專利名稱：包含高氧親和力的修飾血紅蛋白的氧氣輸送方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液制品，更特別涉及包含具有高氧親和力的修飾血紅蛋白的組合物以及制備該組合物的方法。
背景技術(shù)：
循環(huán)系統(tǒng)及血紅蛋白特件血液是為組織輸送營養(yǎng)并從組織中移去排泄廢物的工具。血液由其中懸浮紅細(xì)胞(RBC或紅血球)、白細(xì)胞(WBC)和血小板的血漿組成。紅細(xì)胞約占血液中的細(xì)胞的99%，其主要功能是為組織輸送氧氣并 從中移去二氧化碳。心臟的左心室泵送血液通過循環(huán)系統(tǒng)的動(dòng)脈和較小的微動(dòng)脈。血液然后進(jìn)入毛細(xì)血管，從中進(jìn)行營養(yǎng)和細(xì)胞廢物的大部分交換。(參見例如A.C.Guyton, "Human PhysiologyAnd Mechanisms Of Disease"(第三版；W.B.Saunders C0., Philadelphia, Pa.), 228-229頁(1982))。此后，血液經(jīng)過微靜脈和靜脈而返回心臟的右心房。盡管返回心臟的血液較之從心臟泵出的血液氧氣不足，但安靜時(shí)，返回的血液仍包含約75%的初始氧含量。紅細(xì)胞可逆的氧合功能(即輸送氧氣)是通過蛋白質(zhì)血紅蛋白實(shí)現(xiàn)的。哺乳動(dòng)物血紅蛋白的分子量約64，000道爾頓，由約6%血紅素和94%珠蛋白組成。其天然形式包含兩對(duì)亞基(即其為四聚體)，各自包含血紅素基團(tuán)和珠蛋白多肽鏈。血紅蛋白在水溶液中處于四聚體(MW64，000)和二聚體(MW32，000)形式之間的平衡；紅細(xì)胞外的二聚體由腎臟過早排出(血漿半衰期約2-4小時(shí))。除血紅蛋白外，RBC還包含基質(zhì)(RBC膜)，其中包含蛋白質(zhì)、膽固醇和磷脂。外源性血.液制品由于醫(yī)院及其它環(huán)境下的血液制品需求，已經(jīng)針對(duì)血液代用品(bloodsubstitute)和血漿擴(kuò)容劑進(jìn)行了廣泛研究。血液代用品是能夠攜帶并為組織供應(yīng)氧氣的血液制品。血液代用品具有多種用途，包括替代手術(shù)過程中和急性出血后的失血，以及創(chuàng)傷性損傷后的復(fù)蘇過程。血漿擴(kuò)容劑是輸入血管系統(tǒng)、但一般不能攜氧的血液代用品。血漿擴(kuò)容劑可用于例如替代燒傷中的血漿損失、治療容量不足性休克以及實(shí)現(xiàn)血液稀釋(例如維持血量正常和降低血粘度)?；旧?，血液代用品可用于所述目的或當(dāng)前給予患者庫存血液的任何目的。(參見例如Bonson等人美國專利4，001，401以及Morris等人專利4，061，736)。當(dāng)前的人血液供給伴有若干局限性，可以通過使用外源性血液代用品而緩和。舉例說明，安全有效的血液代用品的廣泛利用將降低對(duì)庫存(異體)血液的需要。此外，這種血液代用品允許在創(chuàng)傷性損傷后立即輸注復(fù)蘇液，而不考慮交叉配型(血液則需要)，從而節(jié)省了為缺血性組織再供給氧氣的重要時(shí)間。而且，可以在手術(shù)前給予患者血液代用品，使得可以取出患者自體血液，如果需要，能夠在該過程中稍后回輸，或在手術(shù)后回輸。因此，使用外源性血液制品不只保護(hù)患者免于接觸非自體(異體)血液，也保存自體或異體(庫存、交叉配型的)血液以供其最適用途。當(dāng)前血液代用品的局限制備血液代用品(有時(shí)稱作”攜氧血漿擴(kuò)容劑”)的努力迄今所制備的產(chǎn)品效果差強(qiáng)人意，或其生產(chǎn)費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢或兼而有之。生產(chǎn)這些產(chǎn)品的費(fèi)用常常很高，以致實(shí)際上妨礙了產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用，尤其是在那些存在巨大需求的市場中(例如新出現(xiàn)的第三世界經(jīng)濟(jì))。血液代用品可以分為以下三類:i)基于全氟化碳的乳劑，ii)脂質(zhì)體包封血紅蛋白，iii)修飾的無細(xì)胞血紅蛋白。如下所述，盡管認(rèn)為包含修飾的無細(xì)胞血紅蛋白的產(chǎn)品最有希望，但均未完全成功?；谌衔锏慕M合物溶解氧氣，而不與其結(jié)合為配基。為了用于生物系統(tǒng)，全氟碳化合物必須與脂類、一般為卵黃磷脂乳化。盡管全氟化碳乳劑制備便宜，但不能在臨床耐受劑量下攜帶足夠有效的氧氣。相反，已經(jīng)表明脂質(zhì)體包封血紅蛋白是有效的，但其廣泛使用極為昂貴。(一般參見Winslow, Robert Μ., ^Hemoglobin-based RedCell Substitutes, ^Johns Hopkins University Press, Baltimore(1992))。當(dāng)今臨床試驗(yàn)的大部分血液代用品產(chǎn)品是基于修飾的血紅蛋白。這些產(chǎn)品通常稱作基于血紅蛋白的氧載體(hemoglobin-based oxygen carriers, HBOC), 一般包含化學(xué)修飾血紅蛋白的均一水溶液，基本不含其它紅細(xì)胞殘存(基質(zhì))。雖然人的無基質(zhì)血紅蛋白(stroma-free haemoglobin, SFH)是制備HBOC最常用的原材料,但也使用其它來源的血紅蛋白。例如，血紅蛋白可以得自或來源于動(dòng)物血液(例如?；蜇i血紅蛋白)、或經(jīng)分子改造為生產(chǎn)目的血紅蛋白產(chǎn)品的細(xì)菌、或酵母、或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物?；瘜W(xué)修飾一般為分子內(nèi)交聯(lián)、寡聚化和/或聚合物綴合之一，來修飾血紅蛋白，使其在循環(huán)中的保留時(shí)間較之未修飾血紅蛋白延長，其氧結(jié)合特性則與血液類似。分子內(nèi)交聯(lián)使四聚體血紅蛋白單位的亞基化學(xué)結(jié)合在一起，以防止其形成如前所述過早排出的二聚體。(參見例如Rausch等人美國專利5，296，465)。制備HBOC產(chǎn)品的高額費(fèi)用大大限制其商業(yè)生存力。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，已知的HBOC傾向于在微動(dòng)脈壁而非毛細(xì)血管處向組織釋放過量的氧氣。這可導(dǎo)致HBOC對(duì)毛細(xì)血管周圍的組織供氧不足。盡管HBOC最初的氧氣載荷可能相對(duì)高于天然紅細(xì)胞正常達(dá)到的量，極低親和力的突變體除外。多數(shù)情況下，設(shè)計(jì)HBOC的氧親和力等于或低于天然血紅蛋白。但如上所述，這可能導(dǎo)致組織供氧不足。因此，本發(fā)明涉及包含在含水稀釋劑中具有高氧親和力的HBOC的血液代用品。發(fā)明概述本發(fā)明的方法和組合物可用于多種環(huán)境下，包括急診室、手術(shù)室、軍事沖突、腫瘤醫(yī)院和獸醫(yī)診所。本發(fā)明的低毒性和高穩(wěn)定性允許室溫保存，而不損害所述血液代用品的效力。本發(fā)明還避開了血型的交叉配型以及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢測要求，允許更早、更安全介入患者治療。本發(fā)明的低毒性、長期穩(wěn)定性以及通用性加在一起，因而表現(xiàn)為一種特別有用的血液代用品。
一方面，本發(fā)明提供了包含表面修飾的氧合血紅蛋白的血液代用品產(chǎn)品，其中在相同條件下檢測時(shí)，該表面修飾的氧合血紅蛋白的P50低于相同動(dòng)物來源(即來自相同種類動(dòng)物)的天然無基質(zhì)血紅蛋白。合適的動(dòng)物來源包括，例如人、牛、豬、馬。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該血液代用品產(chǎn)品采取包含表面修飾的氧合血紅蛋白和含水稀釋劑的組合物的形式。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，該表面修飾的氧合血紅蛋白的P50小于IOtorr,優(yōu)選小于 7torr。另一方面，本發(fā)明提供了通過在氧合血紅蛋白上共價(jià)連接一種或多種聚環(huán)氧烷(polyalkylene oxides)而生成的血液代用品產(chǎn)品。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，該血液代用品產(chǎn)品通過共價(jià)連接聚環(huán)氧烷的聚合物而生成，例如具有化學(xué)式H(OCH2CH2)nOH的聚乙二醇(PEG)，其中η大于或等于4。優(yōu)選該產(chǎn)品的聞鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比小于0.10。另一方面，本發(fā)明提供了包含PEG-血紅蛋白綴合物、在24° C對(duì)自身氧化穩(wěn)定的血液代用品產(chǎn)品，其中高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比小于0.10，并且該P(yáng)EG-血紅蛋白綴合物的Ρ50小于lOtorr。另一方面，本發(fā)明提供了制備血液代用品組合物的方法，其包含以下步驟:a)制備高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比小于0.10的血紅蛋白；b)在血紅蛋白上共價(jià)連接聚環(huán)氧烷，形成P50小于IOtorr的表面修飾的氧合血紅蛋白；以及c)將表面修飾的氧合血紅蛋白懸浮于合適的稀釋劑中。制備血紅蛋白優(yōu)選另外包含從紅細(xì)胞中分離血紅蛋白。此外，制備血紅蛋白的步驟可以另外包含從紅細(xì)胞中分離血紅蛋白，其中血紅蛋白的高鐵血紅蛋白/總血紅 蛋白之比為0.10或以上，并將該血紅蛋白暴露在氧氣條件下(即大氣中)足夠時(shí)間，以使高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比降低到小于0.10。該步驟可在缺少含巰基還原劑的條件下進(jìn)行。另一方面，本發(fā)明提供了使用血液代用品產(chǎn)品為組織輸送氧氣的方法，包含將處于含水稀釋劑中的產(chǎn)品給予有此需要的哺乳動(dòng)物。 本發(fā)明的其它方面如說明書全文所述。附圖簡述

圖1 描述 MalPEG-Hb 和 Si7H 的 FPLC 層析圖。圖2描述MalPEG-Hb和SHl的氧平衡曲線。圖3描述兩種PEG修飾的血紅蛋白(PHP和Ρ0Ε)以及未修飾血紅蛋白(SFH)的FPLC洗脫特征。注意PHP和POE的特征在性質(zhì)上而非數(shù)量上相類似。同樣注意POE曲線中顯然是未修飾血紅蛋白的小峰。圖4描述兩種PEG修飾的血紅蛋白(PHP和Ρ0Ε)的氧平衡曲線。注意兩者均沒有顯著協(xié)同性。圖5描述MalPEG-血紅蛋白在室溫下隨時(shí)間的氧化速率。從以同樣方式保存的兩只獨(dú)立的瓶子中，一式兩份測定樣品。氧化速率為每小時(shí)總血紅蛋白的1%，10小時(shí)內(nèi)從5.0到 5.5%ο圖6描述接受PHP或POE的兩組動(dòng)物的Kaplan-Meier生存分析。圖7描述接受兩種PEG修飾血紅蛋白(PHP和Ρ0Ε)動(dòng)物的平均動(dòng)脈壓。反應(yīng)是即時(shí)性的，接受PHP的動(dòng)物反應(yīng)較大。但在出血期間，POE動(dòng)物的血壓維持較好。圖8描述MalPEG-Hb于-20° C保存6天、+4° C保存5天以及室溫(24° C)保存10小時(shí)的各種隨時(shí)間氧化速率的總結(jié)。圖9描述MalPEG-Hb于+4° C保存5天的隨時(shí)間氧化速率。圖10描述MalPEG-Hb于室溫保存10小時(shí)的隨時(shí)間氧化速率。發(fā)明描述本發(fā)明涉及包含高氧親和力HBOC的血液代用品。對(duì)于某些應(yīng)用，這些組合物能夠比氧親和力類似于天然血紅蛋白的血液代用品更有效地為組織輸送氧氣。定義為幫助理解后文公開內(nèi)容所示本發(fā)明，下文定義了許多術(shù)語。

術(shù)語〃血紅蛋白〃 一般是指紅細(xì)胞內(nèi)包含的輸送氧氣的蛋白質(zhì)。每個(gè)血紅蛋白分子具有4個(gè)亞基，兩條α鏈和兩條β鏈，組成四聚體結(jié)構(gòu)。每個(gè)亞基還包含一個(gè)血紅素基團(tuán)，其含鐵的中心結(jié)合氧。因而每個(gè)血紅蛋白分子可結(jié)合4個(gè)氧分子。術(shù)語〃修飾血紅蛋白〃包括但不限于通過化學(xué)反應(yīng)改造的血紅蛋白，例如分子內(nèi)或分子間交聯(lián)、遺傳操作、聚合和/或綴合其它化學(xué)基團(tuán)(例如，聚環(huán)氧烷諸如聚乙二醇，或其它加成物諸如蛋白質(zhì)、肽、糖類、合成聚合物等)。本質(zhì)上，如果血紅蛋白的任何結(jié)構(gòu)或功能性質(zhì)由其天然狀態(tài)而改變，則是〃修飾的〃。此處所用術(shù)語〃血紅蛋白〃本身是指天然、未修飾的血紅蛋白以及修飾的血紅蛋白。術(shù)語〃表面修飾血紅蛋白〃用來指已經(jīng)連接(最通常共價(jià)連接)化學(xué)基團(tuán)諸如葡聚糖或聚環(huán)氧烷的上述血紅蛋白。術(shù)語〃表面修飾氧合血紅蛋白〃是指表面修飾時(shí)處于〃R〃狀態(tài)的血紅蛋白。術(shù)語〃無基質(zhì)血紅蛋白〃是指已經(jīng)從中去除所有紅細(xì)胞膜的血紅蛋白。術(shù)語〃高鐵血紅蛋白〃是指包含三價(jià)態(tài)鐵的血紅蛋白，不能起氧載體作用。術(shù)語〃MalPEG_Hb〃是指已經(jīng)綴合malemidyl活化的PEG的血紅蛋白。這種MalPEG-Hb可由下式進(jìn)一步指定:Hb- (S-Y-R-CH2-CH2- [O-CH2-CH2] n0_CH3) m 式 I其中Hb是指四聚體血紅蛋白，S是表面巰基，Y是Hb和Mal-PEG之間的琥珀酰亞胺基共價(jià)連接，R是烷基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基(取決于原材料的來源和化學(xué)合成方法)，
n是組成PEG聚合物主鏈的氧化乙烯基單元，其中η定義聚合物長度(例如MW=5000)，O-CH3是末端甲氧基。PHP和POE是兩種不同的PEG修飾血紅蛋白。術(shù)語〃全氟化碳〃是指包含氟原子的合成的惰性分子，并完全由鹵素(Br，F(xiàn)，Cl)和碳原子組成。其乳劑形式比等量的血漿或水能夠多溶解很多倍的氧氣，因而正開發(fā)為血液物質(zhì)。術(shù)語〃血漿擴(kuò)容劑〃是指能夠給予受試者以治療失血的任何溶液。術(shù)語〃攜氧能力〃或簡稱〃氧容量〃是指血液代用品攜氧的能力，但未必與輸送氧的效力相關(guān)。既然已知每克血紅蛋白結(jié)合1.34ml氧氣，一般根據(jù)血紅蛋白濃度計(jì)算攜氧能力。因此，血紅蛋白的@/(11濃度乘以系數(shù)1.34，得到1111/(11的氧容量?？捎扇魏我阎椒y定血紅蛋白濃度，例如使用β -血紅蛋白光度計(jì)(HemoCue, Inc., Angelholm, Sweden)。類似地，使用例如燃料池儀器(例如Lex-O2-Con; Lexington Instruments),通過血紅蛋白或血液樣品釋放的氧氣量測定氧含量。術(shù)語〃氧親和力〃是指氧載體例如血紅蛋白結(jié)合分子氧的親和力。該特征由聯(lián)系血紅蛋白分子氧飽和度(Y軸)與氧分壓(X軸)的氧平衡曲線定義。該曲線的位置由氧載體被氧半飽和時(shí)的氧分壓P50值表示，與氧親和力逆相關(guān)。因此，P50越低，氧親和力越高。可以利用本領(lǐng)域已知的多種方法測定全血(以及全血組分諸如紅細(xì)胞和血紅蛋白)的氧親和力。(參見例如Winslow等人J.Biol.Chem.252(7): 2331-37 (1977))。也可使用可商品化的 HEMOX TM Analyzer (TCS Scientific Corporation, New Hope, Pennsylvania)測定氧親和力。(參見例如 Vandegriff 和 Shrager 之于〃Methods in Enzymology〃(Everse 等人編著)232:460 (1994))。術(shù)語〃高滲〃表示膠體滲透壓(oncotic)高于血液的膠體溶液(> 約25_27mm Hg)?？衫萌魏魏线m技術(shù)，例如在Wescor儀器中，測定膠體滲透壓。術(shù)語〃攜氧成分〃泛指能夠在身體循環(huán)系統(tǒng)中攜氧并將至少部分氧氣輸送給組織的物質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該攜氧成分是天然或小時(shí)血紅蛋白，此處也稱為〃基于血紅蛋白的氧載體〃或〃HB0C〃。術(shù)語〃血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)〃泛指反映血壓、血流和容量狀態(tài)的測量，包括測量諸如血壓、心輸出量、右房壓和左心室舒張末期壓。術(shù)語〃類晶體〃是指小分子(通常小于_i)，諸如鹽、糖和緩沖液。與膠體不同，
晶體不包含任何張力活性(oncotically active)成分，可極快速在循環(huán)和細(xì)胞間隙之間達(dá)到平衡。術(shù)語〃膠體〃與〃類晶體〃相反，是指大分子(通常大于Μ, )，根據(jù)其大小
和電荷跨生物膜達(dá)到平衡，包括蛋白質(zhì)諸如白蛋白和明膠，以及淀粉諸如pentastarch和hetastarcho 術(shù)語〃膠體滲透壓〃是指膠體為平衡流體跨膜平衡而施加的壓力。術(shù)語〃對(duì)自身氧化穩(wěn)定〃是指HBOC維持低速率自身氧化的能力。如果在24° ClO小時(shí)之后高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比增加不超過2%，則認(rèn)為HBOC在24° C穩(wěn)定。例如，假設(shè)自身氧化速率為0.21Γ1，那么如果最初的高鐵血紅蛋白百分比為5%，若該百分比增加不超過7%，則認(rèn)為HBOC在室溫下10小時(shí)是穩(wěn)定的。術(shù)語〃高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比〃是指脫氧血紅蛋白與總血紅蛋白的比值。術(shù)語〃混合物〃是指兩種或多種物質(zhì)混合一起，而不發(fā)生喪失其各自特性的反應(yīng)；術(shù)語〃溶液〃是指液體混合物；術(shù)語〃水溶液〃是指包含一些水的溶液，也可能包含一種或多種其他液體物質(zhì)，與水形成多組分溶液；術(shù)語"大約"是指實(shí)際值位于一個(gè)范圍之內(nèi)，例如指示值的10%術(shù)語〃聚乙二醇〃是指化學(xué)通式H(OCH2CH2)n OH的液體或固體聚合物，其中η大于或等于4?？梢允褂萌魏蜳EG成分，無論取代或未取代。此處所用其它術(shù)語的含義應(yīng)易為本領(lǐng)域適當(dāng)技術(shù)人員所理解。氧氣輸送和消耗的性質(zhì)雖然成功使用本發(fā)明的組合物和方法并不需要理解氧氣輸送和消耗的機(jī)理，但有關(guān)其中某些推斷機(jī)理的基礎(chǔ)知識(shí)可能有助于理解后文之論述。一般認(rèn)為毛細(xì)血管是組織主要的氧輸送者。但對(duì)于靜態(tài)組織，現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)表明，在微動(dòng)脈和毛細(xì)血管氧釋放之間大致存在均勻分配。也就是說，認(rèn)為動(dòng)脈系統(tǒng)中的血紅蛋白在微動(dòng)脈網(wǎng)中輸送約三分之一的氧含量，在毛細(xì)血管輸送三分之一，余者通過靜脈系統(tǒng)離開微循環(huán)。動(dòng)脈本身是氧氣利用的場所。例如，動(dòng)脈壁需要能量以通過抵抗血管阻力收縮，進(jìn)行血流調(diào)節(jié)。因此，動(dòng)脈壁通常是氧氣自血液中擴(kuò)散的重要場所。然而，現(xiàn)有的攜氧組合物(例如HBOC)可能在動(dòng)脈系統(tǒng)中釋放過多的氧含量，從而誘導(dǎo)自動(dòng)調(diào)節(jié)性的毛細(xì)血管灌流減少。因此，具有過多的氧氣或過低的氧親和力實(shí)際上可能妨礙血液代用品的輸氧效率。通過測量管壁梯度，可以確定血管壁的耗氧速率，即機(jī)械功所需氧氣和生化合成所需氧氣之合。參見例如Winslow等人之于"Advances in BloodSubstitutes" (1997), Birkhauser 編著，Boston, MA, 167-188 頁?，F(xiàn)有技術(shù)可以在多種血管中進(jìn)行精確氧分壓測量。所測梯度與測量區(qū)域中組織的氧利用率成正比。該測量表明，血管壁具有基本的氧氣利用，隨激動(dòng)(infla_ation)和收縮的提高而提高，隨松弛而降低。血管壁梯度與組織氧合成反比。血管收縮提高氧梯度(組織代謝)，血管舒張則降低該梯度。高梯度表示血管壁使用的氧氣較多，組織可利用的氧氣則較少。相信同樣現(xiàn)象遍及微循環(huán)。血管收縮和氧親和力的關(guān)系開發(fā)高氧親和力HBOC的基本原理部分基于過去使用無細(xì)胞血紅蛋白代替紅細(xì)胞輸血的研究。這些溶液的某些生理效應(yīng)尚未完全了解。其中可能最有爭議的是導(dǎo)致血管收縮的傾向，在動(dòng)物和人中可能出現(xiàn)高血壓(Amberson, W.，"Clinical experiencewith hemoglobin-saline solutions,〃.Science 106:117-117(1947))(Keipert, P., A.Gonzales,C.Gomez, V.Macdonald, J.Hess 和 R.Winslow, "Acute changes in systemicblood pressure and urine output of conscious rats following exchangetransfusion with diaspirin-crossI inked hemoglobin solution,〃Transfusion33:701-708, (1993))。美軍開發(fā)了用bisdibromosalicyl-延胡索酸α鏈間交聯(lián)的人血紅蛋白(a aHb)作為原型紅細(xì)胞代用品，但在證明其劇烈增加肺及全身血管阻力之后，被軍隊(duì)放棄了 (Hess, J., V.Macdonald, A.Murray, V.Coppes 和 C.Gomez, "Pulmonaryand systemic hypertension after hemoglobin administration, "Blood78:356A(I991))。該產(chǎn)品的商品化形式也在令人失望的III期臨床試驗(yàn)后被放棄了(WinsloW，R.M.^aa-Crosslinked hemoglobin:Was failure predicted by preclinical testing 〃Voxsang79:1-20 (2000)。無細(xì)胞血紅蛋白引起血管收縮的最常見的最新解釋是，它易于結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞來源的松弛因子一氧化氮(NO)。實(shí)際上，已經(jīng)制備了 NO親和力降低的重組血紅蛋白，在最高載量的大鼠實(shí)驗(yàn)中似乎較少高血壓(Doherty, D.H.，Μ.P.Doyle, S.R.Curry, R.J.Val i, T.J.Fattor, J.S.01 son 和 D.D.Lemon, "Rate of reactionwith nitric oxide determines the hypertensive effect of cell-freehemoglobin, "Nature Biotechnologyl6:672-676(1998))(Lemon, D.D., D.H.Doherty, S.R.Curry, A.J.Mathews, M.P.Doyle, T.J.Fattor 和 J.S.0lson, "Control of thenitric oxide-scavenging activity of hemoglobin, ^Art Cells, Blood Subs., andImmob.Biotech24:378 (1996))。但研究提示，NO結(jié)合可能并非血紅蛋白血管活性的唯一解釋。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些大的血紅蛋白分子，例如由聚乙二醇(PEG)修飾的血紅蛋白分子，實(shí)際上沒有高血壓效應(yīng)，即使其NO結(jié)合速率與嚴(yán)重高血壓的a aHb相同(Rohlfs, R.J., Ε.Bruner, A.Chiu, A.Gonzales, M.L.Gonzales, D.Magde, M.D.Magde, K.D.Vandegriff 和 R.M.Winslow, "Arterial blood pressure responses tocell-free hemoglobin solutions and the reaction with nitric oxide, 〃JBiolChem273:12128-12134(1998))。此外，發(fā)現(xiàn)在出血之前以交換輸血給予PEG-血紅蛋白時(shí)，在防止出血后果方面格外有效(Winslow, R.M., A.Gonzales, M.Gonzales, M.Magde, M.McCarthy, R.J.Rohlfs和 K.D.Vandegriff, "Vascular resistance and the efficacy ofred cell substitutes, "JAppl Physiol85:993-1003 (1998))。該保護(hù)效應(yīng)與缺少高血壓相關(guān)，提示血管收縮導(dǎo)致迄今研究的許多基于血紅蛋白產(chǎn)品的失望性能。基于上述觀察，形成了解釋血管收縮的假說，來替代或可能補(bǔ)充NO結(jié)合效應(yīng)。盡管不希望受任何特定理論的限制，但相信血紅蛋白血管活性效應(yīng)的基本成分是血紅蛋白在無細(xì)胞間隙擴(kuò)散的反射性反應(yīng)。在體外毛細(xì)血管系統(tǒng)中測試該假說，證明擴(kuò)散常數(shù)降低的PEG-血紅蛋白以非常類似于天然紅細(xì)胞的方式轉(zhuǎn)移O2(McCarthy，M.R., K.D.Vandegriff 和 R.M.Winslow,〃The role of facilitated diffusion inoxygen transport by cell-free hemoglobin:1mplications for the design ofhemoglobin-based oxygen carriers, ^Biophysical Chemistry92:103-117(2001))。由于血紅蛋白到血管壁飽和度的改變是血紅蛋白自身擴(kuò)散梯度的決定因素，預(yù)期氧親和力在血紅蛋白于血漿空間的易化擴(kuò)散中起作用。由于釋放O2到微動(dòng)脈血管壁將引起血管收縮，無細(xì)胞血紅蛋白的氧親和力可能還起調(diào)節(jié)血管緊張度的作用(Lindbom, L., R.Tuma和K.Arfors, "Influence ofoxygen on perfusion capillary density and capillary red cell velocity inrabbit skeletal muscle, ^Microvasc Resl9:197-208 (1980))。在倉鼠皮膚皺裙中，該血管的PO2為20-40Torr,而正常紅細(xì)胞氧平衡曲線最陸(Intaglietta, M., P.Johnson和 R.Winslow, "Microvascul ar and tissue oxygen distribution, ^CardiovascRes32:632-643 (1996))。因而從理論觀點(diǎn)來看，為了防止無細(xì)胞血紅蛋白在微動(dòng)脈調(diào)節(jié)性血管中釋放O2，其P50低于紅細(xì)胞(即較高的O2親和力)可能是重要的。
_0] 攜氧成分在優(yōu)選實(shí)施方案中，氧載體(即攜氧成分)是基于血紅蛋白的氧載體或HBOC。血紅蛋白可能是天然(未修飾)的；后來利用化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行修飾，例如分子內(nèi)或分子間交聯(lián)、聚合或加成化學(xué)基團(tuán)(例如聚環(huán)氧烷或其它加成物)；或可能經(jīng)重組改造的。人α-和β-珠蛋白基因均已克隆并測序。Liebhaber等人P.N.A.S.77:7054-7058 (1980) ;Marotta等人J.Biol.Chem.353:5040-5053(1977) (β -珠蛋白cDNA)。此外，如今使用定位誘變已經(jīng)產(chǎn)生了許多重組制備的修飾血紅蛋白，盡管這些〃突變〃血紅蛋白種類據(jù)報(bào)道具有并不理想的高氧親和力 ο 參見例如 Nagai 等人 P.N.A.S.,82:7252-7255 (1985)。本發(fā)明不受血紅蛋白來源的限制。例如，血紅蛋白可能來源于動(dòng)物和人。某些應(yīng)用優(yōu)選的血紅蛋白來源是人、牛和豬。此外，可能利用其它方法產(chǎn)生血紅蛋白，包括化學(xué)合成和重組技術(shù)。血紅蛋白可能以游離形式加入到血液制品組合物中，或可能包封到囊中，例如合成顆粒、微球或脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的攜氧成分應(yīng)該無基質(zhì)、無內(nèi)毒素。許多授權(quán)的美國專利公開了攜氧成分的典型例子，包括Hsia的美國專利4，857，636 ；ffalder的美國專利4，600，531,Morris等人的美國專利4，061，736 ；Mazur的美國專利3，925，344 ；Tye的美國專利4，529，719 ；Scannon的美國專利4，473，496 ；Bocci等人的美國專利4，584，130 ；Kluger等人的美國專利5，250, 665 ；Hoffman等人的美國專利5，028, 588以及Sehgal等人的美國專利 4，826，811 和 5，194，590。除前述血紅蛋白來源以外，最近發(fā)現(xiàn)馬血紅蛋白作為本發(fā)明組合物中的攜氧成分具有某些優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，容易獲得從中純化馬血紅蛋白的商品化數(shù)量的馬血。另一意想不到的優(yōu)點(diǎn)在于，馬血紅蛋白具有可能增強(qiáng)其在本發(fā)明血液代用品中用處的化學(xué)特性。先前的報(bào)告已經(jīng)指出，馬血紅蛋白比人血紅蛋白更快速自身氧化為高鐵血紅蛋白，使其作為血液代用品成分不太理想。參見例如J.G.McLean和1.M.Lewis, Research inVet.Sc1.，19:259-262(1975)。為了將自身氧化減到最小，McLean和Lewis在紅細(xì)胞裂解后使用還原劑谷胱甘肽。然而，用于制備本發(fā)明組合物的血紅蛋白，不論來源于人或馬，均布需要在紅細(xì)胞裂之后使用還原劑來防止自身氧化。最近報(bào)道馬血紅蛋白的氧親和力不同于人血紅蛋白。參見例如M.Mellegrini等人Eur.J.Biochem..268:3313-3320 (2001)。這種差異陽礙了詵擇馬血紅蛋白來制各樽擬人血紅蛋白的血液代用品。但在引入本發(fā)明的組合物時(shí)，未觀察到含人和馬血紅蛋白綴合物的氧親和力之間的顯著差異(小于10%)。因此，與這些表面上不理想的特性相反，在本發(fā)明的組合物中，馬血紅蛋白等效、若不然則優(yōu)于人血紅蛋白。對(duì)于本發(fā)明中的使用而言，在相同條件下測量時(shí)，HBOC的氧親和力高于全血，優(yōu)選是全血的兩倍，或者高于無基質(zhì)血紅蛋白(SFH)。在大多數(shù)情況下，這意味著血液代用品中的HBOC的P50 將小于10，更優(yōu)選小于7。游離態(tài)SHl的P50約15torr，而全血的P50約28torr。先前提議提高氧親和力從而降低P50，可能增強(qiáng)對(duì)組織輸氧，雖然暗示低于SFH的P50不可接受。參見Winslow等人之于〃Advances in BloodSubstitutes" (1997), Birkhauser 編著,Boston, MA, 167 頁以及美國專利 6, 054, 427。該提議與廣泛秉承的看法相悖，即，用作血液代用品的修飾血紅蛋白應(yīng)該氧親和力較低，并且P50應(yīng)該接近全血。因此，由于卩比卩多醒化(pyridoxylated)的血紅蛋白相比SFH更易于釋放氧，許多研究者使用磷酸卩比唆醒(pyridoxyl phosphate)將SFH的P50從10提高到約20-22。許多不同的科學(xué)方法可以制備高氧親和力的HB0C(即P50低于SFH)。例如，研究已經(jīng)鑒定了在氧親和力中起作用的氨基酸殘基，例如B-93半胱氨酸，因而如今可以輕易進(jìn)行定位誘變來操縱氧親和力到達(dá)理想水平。參見例如美國專利5，661，124。美國專利6，054，427討論了其它多種方法。血紅蛋白相關(guān)毒件已知血紅蛋白從亞鐵(Fe2+)到鐵(Fe3+)或高鐵血紅蛋白形式可逆變化時(shí)，表現(xiàn)自身氧化。發(fā)生這種情況時(shí)，分子氧以過氧化陰離子(O2-)的形式從氧合血紅蛋白中解離。這還導(dǎo)致血紅素-珠蛋白復(fù)合物去穩(wěn)定，最后珠蛋白鏈變性。相信氧自由基形成以及蛋白質(zhì)變性在 HBOC 的體內(nèi)毒性中起作用(Vandegriff, K.D., Blood Substitutes, PhysiologicalBasis of Efficacy, 105-130 頁，Winslow 等人編著，Birkhauser, Boston, MA (1995))。大多數(shù)HBOC的氧親和力和血紅蛋白氧化具有負(fù)相關(guān)，S卩，氧親和力越高，自身氧化速率越低。然而，不同的血紅蛋白修飾對(duì)氧親和力和自身氧化速率的作用不一定可以預(yù)測。此外，氧親和力和自身氧化速率之間的最佳平衡不甚明了。本發(fā)明部分涉及意外發(fā)現(xiàn)，即，此處所述PEG-Hb綴合物的自身氧化速率極低。測量氧化速率時(shí)，數(shù)值應(yīng)該盡可能低(即，每小時(shí)總血紅蛋白的0.2%、更優(yōu)選每小時(shí)總血紅蛋白的0.1%，在室溫下至少3小時(shí)、更優(yōu)選至少10小時(shí))。本發(fā)明的HBOC因而在給藥和/或室溫保存期間保持穩(wěn)定。攜氧成分的修飾在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該攜氧成分是修飾的血紅蛋白。優(yōu)選的血紅蛋白修飾是"表面修飾〃，即，在血紅蛋白分子暴露的氨基酸側(cè)鏈上共價(jià)結(jié)合化學(xué)基團(tuán)。主要為提高血紅蛋白的分子大小而進(jìn)行修飾，大多通過共價(jià)結(jié)合聚合部分，例如合成的聚合物、糖類、蛋白質(zhì)等。通常優(yōu)選合成的聚合物。適當(dāng)?shù)暮铣捎H水性聚合物包括,尤其是聚環(huán)氧燒,例如聚環(huán)氧乙燒(polyethyleneoxide) ((CH2CH2O)n)、聚環(huán)氧丙燒(polypropylene oxide) ((CH(CH3)CH2O)n)或聚環(huán)氧乙燒/聚環(huán)氧丙烷共聚物((CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH20)n)。適于實(shí)踐本發(fā)明的其它直、支鏈以及任意取代的合成聚合物為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所公知。因其藥物可接受性以及商業(yè)可利用性，最常見的結(jié)合血紅蛋白的化學(xué)基團(tuán)是聚乙二醇(PEG)。PEG是化學(xué)通式為H(OCH2CH2)nOH的聚合物，其中η —般大于或等于4。PEG表述通常后接一個(gè)對(duì)應(yīng)其平均分子量的數(shù)字。例如，PEG-200的平均分子量200，可能的分子量范圍190-210。PEG可商品化獲得多種不同形式，很多情況下為預(yù)活化并預(yù)備綴合蛋白質(zhì)。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的重要方面在于，表面修飾在血紅蛋白處于氧合或〃R〃態(tài)時(shí)發(fā)生。在綴合之前，將血紅蛋白與大氣平衡(或者可以進(jìn)行活性氧合)，這很容易實(shí)現(xiàn)。通過對(duì)氧合血紅蛋白進(jìn)行綴合，所得血紅蛋白的氧親和力增強(qiáng)了。由于許多研究者描述在綴合前脫氧以減少氧親和力，通常視這一步驟為禁忌。參見例如美國專利5，234.903。雖然表面修飾血紅蛋白的性能在許多方面與血紅蛋白和修飾劑(例如PEG)之間的連接無關(guān)，但相信較剛性的接頭，例如不飽和的脂肪族或芳香族C1-C6接頭取代物，與具有較柔性接頭并因而具有可變形聯(lián)結(jié)物的取代物相比，可能加強(qiáng)了綴合物的制備和/或特征。加成到血紅蛋白分子的PEG數(shù)目可能因PEG的大小而不同。但所得修飾血紅蛋白的分子大小應(yīng)該大到足以避免被腎臟清除，以達(dá)到理想的半衰期。Blumenstein等人確定，該大小達(dá)到分子量84，000 以上。(Blumenstein等人之于〃Blood Substitutes and PlasmaExpanders, "Alan R.Liss 編著，New York, New York, 205-212 頁(1978))。其中作者將血紅蛋白綴合到不同分子量的葡聚糖。據(jù)其報(bào)道，血紅蛋白(分子量64，000)和葡聚糖(分子量20, 000)的綴合物〃被緩慢從循環(huán)中清除、由腎臟清除幾可忽略〃，而提高分子量84，000以上并未改變清除曲線。因而如Blum enstein等人所確定，優(yōu)選HBOC的分子量至少84，000。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該HBOC是〃MalPEG〃，代表綴合了 malemidyl活化PEG的血紅蛋白。這種MalPEG可由下式進(jìn)一步指定:
Hb- (S-Y-R-CH2-CH2- [O-CH2-CH2] n0_CH3) m 式 I其中Hb是指四聚體血紅蛋白，S是表面巰基，Y是Hb和Mal-PEG之間的succinimido共價(jià)連接,R是燒基、酰胺、氨基甲酸酯或苯基(取決于原材料的來源和化學(xué)合成方法)，
n是組成PEG聚合物主鏈的氧化乙烯基單元，其中η定義聚合物長度(例如MW=5000)，O-CH3是末端甲氧基。類晶體(Crystalloid)成分在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，該血液代用品可能還包含類晶體。該類晶體成分可以是任何類晶體，在血液代用品組合物中優(yōu)選能夠達(dá)到摩爾滲透壓濃度大于800m0sm/l，即，使該血液代用品〃高滲〃。血液代用品中合適類晶體及其濃度的例子包括，例如3%NaCl、7%NaCl、7.5%NaCl和處于6%葡聚糖中的7.5%NaCl。更優(yōu)選血液代用品的摩爾滲透壓濃度為800-2400m0sm/l。先前報(bào)道了在另外包含膠體(B卩，比葡聚糖擴(kuò)散差的分子)的摩爾滲透壓濃度300-800m0sm/l的溶液中重組制備的血紅蛋白的使用。參見例如美國專利5，661，124。然而，該專利沒有教導(dǎo)制備摩爾滲透壓濃度超過800的血液代用品，并提議血紅蛋白濃度應(yīng)為6-12g/dl。與此相反，本發(fā)明組合物的攜氧效率允許使用較低濃度的血紅蛋白，例如高于6g/dl或甚而高于4g/dl。當(dāng)血液代用品另外包含類晶體并高滲時(shí)，本發(fā)明組合物可能提供比其它包括膠體成分的血液代用品改進(jìn)的功能，可快速恢復(fù)血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。小體積高滲類晶體輸注(例如l-10ml/kg)提供了明顯好處，在受控出血中可快速持久恢復(fù)可接受的血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。(參見例如Przybelski, R.J., E.K.Daily和M.L.Birnbaum, "Thepressor effect of hemoglobin—good or bad 〃 之于 Winslow, R.Μ., K.D.Vandegriff和 M.1ntaglietta 編著.Advances in Blood Substitutes.1ndustrial Opportunitiesand Medical Challenges.Boston, BirkMilSer (1997), 71-85) □但高滲類晶體溶液單獨(dú)不能充分恢復(fù)大腦輸氧。參見D.Prough等人〃Effects of hypertonic saline versusRinger’s solut ion on cerebral oxygen transport during resuscitation fromhemorrhagic shock, 〃J.Neurosurg.64:627-32(1986)。鉬成將氧載體及其它可選賦形劑與合適的稀釋劑混合，配制本發(fā)明的血液代用品。盡管根據(jù)應(yīng)用、特別是基于預(yù)期的給藥后稀釋，氧載體在稀釋劑中的濃度可能改變，在優(yōu)選實(shí)施方案中，由于本發(fā)明組合物的其它特征提供了增強(qiáng)的氧氣輸送及治療效果，通常濃度不必高于6g/dl,更優(yōu)選0.l-4g/dl。合適的稀釋劑(即，供靜脈內(nèi)注射的藥物可接受的稀釋劑)包括，尤其是蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖及其它膠體。這并非意味著這些實(shí)施方案受任何特定稀釋劑的限制。因此，這意味著該稀釋劑涵蓋白蛋白、其它膠體或其它非攜氧成分的無細(xì)胞水溶液，該水溶液的粘度至少2.5cP。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該水溶液的粘度為2.5-4cP。本發(fā)明也涵蓋粘度為6cP或更高的溶液。SfflA.臨床應(yīng)用本發(fā)明及其實(shí)施方案將用于臨床上指示快速恢復(fù)O2水平、或提高O2水平、或更換O2水平的應(yīng)用中。參見例如美國專利6，054，427。本發(fā)明的方法和組合物適用的多種環(huán)境包括以下:
創(chuàng)傷.急性全血損失可導(dǎo)致胞間和細(xì)胞內(nèi)空間的液體轉(zhuǎn)移，以替換喪失的血容量，同時(shí)從低優(yōu)先級(jí)的器官包括皮膚和消化道分流血液。從器官分流血液降低、有時(shí)消除了這些器官的O2水平，導(dǎo)致漸進(jìn)性組織壞死。期望快速恢復(fù)O2水平，也許造成明顯較好地?fù)尵冗@類急性失血患者的組織。局部缺血.在局部缺血中，一個(gè)特定器官(或多個(gè)器官)氧氣〃饑餓〃。器官的小部分，稱為梗塞，因缺O(jiān)2開始死亡?？焖倩謴?fù)O2水平對(duì)于阻止重要組織的梗塞形成極為重要。導(dǎo)致局部缺血的條件包括心臟病發(fā)作、中風(fēng)或腦血管創(chuàng)傷。血液稀釋:在此臨床應(yīng)用中，需要血液代用品來替換手術(shù)前取出的血液。期望取出患者血液，以防止手術(shù)后需要異體輸血。在此應(yīng)用中，給予血液代用品以替換(或代替)取出的自體血液的O2水平。如此允許使用取出的自體血液供手術(shù)期間或之后的必要輸血。一種需要術(shù)前取血的這類手術(shù)為心肺分流術(shù)。敗血癥性休克.在急性敗血癥中，盡管大輸液治療并利用血管收縮劑治療,某些患者可能變?yōu)楦哐獕?。在此情況下，一氧化氮(NO)的過量生成導(dǎo)致血壓降低。由于血紅蛋白以類似O2的親和力結(jié)合NO，血紅蛋白因而近乎是治療這些患者的理想藥劑。癌癥.向腫瘤塊含氧低的內(nèi)核輸送O2，可提高其放化療敏感性。由于腫瘤的微血管系統(tǒng)不同于其它組織，藉由提高O2水平促進(jìn)敏感性需要在低氧核心內(nèi)卸載02。換言之，P50應(yīng)該很低，防止過早卸載O2、提高O2水平，以確保使腫瘤對(duì)隨后的放化療最為敏感。慢性貧血.在這些患者中，損失或代謝的血紅蛋白的置換受到損害或完全喪失。血液代用品可有效置換或提高患者下降的O2水平。鐮狀細(xì)胞貧血.在鐮狀細(xì)胞貧血中，患者因鐮狀形成過程中的O2水平損失以及極高的紅細(xì)胞轉(zhuǎn)換率而衰弱。鐮狀形成過程是PO2的函數(shù)，PO2越低，鐮狀形成率越高。理想的血液代用品應(yīng)使患者在鐮狀形成危險(xiǎn)期的O2水平恢復(fù)到正常范圍內(nèi)。

心麻痹.在某些心臟手術(shù)過程中，利用適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)溶液并降低患者溫度使心臟停止。降低穩(wěn)度將顯著降低P50，可能阻止在任何普通生理?xiàng)l件下的O2卸載。替換O2水平有可能減少這些過程中的組織損害和壞死。缺氧.士兵、高海拔居民以及極限條件下的世界級(jí)運(yùn)動(dòng)員因肺從空氣中提取O2受限，而可能忍受降低的O2水平。受限的O2提取進(jìn)一步限制了 O2輸送。血液代用品可以置換或提高這些個(gè)體的O2水平。器官灌注.在器官離體維護(hù)期間，維持O2含量對(duì)于保持結(jié)構(gòu)和細(xì)胞完整性并最大限度減少梗塞形成極為重要。血液代用品將維持這類器官的O2需求。細(xì)胞培養(yǎng).該需求實(shí)際上與器官灌注相同，只是O2消耗率可能較高。血細(xì)胞生成.血液代用品作為血紅素和鐵的來源，用于在血細(xì)胞生成期間合成新的血紅蛋白。B.獸醫(yī)應(yīng)用本發(fā)明也可用于非人類。本發(fā)明的方法和組合物可用于家養(yǎng)動(dòng)物，例如家畜和寵物(例如狗、貓、馬、鳥、爬行類)，以及在水族館、動(dòng)物園、海洋館及其它動(dòng)物收容設(shè)施中的其它動(dòng)物。本發(fā)明適用于遭受因傷失血、溶血性貧血等的家養(yǎng)及野生動(dòng)物的緊急治療。例如，本發(fā)明的實(shí)施方案可用于下列情況下，例如馬感染性貧血、貓感染性貧血、化學(xué)及其它物理因素所致溶血性貧血、細(xì)菌感染、因子IV斷裂、脾功能亢進(jìn)和脾腫大、家禽出血綜合癥、再生不良性貧血、再生障礙性貧血、自發(fā)性免疫溶血癥、缺鐵癥、異體免疫性溶血性貧血、微血管病性溶血、寄生物感染等。本發(fā)明特別適用于難以找到稀有動(dòng)物和/或外來品種的供血者的領(lǐng)域。
實(shí)施例實(shí)施例1制各無某質(zhì)血紅蛋白步驟1-獲得討期紅細(xì)朐從商業(yè)來源獲得過期的壓積紅細(xì)胞,例如San Diego血庫(the San Diego BloodBank)或美國紅十字會(huì)(the American Red Cross)。優(yōu)選收到過期材料至采集之日起不超過45天。壓積RBC(pRBC)保存于4±2° C，直至進(jìn)一步處理(1_7天)。在使用前篩查所有單位的病毒感染并進(jìn)行核酸檢測。步驟2 -混合討期血液在清潔設(shè)施的無菌容器中混合壓積紅細(xì)胞。記錄壓積紅細(xì)胞的體積，使用可商品化獲得的聯(lián)合血氧定量計(jì)或其它技術(shù)認(rèn)可的方法測定血紅蛋白濃度。步驟 3 -白細(xì)胞去除(Ieukodepletion)使用膜過濾進(jìn)行白細(xì)胞去除(即去除白細(xì)胞)。進(jìn)行開始及最后的白細(xì)胞計(jì)數(shù)，以監(jiān)控該處理的效率。步驟4-細(xì)胞分離及細(xì)胞洗滌

利用6體積0.9%氯化鈉洗滌紅細(xì)胞。該過程在4±2° C進(jìn)行。利用白蛋白的分光光度計(jì)測定分析細(xì)胞洗滌，驗(yàn)證去除血漿成分。步驟5-紅細(xì)胞裂解并去除細(xì)胞碎片使用6體積水在4±2° C攪拌至少4小時(shí)或過夜，裂解洗滌的紅細(xì)胞。在冷處加工裂解物，以純化血紅蛋白。這通過處理裂解物通過0.16-μπι膜而實(shí)現(xiàn)。將純化的血紅蛋白收集到無菌去熱源的容器中。該過程的所有步驟在4±2° C進(jìn)行。步驟6 -病毒去除通過4±2° C超濾進(jìn)行病毒去除。步驟7 -濃縮及溶劑交換使用ΙΟ-kD膜將從裂解并超濾純化的血紅蛋白交換到林格氏乳酸鹽(Ringer’slactate, RL)或磷酸緩沖鹽(PBS，pH7.4)中。然后使用相同的膜濃縮血紅蛋白到終濃度1.l-1.5mM(按四聚體)。10-12體積的RL或PBS用于溶劑交換。該過程在4±2° C進(jìn)行。將在RL中制備的溶液的pH調(diào)整到7.0-7.6。步驟8 -無菌過濾處于PBS或林格氏乳酸鹽(RL)中的血紅蛋白通過0.45-或0.2_μ m —次性濾器無菌過濾，在進(jìn)行化學(xué)修飾反應(yīng)之前于4±2° C保存。純化血紅蛋白的其它方法為本領(lǐng)域公知。此外，通常不需要使用還原劑(例如谷胱甘肽或另一含巰基還原劑)來防止細(xì)胞裂解后自身氧化。實(shí)施例2修飾無某質(zhì)血紅蛋白
步驟 1-硫酉享化(thiolation)使用對(duì)血紅蛋白10倍摩爾過量的iminothiolane于4±2° C連續(xù)攪拌4小時(shí),進(jìn)行硫醇化。反應(yīng)條件: 位于RL(pH7.0-7.5)或PBS(pH7.4)中的ImM血紅蛋白(四聚體) 位于 RL (ρΗ7.0-7.5)或 PBS(pH7.4)中的 IOmMiminothiolane優(yōu)化1:1OSFH:1minothiolane的比值以及反應(yīng)時(shí)間，使PEG化巰基數(shù)目最高、產(chǎn)物不均一性最低。步驟2 -硫醇化血紅蛋白的PEG化根據(jù)起始四聚體血紅蛋白濃度，使用20倍摩爾過量的Mal-PEG (帶有烷基或苯基接頭)對(duì)硫醇化血紅蛋白進(jìn)行PEG化。首先使血紅蛋白與大氣平衡，以氧化血紅蛋白。于4±2° C連續(xù)攪拌2小時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件: 位于RL或PBS (pH7.4)中的ImM硫醇化血紅蛋白 位于 RL 或 PBS (ρΗ7.4)中的 20mM Mal-PEG步驟3-去除未反應(yīng)試劑PEG化Hb通過70 -kD膜處理，去除過量的未反應(yīng)試劑或血紅蛋白。進(jìn)行20體積的過濾，以確保去除未反應(yīng)試劑，通過大小排阻層析在540nm和280nm處進(jìn)行監(jiān)控。將蛋白質(zhì)濃度稀釋到4g/dl。使用IN NaOH調(diào)整pH至7.3 ±0.3。步驟3 -無菌過濾4±2° C使用0.2-μ m無菌一次性濾膜于無菌過濾MalPEG-Hb終產(chǎn)物并收集到無菌去熱源的容器中。步驟4-配制 MalPEG-Hb將PEG 化 Hb 稀釋到 4g/dl RL，pH 調(diào)整到 7.4±0.2。步驟5 -無菌填裝在層流罩超凈臺(tái)中將最終的血液代用品組合物無菌過濾(0.2 μ m)，按重量分裝到無菌玻璃瓶中，利用帶有波紋密封圈的無菌膠塞密封，-80° C保存直至使用。實(shí)施例3MalPEG-Hb的牛理化學(xué)分析生理化學(xué)分析方法MalPEG-Hb血液代用品的均一性和分子大小由液相層析(LiquidChromatography, LC)表征。使用分析型LC評(píng)價(jià)PEG化血紅蛋白的均一性以及未反應(yīng)Mal-PEG的去除程度。使用540nm吸光度評(píng)價(jià)血紅蛋白，通過峰位置分辯PEG化血紅蛋白和未反應(yīng)血紅蛋白。使用280nm吸光度分辯PEG化血紅蛋白和游離Mal-PEG，因MalPEG中的環(huán)結(jié)構(gòu)而在紫外(ultraviolet, UV)光譜有吸收。使用快速掃描二極管陣列分光光度計(jì)(Milton Roy2000或Hewlett PackardModel8453)收集Soret和可見區(qū)光譜，利用多成分分析進(jìn)行血紅蛋白濃度和高鐵血紅蛋白百分t匕分析(Vandegriff, K.D.和 R.E.，Shrager.Evaluation of oxygen equilibriumbinding to hemoglobin by rapid-scanning spcetrophotometry and singular valuedecomposition.Meth.Enzymo1.232:460-485(1994)。 使用聯(lián)合血氧定量計(jì)測定MalPEG-Hb濃度和高鐵血紅蛋白百分比。使用流變儀測定粘度。使用膠體滲透壓計(jì)測定膠體滲透壓。根據(jù)氧平衡曲線測定氧結(jié)合參數(shù)。優(yōu)選的血液代用品組合物規(guī)范(specification)列于下表1:表I
權(quán)利要求
1.包含修飾的血紅蛋白和含水稀釋劑的藥學(xué)組合物，其中該修飾的血紅蛋白是已經(jīng)通過對(duì)于血紅蛋白分子上的暴露的氨基酸側(cè)鏈的巰基基團(tuán)的巰基反應(yīng)性部分共價(jià)連接聚環(huán)氧烷的血紅蛋白，而同時(shí)該血紅蛋白處于氧合狀態(tài)；聚環(huán)氧烷通過選自亞烴基或亞胺基的接頭連接至巰基反應(yīng)性部分；以及其中在37° (:，？!17.4測量時(shí)，該修飾的血紅蛋白的？50低于 15torr。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中聚環(huán)氧烷是聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷或聚環(huán)氧乙烷/聚環(huán)氧丙烷共聚物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中聚環(huán)氧烷是聚乙二醇。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中聚環(huán)氧烷是依據(jù)通式H(OCH2CH2)nOH的聚乙二醇，其中η大于或等于4。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中巰基反應(yīng)性部分是馬來酰亞胺。
6.權(quán)利要求1或5的組合物，其中該修飾的血紅蛋白具有通式:Hb- (S-Y-R-CH2-CH2- [O-CH2-CH2] n-0-CH3) m 其中: Hb是血紅蛋白； S是血紅蛋白的疏基； Y是琥珀酰亞胺基； R是烷基或亞苯基； η定義聚合物長度并且大于或等于4 ；以及 m是連接至四聚體血紅蛋白的聚乙二醇聚合物的數(shù)量。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中m為4-5。
8.權(quán)利要求1一 7中任一項(xiàng)的組合物，其中在修飾前，所述血紅蛋白已經(jīng)被巰基化。
9.權(quán)利要求1一 8中任一項(xiàng)的組合物，其高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比小于0.10。
10.權(quán)利要求1一 9中任一項(xiàng)的組合物，其中所述修飾的氧合血紅蛋白的P50小于IOtorr (1333Pa)。
11.權(quán)利要求1一 9中任一項(xiàng)的組合物，其中所述修飾的氧合血紅蛋白的P50小于7torr (933Pa)。
12.權(quán)利要求1一 11中任一項(xiàng)的組合物，其在24°C具有高鐵血紅蛋白/總血紅蛋白之比小于0.10，并且所述修飾的血紅蛋白的P50小于lOtorr。
13.權(quán)利要求1一 12中任一項(xiàng)的組合物，其中所述血紅蛋白來自人、牛、豬或馬，或者是重組血紅蛋白。
14.權(quán)利要求1一 12中任一項(xiàng)的組合物，其中各巰基反應(yīng)性部分連接至紅蛋白表面上的其它巰基或連接至紅蛋白中天然P93Cys巰基。
15.權(quán)利要求1的組合物，其中血紅蛋白的濃度是0.1 - 4.0g/dl。
16.權(quán)利要求1一 15中任一項(xiàng)的血液代用品產(chǎn)品，其在人或動(dòng)物體的處理或治療方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及血液制品，更特別涉及包含具有高氧親和力的修飾氧合血紅蛋白的組合物以及制備該組合物的方法。本發(fā)明的組合物具有較好的自身氧化穩(wěn)定性以及優(yōu)良的攜氧特征。
文檔編號(hào)A61P7/08GK103203013SQ20131009102
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2003年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月11日
發(fā)明者R·M·溫斯洛, K·D·萬得格里夫 申請(qǐng)人:桑格特公司