié)同性高。本發(fā)明還涉及利用重組DNA技術(shù)制備可替代血紅細胞的突變型血紅蛋白。
背景技術(shù)：
HIV和肝炎之類感染源在人血制品的血紅細胞中的傳播，加上由于缺少合適的供血者而造成的血源缺乏，這些使得人們對開發(fā)紅細胞代用品，尤其是人血紅蛋白(“Hb”)及其衍生物產(chǎn)生了極大興趣。血紅蛋白是攜氧血液成份，位于紅細胞內(nèi)在血流中循環(huán)。
人正常成人血紅蛋白(“Hb A”)是一種四聚體蛋白質(zhì)，包含兩條各含141個氨基酸殘基的α鏈和兩條各含146個氨基酸殘基的β鏈，還帶有被稱為血紅素的輔基。紅細胞幫助維持血紅蛋白處于還原性功能形式。血紅素亞鐵離子很容易被氧化，但可以被紅細胞內(nèi)的兩種系統(tǒng)之一還原，即細胞色素b5和谷胱甘肽還原系統(tǒng)。
對于使用血紅蛋白的無細胞溶液作為潛在的攜氧紅細胞替代品早已有研究。參見，Mulder，A.G.等，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Cell Comp.Physilo)5383(1934)，本文引用其內(nèi)容作為參考。使用純化自紅細胞的非修飾的無細胞人血紅蛋白除污染和前文所述的來源限制之外還受到許多限制，即輔因子2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的喪失使得氧親和力上升，和Hb四聚體分解為由腎排除的αβ二聚體，這會導(dǎo)致慢性腎損傷。參見，Bunn，H.F.等，(J.Exp.Med.)129909(1969)，本文引用其內(nèi)容作為參考。
血紅蛋白由于其對2，3-DPG(一種別構(gòu)調(diào)節(jié)劑)的依賴性，可以改變其氧親和力，從而提高體內(nèi)的氧運送效率。2，3-DPG以一定的濃度存在于紅細胞中，該濃度促進血紅蛋白將氧釋放給組織。沒有2，3-DPG時，血紅蛋白與氧的結(jié)合更緊密，不易釋放與之結(jié)合的氧。這樣，需要給因血漿中缺乏2，3-DPG而不能有效地進行氧傳送的病人輸入天然的人正常成人血紅蛋白(“Hb A”)。
已經(jīng)在以下系統(tǒng)中表達了人球蛋白和血紅蛋白轉(zhuǎn)基因鼠，參見Chada，K.等，自然(Nature)(London)314377(1 985)和Townes，T.M.等，(EMBO.J.)41715(1985)，本文引用其內(nèi)容作為參考；Swanson，M.E.等，在生物/技術(shù)(Bio/Technology)10557(1992)中所述的轉(zhuǎn)基因豬，本文引用其內(nèi)容作為參考；Groebe，D.R.等在蛋白質(zhì)的表達與純化(Protein Expression and Purification)中報道的昆蟲細胞培養(yǎng)物，本文引用其內(nèi)容作為參考；Wagenbach，M.等在生物/技術(shù)(Bio/Technology)957(1991)中，和DeLiano，J.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90918(1993)中所述的酵母菌，本文引用其內(nèi)容作為參考；和Hoffman，S.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)878521(1990)中所述，Hernan，R.A.等在生物化學(xué)(Biochemistry)318619(1992)中所述，和Shen，T.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108(1993)中所述的大腸桿菌(“E.coli”)，本文引用其內(nèi)容作為參考。在許多方面，大腸桿菌系統(tǒng)是用于此目的的最佳選擇，因為它表達效率最高，而且容易進行定點誘變。
Nagai，K.等在自然(Nature)309810(1984)和(Methods Enzymol)153416(1987)中創(chuàng)建并描述了第一個表達作為融合蛋白的人α-或β-球蛋白的大腸桿菌系統(tǒng)，本文引用其內(nèi)容作為參考，但是，對該系統(tǒng)產(chǎn)物的后處理過程十分繁瑣而且得率很低。所以，該表達系統(tǒng)并不理想，尤其是在為了進行生物化學(xué)、生物物理學(xué)和生物學(xué)研究而需要大量重組血紅蛋白(“r Hb A”)時。
Hoffman，S.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)878521(1990)中報道了一種共表達系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，合成的人α-和β-球蛋白基因被組織在單順反子內(nèi)，并且等量表達。表達的α-和β-球蛋白都在大腸桿菌中與內(nèi)源血紅素正確組裝成四聚體的Hb分子。Hernan，R.A.等，在生物化學(xué)(Biochemistry)318619(1992)中報道了非融合單一β-球蛋白在大腸桿菌中的表達。雖然這兩個非融合系統(tǒng)在許多方面效果良好，但在α-和β-球蛋白的氨基(N)端都保留了額外的甲硫氨酸殘基。
如Bunn，H.F.等編輯的血紅蛋白分子、遺傳及臨床方面(HemoglobinMolecular，Genetic and Clinical Aspects)(W.B.Saunders，Co.，Philadelphia，PA)pp.37-60(1986)(本文引用其內(nèi)容作為參考)所述，Hb A天然氨基末端的纈氨酸殘基被認為在調(diào)節(jié)氧親和力，波爾效應(yīng)(Bohr effect)和與別構(gòu)劑和陰離子之間的相互作用方面起著重要作用。如在此引用參考的Kavanaugh，J.S.等在生物化學(xué)(Biochemistry)318640(1992)中所述，額外的甲硫氨酸能夠改變Hb分子N末端的構(gòu)象。所以，Hb的氧合特性取決于N末端殘基的完整性，所以必須從表達的Hb的α-和β-球蛋白的N末端去除額外的甲硫氨酸殘基，才能使大腸桿菌系統(tǒng)有效地被用于生產(chǎn)需要的非修飾和突變型Hb。
甲硫氨酸氨肽酶(“Met-AP”或“MAP”)被發(fā)現(xiàn)負責(zé)在大腸桿菌、沙門氏菌、芽胞桿菌和酵母菌中去除新生肽鏈N末端的甲硫氨酸殘基，而且已經(jīng)純化和鑒定了來自多種生物體的Met-AP。參見，Ben-Bassat，A等，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)169751(1987)和美國專利4,865,974、4,870,017和5,013,662，本文引用其內(nèi)容作為參考。這些酶對某肽或蛋白質(zhì)的N末端甲硫氨酸具有獨有的特異性，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的Met-AP據(jù)報道能夠去除許多表達的外源蛋白質(zhì)的N末端甲硫氨酸。Ben-Bassat，A等，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)169751(1987)。
利用希爾系數(shù)(Hill coeffient)(“n”)衡量的協(xié)同氧合作用是其別構(gòu)特性的較適宜的量度。參見Dickerson，R.E.等，血紅蛋白結(jié)構(gòu)、功能、進化和病原學(xué)(HemoglobinStructure，F(xiàn)unction，Evolution，and Pathology)(Benjamin CummingsPublishing Co.，Menlo Park，CA)(1983)，本文引用其內(nèi)容作為參考。Hb A在一般實驗條件下與O2結(jié)合的nmax約為3。在α1β2(或α2β1)亞基界面有氨基酸取代的人正常Hb通常表現(xiàn)出比Hb A高的氧親和力和比其低的氧結(jié)合協(xié)同性。參見，Dicherson，R.E.等，同上(1983)；Bunn，H.F.等生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2497402(1974)；和Perutz，M.F.等，蛋白質(zhì)中協(xié)同性和別構(gòu)調(diào)節(jié)的機理(Mechanisms of Cooperativity and Allosteric Regulation in Proteins)CambridgeUniversity Press(1990)。所以，α1β2亞基界面被認為對Hb的功能來說是十分重要的。例如，在β99Asp處發(fā)生氨基酸取代的人突變Hb具有大大低于Hb A的協(xié)同性和提高的氧親和力。這類突變型血紅蛋白的實例有HbKempsey(β99Asp→Asn)(Reed，C.S.等，血液(Blood)31623(1968))；HbYakima(β99Asp→His)(Jones，R.T.等 ，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)461840(1967))；和Hb Radcliff(β99Asp→Ala)(Weatherall，D.J.等，英國血液學(xué)雜志(British J.Haematol.)35177(1977))，本文引用其內(nèi)容作為參考。在此引用參考的Fermi，G.等在分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)175159(1984)中，已經(jīng)進行了對脫氧Hb A(不帶氧分子的Hb A)的X射線晶體學(xué)研究，該研究顯示β99Asp同時與α1β2亞基界面的α42Tyr和α97Asn以氫鍵連接。這表明，β99Asp的實質(zhì)性作用是通過形成亞基間的氫鍵來維持脫氧Hb分子的穩(wěn)定性。
最近，已經(jīng)構(gòu)建了兩種涉及α42Tyr突變的重組Hb(“r Hb”)，兩種突變在形成的突變體中導(dǎo)致了非常不同的特性。rHb(α42Tyr→His)(Ishimori，K.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)24614624(1989)和Imai，K.等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)218769(1991)，本文引用其內(nèi)容作為參考)表現(xiàn)出一定的氧結(jié)合協(xié)同性(pH＝6.8時，n＝2)和中等的氧親和力。r Hb(α42Tyr→Phe)((Ishimori，K.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)24614624(1989)和Imai，K.等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)218769(1991)，本文引用其內(nèi)容作為參考)幾乎完全沒有氧結(jié)合協(xié)同性(n＝1.2)，而且具有很高的氧親和力。兩種突變體之間的特性差異被認為是因為在r Hb(α42Tyr→His)的脫氧態(tài)中，在α42His和β99Asp之間存在微弱的氫鍵，而在脫氧r Hb(42Tyr→Phe)中則沒有。已知，不論在β99Asp或α42Tyr發(fā)生氨基酸取代而喪失亞基間氫鍵的異常Hb都同時喪失其功能特性，所以，這些氫鍵被認為對于Hb分子的結(jié)構(gòu)和功能是十分重要的。
在此引用參考的Shaanan，B.等在分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)17131(1983)中報道，含氧形式的Hb A在α1β2亞基界面的α94Asp和β102Asn之間有特征性氫鍵。在α94Asp發(fā)生氨基酸取代的人Hb，如Hb Titusville(α94Asp→Asn)(Schneider，R.G.等，(Biochim.Biohpys.Acta.)400365(1975)，本文引用其內(nèi)容作為參考)，或在β102Asn發(fā)生氨基酸取代的人Hb，如Hb Kansas(β102Asn→Thr)(Bonaventura，J.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)243980(1968)，本文引用其內(nèi)容作為參考)，以及其它的，都表現(xiàn)出很低的氧親和力。但是，這些直接打斷含氧形式Hb內(nèi)α94Aps和β102Asn間氫鍵的Hb突變體其氧結(jié)合協(xié)同性都顯著降低，而且很容易在連接態(tài)時分解為二聚體。
也有不涉及α94Aps或β102Asn的低氧親和力人突變型Hb。例如HbPresbyterian(p108Asn Lys)(Moo-Penn，W.F.等，(FEBS Lett.)9253(1978)和O’Donnell，J.K.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26927692(1994)；Hb Yoshizuka(β108Asn→Asp)(O’Donnell，J.K.等，生物化學(xué)雜志(J.Bio1.Chem.)26927692(1994)；和重組Hb Mequon(β4lPhe→Tyr)(Baudin，V.等，(Biochim.Biohpys.Acta.)1159223(1992)，本文引用以上內(nèi)容作為參考)，都表現(xiàn)出比Hb A低的氧親和力，但是他們都表現(xiàn)出不同的利用希爾系數(shù)衡量的協(xié)同性，n在1.8至2.9之間不等。
已經(jīng)使用了分子動力學(xué)(“MD”)模擬來計算天然蛋白和突變型蛋白之間的自由能差異。參見Dang，L.X等，美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)1118505(1989)和Gao，J.等，科學(xué)(Science)2441069(1989)，本文引用其內(nèi)容作為參考。Gao，J.等在科學(xué)(Science)2441069(1989)報道，Hb Radcliff(β99Asp→Ala)的MD模擬顯示出熱動力學(xué)測量值與計算值之間的高度一致性。Kim，H.W.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9111547(1994)中報道，MD模擬已被用于成功地設(shè)計異常Hb中的補償性氨基酸取代，該取代可以恢復(fù)其別構(gòu)特性，本文引用其內(nèi)容作為參考。
在此引用參考的Shen，T.J.等在美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)908108(1993)中描述了一種大腸桿菌表達質(zhì)粒(pHE2)，在該質(zhì)粒中合成的α-和β-球蛋白基因與大腸桿菌的甲硫氨酸氨肽酶基因在各自的tac啟動子調(diào)控下共表達。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞表達r Hb A，共表達的MAP有效地切除了這種r Hb A N末端的甲硫氨酸。由此生產(chǎn)的沒有N末端甲硫氨酸的重組Hb A在許多結(jié)構(gòu)和功能特性上與天然Hb A一致。
但是，仍然需要一種可以被用作以血紅蛋白為基礎(chǔ)的代血制品或治療劑的突變型血紅蛋白。人們尤其感興趣的是這樣的突變型血紅蛋白，即具有低氧親和力，高氧結(jié)合協(xié)同性，而且不會在連接態(tài)時表現(xiàn)出異常的亞基分解。還需要用重組方法得到的這種血紅蛋白，以及能夠以高得率產(chǎn)生特別用于代血制品的這種突變型血紅蛋白的有效的表達系統(tǒng)。
發(fā)明綜述所以，本發(fā)明的主要目的是提供一種低氧親和力的突變型血紅蛋白。
本發(fā)明的目的之二是提供一種低氧親和力的非天然突變型血紅蛋白。
本發(fā)明目的之三是提供一種人工生成的，最好是以重組方法產(chǎn)生的低氧親和力突變型血紅蛋白，同時具有正確的血紅素構(gòu)象。
本發(fā)明的目的之四是提供氧親和力低但在氧結(jié)合中協(xié)同性高的突變型血紅蛋白。
本發(fā)明目的之五是提供在無細胞環(huán)境中具有與紅細胞中的人正常成人血紅蛋白相似的氧結(jié)合特性的突變型血紅蛋白。
本發(fā)明目的之六是提供用于產(chǎn)生這類突變型血紅蛋白的表達系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一目的是提供人造血紅蛋白用作以血紅蛋白為基礎(chǔ)的代血制品或治療劑。
通過后文實施例可以達到本發(fā)明的上述及其它目的。
本

發(fā)明內(nèi)容
之一描述了一種非天然的突變型血紅蛋白，其中α鏈中96位的纈氨酸殘基被色氨酸殘基取代。
本

發(fā)明內(nèi)容
之二，利用重組方法產(chǎn)生了具有比正常的人成人血紅蛋白低的氧親和力，但具有高氧結(jié)合協(xié)同性的血紅蛋白。
本

發(fā)明內(nèi)容
之三描述了一種非天然的低氧親和力突變型血紅蛋白，它在別構(gòu)劑2，3-DPG存在下，具有與人正常成人血紅蛋白相當(dāng)?shù)难踅Y(jié)合特性。
在較好的實施方式中，突變型血紅蛋白中α鏈96位的纈氨酸殘基被色氨酸殘基取代。
通過以下說明和權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的。


圖1，用pHE202(“pHE202/JM109”)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細胞，超聲波粉碎后獲得的r Hb(α96Val→Trp)，圖1是該r Hb從Mono S柱上洗脫的色譜洗脫圖形，圖形顯示峰a、b1和b2。洗脫液在546nm處檢測。
圖2A-2D是來自質(zhì)粒pHE202的峰a(圖2A)、峰b1(圖2B)和峰b2(圖2C)的rHb(α96Val→Trp)，以及作為參照的Hb A(圖2D)的電噴霧質(zhì)譜法。
圖3A和3B是顯示在29℃，在pH7的0.1M磷酸鹽緩沖水溶液中，CO形式的4％來自pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)和4％Hb A的環(huán)流位移質(zhì)子共振的1H-NMR譜。圖3A顯示經(jīng)Mono S柱純化的純洗脫液(a、b1、b2)的CO形式。圖3B顯示從CO形式回復(fù)到Fe+3態(tài)的來自峰a，b1，b2的純r Hb(α96Val→Trp)。
圖4A和4B顯示在29℃(兩圖)和36℃(僅圖4B)，在pH7的0.1M磷酸鹽緩沖水溶液中，脫氧形式的4％來自pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)和4％Hb A的1H-NMR共振。圖4A顯示的是鄰近的組氨酸的超精-位移的NδH可交換質(zhì)子共振；圖4B顯示的是超精位移和可交換共振。“脫氧-r Hb”在圖4B中表示脫氧rHb(α96Val→Trp)。
圖5A-5D的1H-NMR質(zhì)譜顯示的是在10、21、29和36℃，在10mM肌醇六磷酸(“IHP”)存在下，在pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液中，溫度對4％來自pHE202/JM109的峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的300-MHz質(zhì)子共振的影響。圖5A和圖5B分別是4％峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的可交換質(zhì)子共振。圖5C和5D分別是4％峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的環(huán)-流位移共振。
圖6A-6D的1H-NMR質(zhì)譜顯示的是在10、15、21和29℃，在無肌醇六磷酸(“IHP”)的pH7.0水中，溫度對4％來自pHE202/JM109的峰a的rHbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的300-MHz質(zhì)子共振的影響。圖6A和圖6B分別是4％峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的可交換質(zhì)子共振。圖6C和6D分別是4％峰a的r HbCO(α96Val→Trp)和4％HbCO A的環(huán)-流位移共振。
圖7A和圖7B顯示50％飽和時用氧分壓表示的氧親和力(P50)(mmHg)，該圖被繪制成pH的函數(shù)，使用的是Hb A或pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)在0.1M磷酸鈉緩沖液中形成的0.1mM溶液，緩沖液pH范圍為6.3-8.9，溫度為29℃。圖7A顯示的是Hb A(○)和來自Mono S柱的r Hb(α96Val→Trp)純洗脫液(峰a(■)、峰b1(△)，和峰b2(+))；圖7B顯示的是從CO形式轉(zhuǎn)換到Fe+3態(tài)，再回復(fù)到CO形式的Hb A(○)和來自Mono S柱的r Hb(α96Val→Trp)純洗脫液(峰a(■)、峰b1(△)，和峰b2(+))。
圖8A和圖8B顯示希爾系數(shù)(nmax)作為pH的函數(shù)，其中的氧解離數(shù)據(jù)是利用0.1mM的Hb A或pHE202/JM109產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)的0.1M磷酸鈉緩沖液溶液在6.5-8.4 pH范圍及29℃時獲得的。圖8A顯示的是Hb A(○)和Mono S柱純化的洗脫液(峰a(■)，峰b1(△)，和峰b2(+))；圖8B顯示的是從CO形式轉(zhuǎn)換到Fe+3態(tài)，再回復(fù)到CO形式的Hb A(○)和來自Mono S柱的r Hb(α96Val→Trp)純洗脫液(峰a(■)、峰b1(△)，和峰b2(+))。
圖9顯示用0.1mMHb的0.1M磷酸鈉緩沖液溶液在pH7.4和29℃獲得的氧解離曲線，Hb分別是Mono S純化的pHE202/JM109的洗脫峰a的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A，分別與有別構(gòu)劑2mM的2，3-DPG和2mM的IHP存在下的Mono S純化的r Hb(α96Val→Trp)比較。
圖10A和10B分別顯示氧親和力(P50)的溫度依賴性和希爾系數(shù)，是使用Hb A或pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)在pH7.4的0.1M磷酸鈉緩沖液溶液中形成的0.1mM溶液在16、20、25、29和37℃獲得的。使用的Hb是Hb A(○)，r Hb(α96Val→Trp)(△)，2mM IHP存在下的r Hb(α96Val→Trp)(+)；和2mM IHP存在下的Hb A(□)。
圖11A和11B顯示的是可交換質(zhì)子共振(圖11A)和環(huán)-流位移質(zhì)子共振(圖11B)，分別是4％來自pHE202/JM109的峰b2的r HbCO(α96Val→Trp)，4％來自pHE202/JM109的峰2的r HbCO(α96Val→Trp)和Hb A，都是CO形式，配制在0.1M的pH7.0磷酸鹽緩沖水溶液中，在29℃時。兩種rHb(α96Val→Trp)樣品都在進行NMR測量前接受了氧化-還原處理。
本發(fā)明的說明I.定義在本文中，“Hb A”或“天然Hb A”指由人獲取的人正常成人血紅蛋白。
“重組人正常成人血紅蛋白”，“r Hb A”和“非修飾r Hb A”指如Shen，t.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108(1993)中所述，利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的，結(jié)構(gòu)和功能與天然Hb A基本相同的人正常成人血紅蛋白。
“r Hb(α96Val→Trp)”指利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的，位于α1β2(或α2β1)界面的α鏈上96位的纈氨酸殘基被色氨酸取代的突變型人正常成人血紅蛋白。這種血紅蛋白顯示低氧親和力和高氧結(jié)合協(xié)同性，在連接態(tài)時不發(fā)生異常的亞基解離。
“脫氧”或“含氧”指Hb A和r Hb(α96Val→Trp)中的血紅素-亞鐵離子的氧合態(tài)。含氧血紅蛋白“含氧Hb”或“HbO2”具有與血紅素基團結(jié)合的4個氧分子；脫氧血紅蛋白(“脫氧Hb”)不含氧分子。在一般動脈血中，正常成人血紅蛋白A(“Hb A”)是含氧態(tài)的(“含氧Hb A”)。在靜脈血中，部分Hb A是脫氧形式的(“脫氧Hb A”)。
“一氧化碳-Hb”，“HbCOA”，“rHbCO(α96Val→Trp)”和“CO形式”都指與一氧化碳分子而不是氧分子結(jié)合的血紅蛋白。
“鐵-血紅蛋白”，“鐵-Hb”，“鐵形式”，“金屬球蛋白”，“met-Hb”和“Fe+3態(tài)”都指各自的血紅素-鐵原子被氧化成鐵態(tài)(Fe+3)的Hb A和r Hb(α96Val→Trp)。鐵-Hb不結(jié)合氧。
“亞鐵-血紅蛋白”，“亞鐵-Hb”，“Fe+2態(tài)”和“亞鐵形式”都指各自的血紅素-鐵原子處于天然的還原態(tài)(Fe+2)。亞鐵-Hb能夠結(jié)合氧或一氧化碳。
“調(diào)控”指編碼序列的基因從屬于DNA分子調(diào)控區(qū)中的另一基因，具體地說是啟動子，編碼序列由此在該啟動子的調(diào)控下被表達和調(diào)節(jié)。沒有這樣的調(diào)控，編碼序列會在宿主體內(nèi)表達過多或過少，或在不合適的時候表達。
“Met-氨肽酶”，“Met-AP”和“MAP”指甲硫氨酸氨肽酶，該酶特異性地從肽序列上切斷氨基端(N末端)的甲硫氨酸殘基。
“四級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換”指血紅蛋白亞基界面的結(jié)構(gòu)重排，例如在從脫氧形式轉(zhuǎn)變到含氧形式α1β2的轉(zhuǎn)換。
“氧親和力”指氧與血紅蛋白的結(jié)合強度。高氧親和力指血紅蛋白不易釋放與之結(jié)合的氧分子。P50是氧親和力的一種量度。
“協(xié)同性”指血紅蛋白S形的氧結(jié)合曲線，即，與四聚體血紅蛋白一個亞基結(jié)合的第一個氧分子促進氧與其它未結(jié)合的亞基的結(jié)合。這宜用希爾系數(shù)(nmax)來衡量。Hb A的nmax＝3.0。
血紅蛋白的R型或R樣以及T型或T樣結(jié)構(gòu)指表現(xiàn)特征性四級結(jié)構(gòu)標(biāo)記，例如以距DSS10.7ppm的質(zhì)子共振為R-結(jié)構(gòu)標(biāo)記，以距DSS14ppm的質(zhì)子共振為T-結(jié)構(gòu)標(biāo)記。有些突變型和化學(xué)修飾過的Hb可能具有改變了三級結(jié)構(gòu)的T-或R-四級結(jié)構(gòu)標(biāo)記。
II.方法與結(jié)果本發(fā)明提供了一種非天然存在的低氧親和力突變型人血紅蛋白以及利用重組技術(shù)產(chǎn)生這種血紅蛋白的方法。更具體地說，本發(fā)明的目的在于利用重組技術(shù)產(chǎn)生的突變型Hb A，本文中表示為r Hb(α96Val→Trp)，其中α1β2(或α2β1)亞基界面區(qū)域內(nèi)α鏈上96位的纈氨酸殘基被色氨酸殘基取代。這種新的人造血紅蛋白，即完全來自血液以外來源的血紅蛋白表現(xiàn)出低氧親和力，但氧結(jié)合的協(xié)同性很高。此外，它在連接態(tài)時不會發(fā)生異常的亞基解離。在無細胞環(huán)境中，本發(fā)明的r Hb(α96Val→Trp)具有與紅細胞內(nèi)的Hb A相似的氧結(jié)合特性。這種利用重組技術(shù)產(chǎn)生的低氧親和力血紅蛋白突變體其價值在于可作為以血紅蛋白為基礎(chǔ)的代血制品的成份。這種血紅蛋白還可以用在對腫瘤、損傷的放射治療和手術(shù)中的血液稀釋。
本發(fā)明的范圍還包括制備和使用具有其它適當(dāng)突變的低氧親和力血紅蛋白。具體地說，本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生具有其它優(yōu)良特性的突變型血紅蛋白。據(jù)信，α1β2界面和血紅蛋白中央凹槽內(nèi)的其它突變可以產(chǎn)生其它有用的低氧親和力突變體。后文描述了評價這種突變蛋白在代血制品中或治療中適用性的方法。
后文詳細說明的分子動力學(xué)模擬顯示，本發(fā)明r Hb(α96Val→Trp)獨特的氧結(jié)合特性可能是因為在脫氧r Hb(α96Val→Trp)的α1β2界面內(nèi)存在一個α96Trp與β99Asp之間的額外氫鍵。
盡管在α1β2界面內(nèi)小氨基酸殘基纈氨酸被大的色氨酸殘基所取代，后文將證明，這種人造血紅蛋白的血紅素袋結(jié)構(gòu)周圍的三級結(jié)構(gòu)以及α1β2亞基界面的四級結(jié)構(gòu)與人正常成人血紅蛋白非常相似。血紅蛋白分子的三級結(jié)構(gòu)指的是在直鏈序列中相距很遠的氨基酸殘基之間的立體關(guān)系，這種關(guān)系使每條鏈自體折疊，而四級結(jié)構(gòu)指的是亞基鏈之間如何相互作用。
如后文所述，本發(fā)明的人造血紅蛋白具有這樣的特性，即該血紅蛋白含氧(R-)型四級結(jié)構(gòu)的連接形式，例如一氧化碳形式可以被轉(zhuǎn)化成脫氧(T-)型四級結(jié)構(gòu)，而無需加入肌醇六磷酸之類的別構(gòu)劑來改變其連接狀態(tài)。這種轉(zhuǎn)化還可以通過在沒有肌醇六磷酸存在下降低溫度來進行。所以，本發(fā)明的重組血紅蛋白可以用于獲取對α1β2界面內(nèi)亞基間作用的性質(zhì)和血紅蛋白別構(gòu)機制分子基礎(chǔ)的新認識。
顯而易見的是，本發(fā)明的方法還可以用于產(chǎn)生其它具有不同特性的突變型人造血紅蛋白，和具有補償天然產(chǎn)生的突變體的血紅蛋白。后文中的參考實施例說明了用于獲取r Hb(α96Val→Trp)的較好的材料和方法。雖然本發(fā)明的rHb(α96Val→Trp)宜利用重組技術(shù)產(chǎn)生，但是可以理解的是也可以使用非重組方法。
實施例A.質(zhì)粒pHE202表達質(zhì)粒pHE202的構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)構(gòu)建了兩種表達r Hb(α96Val→Trp)的質(zhì)粒，質(zhì)粒pHE202和質(zhì)粒pHE702。首先，質(zhì)粒pHE202的構(gòu)建方法和結(jié)果如下文所述。
將含有合成的人α-和β-球蛋白基因的表達質(zhì)粒pHE2作為起始質(zhì)粒。ShenT.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108(1993)中已就質(zhì)粒pHE2的構(gòu)建和性質(zhì)作了全面的描述，本文引用其內(nèi)容作為參考。在質(zhì)粒pHE2的構(gòu)建中，合成的人α-和β-球蛋白基因來自質(zhì)粒pDLIII-13e(Somatogen，Inc.，Boulder CO，的產(chǎn)品，Hoffman，S.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)878521(1993)中作了全面描述，本文引用其內(nèi)容作為參考)。大腸桿菌Met-AP基因的編碼序列來自質(zhì)粒pSYC1174(大腸桿菌MM294中的pSYC1174是CetusCorp.，Emeryville，CA的產(chǎn)品)，該菌株同時保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號為ATCC53245，而且已經(jīng)公開。同時參見美國專利4,865,974，4,870,017和5,013,662。質(zhì)粒pHE2在各自的tac啟動子調(diào)控下共表達合成的人α-和β-球蛋白基因和大腸桿菌Met-AP基因。
然后如后文所述，進行定點誘變，用色氨酸殘基取代α鏈上96位的纈氨酸殘基。利用本領(lǐng)域的常規(guī)方法將合成的人α-和β-球蛋白基因(來自質(zhì)粒pDLIII-13e)插入噬菌粒pTZ18U(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中。利用標(biāo)準DNA合成技術(shù)在DNA合成儀，University of Pittsburgh 上合成序列為5’-TTTGAAGTTCCATGGATCAAC-3’的合成寡核苷酸(用下劃線表示突變的密碼子)，將它用作引入α96Val→Trp突變的引物。寡核苷酸合成技術(shù)是眾所周知的，本發(fā)明并不限于任何特定的技術(shù)。如Kunkel，T.M.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82488(1985)和Shen，T.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108(1993)中所述進行定點誘變，本文引用其內(nèi)容作為參考。然后用突變基因取代質(zhì)粒pHE2中的人正常α-球蛋白基因形成質(zhì)粒pHE202。宿主細胞大腸桿菌JM109中的質(zhì)粒pHE202，標(biāo)識為pHE202/JM109，于1995年4月26日保藏在Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC69792。
細胞的生長利用本領(lǐng)域常規(guī)方法將質(zhì)粒pHE202轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109細胞(Promega，Madison，WI)內(nèi)。細胞在20升的Microferm MF20型發(fā)酵罐(New BrunswickScientific，Edison，NJ)中，于TB培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)基中含有1.2％細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，2.4％細菌培養(yǎng)用酵母提取物，0.4％甘油，17mM KH2PO4，72mMK2HPO4和100μg青霉素(Sigma，St.Louis，MO)，溫度為30℃，直至細胞密度達到1-2×109細胞/ml。
加入0.2mM的異丙基β-硫代吡喃半乳糖苷誘導(dǎo)r Hb(α96Val→Trp)的表達。然后在培養(yǎng)物中補充氯高鐵血紅素(20mg/l)(Sigma，St.Louis，MO)和葡萄糖(10mg/l)，至少再繼續(xù)生長4小時。然后離心收獲細胞，在需要進一步純化前按每份100g在-80℃冷凍保存。
雖然優(yōu)選大腸桿菌細胞來表達和產(chǎn)生本發(fā)明的重組突變型血紅蛋白，但是本發(fā)明并不局限于大腸桿菌細胞。其它合適的表達系統(tǒng)，例如酵母細胞、昆蟲細胞和豬及牛之類的轉(zhuǎn)基因動物也可以較好地被用于表達突變型血紅蛋白。質(zhì)粒pHE202已被優(yōu)化用于大腸桿菌細胞，但是后文所述的質(zhì)粒pHE702是由人基因構(gòu)建的，所以利用質(zhì)粒pHE702中包含的人基因可使用其它合適的表達系統(tǒng)。
重組Hb的分離和純化基本上如Shen，T.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108(1993)中所述，略作修改，純化由用質(zhì)粒pHE202轉(zhuǎn)化的細胞獲得的r Hb(α96Val→Trp)。
將冷凍保存的細胞加入裂解緩沖液(40mM Tris-堿/1mM芐醚(Sigma)，3ml/g細胞)中攪拌至充分懸浮。將(Sigrna)(1mg/g細胞)溶解在10ml 40mM的Tris-HCl，pH8.0的溶菌酶加入細胞懸浮液，在4℃靜置約45分鐘(溶液變得非常粘稠)。加入MgCl2和MnCl2至最終濃度分別為10mM和1mM。加入約3-5μg/ml的DNAse(ICN Biochemical，Inc.，Costa Meas，CA)，攪拌30-60分鐘，或直至粘度降低。然后，裂解液在Branson 450超聲處理儀(Branson，Danbury，CT)中，在冰浴中，在65-75W，進行3個3分鐘循環(huán)的超聲處理，在循環(huán)之間進行停頓以保證裂解液處于低溫。然后，裂解液在Sorvall GSA轉(zhuǎn)子中(E.I.duPont，Wilmington，DE)在14,000rpm，在4℃離心45分鐘。然后用CO飽和上清液，并在4℃靜置3至4天。用1M的Tris-堿將上清液的pH調(diào)節(jié)至8.0，緩慢加入10％的聚乙烯亞胺(Sigma)(vol/vol)，直至最終濃度0.5％，以便沉淀出核酸。在CO氣氛下攪拌沉淀15分鐘，然后如上所述在14,000rpm離心。用1M的Tris-堿將上清液的pH調(diào)節(jié)至8.3，將其通過Millipore Minitan丙烯酸超濾系統(tǒng)(Millipore Corp.，Bedford，MA)至體積約為150ml。對20mM pH8.3的Tris-HCl/0.1mM三亞乙基四胺(TETA)(后文稱為“Q2緩沖液”)通宵透析濃縮液。通常通過添加20mM Tris-堿/0.1mM TETA來調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)率，使之與Q2緩沖液的一樣。
在利用Pharmacia快速蛋白質(zhì)液相色譜(“FPLC”)系統(tǒng)(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，IN)的最后純化過程中使用了兩根色譜柱。使用的第一根色譜柱是用于結(jié)合Hb的Q-瓊脂糖高流速柱(Pharmacia陰離子交換柱)(5cm×28cm)。上樣后，用Q2緩沖液(20mM Tris-HCl/0.1mM TETA，pH8.3)洗脫，并在260nm處檢查，直至將污染核酸洗脫。然后用pH7.2的20mM Tris-HCl洗脫Hb部分。用pH6.8的10mM磷酸鹽/0.1mM乙二胺四乙酸(“EDTA”)(緩沖液A)濃縮洗脫液。上樣的第二根色譜柱是Mono S柱(Pharmacia陽離子交換柱，HR6/10)。用10mMpH6.8的磷酸鈉/0.1mM乙二胺四乙酸(“EDTA”)至20mM pH8.3的磷酸鈉/0.1mM EDTA的梯度在Mono S柱上純化平衡后的樣品。在546nm對洗脫部分進行檢查。
如圖1所示，r Hb(α96Val→Trp)被洗脫在兩個主峰中，一個對稱峰(a峰)和隨后的兩個重疊峰(b1峰和b2峰)。如前文所述獲得的這些洗脫峰在后文中稱為“a峰”、“b1峰”和“b2峰”，如圖1所示。利用Antomini，E.等在血紅蛋白和肌球蛋白與其配體的反應(yīng)(Hemoglobin and Myoglobin in Their Reaction withLigands)(North Holland，Amsterdam)p.19(1971)中所述的公開的消光系數(shù)來測定，本文引用其內(nèi)容作為參考。
Hb的形式Hb(即Hb A和r Hb(α96Val→Trp))的CO形式是通過將CO氣流通過燒瓶內(nèi)的HbO2或脫氧Hb溶液來制備的。該過程在通風(fēng)櫥中進行。脫氧Hb通常是如Lindstrom，T.R.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)691701(1972)中所述，在4℃，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在氮氣氛下將HbCO或HbO2轉(zhuǎn)變成脫氧形式來制備的。氧-Hb是使脫氧-Hb接觸空氣或O2。
蛋白質(zhì)測序如Hewick，R.M.等在生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2567990(1981)中所述，進行自動化的Edman降解循環(huán)，使用配備了在線苯基硫代乙內(nèi)酰脲-氨基酸分析儀(120A型)的Applied Biosystem氣/液相測序儀(470/900A型)進行自動Edman降解循環(huán)，本文引用其內(nèi)容作為參考。
質(zhì)譜分析接受質(zhì)譜分析的Hb樣品對蒸餾水充分透析，然后冷凍干燥。在臨分析前將樣品在水中溶解成125pmol Hb/μl H2O(7.8mg/ml)的最終濃度。然后將這些溶液分成等份后分別稀釋至10pmol/μl 5050的水/含0.2％甲酸的乙腈。將各份(10μl)最終溶液以5μl/min的速度引入電噴霧離子源。
電噴霧測定在VG Quattro-BQ(Fisons Instruments，VG Biotech，Altrincham，U.K.)上進行，這是一種質(zhì)量范圍在4000單電荷離子的三重四極裝置。進行m/z980至1400的掃描，每次掃描10秒鐘。將20次掃描得到的數(shù)據(jù)相加得出最終質(zhì)譜。質(zhì)量刻度的標(biāo)定使用Hb A α鏈(Mr＝15,126.4)的多重帶電離子峰作為外部參照。通過氨基酸測序計算得到的正常α鏈和β鏈的分子量分別為15,126.4和15,967.2。這些值是以以下元素原子量為基礎(chǔ)的C＝12.011；H＝1.00794；N＝14.00674；O＝15.9994；和S＝32.066，根據(jù)原子量和同位素豐度委員會(Commision on Atomic Weight and Isotopic Abundances)在(Pure Appl.Chem.)63975(1991)中的報道，本文引用其內(nèi)容作為參考。圖2A至2D顯示得出的質(zhì)譜。
血紅素鐵原子氧化態(tài)的轉(zhuǎn)變?yōu)榱藢b，在本例中是Hb A和r Hb(α96Val→Trp)的CO形式氧化成Fe+3態(tài)，測定pH6.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中的Hb溶液的濃度。在溶液中加入3摩爾過量K3Fe(CN)6(Fisher Scientific)或其它合適的氧化劑，并在室溫下攪拌1小時。在此期間，Hb溶液由紅色變成棕色。使生成的氧化型Hb(Fe+3)通過SephadexG-25(中等)凝膠柱，用0.1MpH6.5的磷酸鹽緩沖液去除過量的K3Fe(CN)6，留下的Hb(Fe+3)在室溫下靜置過夜。
然后，如下還原氧化型Hb(Fe+3)，首先在試管中制備pH約7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液，并通過在緩沖液中吹氮氣去除溶解氧來使緩沖液脫氧。在另一試管中，稱取足量的連二亞硫酸鈉(Fluka Chemie，Switzerland)制備0.1M的連二亞硫酸鹽溶液。然后用氮氣吹洗去試管中的氧。然后將脫氧的磷酸鹽緩沖液在無氧條件下轉(zhuǎn)移到脫氧連二亞硫酸鹽中形成0.1M的最終濃度。使CO氣流吹過氧化型Hb的表層(不產(chǎn)生氣泡)。將脫氧連二亞硫酸鹽緩沖液加入氧化型Hb溶液，直至顏色重新恢復(fù)到亮紅色。此時，可檢查光譜來確認所有的Hb(Fe+3)都被還原成了Hb(Fe+2)。用還原Hb所用的相同的通過CO氣的緩沖液平衡Sephadex G-25凝膠柱。然后用相同的通過CO氣的緩沖液使還原型Hb溶液通過Sephadex G-25凝膠柱。然后最好用前述FPLC Mono S色譜柱純化由此得到的氧化/還原型Hb。然后如前文所述將得到的氧化型、還原型、MonoS純化的r Hb(α96Val→Trp)或Hb A轉(zhuǎn)變成一氧化碳或含氧形式。
可以使用其它合適的氧化劑來將亞鐵-血紅蛋白(Fe+2)氧化成鐵-Hb(Fe+3)，例如氰鐵酸鹽、銅、過氧化氫、羥基胺、亞硝酸鹽、肼、硫醇、芳基胺，或化學(xué)電勢(“Em”)在0.14伏以上的其它化合物。其它可用于將鐵-Hb(Fe+3)還原成亞鐵-血紅蛋白(Fe+2)的合適的還原劑是(i)用于非酶還原反應(yīng)的-連二亞硫酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽，和維生素C(在亞甲基藍存在下)；(ii)用于酶還原反應(yīng)的-細胞色素b5還原酶，NADPH-黃素還原酶，以及Em在0.14伏以下的其它化合物。參見Bunn，H.F.等，血紅蛋白分子、異常及臨床方面的內(nèi)容(HemoglobinMolecular，Genetic and Clinical Aspects)(W.P.Saunders，Inc..Philadephia，PA)pp.634-662(1986)，本文引用其內(nèi)容作為參考。
NMR測定1H-NMR光譜學(xué)已被證明是研究Hb A結(jié)構(gòu)特征的極好的工具，例如包括血紅素袋結(jié)構(gòu)在內(nèi)的三級結(jié)構(gòu)以及即亞基界面的四級結(jié)構(gòu)。參見Ho，C.，蛋白質(zhì)化學(xué)進展(Adv.Protein.Chem.)43153(1992)，本文引用其內(nèi)容作為參考。已知，血紅蛋白的環(huán)-流位移1H共振對CO形式的r Hb A的血紅素取向和環(huán)境敏感(Ho，C.，蛋白質(zhì)化學(xué)進展(Adv.Protein.Chem.)43153(1992)和Shen，T.J.等，美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108(1993)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。
在300MHz和10℃至36℃用Bruker AM-300分光計進行1H-NMR光譜測定。將全部Hb樣品加在pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液(100％H2O水溶液)中。Hb的濃度范圍約為4％。如Plateau，P.等在美化化學(xué)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1047310(1982)中所述，利用“跳-返”脈沖順序抑制水信號，本文引用其內(nèi)容作為參考。用5-mm多核探針(Bruker)的質(zhì)子去偶線圈，用9.7微秒的90°脈沖，8kHz的光譜寬度(脫氧Hb的是16kHz)，8000數(shù)據(jù)點，獲得特定的一氧化碳-Hb(“HbCO”)和脫氧-Hb樣品的1H-NMR光譜。通常，將256或1024次掃描進行平均以提高信號-干擾比。利用水信號，質(zhì)子的化學(xué)位移直接以2，2-二甲基-2-硅雜戊烷-5磺酸鈉(DSS)的甲基質(zhì)子共振為參照，在29℃，信號出現(xiàn)在離作為內(nèi)標(biāo)的DSS 4.76ppm低磁場處。圖3至6和圖11展示了得到的1H-NMR光譜。
Hb A樣品的氧結(jié)合在16℃-37℃，在pH6.0-8.3的0.1M磷酸鈉緩沖液中，利用Hemox-Analyzer(TCS Medical Products，Huntington Valley，PA)測定氧解離曲線。加入Hayashi，A等在(Biochim.Biophys.Acta)310309(1973))(本文引用其內(nèi)容作為參考)中所述的高鐵血紅蛋白還原酶系統(tǒng)30～60μl以防形式高鐵-Hb。根據(jù)各條曲線測定50％氧合的作用分壓(P50)和希爾系數(shù)(nmax)。這些結(jié)果顯示于圖7-10。
MD模擬用Brooks，C.L.等在分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)208159(1989)中所述，使用CHAMM22(Brooks，C.L.等，(J.Comp.Chem.)4187(1983)，本文引用其內(nèi)容作為參考)的隨機邊界法，利用極性氫蛋白模型(paraml9)的標(biāo)準參數(shù)進行MD模擬。
為了比較不同血紅蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性，分子被分配在半徑分別為10埃和15埃的MD區(qū)和郎之萬(Langevin)區(qū)，兩區(qū)被定中心在脫氧Hb A晶體結(jié)構(gòu)參照坐標(biāo)系上，F(xiàn)ermi，G.等在分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)175159(1984)中對后者進行了說明，本文引用其內(nèi)容作為參考。這些坐標(biāo)系大致位于兩α96Val側(cè)鏈的CB中間。為了計算模擬自由能，將分子分配在半徑分別為10埃和15埃的MD區(qū)和郎之萬區(qū)，兩區(qū)定中心在Hb A的脫氧和含氧晶體結(jié)構(gòu)中β99Asp側(cè)鏈Cβ的質(zhì)心坐標(biāo)系上(Fermi，G.等分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)17131(1983)，Shannan，B.分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)17331(1983)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。如Jorgensen，W.L.等在化學(xué)物理雜志(J.Chem.Phys.)79926(1983)中所述，內(nèi)球區(qū)被粲數(shù)擬合(charmm-adapted)的預(yù)平衡TIP3P水分子充滿，本文引用其內(nèi)容作為參考。脫氧模擬包括103個水分子，含氧模擬包括83個水分子。
因為不知道r Hb(α96Val→Trp)晶體結(jié)構(gòu)，α96Trp的幾種不同的局部構(gòu)象被考慮作為起始構(gòu)象。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫(Ponder，J.W.等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)193775(1987)，本文引用其內(nèi)容作為參考)中機率大于10％的四種可能的側(cè)鏈角度(x1＝-70.4，x2＝-100.5(37.9％)；x1＝64.8，x2＝-88.9(20.7％)；x1＝-177.3，x2＝-95.1(13.8％)；x1＝-179.5，x2＝87.5(10.3％))被作為進行MD模擬的最初取向。每種構(gòu)象使用相同數(shù)量的蛋白質(zhì)原子和水分子。
野生型蛋白質(zhì)和突變蛋白質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化可以利用雜合勢能函數(shù)Vλ＝(1-λ)VA+λVB(Gao，J.等，科學(xué)(Science)2441069(1989)和Tidor，B.等，生物化學(xué)(Biochemistry)303217(1991)，本文引用其內(nèi)容作為參考)獲得，其中λ是0和1之間的偶聯(lián)因子。VA和VB分別是Hb A和突變型Hb的勢能函數(shù)。進行9種λi值(λ＝0.1、0.2、…0.9)的模擬，每次使用5-ps平衡后5-ps生成的動態(tài)，但是在λ＝0.1和λ＝0.9時使用10-ps平衡。將非鍵合相互作用在8.5埃縮短為0，并使用介電常數(shù)(ε＝1)。所有涉及氫原子的鍵都用SHAKEJ計算法約束(Ryckaert，J.R.等，(J.Comput.Phys.)23327(1977)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。一次10ps的模擬在SunSparc工作站10上約需2小時，積分時間為1fs。
利用Kirkwood，J.G.，化學(xué)物理學(xué)雜志(J.Chem.Phys.)3300(1935)所述的熱動力學(xué)積分法，即以下積分方程，由Hb脫氧形式和含氧形式的MD模擬軌跡文件獲得模擬的自由能ΔG＝GB-GA=∫01(ΔV)λdλ=Σi(ΔV)λΔλ]]>其中ΔV＝VB-VA，熱動力平均值(ΔV)λ表示雜合系統(tǒng)Vλ的平均值。熱動力方程的線性形式表明總的模擬自由能可以分解為單獨的加合分量。由Gao，J.等，科學(xué)(Science)2441069(1989)所述的熱動力循環(huán)可以間接得出突變引起的協(xié)同性自由能改變。

為了結(jié)構(gòu)分析的目的，利用Brooks，C.L.等在物理學(xué)化學(xué)進展(P.Phys.Chem.)906680(1986)中所述的勢能公式，由最接近的模擬狀態(tài)(λ＝0.1和λ＝0.9)計算野生型系統(tǒng)(λ＝0)和突變型系統(tǒng)(λ＝1)的一般結(jié)構(gòu)，本文引用其內(nèi)容作為參考X0＝(Xe+018ΔV)λ＝0.1/(e+0.18ΔV)λ＝0.1和X1＝(Xe+0.18ΔV)λ＝0.9/(e+0.18ΔV)λ＝0.9其中的X代表系統(tǒng)的Cartesian坐標(biāo)，X0和X1模擬平均野生型和突變型坐標(biāo)，β＝1/KBT，()λ是勢能Vλ下的總平均數(shù)。
B.結(jié)果r Hb(α96Val→Trp)的生物化學(xué)特性如前文所述，如圖1所示，由包含質(zhì)粒pHE202的大腸桿菌JM109經(jīng)超聲處理后獲得的表達的r Hb(α96Val→Trp)經(jīng)Mono S色譜得到兩個主峰(a峰和b峰)。首先是對稱峰(a峰)然后是兩個交疊峰(b1和b2)。這些由Mono S色譜得到的峰在后文中稱為“a峰”“峰b1”和“峰b2”。所有這些CO形式的峰都顯示與Hb A一致的可見光譜范圍，即350-700nm(沒有顯示結(jié)果)。
如圖2所示，如前文所述進行的電噴霧質(zhì)譜法顯示，三個峰的氨基末端甲硫氨酸都被共表達的Met-AP有效切除。對于a峰，至少98％a鏈的質(zhì)量為15,213，這是纈氨酸被色氨酸取代后的計算值，多至90％β鏈的質(zhì)量為15,867，這是Hb A的β鏈的計算質(zhì)量。有一小部分組分(＜10％)其質(zhì)量(15,998)對應(yīng)于正常β鏈加甲硫氨酸殘基。但是，對于峰b1和峰b2，α鏈和β鏈都具有正確的質(zhì)量，具有非可測(＜2％)的N末端甲硫氨酸。
r Hb(α96Val→Trp)的1H-NMR研究i.Hb由CO形式轉(zhuǎn)化到高鐵形式，再回復(fù)到CO形式圖3展示了經(jīng)Mono S純化、來自pHE202/JM109的r Hb(α96Val→Trp)CO形式的三個峰與HbCOA的環(huán)-流位移1H共振比較。光譜是利用轉(zhuǎn)化成各自CO形式的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A在pH7.0的0.1M磷酸鹽水溶液中的4％溶液在29℃獲得的。為了獲得圖3B的光譜，所有的血紅蛋白都被從CO形式轉(zhuǎn)化成Fe+3形式，再回復(fù)到CO形式。距DSS 0至～0.2ppm處的1H共振來自Hb分子血紅素袋結(jié)構(gòu)附近的氨基酸殘基的質(zhì)子和卟啉的質(zhì)子(Ho，C.，蛋白質(zhì)化學(xué)進展(Advanc.Protein Chem.)43153(1992)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。由圖3A可見，來自a峰、b1峰和b2峰的r HbCO(α96Val→Trp)其環(huán)-流位移1H共振與HbCO A的都有某些不同。而且，在距DSS 0至～1.1ppm范圍內(nèi)還有HbCO A中沒有的其它共振和強度變化。但是，a峰在～1.7至～1.8ppm處的共振與Hb A的基本相同，而峰b1和峰b2的要寬的多，該處的共振被認為是HbCO A的α和β鏈上E11Val的γ2-甲基(Lindstrom，T.R.等，生物化學(xué)(Biochemistry)111677(1972)和Dalvit，C等，生物化學(xué)(Biochemistry)243398(1985)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。
Shen，T.J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108(1993)中論述了在大腸桿菌中利用Hb表達質(zhì)粒pHE2使得血紅素正確插入表達的球蛋白中的現(xiàn)象。他們描述了rHb A一種純化成份的血紅素袋結(jié)構(gòu)通過氧化和還原處理向天然Hb A的血紅素結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。同樣，本發(fā)明也研究了將r Hb(α96Val→Trp)的異常1H共振轉(zhuǎn)變成血紅蛋白天然形式共振的可能性。如前所述，來自三個峰的rHb(α96Val→Trp)首先被氧化成各自的高鐵狀態(tài)，然后還原成各自的CO或含氧形式。如圖3B所示，氧化和還原處理后，三個峰的“轉(zhuǎn)變后的Hb”都顯示一致的NMR光譜(遠端纈氨酸的環(huán)境都相同)，這與轉(zhuǎn)變前的a峰r Hb(α96Val→Trp)的(圖3A)相似。這表明a峰的r Hb(α96Val→Trp)具有正確的血紅素構(gòu)象和亞基界面。所以，將a峰的r Hb(α96Val→Trp)用于后文中作以研究，除非另作說明。
ii.血紅素環(huán)境和亞基界面圖4A和圖4B的1H-NMR光譜是a峰的、即來自pHE202/JM109并經(jīng)Mono S純化的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A如前所述其脫氧形式在pH7.0的0.1M磷酸鹽水溶液中形成的4％溶液的光譜。圖4A的光譜是在29℃獲得的；圖4B的光譜是如圖中所示在29℃和36℃獲得的。圖4A顯示鄰近的組氨酸殘基的超精位移NδH可交換質(zhì)子共振。在圖4A中，～63ppm處的共振是脫氧Hb A的β鏈上鄰近的組氨酸殘基(α87His)的超精位移NδH可交換質(zhì)子，～77ppm處的共振是脫氧Hb A的β鏈上對應(yīng)殘基(β92His)(Takahashi，S.等，生物化學(xué)(Biochemistry)195196(1980)和La Mar，G.N.等，生物化學(xué)生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)961172(1980)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。如圖4A所示，a峰rHb(α96Val→Trp)的這兩個鄰近組氨?；舱竦幕瘜W(xué)位移與Hb A的相同。這表明在r Hb(α96Val→Trp)鄰近的組氨酸周圍沒有微擾。
圖4B顯示的是a峰r Hb(α96Val→Trp)和Hb A脫氧形式的亞鐵超精位移和可交換質(zhì)子共振。超精位移共振來自血紅素基團和鄰近氨基酸殘基上的質(zhì)子，是因為質(zhì)子與血紅素鐵原子Fe(II)的非配對電子之間的超精相互作用。在29℃，與Hb A的相比，a峰r Hb(α96Val→Trp)在距DSS～22.5和～18.7ppm(與脫氧Hb A的β鏈締合的質(zhì)子)(Takahashi等，1980)周圍和距DSS～17ppm周圍(與脫氧Hb A的α鏈締合的質(zhì)子)(Takahashi等，1980)的超精位移共振顯示某些化學(xué)位移的改變。距DSS 11至14ppm范圍內(nèi)的可交換1H共振被認為是Hb A脫氧四級結(jié)構(gòu)的極好的標(biāo)志(Ho，C.蛋白質(zhì)化學(xué)進展(Advanc.Protein Chem.)43153(1992)，本文引用其內(nèi)容作為參考)?！?4ppm的共振已被認為是α42Tyr和β99Asp之間的亞基間氫鍵，這是脫氧四級結(jié)構(gòu)(T)的特征性特性(Fung，L.W.M.等，生物化學(xué)(Biochemistry)142526(1975)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。如圖4B所示，脫氧形式的Hb A和a峰r Hb(α96Val→Trp)在距DSS～14ppm的共振沒有明顯差異，這表明突變沒有干擾脫氧形式的α1β2亞基間氫鍵。
如圖4B所示，在29℃，在r Hb(α96Val→Trp)中出現(xiàn)了一個新的距DSS～12.6ppm的共振，這在脫氧Hb A中是沒有的。但是，在較高溫度(36℃)獲取1H-NMR光譜時，距DSS～12.6ppm的共振發(fā)生位移。對溫度敏感的化學(xué)位移表明，這一新的共振很可能是超精位移共振而不是可交換共振(Jesson，J.P.，化學(xué)物理學(xué)雜志(J.Chem.Phys.)47579)1967)；Kurland，R.J.等，核磁共振雜志(J.Megn.Reson.)2286(1970)；Johnson，M.E.等，美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)991245(1977)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。
以上結(jié)果表明MD模擬可以被成功用于由野生型(Hb A)向突變型Hb(α96Val→Trp)的轉(zhuǎn)化。
iii.不改變連接狀態(tài)的四級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換r Hb(α96Val→Trp)的CO形式在10mM肌醇六磷酸(IHP)(Sigma)存在下的可交換質(zhì)子共振與Hb A的相比表現(xiàn)出某些非常有趣而獨特的性質(zhì)。獲得的是在300MHz，和10mM IHP存在下，來自pHE202/JM109 a峰的r HbCO(α96Val→Trp)和HbCO A在pH7.0的0.1M磷酸鹽水溶液中形成的4％的1H-NMR光譜。光譜是在10、21、29和36℃獲得的。圖5A和5B分別展示r HbCO(α96Val→Trp)和HbCO A的可交換質(zhì)子共振。圖5C和5D分別展示r HbCO(α96Val→Trp)和HbCOA的環(huán)-流位移共振。
在29℃和IHP存在下，在r HbCO(α96Val→Trp)的1H-NMR光譜(圖5A)中，含氧四級(R)結(jié)構(gòu)特征性的距DSS～10.7ppm的共振(α94Asp和β102Asn之間的亞基間氫鍵)(Fung，L.W.-M.等，生物化學(xué)(Biochemistry)142526(1975)；Shaana，B.，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)17131(1983)，本文引用其內(nèi)容作為參考)消失。取而代之的是，與HbCO A(圖5B)相比，圖5A顯示有一個脫氧四級(T)結(jié)構(gòu)特征性距DSS～14ppm的共振(α42Tyr和β99Asp之間的亞基間氫鍵)(Fung，.等，1975；分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)175159(1984)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。
如后文所述，根據(jù)圖5，強效別構(gòu)劑IHP的存在似乎能穩(wěn)定r Hb(α96Val→Trp)的脫氧形式，由此能夠使得平衡向脫氧形式移動。在IHP存在下，尤其在低溫下，α1β2和α2β1亞基界面內(nèi)新的氫鍵的存在能夠增加額外的穩(wěn)定性，使得四級結(jié)構(gòu)更容易向脫氧四級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。
圖5A中，隨著溫度從29℃降至10℃，r Hb(α96Val→Trp)光譜中距DSS～14ppm共振的強度逐漸加強。在36℃，距DSS～14ppm的共振消失，而出現(xiàn)成為肩峰的含氧四級(R)結(jié)構(gòu)的特征性距DSS～10.7ppm共振。10℃時～14ppm共振的相對強度與r Hb(α96Val→Trp)可交換共振的相近。這一距DSS～14ppm共振的化學(xué)位移不隨溫度而改變，這表明該共振的起源是可交換的而不是超精位移的。距DSS～14ppm共振的出現(xiàn)并不伴隨從～11ppm至～24ppm超精位移共振的出現(xiàn)，這表明血紅素鐵離子仍然處于低旋、反磁狀態(tài)(即配體結(jié)合形式)。脫氧(T-)和含氧(R-)四級結(jié)構(gòu)特征性共振其強度隨溫度的改變是可逆的。
圖5B顯示與圖5A中r HbCO(α96Val→Trp)的觀察相反，在10mM IHP存在下，HbCO A的可交換質(zhì)子共振隨溫度改變只有很小的變化。即使在10℃，HbCOA在～14ppm只有一個很弱的信號，與r HbCO(α96Val→Trp)的相比，在強度上大不相同。在中溫區(qū)，例如21和29℃，在10mM IHP存在下，r HbCO(α96Val→Trp)的可交換質(zhì)子共振顯示含氧四級結(jié)構(gòu)特征性的～10.7ppm共振基本消失，而脫氧四級結(jié)構(gòu)特征性的～14ppm共振強度很弱。這些結(jié)果顯示，可能存在一種中間四級結(jié)構(gòu)，它失去一個α94Asp和β102Asn之間的氫鍵，這可以由～10.7ppm的共振證明，但尚未形成α42Asp和β99Asp之間的氫鍵，這可以由～14ppm的共振證明。添加強效別構(gòu)劑，和/或降低溫度，可以將本發(fā)明的rHbCO(α96Val→Trp)逐漸轉(zhuǎn)變成脫氧樣四級結(jié)構(gòu)，但不改變其連接狀態(tài)。
如圖5C和5D所示，還在不同的溫度比較了CO形式的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A在10mM IHP存在下的環(huán)-流位移質(zhì)子共振。隨著溫度的改變，r Hb(α96Val→Trp)在距DSS 0至-1.1ppm共振的相對強度和化學(xué)位移發(fā)生很大改變，而Hb A的變化很小。在低溫下，r Hb(α96Val→Trp)和Hb A兩者CO形式的被認為是HbCO A的α和β鏈上E11Val(遠端的纈氨酸)的γ2-甲基的距DSS-1.7至-1.8ppm的共振(Lirdstrom，T.R.等，生物化學(xué)(Biochemistry)111677(1972)；Dalvit，C.等，生物化學(xué)(Biochemistry)243398(1985)，本文引用其內(nèi)容作為參考)合并成一個峰。r Hb(α96Val→Trp)距DSS-11.7ppm至-1.8ppm的共振比Hb A的寬得多。據(jù)信，r Hb(α96Val→Trp)距DSS 0至-1.1ppm區(qū)域內(nèi)共振相對強度和化學(xué)位移的變化和-11.7ppm至-1.8ppm共振的變寬可能反應(yīng)了Hb A中沒有的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。
還獲取了在300MHz和沒有任何IHP存在下，a峰的r HbCO(α96Val→Trp)和HbCO A在pH7.0的1.0M磷酸鹽水溶液中形成的4％溶液的1H-NMR光譜。在圖6A和6B中比較了在不同溫度下、無IHP存在下獲得的CO形式的rHb(α96Val→Trp)和Hb A的可交換質(zhì)子共振光譜。隨著溫度的降低，沒有IHP時，r Hb(α96Val→Trp)中出現(xiàn)距DSS～14ppm的共振，但是Hb A即使在10℃也沒有距DSS～14ppm的共振。圖6C和圖6D顯示無IHP存在下r Hb(α96Val→Trp)和HbCO A都有環(huán)-流位移共振。這些圖同樣顯示出依賴于溫度的光譜改變。
r HbCO(α96Val→Trp)在距DSS 0至-1.1ppm范圍內(nèi)共振的相對強度和化學(xué)位移被發(fā)現(xiàn)隨溫度變化很大，而HbCO A的只有很小的變化。r HbCO(α96Val→Trp)在低溫下有脫氧四級結(jié)構(gòu)特征性距DSS～14ppm可交換共振，以及在距DSS 0至-1.1ppm環(huán)-流位移區(qū)共振的相對強度和化學(xué)位移改變(圖6C和6D)表明，即使沒有IHP，也發(fā)生了脫氧四級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。
r Hb(α96Val→Trp)的氧結(jié)合特性將來自pHE202/JM109的三個r HbCO2(α96Val→Trp)峰(a峰，峰b1和b2)的Hb在pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液中形成的0.1mM溶液上樣在Sephadex-75色譜柱上。都在對應(yīng)于HbO2A的位置洗出一對稱峰，表明三種形式的含氧rHb(α96Val→Trp)在本實驗條件下都是四聚體(沒有顯示結(jié)果)。
如前文所述，研究了作為pH函數(shù)的峰a、b1和b2的r Hb(α96Val→Trp)的氧結(jié)合特性。簡而言之，在29℃，在pH6.3至8.9，獲取各種Hb在0.1M磷酸鈉緩沖液中形成的0.1mM溶液的氧解離數(shù)據(jù)。由各曲線確定50％飽和度時的氧分壓(P50圖)7A的數(shù)據(jù)來自pHE202/JMl09產(chǎn)生的、經(jīng)Mono S純化的組分，pHE202/JM109產(chǎn)生的峰a、b1和b2和Hb A。圖7B的數(shù)據(jù)來自如前所述由各自的CO形式轉(zhuǎn)換成Fe+3形式再回復(fù)到CO形式的pHE202/JM109產(chǎn)生的、經(jīng)MonoS純化的組分，pHE202/JM109產(chǎn)生的峰a、b1和b2和Hb A。在兩圖中，Hb A是(○)；峰a的r Hb(α96Val→Trp)是(■)；峰b1的r Hb(α96Val→Trp)是(△)，和峰b2的r Hb(α96Val→Trp)是(+)。如圖7A和7B所示，在氧化和還原處理前，峰b1和b2的r Hb(α96Val→Trp)顯示與Hb A相近的P50值(50％飽和度時的氧分壓)，但是，峰a的r Hb(α96Val→Trp)和“轉(zhuǎn)換過的”峰b1和b2的r Hb(α96Val→Trp)表現(xiàn)出低得多的氧親和力。
測定pHE202/JM109產(chǎn)生的、Mono S純化的峰a、b1和b2的rHb(α96Val→Trp)和Hb A各自非修飾形式和由各自的CO形式轉(zhuǎn)換成Fe+3形式再回復(fù)到CO形式的希爾系數(shù)(nmaw)。如前所述獲取氧解離數(shù)據(jù)。簡而言之，在29℃，用Hb在pH6.5至8.4的0.1M磷酸鈉液中形成的0.1mM溶液獲取各Hb樣品的數(shù)據(jù)。由各曲線確定希爾系數(shù)。圖8A顯示各種非修飾血紅蛋白的數(shù)據(jù)；圖8B顯示由各自的CO形式轉(zhuǎn)換成Fe+3形式再回復(fù)到CO形式的血紅蛋白的數(shù)據(jù)。在兩圖中，Hb A是(○)；峰a的r Hb(α96Val→Trp)是(■)；峰b1的r Hb(α96Val→Trp)是(△)，和峰b2的r Hb(α96Val→Trp)是(+)。
圖8A和圖8B顯示，峰a的r Hb(α96Val→Trp)和“轉(zhuǎn)換過的”Hb表現(xiàn)出Hb A波爾效應(yīng)(ΔlogP50/ΔpH)的約90％，而且，比之Hb A的約3，表現(xiàn)出pH依賴性nmax約2.2至2.6的協(xié)同性。
以下表1比較了pHE202/JM109產(chǎn)生的a峰的r Hb(α96Val→Trp)、r Hb A(根據(jù)Shen，T.-J.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9081080(1993)所述在自己的實驗室中制備的)，Hb A和有5mM 2，3-DPG存在下的Hb A的P50和nmax。峰a的r Hb(α96Val→Trp))顯示與有2，3-DPG存在時的Hb A相似的氧結(jié)合特性。所以，據(jù)信，由于rHb(α96Val→Trp)獨特的結(jié)構(gòu)，即使在沒有別構(gòu)劑存在下，它仍然具有與有別構(gòu)劑存在下的Hb A近似的特性。
表1

在29℃，還獲取了以下血紅蛋白樣品在pH7.4，0.1M磷酸鈉緩沖液中形成的0.1mM溶液的氧解離數(shù)據(jù)。測定了Hb A、r Hb(α96Val→Trp)(pHE202/JM109)、有2mM 2，3-DPG存在下的r Hb(α96Val→Trp)和有2mM IHP存在下的rHb(α96Val→Trp)的曲線。實驗結(jié)果如圖9所示。除了低氧親和力和高協(xié)同性，a峰的r Hb(α96Val→Trp)還顯示出特有的氧結(jié)合特性。在很低的氧壓力下，a峰的r Hb(α96Val→Trp)在別構(gòu)劑例如2，3-DPG存在下的氧結(jié)合表現(xiàn)為雙相曲線。
圖10A和10B分別比較了溫度對a峰的r Hb(α96Val→Trp)和Hb A的氧親和力(P50)和希爾系數(shù)(nmax)的影響。
用各種Hb樣品在pH7.4的0.1M磷酸鈉緩沖液中形成的0.1mM溶液獲取各自的氧解離數(shù)據(jù)。溫度為16、20、25、29和37℃。由各曲線測定P50和希爾系數(shù)(nmax)。獲得的是以下樣品的數(shù)據(jù)Hb A(○)；a峰的r Hb(α96Val→Trp)(pHE202/JM109)(△)；2mM IHP存在下的r Hb(α96Val→Trp)(+)；2mM IHP(+)存在下的Hb A(□)。圖10A顯示的是氧親和力(P50)；圖10B顯示的是希爾系數(shù)(nmax)。
如圖10A所示，不論有沒有IHP存在，r Hb(α96Val→Trp)和Hb A的氧親和力都隨溫度的降低而顯著升高。但是，圖10B顯示r Hb(α96Val→Trp)和Hb A的希爾系數(shù)(nmax)并不隨溫度發(fā)生很大的改變。在15至37℃的溫度范圍內(nèi)，rHb(α96Val→Trp)和Hb A都表現(xiàn)出約nmax2.0至2.9的協(xié)同性。
B.質(zhì)粒pHE702表達質(zhì)粒pHE702的構(gòu)建按照已公開的方法(Kunkel，T.M.1985)美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82488-492；Shen，T.-J.等，1993美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)908108)用寡核苷酸5’-AGCTTGAAGTTCCATGGGTCCACCC-3’(DNAInternational，Inc.，Lake Oswego，OR)在質(zhì)粒pHE7中引入相似的α96Val→Trp突變，形成質(zhì)粒pHE702。
質(zhì)粒pH7是表達人α-和β-cDNA和大腸桿菌的Met-AP基因的質(zhì)粒。與前文的pHE2一樣，它包含兩個以相同取向串聯(lián)排列的表達盒(i)tac啟動子-大腸桿菌Met-AP編碼序列-5ST1T2終止子和(ii)tac啟動子-α-球蛋白cDNA編碼序列-β-球蛋白cDNA編碼序列-5ST1T2終止子。
用先前構(gòu)建質(zhì)粒pHE2的方法構(gòu)建質(zhì)粒pHE702，所不同的是(1)用人α-球蛋白cDNA取代合成的人α-球蛋白基因；(2)用人β-球蛋白cDNA取代合成的人β-球蛋白基因；(3)直接從大腸桿菌基因組DNA獲取大腸桿菌Met-AP編碼序列，而不是從質(zhì)粒pSYC1174獲得。
以pKT218-αc(Yale University的B.G.Forget提供)為模板，使用兩個合成引物5’-GAGAACCCCATATGGTGCTGTCTCCTGCC-3’和5’-CCGAGGCACTAGTTTAACGGTATTTGGAGGTC-3’(都由DNAInternational，Inc.提供)通過PCR獲取人α-球蛋白cDNA編碼序列，兩引物與人α-球蛋白cDNA的5’端和3’端互補并分別含有NdeI位點和SpeI位點。
以按照Groebe，等在蛋白質(zhì)的表達和純化(Protein Expression andPurification)3134(1992)中所述方法構(gòu)建的pβ為模板，使用兩個合成引物5’-CAAACAGACCATATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAG-3’和5’-AGCAAGAATGCATGCTTAGTGATACTTGTGGGCCAGG-3’(都由DNAInternationa1，Inc.提供)通過PCR獲取人β-球蛋白cDNA編碼序列，兩引物與人β-球蛋白cDNA的5’端和3’端互補并分別含有NdeI位點和NsiI位點。
以大腸桿菌基因組DNA為模板，使用兩個合成引物5’-TGGACAGAATTCCATGGCATTCTCAATCA-3’和5’-TGGCTTAAGCTTATTCGTCGTGCGAG-3’(都由DNA SynthesizingFacility，University of Pittsburgh 提供)通過PCR獲取大腸桿菌Met-AP基因的編碼序列，兩引物與大腸桿菌Met-AP基因的5’端和3’端互補并分別含有EcoRI位點和HindIII位點。存在于宿主大腸桿菌JM109中的質(zhì)粒pHE702，標(biāo)識為pHE702/JM109，于1995年4月26日保藏在Rockville MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為ATCC69793。
由質(zhì)粒pHE202和pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)的比較含有pHE702的大腸桿菌JM109的生長條件與前述用于含有pHE202的相同。pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)的得率是用前述pHE202產(chǎn)生的rHb(α96Val→Trp)的50％。如前所述，pHE702是用人基因構(gòu)建的，所以宜使用其它的表達系統(tǒng)。經(jīng)Mono S色譜后，pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)洗脫圖形出現(xiàn)兩個峰，標(biāo)記為峰1和峰2(未顯示結(jié)果)。同樣，以相同方式對pHE702產(chǎn)生的血紅蛋白的進行了對pHE202產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)的全部分析。
對pHE202和pHE702這兩種不同質(zhì)粒產(chǎn)生的低氧親和力r Hb(α96Val→Trp)的功能和結(jié)構(gòu)特性進行了比較。前文已詳細描述了pHE202產(chǎn)生的rHb(α96Val→Trp)。如前所述將pHE202和pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)氧化還原，然后在29℃在pH6.8和7.4的0.1M磷酸鈉緩沖液中測定他們的P50和nmax，并與Hb A的比較。以下表2概括了pH6.8和pH7.4時，Hb A、pHE202產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)和pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)的氧結(jié)合特性。顯然，兩種質(zhì)粒產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)表現(xiàn)出基本相同的功能特性。
表2P50(mmHg)*nmax*pH pH6.8 7.4 6.87.4Hb/A17.28.0 3.13.0pHE202產(chǎn)生的20.611.22.42.6r Hb(α96Val→Trp)(峰b2)pHE702產(chǎn)生的22.8l1.72.42.8r Hb(α96Val→Trp)(峰b2)*實驗誤差±10％圖11顯示如前所述，在29℃、pH7.0的0.1M磷酸鹽緩沖液中進行的HbA和pHE202以及pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)CO形式的的1H-NMR光譜。圖11A顯示的是Hb A和pHE202以及pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)CO形式的可交換質(zhì)子共振，圖11B顯示的是環(huán)-流位移質(zhì)子共振。兩組1H-NMR結(jié)果都顯示兩種r Hb(α96Val→Trp)的1H-NMR光譜沒有可檢知的差異。所以，可以推定，pHE202和pHE702產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)之間沒有可檢知的結(jié)構(gòu)或功能差異。
C.MD模擬脫氧Hb A晶體結(jié)構(gòu)中兩個α96Val殘基的Cα之間的距離為10.3埃(Fermi，G.等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)175159(1984)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。rHb(α96Val→Trp)α96位置上的色氨酸殘基大小會使人預(yù)計r Hb(α96Val→Trp)的穩(wěn)定性將高度依賴于色氨酸殘基側(cè)鏈的角取向。最初脫氧型的計算機模擬顯示，在旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫中機率大于10％的四種色氨酸側(cè)鏈角中，只有側(cè)鏈角x1＝64.8和x2＝-88.9(20.7％)的色氨酸具有穩(wěn)定的構(gòu)象。其它三種色氨酸構(gòu)象都直接相互對正，具有不利的非結(jié)合相互作用。
對全部4種可能的色氨酸殘基角度進行了Hb野生型和突變型之間的轉(zhuǎn)變。以下表3概括了脫氧型顯示平均模擬結(jié)構(gòu)中兩條α鏈上Nε1Trp96殘基之間的距離和每個α96Trp殘基的側(cè)鏈角。
表3旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫*α196Trpα296Trp 距離x1x2x1x2x1x2Nε1(α1)-(度) (度)(度)(度) (度) (度) Nε1(α2)(埃)-70.4±7.0100.5±18.2 -63.3 -176.3-88.5128.97.7(37.9％)64.8±13.0-88.9±5.3 92.3 -71.0 96.2-78.717.3(20.7％)-177.3±7.9 -95.1±7.6-86.589.9 -174.2 -116.3 10.2(13.8％)-179.5±3.487.5±3.8-118.0 89.5 -177.171.85.6(10.3％)*Ponder，J.W.等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)193775(1987)只有來自最初的色氨酸側(cè)鏈角x1＝64.8和x2＝-88.9的模擬結(jié)構(gòu)顯示兩個α96Trp具有相對對稱的構(gòu)象。在這種構(gòu)象中，較好的保存了兩個α96Trp的側(cè)鏈角，兩個α96Trp殘基的Nε1之間的距離表明兩個α96Trp殘基充分分開而不至于相互影響。這些結(jié)果表明色氨酸側(cè)鏈角x1＝64.8和x2＝-88.9最接近于天然構(gòu)象。
所以，為了簡化模擬的自由能分析，計算協(xié)同性的自由能時，只用在定中心于r Hb脫氧和含氧形式晶體結(jié)構(gòu)中β99Asp的Cβ的質(zhì)心坐標(biāo)的球區(qū)上x1＝64.8和x2＝-88.9的側(cè)鏈角進行模擬。該球區(qū)只包括一個用于計算的α96Trp。
脫氧形式的Hb A和r Hb(α96Val→Trp)的一般模擬結(jié)構(gòu)由分子圖形程序，GRAPHX生成，該程序是Pittsburgh Supercomputing Certer，Pittsburgh，PA開發(fā)的。以上側(cè)鏈角的一般模擬結(jié)構(gòu)表明除了已有的β99Asp與α42Tyr之間和β99Asp與α97Asn之間的氫鍵之外，還有新的α96Trp和β99Asp之間的界面間氫鍵。脫氧形式的轉(zhuǎn)化的突變型Hb(α96Val→Trp)的100-ps MD表明α1β2亞基界面內(nèi)的這些氫鍵十分穩(wěn)定，即β99Asp與α42Tyr之間的平均模擬距離約為2.25±0.19埃和2.32±0.22埃，β99Asp與α97Asn之間的約為2..22±0.34埃。
雖然沒有有關(guān)r Hb(α96Val→Trp)協(xié)同性自由能的實驗測得值，但是rHb(α96Val→Trp)的希爾系數(shù)相對較高(pH7.4時，nmax＝2.6)，這與Hb A的十分相近，這表明r Hb(α96Val→Trp)的協(xié)同性自由能與Hb A的相近。如以下表4所示，r Hb(α96Val→Trp)和Hb A之間協(xié)同性自由能差異的計算值是每個界面-1.5kcal/mol，大致符合對于協(xié)同性略低于Hb A的Hb的估計值(Turner，G.J.等，蛋白質(zhì)(Protein)14333(1992)，本文引用其內(nèi)容作為參考)。
表4有貢獻成份ΔG(脫氧) ΔG(含氧) ΔΔG(kcal/摩爾)溶劑 0.3 -5.0 -5.3蛋白質(zhì)α94Asp -0.8 -1.3 -0.5α97Asn -1.9 -0.7 1.2β99Asp -12.2 2.6 14.8β101Glu 0.1 -0.8 -0.9β102Asn 0.5 -0.8 -1.3自身(α96Val→Trp)-24.9 -32.0-7.8總值 -24.9 -39.1-1.5以上值都是一個α1β2界面的。只列出了貢獻大于0.5kcal脫氧或含氧形式的殘基。ΔG的正號表示使r Hb(α96Val→Trp)不如Hb A穩(wěn)定。ΔΔG等于ΔG(含氧)-ΔG(脫氧)，即r Hb(α96Val→Trp)和Hb A之間的協(xié)同性自由能差異。
這樣，MD模擬的結(jié)果被很好地用于獲取有關(guān)對總的協(xié)同性自由能有貢獻的特定相互作用的信息。表4還列出了每個氨基酸殘基對總的協(xié)同性自由能的貢獻。大多數(shù)氨基酸的貢獻小于1.0kcal，這表明在α1β2界面引入色氨酸不會引起大的構(gòu)象改變。對總的協(xié)同性自由能最大的貢獻來自于與β99Asp的相互作用(14.8kcal)，這很可能是由于脫氧結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化作用(-12.2kcal)。以上結(jié)果表明，可能是新的α96Trp和β99Asp之間的氫鍵引起了r Hb脫氧結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化作用。
本發(fā)明的rHb(α96Val→Trp)可以在用作代血制品或治療劑之前進行交聯(lián)，以防該分子解離成二聚體。雖然，實際上所有紅細胞中的血紅蛋白都是四聚體狀態(tài)的，但是在例如代血制品中循環(huán)的無細胞血紅蛋白會解離成二聚體，其程度可堵塞腎小球，以及輸入的四聚體血紅蛋白被連續(xù)排出循環(huán)。血紅蛋白必須進行交聯(lián)以防止這種解離清除作用。
血紅蛋白可以在α鏈之間交聯(lián)，例如利用二異氰硫基苯磺酸鹽，在四聚體的內(nèi)部交聯(lián)，例如利用吡多醛及其衍生物和?；牧姿狨ァ⒁奧inslow，R.M.，等編輯，代血制品效用的生理學(xué)基礎(chǔ)(Blood Substitutes Physiological Basis ofEfficacy)(Birkhauser，Boston，MA)pp.82-84(1995)，本文引用其內(nèi)容作為參考。同時參見，Winslow，R.M.，以血紅蛋白為基礎(chǔ)的紅細胞取代物(Hemoglobin-BasedRed Cell Substitutes)(Johns Hopkins University Press，Baltimore，MD)(1992)；Manning.L.R.等，生物化學(xué)(Biochemistry)276640(1988)；Benesch，R.E等，生物化學(xué)生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)1569(1988)；Bucci，E.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2646191(1989)；Chang，T.M.S等編輯，國際代血制品會議第二次會議(Proceeding II of International Symposium on Blood Substitutes)，(Biomater.Artif.Cells Artif.Organs)(1988)；Kluger，R.等，生物化學(xué)(Biochemistry)317551(1992)；和DeVenuto，F(xiàn)等，(Surg.Gynecol.Obster.)155342(1982)，本文引用其內(nèi)容作為參考。
純化的，正確交聯(lián)的rHb(α96Val→Trp)然后可以被加入以血紅蛋白為基礎(chǔ)的代血制品中，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，這種代血制品是在生理學(xué)上被認可的。參見，R.M.Winslow等編輯的代血制品效用的生理學(xué)基礎(chǔ)(Blood SubstitutesPhysiological Basis ofEfficacy)(Birkhauser，Boston，MA)pp.82-84(1995)，本文引用其內(nèi)容作為參考。
雖然為了說明已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但是應(yīng)該理解的是，所有的具體細節(jié)都是為了說明，本發(fā)明技術(shù)人員將可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)進行某些改動，本發(fā)明的范圍和精神僅受權(quán)利要求的限制。
序列表(1)一般信息(i)申請人Ho，ChienKim，Hyun-WonShen，Tong-Jian(ii)發(fā)明名稱低氧親和力突變型血紅蛋白(iii)序列數(shù)目8(iv)通訊地址(A)收信人Carnegie Mellon University(B)街道4400 Forbes大道(C)城市Pittsburgh(D)州PA(E)國家USA(F)郵編15213(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型5-1/4低密度盤(B)計算機IBM PC機或兼容機(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(E)軟件ASCII(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日期30-04-96(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/432,071
(B)申請日期01-05-95(viii)律師/代理人信息(A)姓名Mary-Elizabeth Buckles(B)登記號31，907(C)參考/案卷號95-243PCT(ix)通訊信息(A)電話202/414-9200(B)傳真202/414-9299(C)電傳64711(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度21核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(x)公開信息(A)作者Hyun-Won KimTong-Jian ShenDazhen Philip SunNancy T.HoMarcella MadridChien Ho(B)名稱新的低氧親和力重組血紅蛋白(α96Val→Trp)轉(zhuǎn)換四級結(jié)構(gòu)而不改變其連接狀態(tài)(C)刊物分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)
(D)卷號248(E)期號4(F)頁數(shù)867-882(G)日期00-05-95(K)SEQ ID NO1中的有關(guān)殘基1至21(xi)序列描述SEQ ID NO1TTTGAAGTTC CATGGATCAA C 21(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度25核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AGCTTGAAGT TCCATGGGTC CACCC25(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度29核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述 SEQ ID NO3GAGAACCCCA TATGGTGCTG TCTCCTGCC29(5)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度32核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CCGAGGCACT AGTTTAACGG TATTTGGAGG TC32(6)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度36核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CAAACAGACC ATATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGAG36(7)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度37核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6AGCAAGAATGCATGCTTAGTGATACTTGTGGGCCAGG37(8)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述 SEQ ID NO7TGGACAGAAT TCCATGGCTA TCTCAATCA29(9)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度26核苷酸(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述 SEQ ID NO8TGGCTTAAGCTTATTCGTCGTGCAG 2權(quán)利要求
1.一種非天然存在的突變型人血紅蛋白，其中α鏈96位上的纈氨酸殘基被色氨酸殘基取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白，它具有比正常人成人血紅蛋白低的氧親和力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的血紅蛋白，它具有高的氧結(jié)合協(xié)同性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血紅蛋白，它是利用重組技術(shù)產(chǎn)生的。
5.重組血紅蛋白r Hb(α96Val→Trp)。
6.治療人的方法，包括使用包含人造突變型血紅蛋白的無毒組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的突變型血紅蛋白具有比正常人成人血紅蛋白低的氧親和力。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的突變型血紅蛋白還具有高的氧結(jié)合協(xié)同性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的突變型血紅蛋白是利用重組技術(shù)產(chǎn)生的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的突變型血紅蛋白包含一個位于α鏈96位上的纈氨酸殘基的突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的突變型血紅蛋白是rHb(α96Val→Trp)。
12.一種重組DNA表達質(zhì)粒，它包含在各自tac啟動子調(diào)控下的、串聯(lián)的可表達的人α-和β-球蛋白基因和大腸桿菌的Met-AP基因，其中所述的α-球蛋白基因包含一個突變，所述序列分別表達所述的人α-和β-球蛋白基因以及Met-AP基因，并且結(jié)合血紅素以形成除突變之外的相同氨基酸序列和血紅素構(gòu)象與天然HbA基本相同的重組血紅蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的質(zhì)粒，其中所述的α-球蛋白基因被誘變，使得表達出的蛋白質(zhì)中α鏈上96位的纈氨酸殘基被色氨酸殘基取代
14.一種產(chǎn)生人造血紅蛋白的方法，它包括將權(quán)利要求13所述的表達質(zhì)粒引入除紅細胞之外的合適的宿主細胞中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的細胞；表達所述的DNA，產(chǎn)生所述的人造血紅蛋白；回收和純化所述的血紅蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的宿主細胞是大腸桿菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的質(zhì)粒是pHE202。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的質(zhì)粒是pHE702。
18.一種無毒的藥物組合物，它包含在藥學(xué)上認可的載體內(nèi)的非天然突變型血紅蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述的無細胞環(huán)境中的血紅蛋白具有比人正常成人血紅蛋白低的氧親和力。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中的血紅蛋白是r Hb(α96Val→Trp)。
21.質(zhì)粒pHE202。
22.質(zhì)粒pHE702。
23.人造突變?nèi)搜t蛋白，它在無細胞環(huán)境中具有比紅細胞中的人正常成人血紅蛋白低的氧親和力。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的血紅蛋白，其中所述的血紅蛋白包含一個其α鏈96位上的纈氨酸殘基的突變。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的血紅蛋白，其中所述的纈氨酸殘基被色氨酸殘基取代。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的血紅蛋白，它是利用重組技術(shù)得到的。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的血紅蛋白，其中的血紅蛋白是rHb(α96Val→Trp)。
28.一種非天然存在的低氧親和力突變型血紅蛋白，它包含一個α1β2亞基界面內(nèi)的突變，其中所述的突變型血紅蛋白具有比人正常成人血紅蛋白低的氧親和力。
29.一種非天然存在的低氧親和力突變型血紅蛋白，在別構(gòu)劑23，-DPG存在下，它具有與人正常成人血紅蛋白相當(dāng)?shù)难踅Y(jié)合特性。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的突變型血紅蛋白，其中α鏈96位上的纈氨酸殘基被色氨酸殘基取代。
31.一種非天然存在的突變型血紅蛋白，它具有表1所示的特性。
32.由用質(zhì)粒pHE202轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)。
33.由用質(zhì)粒pHE702轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生的r Hb(α96Val→Trp)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種非天然存在的突變型血紅蛋白(α96Val→Trp),該血紅蛋白的氧親和力比天然血紅蛋白低,但在氧結(jié)合中的協(xié)同性較高。突變型血紅蛋白宜利用重組DNA技術(shù)獲取。這樣的突變型血紅蛋白可以用作代血制品的組分。
文檔編號C12N15/09GK1183120SQ96193545
公開日1998年5月27日 申請日期1996年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月1日
發(fā)明者何潛, 金炫元, 申同健 申請人:卡內(nèi)基·梅隆大學(xué)