專利名稱：：免疫原性降低的高親和力人及人源化抗α5β1整聯(lián)蛋白功能阻斷性抗體的制作方法免疫原性降低的高親和力人及人源化抗oi5|31整聯(lián)蛋白功能阻斷性抗體本發(fā)明涉及以高親和力結(jié)合于oc5(31整聯(lián)蛋白并阻斷其功能的重組人多肽或人源化多肽。此外，披露了所述多肽的診斷及藥物用途。血管生成是新血管從先前存在的血管中發(fā)育的過程。新血管的生長促進胚發(fā)育、傷口愈合和雌性繁殖周期。它也在實體癌和其它疾病例如血管瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)的病理發(fā)展并可能在骨關(guān)節(jié)炎和炎性腸病的病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用(l)。由低含氧量的腫瘤組織釋放的生長因子刺激了新血管生成。盡管生長因子及其受體在血管生成出芽中發(fā)揮重要作用，然而與胞外基質(zhì)(ECM)粘著也是血管生成的激發(fā)調(diào)節(jié)物。粘著促進內(nèi)皮細胞存活及內(nèi)皮增殖和移行(2-5)。一種ECM蛋白尤其纖連蛋白表達在臨時(腫瘤)基質(zhì)中并向血管細胞提供增殖信號(2，3)。值得注意地，無纖連蛋白的小鼠在發(fā)育中因綜合缺陷而早期死亡，所述的綜合缺陷包括不適當(dāng)形成的脈管系統(tǒng)(6，7)。在實驗動物模型和在突變小鼠中的研究表明(x5[31整聯(lián)蛋白作為纖連蛋白的最重要受體在調(diào)節(jié)血管生成中發(fā)揮作用。這種整聯(lián)蛋白的胚性缺失誘導(dǎo)了早期及致死性間充質(zhì)異常，這包括新生脈管系統(tǒng)(8，9)的構(gòu)造缺陷和內(nèi)皮細胞體外形成脈管樣結(jié)構(gòu)的能力缺陷(IO，11)。(x5(31整聯(lián)蛋白的表達尤其與血管生成相關(guān)oc5pi整聯(lián)蛋白在靜止的內(nèi)皮中檢測不到，但是在應(yīng)答于血管生成生長因子(3,4)時體外表達或在生長的腫瘤的血管生成性脈管系統(tǒng)中體內(nèi)表達(12，20，21)。Kim等(3)可以證實小鼠抗a5(31整聯(lián)蛋白-功能阻斷性抗體IIA1在體內(nèi)抑制生長因子誘導(dǎo)的血管生成和腫瘤血管生成。研究當(dāng)a5|31整聯(lián)蛋白受拮抗時所轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號表明未結(jié)合的受體激活了PKA，后者隨后激活胱天蛋白酶3和8并且誘導(dǎo)凋亡(2，13)。已經(jīng)開展工作以制備小鼠抗體IIA1的人源化衍生物(BDPharmingen產(chǎn)品目錄號555614)。因此，產(chǎn)生了稱作M200的82%人/18%小鼠的嵌合IgG4單克隆抗體。此外，已經(jīng)產(chǎn)生M200的單價Fab-片段(稱作F200)并在用于黃斑變性的獼猴(cynomolgusmonkey)模型中成功測試。然而進一步試圖制備M200的完全人源化抗體衍生物則導(dǎo)致生物學(xué)活性的嚴重喪失(14)。在人類醫(yī)學(xué)中目前抗a5(31整聯(lián)蛋白的已知抗體如M200或F200的任何應(yīng)用存在誘導(dǎo)人患者中免疫原性人抗嵌合抗體(HACA)應(yīng)答的風(fēng)險。因此，本發(fā)明的目的旨在提供人抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體，其與現(xiàn)有抗體相比具有減少的免疫原性，同時保留靶特異性和高生物學(xué)活性及親和力。根據(jù)本發(fā)明，使用a5pl整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)染的細胞，通過噬菌體展示法從HuCAL-Gold抗體文庫分離Fab形式的全人抗體。這些抗體顯示高度的體外活性，同時因人類來源而可以在人患者中期望低的免疫原性。因此，本發(fā)明的第一方面是這樣的人抗體或人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其(i)以100nM并優(yōu)選以《10nM的親和力結(jié)合于oc5pi整聯(lián)蛋白并且(ii)體外和體內(nèi)地抑制表達a5pi整聯(lián)蛋白的細胞與其受體粘著。本發(fā)明的多肽是人抗體或人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"人抗體"涉及這樣的抗體分子，其具有基本上人的或全人的可變結(jié)構(gòu)域以及(若存在)人恒定結(jié)構(gòu)域。如本申請中所用，術(shù)語"人"涉及可以在人類個體中形成的或通過利用源于人類個體的共有序列形成的序列，例如，如Kabat等(l991)，SequencesofProteinsofimmunologicalInterest,第五版，NIH出版編號91-3242，美國衛(wèi)生和福利部，Washington,DC在相應(yīng)的摘要中描述那樣。術(shù)語"基本上人的"指可以不同于如Kabat所述的"全人"序列至多到l、2、3、4或5個氨基酸的序列。更具體地，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含免疫球蛋白重鏈(H)和輕鏈(L)中基本上或完全的人可變框架區(qū)。術(shù)語"人源化抗體"在本發(fā)明的含義中涉及這樣的抗體分子，其具有基本上小鼠的或全小鼠的可變結(jié)構(gòu)域和人的或基本上人的恒定結(jié)構(gòu)域，并且是>82%、優(yōu)選至少90%并且特別優(yōu)選至少98%人源的。術(shù)語"小鼠"如本申請中所用涉及在嚙齒動物個體中或通過利用源于嚙齒動物個體的共有序列形成的序列。術(shù)語"基本上小鼠的"指可以不同于"全小鼠"序列至多到1、2、3、4或5個氨基酸的序列。優(yōu)選地，抗體或其抗體片段是IgG抗體，例如人的或人源化的IgGl、IgG2、IgG3或lgG4抗體或其片段，例如Fab、Fab'或(Fab)2片段。然而，本發(fā)明也涉及具有人序列的重組抗體(例如單鏈(sc)抗體)或其片段，例如scFv片段。本發(fā)明的抗體或抗體片段含有特異性地相互作用于ot5pl整聯(lián)蛋白的一個或多個抗原-結(jié)合位點。優(yōu)選地，這種抗原結(jié)合特性通過組合可變重鏈(VH)區(qū)和可變的輕鏈(VL)區(qū)獲得。VH或VL區(qū)包括框架區(qū)(FR1、FR2、FR3和FR4)和介導(dǎo)抗原結(jié)合的CDR區(qū)(VH區(qū)的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3和VL區(qū)的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)。本發(fā)明的人抗體或人源化抗體或抗體片段優(yōu)選地具有針對a5(31整聯(lián)蛋白的親和力，其對應(yīng)于《100nM、優(yōu)選《10nM并最優(yōu)選《lnM的Kd惶，其中該親和力如實施例中所述通過在a5(31陽性人HUVEC細胞上的FACS滴定法或通過競爭BIAcore或競爭ELISA測量法確定。此外，本發(fā)明的多肽體外抑制表達a5pi整聯(lián)蛋白的人腫瘤細胞(例如Lozzio(1979)，LeukemiaResearch,3:363-370研究的K562細胞(ATCC登錄號CCL-243》的粘著，如實施例中所述。優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段在《10nM和優(yōu)選《5nM的濃度(1<:5())上顯示50°/。細胞粘著抑制。此外，本發(fā)明的多肽優(yōu)選地能夠誘導(dǎo)HUVEC細胞中的胱天蛋白酶活性。對應(yīng)于HUVEC生存力的IC5。值優(yōu)選地是《10nM，更優(yōu)選是《5nM，其中IC5。值(50。/。生存力)如實施例中所述確定。此外，本發(fā)明的多肽、抗體和抗體片段可以優(yōu)選地用于診斷并用于預(yù)防及治療腫瘤和癌癥，尤其結(jié)腸癌。所述的多肽、抗體和抗體片段可以與可檢測標(biāo)記基團(如放射性標(biāo)記基團、NMR、染料、酶和熒光標(biāo)記基團)綴合。放射性基團可以例如是I125、I"3或Y9。。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或抗體片段包含(a)VH區(qū)，其選自(iii)氨基酸序列SEQIDNO:1(MOR04624)、SEQIDNO:3(MOR04055)或所述VH區(qū)之一的至少一個H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3區(qū)，或(iv)通過改變至少一個H-CDR區(qū)而從(i)的序列衍生的氨基酸序列，和/或(b)VL區(qū)，其選自(v)氨基酸序列SEQIDNO:2(MOR04624)、SEQIDNO:4(MOR04055)或所述VL區(qū)之一的至少一個L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3區(qū)，或(vi)通過改變至少一個L-CDR區(qū)而從(i)的序列衍生的氨基酸序8列。特別優(yōu)選這樣的抗體或抗體片段，其包含通過H-CDR2區(qū)的隨機化而從如上所述的(a)(i)的VH區(qū)中衍生的VH區(qū)。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，抗體或抗體片段包含通過L-CDR3區(qū)的隨機化而從如上所述的(b)(i)的VL區(qū)中衍生的VL區(qū)。在又一個特別優(yōu)選的實施方案中，抗體或抗體片段包含通過抗體鏈的改組作用而從(a)(i)的VH區(qū)或和/或從(b)(i)的VL區(qū)衍生的VH區(qū)和/或VL區(qū)。H-CDR2和L-CDR3的亞文庫通過蛋白質(zhì)工程方法分別將H-CDR2和L-CDR3與人CDR庫交換而產(chǎn)生(17)。例如，抗體或抗體片段包含從如SEQIDNO.'l或SEQIDNO:2(MOR04624)中描述的VH和/或VL區(qū)所衍生的VL禾Q/或VH區(qū)。特別優(yōu)選這樣的多肽，包含(a)選自氨基酸序列SEQIDNO:5(MOR04971)、SEQIDNO:7(MOR04974)、SEQIDNO:9(MOR04975)、SEQIDNO:11(MOR04977)和SEQIDNO.11(MOR04985)的VH區(qū)，或所述VH區(qū)的至少一個H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3區(qū)，和/或(b)選自氨基酸序列SEQIDNO:6(MOR04971)、SEQIDNO:8(MOR04974)、SEQIDNO:10(MOR04975)、SEQIDNO:12(MOR04977)和SEQIDNO:14(MOR04985)的VL區(qū)，或所述VL區(qū)的至少一個L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3區(qū)。本發(fā)明多肽的具體實例如下抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:l的VH區(qū)和SEQIDNO:2的VL區(qū)(MOR04624)或其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:3的VH區(qū)和SEQIDNO:4的VL區(qū)(MOR04055)或其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區(qū)?？贵w或抗體片段，包含SEQIDNO:5的VH區(qū)和SEQIDNO:6的VL區(qū)(MOR04971)或其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區(qū)?？贵w或抗體片段，包含SEQIDNO:7的VH區(qū)和SEQIDNO:8(的VL區(qū)MOR04974)或其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3區(qū)?？贵w或抗體片段，包含SEQIDNO:9的VH區(qū)和SEQIDNO:10的VL區(qū)(MOR04975)或其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)?？贵w或抗體片段，包含SEQIDNO:ll的VH區(qū)和SEQIDNO:12的VL區(qū)(MOR04977)或其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)?？贵w或抗體片段，包含SEQIDNO:13的VH區(qū)和SEQIDNO:14的VL區(qū)(MOR04985)或其至少一個H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。本發(fā)明還涉及針對抗原上相同表位的抗體或抗體片段，如上文提及的優(yōu)選和/或舉例的抗體或抗體片段。所述多肽的VH和VL鏈包含以下區(qū)MOR04624、MOR04055和衍生物的VH鏈(根據(jù)(17)的編號方案)-框架1區(qū)從第1位氨基酸延伸至第30位氨基酸-CDRl區(qū)從第31位氨基酸延伸至第35位氨基酸-框架2區(qū)從第36位氨基酸延伸至第49位氨基酸-CDR2區(qū)從第50位氨基酸延伸至第65位氨基酸-框架3區(qū)從第66位氨基酸延伸至第94位氨基酸-CDR3區(qū)從第95位氨基酸延伸至第102位氨基酸-框架4區(qū)從第103位氨基酸延伸至第113位氨基酸MOR04624和衍生物的VLk1鏈(根據(jù)(17)的編號方案)-框架1區(qū)從第1位氨基酸延伸至第23位氨基酸-CDRl區(qū)從第24位氨基酸延伸至第35位氨基酸-框架2區(qū)從第36位氨基酸延伸至第50位氨基酸-CDR2區(qū)從第51位氨基酸延伸至第57位氨基酸-框架3區(qū)從第59位氨基酸延伸至第89位氨基酸-CDR3區(qū)從第90位氨基酸延伸至第98位氨基酸10-框架4區(qū)從第99位氨基酸延伸至第109位氨基酸MOR04055和衍生物的VLk1鏈(根據(jù)(17)的編號方案)-框架1區(qū)從第1位氨基酸延伸至第23位氨基酸-CDR1區(qū)從第24位氨基酸延伸至第35位氨基酸-框架2區(qū)從第36位氨基酸延伸至第50位氨基酸-CDR2區(qū)從第51位氨基酸延伸至第57位氨基酸-框架3區(qū)從第58位氨基酸延伸至第89位氨基酸-CDR3區(qū)從第90位氨基酸延伸至第98位氨基酸-框架4區(qū)從第99位氨基酸延伸至第109位氨基酸VH鏈和/或VL鏈的框架區(qū)可以通過交換一個或多個氨基酸例如1、2、3、4或5個氨基酸加以改變。例如，VLk1鏈的框架3區(qū)可以在MOR04624家族的成員中加以改變。優(yōu)選地，在Fab序列第85位置處的氨基酸是可交換的，以纈氨酸(MOR04624、MOR04985)交換成蘇氨酸(MOR04974、-75、-77)為特別優(yōu)選。此外，VH鏈的框架1區(qū)可以加以改變。在優(yōu)選的實施方案中，可以交換在每個VH-Fab序列第3位置處的氨基酸。特別優(yōu)選谷氨酰胺(q)交換成谷氨酸(e)，這可以例如在克隆期間進行。本發(fā)明的多肽適合用于治療或診斷用途，例如用于體外或體內(nèi)診斷用途。對于治療用途，抗體或抗體片段可以原樣使用。或者，多肽可以是帶有治療劑的綴合物形式，所述的治療劑例如選自放療劑或化療藥，例如低分子量或生物性細胞抑制劑或細胞毒性劑。所述治療劑可以根據(jù)己知方法綴合于抗體或抗體片段，優(yōu)選地經(jīng)共價連接與多肽的活性氨基、羧基、羥基和/或巰基綴合，任選地使用同雙官能性接頭或異雙官能性接頭。在其它實施方案中，此多肽可以是融合蛋白形式，所述的融合蛋白包含抗體或抗體片段結(jié)構(gòu)域和異源融合結(jié)構(gòu)域，例如細胞因子如IL-2、IL-12或TNF-ct。本發(fā)明抗體或抗體片段的其它治療相關(guān)性融合伴侶包括用以增加或減少免疫效應(yīng)細胞召集的工程化IgGFc部分、蛋白質(zhì)毒素如RNA酶或ETA、小藥物分子如美登素(maytansine)或auristatin衍生物、用于活化前體藥物的酶、帶有阻斷其它整聯(lián)蛋白功能的拮抗物的融合蛋白或帶有具備血管生成活性的酶如MMP-2或MMP-9的融合蛋白(15)。此外，融合蛋白可以是雙特異性抗體形式，所述的雙特異性抗體包含如上文所述的至少一個結(jié)合(x5j31整聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域和對其它抗原特異的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以針對用于診斷性和/或治療性放射性核素(例如ou卩或Y發(fā)射的放射性核素如^Y)的螯合劑、診斷性NIR(近紅外型)染料、治療活性染料、免疫效應(yīng)細胞(例如NK-細胞、細胞毒T-細胞或NKT-細胞)上的表面分子、功能性阻斷抗VEGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域和針對VEGF受體1、2與3及細胞因子(如白細胞介素)的功能性阻斷結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對于診斷用途，所述多肽可以是帶有可檢測標(biāo)記基團(例如用于體外或體內(nèi)診斷用途的標(biāo)記基團)的綴合物形式。例如，所述可檢測標(biāo)記基團可以選自放射性、NMR、染料、酶和熒光(例如NIR熒光)標(biāo)記基團。對于治療用途，將多肽優(yōu)選地配制成藥物組合物，所述的藥物組合物還可以包含其它活性成分和/或可藥用的載體、稀釋劑和/或輔藥。該藥物組合物包含治療活性劑量的活性成分，其中所述的治療活性劑量可以由技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法例如通過體外實驗或在動物模型中確定。該組合物優(yōu)選地通過輸注、注射或吸入加以施用?；钚猿煞值膭┝扛鶕?jù)疾病的類型及嚴重性和待治療患者的基本狀況確定。優(yōu)選地，治療組合物以幾個劑量經(jīng)至少2-4周時間施用。在這種情況下，參考用于施用抗體或抗體綴合物的已知方案(例如，如在FerraraNatureReviewsDrugDiscovery,第3巻，2004年5月，391-400和Salgaller，CurrentOpinioninMolecularTherapeutics,2003，5(6)，657-667描述)或參考用于施用藥用抗體如利妥昔單抗、阿侖珠單抗、英利昔單抗等的方案。此外，本發(fā)明涉及包含如上文所述的抗體或抗體片段作為診斷試劑的診斷組合物。該診斷組合物可以包含其它診斷可用的試劑、載體、稀釋劑和/或輔藥。該診斷組合物以足夠在相應(yīng)的測定模式(如在體內(nèi)或體外診斷性測定模式)中提供診斷性檢測的量包含所述多肽。該組合物可以用于"pi整聯(lián)蛋白相關(guān)性病癥中的治療性或診斷性用途。例如，這些病癥可以是過度增殖性疾病，例如與血管生成和/或轉(zhuǎn)移相關(guān)的病癥，尤其癌癥。可以由本發(fā)明組合物治療的癌癥包含全部種類的實體腫瘤，例如結(jié)腸、腎、肺、前列腺、乳腺、腦、胃、肝臟或皮膚的癌?；蛘?，該組合物可以用于治療與血管生成相關(guān)的血液性癌癥中。與新血管12形成相關(guān)的其它病癥包括，但不限于子宮內(nèi)膜異位、血管瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、炎性腸病、炎性CNS病、銀屑病、眼病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變或年齡相關(guān)性黃斑病和肥厚性瘢痕。在優(yōu)選的實施方案中，該組合物的抗血管生成活性不依賴生長因子。該組合物可以包含一種或幾種抗體或抗體片段，例如與(x5pi整聯(lián)蛋白的不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體或抗體片段的組合。該組合物也可以含有小分子藥物用于聯(lián)合療法。該組合物合適在人醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中使用。特別優(yōu)選在人類醫(yī)學(xué)中使用。此外，本發(fā)明涉及編碼如上文所述的抗體或抗體片段或融合多肽的核酸。此核酸可以例如是單鏈或雙鏈DNA或RNA。優(yōu)選地，該核酸有效地連接于提供在合適宿主細胞或宿主生物中表達的表達控制序列。該核酸可以存在于可導(dǎo)入宿主細胞或宿主生物中的載體或載體系統(tǒng)(即多種載體)內(nèi)。載體可以是適于原核細胞的原核載體，例如質(zhì)粒或噬菌粒。此外，載體可以是用于真核宿主細胞或宿主生物的真核載體，例如質(zhì)粒、人工染色體或病毒載體。合適載體例如在Sambrook(1989),MolecularCloning,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress禾口Ausubel(1989)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons中描述。本發(fā)明也指涉及用如上文所述核酸或載體轉(zhuǎn)化的細胞，例如原核細胞或真核細胞，如人細胞。此外，本發(fā)明涉及用如上文所述核酸或載體轉(zhuǎn)化的非人生物，例如轉(zhuǎn)基因動物，如轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括用于將外來核酸導(dǎo)入細胞或生物的全部方法，包括轉(zhuǎn)染法或感染法。多肽可以通過在這樣的條件下培養(yǎng)如上文所述的細胞或非人生物來制備，在所述條件下表達該多肽并回收表達的多肽，例如從細胞、細胞培養(yǎng)基、生物或該生物的分泌物中回收。此外，本發(fā)明將在以下附圖和實施例中詳細地說明。圖1A:FACS分析K562細胞的a5表達用功能阻斷性抗a5(31整聯(lián)蛋白小鼠單克隆抗體IIA1(14)證實人a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白在活K.562細胞的細胞表面上的表達。為此目的，使用如在MorphoSys提供的HuCALGOLD手冊中描述的標(biāo)準(zhǔn)FACS方法。圖1B:人結(jié)腸癌細胞系HT29不表達a5整聯(lián)蛋白鏈FACS分析表明HT29細胞不表達a5整聯(lián)蛋白鏈，其中(31鏈高密度地存在于該細胞表面上。出于該原因，HT29細胞非常適于用a5整聯(lián)蛋白鏈轉(zhuǎn)染。圖1C:人結(jié)腸癌細胞系HT29在用a5整聯(lián)蛋白cDNA轉(zhuǎn)染后表達a5pi整聯(lián)蛋白在用a5整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)染后，使用功能阻斷性小鼠抗人(x5pl整聯(lián)蛋白單克隆抗體IIA1作為參考，由FACS分析法證實a5pi整聯(lián)蛋白在HT29a5細胞表面上的均勻表達。圖2:抑制K562細胞對纖連蛋白包被的培養(yǎng)平板粘著:在功能阻斷性(IIAl)或非阻斷性(VC5)抗a5J31整聯(lián)蛋白小鼠單克隆抗體存在下孵育用鈣熒光素預(yù)載的K562-細胞。使用10mMEDTA確定K562-細胞與纖連蛋白發(fā)生整聯(lián)蛋白非依賴性背景結(jié)合。在BSA封閉的孔內(nèi)確定該測定法的整體背景，其中所述的孔不支持K562細胞對培養(yǎng)平板表面的粘著。將貼壁細胞(在洗滌后)裂解并測定熒光。圖3:Fab介導(dǎo)對K562細胞與纖連蛋白粘著的劑量依賴性抑制對抗人a5pi特異性Fab測試其抑制載有熒光染料的K562細胞與固定化纖連蛋白結(jié)合的能力。在粘著后，將細胞裂解并確定熒光，作為貼壁細胞的度量。單獨的纖連蛋白表現(xiàn)最大粘著，而在BSA包被的細胞上確定該測定法的整體背景。圖4:抗a5pi-功能阻斷性抗體在內(nèi)皮細胞中誘導(dǎo)凋亡使用在無血清內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中的HUVEC細胞確定單價形式的純化Fab對胱天蛋白酶3/7活化的誘導(dǎo)。使用市售的化學(xué)發(fā)光測定系統(tǒng)(CaspaseGlo，PROMEGA)根據(jù)制造商說明書測定胱天蛋白酶活性。圖5:Fab和IIA1的競爭FACS法FACS競爭法顯示MOR04624與參考抗體IIA1競爭HT29a5細胞上的表位?？梢缘贸龅慕Y(jié)論是這兩種抗體共有相似的表位，而全部其它Fab與(x5(31整聯(lián)蛋白上的不相關(guān)結(jié)合位點反應(yīng)(黑色線表示Fab結(jié)合，綠色線表示當(dāng)與參考抗體IIA1競爭時的Fab結(jié)合)。圖6:親和力成熟的抗ot5pi-功能阻斷性抗體強烈地在內(nèi)皮細胞中誘導(dǎo)凋亡使用在無血清內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中的HUVEC細胞確定單價形式的純化Fab對胱天蛋白酶3/7活化的誘導(dǎo)。使用市售的化學(xué)發(fā)光測定系統(tǒng)(CaspaseGlo，PROMEGA)根據(jù)制造商說明書測定胱天蛋白酶活性。圖7:親和力成熟的抗a5pi-功能阻斷性Fab抗體抑制內(nèi)皮細胞增殖將貼壁的HUVEC細胞在無血清內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中于所示量的純化Fab或參考抗體IIA1存在下孵育48小時。用市售XTT測定法根據(jù)制造商說明書確定正在增殖的細胞。測定ICso值并匯總于表4。圖8:HUVEC粘著測定法中的優(yōu)化IgG:通過(x5pi功能阻斷性IgG抗體抑制HUVEC細胞對纖連蛋白的粘著。IgGMOR04974、MOR04975、MOR04977、MOR04985以相似于IIA1的IC50阻斷粘著。從Fab至IgG的轉(zhuǎn)變引起大約2倍改善。圖9:HUVEC生存力測定法-對抗a5pi整聯(lián)蛋白IgG的分析通過cc5卩l(xiāng)功能阻斷性IgG抗體抑制HUVEC細胞的生存力。將HUVEC細胞鋪在纖連蛋白包被的平板內(nèi)，與遞增濃度的IgG抗體孵育并且在48小時后測量存活。IgGMOR04974、MOR04975、MOR04977、MOR04985以相似于IIA1的IC5。阻斷粘著。從Fab至IgG的轉(zhuǎn)變引起大約2倍改善。圖10:對抗a5pi整聯(lián)蛋白IgG的HUVEC胱天蛋白酶測定法使用在無血清內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中的HUVEC細胞確定由ct5pi功能阻斷性IgG抗體對胱天蛋白酶3/7活化的誘導(dǎo)。使用市售的化學(xué)發(fā)光測定系統(tǒng)(CaspaseGlo，PROMEGA)根據(jù)制造商說明書測定胱天蛋白酶活性。MOR04974、MOR04975、MOR04977和MOR04985具有相似于參考抗體IIA1的活性。圖11:親和力成熟的Fab特異性地從表面生物素化細胞裂解物中沉淀a5(51整聯(lián)蛋白HT29a5和HT29wt的表面生物素化NP40-裂解物與偶聯(lián)至Dyna珠的Fab孵育。將免疫沉淀物轉(zhuǎn)移至PVDF膜并用鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶(AP)分析。全部Fab特異性地從HT29a5裂解物中沉淀出與參考抗體IIA1預(yù)期大小相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)，而在HT29wt裂解物中檢測不到任何蛋白質(zhì)。無關(guān)FabMOR03207沒有特異性地沉淀出任何蛋白質(zhì)。圖12:抗a5JJl整聯(lián)蛋白IgG(實例MOR04974)對HT29-wt和HT29a5(FACS測量法)的結(jié)合特異性親和力成熟的IgG抗體以10ng/mL與5xl()S個HT29wt和HT29a5細15胞孵育。用Cy3標(biāo)記的第二抗體檢測特異性結(jié)合的抗體。上半部分與HT29wt(左)或HT29a5細胞(右)孵育的IIA1，下半部分IgGlMOR04974。熒光遷移表示與ot5整聯(lián)蛋白的特異性結(jié)合并且以MOR04975、MOR04977、MOR04985和MOR04624找到這種熒光遷移?？贵w同種型對照呈陰性(黑色線)。我們的抗整聯(lián)蛋白抗體以與參考抗體IIA1相同的特異性結(jié)合于ot5-鏈轉(zhuǎn)染的細胞。圖13:抗a5pi整聯(lián)蛋白IgG(實例MOR04974)與IIA1在HT29a5細胞上的競爭結(jié)合作用(FACS測量法)。抗a5(51整聯(lián)蛋白IgG與IIA1競爭重疊表位自產(chǎn)的抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體以1^g/mL與5xl()S個HT29a5細胞孵育，其中所述的HT29a5細胞與或不與20pg/mLIIAl預(yù)孵育。通過用山羊-抗小鼠-FITC的檢測證實存在IIA1結(jié)合作用(左半部分)。通過用羊-抗人-FITC第二抗體的檢測證實人抗體(MOR04974)的結(jié)合及競爭(右半部分)。本實施例顯示MOR04974的競爭作用。以MOR04975、MOR04977、MOR04985、MOR04624得到相同結(jié)果。圖14:在管形成測定法中分析IgGl抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體(實例MOR04974)。親和力優(yōu)化的抗a5pl整聯(lián)蛋白IgGl抗體如IIA1—樣高效地阻斷管形成將低代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC#2519)以60-80%融合收獲并且將2xl04個細胞接種在EBM-2培養(yǎng)基(Clonetics弁CC3156)中的含有基質(zhì)膠(BectonDickinson#354234)的孔內(nèi)。15分鐘后添加抗體并且允許管形成在37°C進行18-24小時。隨后將細胞固定(4%福爾馬林)、透化、封閉并用抗CD31染色?？贵w以6nM、3nM、600pM、300pM和60pM施加。代表性圖像顯示的是在300pM上的該效應(yīng)。A:未處理的樣本，B:人IgGl抗溶菌酶MOR03207,C:IgGlMOR04624，D:IgGlMOR04974，E:IIAl，F(xiàn):小鼠IgGl。對MOR04975和MOR04977也得到相同結(jié)果。圖15:親和力優(yōu)化的抗a5pi整聯(lián)蛋白IgG抗體在跨孔移行測定法中的活性移行測定法在96-孔跨孔移行微量平板(8pm孑L，#351163Falcon/BD)中進行，以纖連蛋白作為唯一刺激物。Fluoroblok膜的底面用纖連蛋白在37°C包被1小時并用2%BSA在37°C封閉30分鐘。使用含有0.1%BSA的人內(nèi)皮無血清培養(yǎng)基(Iiwitrogen)作為在上半腔室和下半腔室中的移行緩沖液?？筧5|31整聯(lián)蛋白抗體(0.6-10嗎/mL)添加至各孔的上半腔室，添加低代HUVEC(2X104講且使細胞移行在37°C進行4小時。對所述膜底面上的移行細胞隨后進行鈣熒光素染色并且產(chǎn)生的熒光用PerkinElmer1220Victor計數(shù)儀在485nm激發(fā)和535nm發(fā)射處確定。A:所示圖像在10i!g/mL抗體濃度上獲得。MOR04974、MOR04975、MOR04977如IIA1—樣高效地抑制HUVEC移行。B:MOR04974、-75、-77(IgG4-Pro抗體同種型)的抗移行活性的劑量反應(yīng)。IC5。(MOR04974:l昭/ml，MOR04975:1.5jag/ml，MOR04977:l^g/ml,IIA1:2(xg/ml)。圖16:親和力優(yōu)化的IgGl抗ix5pi整聯(lián)蛋白抗體在結(jié)腸癌組織上的IHC染色模式放大率10X，在結(jié)腸癌的系列組織切片上滴定生物素化抗體。用鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶實行檢測。作為一個實例，顯示了用濃度2.5ng/mL獲得的免疫組織化學(xué)切片。對于IIA1和MOR04974，找到了微小至中等大小的血管和基質(zhì)區(qū)室。黑色箭頭表示用這兩種抗體染色的相同血管。對MOR04975和MOR04977觀察到相似的染色模式。藍色箭頭表示染色的血管?？梢缘贸龅慕Y(jié)論是優(yōu)化的抗a5|31整聯(lián)蛋白抗體顯示與IIA1相當(dāng)?shù)娜旧Ｊ健D17:親和力優(yōu)化的抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體(IgG4-Pro)的腫瘤導(dǎo)向作用抗a5pl整聯(lián)蛋白抗體用碘-125放射性標(biāo)記(l分鐘，四氯二苯基苷脲法)。測定剩余的免疫反應(yīng)性是75-80%并且將3嗎標(biāo)記抗體注射至HT29a5異種移植的裸鼠中。丄IgGlMOR04974、MOR04975和對照(參考抗體IIA1和抗溶菌酶MOR03207)的腫瘤攝取，IgGlMOR04977和對照的腫瘤攝取?？筧5(31整聯(lián)蛋白抗體的抗體攝取與IIA1相似并且與無關(guān)IgGlMOR03207相比顯著較高。從該結(jié)果得出的結(jié)論是抗a5J31整聯(lián)蛋白抗體特異性地耙向a5(31整聯(lián)蛋白陽性的HT29a5異種移植物。圖18:在血管生成作用3D體內(nèi)球狀體替代模型中分析優(yōu)化的抗a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白IgG抗體將含有限定數(shù)目的內(nèi)皮細胞以及VEGF和FGF2的球狀體的基質(zhì)膠塞皮下植入SCID小鼠中。在用優(yōu)化的人抗a5(31整聯(lián)蛋白抗體和對照抗體處理后，分析帶有小鼠脈管系統(tǒng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的EC出芽和血管形成。人IgGMOR04974和MOR04975與IIAl—樣有效。本發(fā)明進一步在實施例中說明。然而，以下實施例不理解為是限制性的。實施例1.功能阻斷性抗cx5pi整聯(lián)蛋白抗體的產(chǎn)生1.1篩選策略小鼠單克隆抗體IIA1與(x5(31整聯(lián)蛋白的構(gòu)象表位結(jié)合，該表位僅存在于激活的活(內(nèi)皮)細胞上。為涵蓋選擇性和功能活性，建立這樣的篩選途徑用以鑒定Fab形式的-HuCAL⑧GOLD衍生的前導(dǎo)抗體候選物，其中所述的篩選途徑由在分離的抗原和表達抗原的細胞上交替淘洗聯(lián)合基于細胞的功能性篩選測定法組成1.使用HuCAL-Gold文庫(MorphoSys)，通過噬菌體展示法選擇抗a5|31整聯(lián)蛋白結(jié)合性Fab抗體片段。淘洗實驗在分離的抗原和表達抗原的細胞上進行。基于最佳抗體克隆的氨基酸序列，使用人CDR序列，通過VL-CDR3或VH-CDR2的隨機化作用產(chǎn)生亞文庫并且在進一步淘洗實驗中從所述亞文庫選擇出更高級的結(jié)合物。其它克隆通過將含有目的VL-CDR3和VH-CDR2的輕鏈及重鏈組合克隆在一個抗體分子中獲得("X-克隆作用")。2.如下進行對富集的Fab-抗體的篩選。在(x5pi整聯(lián)蛋白陽性及(x3pi整聯(lián)蛋白陰性細胞上對全部淘洗實驗的結(jié)合物測試ELISA結(jié)合作用。隨后進一步在FACS實驗中在a5-過量表達的細胞和a5-陰性細胞上分析ELISA陽性克隆的細胞結(jié)合作用。隨后在功能性測定法中對合適的克隆分析i)細胞與纖連蛋白粘著，ii)誘導(dǎo)HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細胞)和/或HDMVEC(人真皮血管內(nèi)皮的細胞)凋亡，iii訴參考抗體IIA1的親和力測量法及FACS競爭測定法和iv)物種交叉反應(yīng)性。1.2工具生成和測定法開發(fā)a5整聯(lián)蛋白鏈cDNA人a5-鏈的cDNA從RZPD(IMAGE-ID6821577)購買并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法克隆到pcDNA3表達載體(INVITROGEN)。純化的整聯(lián)蛋白受體去垢劑增溶的人整聯(lián)蛋白受體a5pi(ChemiconCC1052)和a3f31(ChemiconCC1092)從CHEMICONINTERNATIONAL(Temecula，CA，USA)購買。對于固相噬菌體展示法、ELISA和BiaCore測定法而言，通過非變性SDS-PAGE選出具有至少90%純度的整聯(lián)蛋白批次。細胞系人慢性粒細胞白血病細胞系K562(ATCC登錄號CCL-243)對纖連蛋白的粘著僅由(x5|31整聯(lián)蛋白介導(dǎo)(16)。該細胞系用在纖連蛋白介導(dǎo)的粘著測定法中用于初始的功能性篩選。使用檢測抗體IIA1，通過FACS分析法證實a5(31整聯(lián)蛋白的存在(圖1A)。差異性細胞淘洗策略的前提是存在一種模型系統(tǒng)，其中目的靶過量表達于靶-陰性細胞系上。為此目的，己經(jīng)選擇到表達(31整聯(lián)蛋白鏈而不表達a5-鏈的人結(jié)腸癌細胞系HT29(ATCC登錄號HTB-38)(圖1B)。使用Lipofectamine根據(jù)制造商說明書，將a5-鏈的cDNA轉(zhuǎn)染至親代HT29-細胞。使用用以特異性地標(biāo)記表面表達的a5pi整聯(lián)蛋白的小鼠單克隆抗體IIA1，通過FACS篩選法選擇出過量表達a5的穩(wěn)定克隆(圖1C)。粘著測定法使用僅表達人a5(31整聯(lián)蛋白的K562細胞系建立用于功能性篩選的敏感粘著測定法。為此目的，用l嗎/ml人纖連蛋白或BSA作為非黏附性底物包被96孔平板，以確定該測定法的整體背景。因為整聯(lián)蛋白對ECM分子的粘著依賴C^VMg^的存在，故使用10mMEDTA來確定對纖連蛋白的不依賴整聯(lián)蛋白的背景結(jié)合。使用功能阻斷性抗體IIA1作為參考物并且非阻斷性抗a5pi整聯(lián)蛋白小鼠單克隆抗體(VC5)充當(dāng)陰性抗體對照。如所期望，EDTA、IIA1(5ng/ml)和BSA包被作用均抑制K562介導(dǎo)的粘著結(jié)合，而VC5(5嗎/ml)不干擾細胞粘著(圖2)。1.3抗體噬菌體展示和淘洗策略根據(jù)文獻中所述的方案(17-20)，以HuCAL-GOLD文庫開展用以鑒定全人抗(x5(31整聯(lián)蛋白抗體的抗體噬菌體展示法。應(yīng)用以下淘洗策略并平行進行(表1)淘洗次級編號第一輪第二輪第三輪1298.1-3(x5|31整聯(lián)蛋白固相ct5pl整聯(lián)蛋白固相a5|31整聯(lián)蛋白固相1298.4-6ct5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白固相K562細胞a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白固相1299.1-3K562細胞a5(31整聯(lián)蛋白固相K562細胞1321.1-3cx5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白固相HT29a5細胞a5j31整聯(lián)蛋白固相1322.1-3HT29a5細胞p.a.HT29wta5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白固相HT29a5細胞1322.4-6HT29a5細胞p.a.HT29wtHT29a5細胞p.a.HT29wtHT29a5細胞1324.1-3HDMVECa5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白固相HDMVEC1369.1-2a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白固相HT29a5細胞p,a.HT29wtx5J31整聯(lián)蛋白固相1371.1-2HT29a5細胞p.a.HT29wta5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白固相HT29a5細胞p.a.HT29w表l:淘洗方法概覽p.a:用HT29wt吸附后(以減少非特異性細胞表面結(jié)合)結(jié)果在淘洗1298-1324期間，篩選出幾千個克隆。盡管應(yīng)用多種展示策略，然而反復(fù)分離到在ELISA和FACS中呈選擇性的一個克隆(MOR04055)。除了明顯結(jié)合至免疫優(yōu)勢表位的MOR04055之外，還鑒定到4個額外克隆(MOR04139、04141、04160、04568)。為進一步提高選擇到更多樣和更特異的整聯(lián)蛋白結(jié)合物的幾率，進行額外的兩次淘洗(1369.1-2和1371.1-2)。這里，在噬菌體展示期間添加10[igZmlMOR04055-Fab以便抑制占優(yōu)勢的克隆MOR04055富集。盡管存在Fab競爭，經(jīng)淘洗1369所找到的全部特異性結(jié)合物還是MOR04055。在淘洗1371中，鑒定到一個額外的單獨結(jié)合物(MOR04624)。1.4功能性測試Fab-抗體粘著測定法從第一淘洗方法獲得的抗體根據(jù)它們在預(yù)篩選實驗中的功能阻斷效力進行如下排序MOR04624>MOR04055>MOR04141=MOR04568=MOR04160。MOR04139具有輕度抑制性，但未達到50%抑制?？贵w在K56220粘著測定法中在不同濃度下的劑量依賴性再測試證實了預(yù)篩選實驗的結(jié)果，不過存在一個例外MOR04139未顯示任何劑量依賴性抑制。未進一步研究該抗體(圖3)。誘導(dǎo)凋亡進一步評估從第一淘洗方法所獲得抗體的凋亡誘導(dǎo)特性。因而將96孔平板用0.2嗎/ml和0.4(ag/ml纖連蛋白在37。C包被1小時并用2。/。BSA封閉。1><104個HUVEC細胞與各自抗體在用于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基(Gibco)中一起孵育。在18小時后，將胱天蛋白酶3/7測定試劑盒根據(jù)制造商所述的方法(CaspaseGlo3/7;Promega)用于細胞裂解并定量胱天蛋白酶活性。在100lag/ml濃度上，單價FabMOR04055和04624在HUVEC細胞中誘導(dǎo)與10昭/ml上的雙價參考IgGIIA同樣強烈的胱天蛋白酶3/7活性(圖4)。全部其它Fab在本測定法中是陰性的。通過FACS滴定法的親和力測量為在天然a5pi.整聯(lián)蛋白上分析結(jié)合效能，通過FACS滴定法在a5|31-陽性HUVEC細胞上測試全部抗體(表2)。MOR04055具有最高結(jié)合親和力(0.9nM)并且其二聚體IgG形式的結(jié)合親和力增加。對于MOR04624，發(fā)現(xiàn)單價Fab的KD處在低的納摩爾范圍內(nèi)，并且其二聚體IgG的KD增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表2:通過FACS滴定法確定單價Fab和IgG親和力的結(jié)果。Fab和IIAl的競爭FACS為研究Fab抗體是否與IIAl共有相同的表位，將HT29a5細胞僅與0.5(ig/mlFab孵育或還與10(ig/mlIIAl—起孵育。以用于FACS分析的山羊抗人Fab-特異性-PE綴合物檢測與細胞結(jié)合的人Fab。圖7顯示僅Fab染色(黑色線)和Fab+IIA1(綠色線)的疊加。作為結(jié)果，添加IIAl導(dǎo)致MOR04624的染色強度明顯降低。全部其它Fab不受IIAl影響。該結(jié)果表明IIAl與MOR04624相互競爭結(jié)合至相同或重疊的表位上，而其它4種Fab結(jié)合至不相關(guān)的表位上。1.5親和力-成熟對Fab和IgG抗體的分析FabMOR04055和04624接受一輪親和力成熟處理。因此，通過VL-CDR3或VH-CDR2的隨機化作用(17)從親代Fab中構(gòu)建亞文庫并在純化的015(31和HT29a5細胞上進行噬菌體展示選擇。將這種篩選法的陽性結(jié)合物在粘著測定法中在HT29a5細胞上進一步分析并根據(jù)其抑制活性排序。發(fā)現(xiàn)MOR04624的衍生物具有最佳抑制效能。MOR04055、MOR04568、MOR04141的衍生物僅顯示中等的抑制改善或不顯示顯著抑制改善?；谶@些克隆的重鏈和輕鏈，克隆VL-CDR3和VH-CDR2的12種新組合用于進一步優(yōu)化(所謂的"X-克隆作用")。將最佳抑制性克隆和來自X-克隆作用的克隆表達并純化并且進行體外比較，從而逐步鑒定出具有改善的功能阻斷性活性的7種強化的獨特結(jié)合物用于進一步詳細分析(MOR0497K-72、-74、-75、-77、-85、-87)。誘導(dǎo)凋亡在HUVEC細胞上的體外凋亡誘導(dǎo)作用通過胱天蛋白酶活性和細胞存活測量(圖6和圖7)。在這兩種測定法中，單價FabMOR04974、04975和04977的效力與雙價小鼠單克隆參考抗體IIA1是可比的。IC50Og/ml)IC50(nM)IIA10.050.3MOR0462411.25225.0MOR049850.091.8MOR049870.122.4MOR049770.091.9MOR049750.091.8MOR049740.061.2MOR040551.8737.3MOR049710.214.3MOR049720.6713.3表3:Fab抗體在XTT-增殖測定法中的ICso值22與親代Fab相比，親和力成熟的抗體得以明顯改善(至多到190倍)。單價Fab抑制增殖作用的效率比雙價參考抗體IIA1低四倍。免疫沉淀法為證實Fab抗體的特異性，表面生物素化HT29a5和HT29wt細胞的NP-40裂解物與偶聯(lián)至Dyna磁珠的Fab孵育。使用IIA1作為參考抗體。在密集洗滌后，將沉淀物在還原條件下在DS-PAGE樣本緩沖液中煮沸，印跡至PVDF-膜上并用鏈霉抗生物素-AP探測。全部抗oi5|31整聯(lián)蛋白抗體特異性地沉淀出約135kDa的蛋白質(zhì)雙條帶，其對應(yīng)于整聯(lián)蛋白鏈a5和(31的預(yù)期分子量(圖ll)并且在HT29wt細胞裂解物中未找到。用IIA1找到相同的雙條帶。使用無關(guān)FabMOR03207作為陰性對照并且未沉淀出所述雙條帶。該結(jié)果證實了Fab抗體的高度特異性。HUVEC粘著測定法中優(yōu)化的IgG為研究上文所述Fab抗體的體外效能是否在二聚體形式下進一步得以改善，將所述抗體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使用MorphoSysHuCALIgG載體試劑盒(MorphoSysAG，Munich;Germany)轉(zhuǎn)化成完整的IgGl分子并通過HUVEC粘著測定法(圖8)、HUVEC生存力測定法(圖9)和HUVEC凋亡測定法(圖IO)分析，以與參考抗體IIA1比較。最重要地，在每個實驗中包含IIA1作為參考點。在此方面，MOR04974、-75及-77的IgG轉(zhuǎn)化產(chǎn)生與IIA1具有極相似IC5()的HuCALIgG，這表明與單價Fab形式相比，轉(zhuǎn)化的確導(dǎo)致約2倍的改變。HUVEC生存力測定法中優(yōu)化的IgG觀察到在IgG轉(zhuǎn)化后，5種結(jié)合物與Fab形式相比具有約2倍改善的IC50值。MOR04974、-75和-77在降低HUVEC生存力方面顯示與參考IgGIIA1極相似的效力。HUVEC凋亡測定法中優(yōu)化的IgG從胱天蛋白酶3/7測定法內(nèi)對前導(dǎo)IgG的分析中，可以得出結(jié)論MOR04974、-75和-77與參考抗體IIA1可比較地良好誘導(dǎo)凋亡。1.6對親和力優(yōu)化的抗整聯(lián)蛋白IgG抗體的詳細分析親和力優(yōu)化的抗整聯(lián)蛋白抗體的特異性通過FACS分析在HT29wt與HT29a5細胞上測試IgGl形式的親和力成熟抗體的結(jié)合特異性。HT29wt細胞是a5-陰性的，但的確含有pi整聯(lián)蛋白鏈。HT29a5而非HT29wt細胞特異性地由IgGl-抗整聯(lián)蛋白抗體和參考抗體IIA1識別，如熒光遷移所示(圖12)。非特異性抗體同種型對照不與此細胞結(jié)合并且未觀察到所測量熒光的遷移。這些實驗顯示前導(dǎo)候選抗體特異性地識別(x5整聯(lián)蛋白并以與參考抗體IIA1相同的特異性發(fā)生結(jié)合?？筼6pi整聯(lián)蛋白抗體的表位特異性在親和力成熟和再克隆成IgG形式后仍保留已經(jīng)通過FACS競爭實驗證實Fab抗體MOR04624及其衍生物與參考抗體IIA1競爭結(jié)合至重疊表位上。在轉(zhuǎn)化成IgGl形式后，再次測試抗a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白抗體與IIA1的結(jié)合競爭作用。IgGl抗a5JM整聯(lián)蛋白抗體MOR04974、-75、-77、-85和MOR04624對HT29a5細胞的結(jié)合導(dǎo)致熒光遷移，其中所述的熒光遷移在細胞與IIA預(yù)孵育時受到完全抑制。該結(jié)果證實IIA1與IgGl抗a5(31整聯(lián)蛋白抗體的表位競爭作用(圖13)。在管形成血管生成測定法中對抗a5pi整聯(lián)蛋白IgGl抗體的定性分析將阻斷活化的內(nèi)皮細胞新形成血管視為抗a5f31整聯(lián)蛋白抗體的關(guān)鍵抑制活性之一。為充分表征，在HUVEC管形成測定法中，與參考抗體IIA1相比而分析親和力優(yōu)化的IgGl抗oc5pi整聯(lián)蛋白抗體。在本測定法中，2X1()4個人臍靜脈內(nèi)皮細胞(UVEC#2519，Promocell)接種在EBM-2培養(yǎng)基(Clonetics弁CC3156)中的生長因子豐富基質(zhì)膠(BectonDickinson#354234)上。15分鐘后添加抗體(6nM、3nM、600pM、300pM、60pM)并且允許管形成在37°C進行18-24小時。隨后將細胞固定并用抗CD31染色用于管形成的光記錄對孔內(nèi)形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的肉眼分析揭示出全部MOR04624衍生性抗a5|31整聯(lián)蛋白抗體均具有管形成阻斷活性，它們的效能與參考抗體相似(圖14)。在高濃度上，對人和小鼠IgGl同種型對照也發(fā)現(xiàn)管形成的抗體阻斷作用。然而，在較低的抗體濃度(下降至300pM)上，觀察到活性窗口，在其中管形成僅在用特異性抗體處理的孔內(nèi)被阻斷，而在未處理的孔或用抗體同種型對照或弱功能阻斷性抗體MOR04624處理的孔內(nèi)則不被阻斷。在移行測定法中對抗a5pi整聯(lián)蛋白IgG抗體的分析在血管生成過程期間，活化的內(nèi)皮細胞在主要由纖連蛋白(FN)組成的血管生成特異性臨時基質(zhì)上向血管生成刺激物移行。我們在跨孔移行測定法中分析了優(yōu)化的抗(X5J31整聯(lián)蛋白IgG抗體并對全部抗oi5|31抗體觀察到a5卩l(xiāng)-纖連蛋白依賴性HUVEC移行的阻斷活性，其中所述的抗(x5(31抗體具有與IIA1相同數(shù)量級別的效力(l-10嗎/ml)(圖15)。抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體的反應(yīng)性在腫瘤和內(nèi)皮細胞系上的反應(yīng)性通過FACS結(jié)合實驗在多種內(nèi)皮和腫瘤細胞系上測試抗oc5(31整聯(lián)蛋白抗體的反應(yīng)性(表4)。觀察到與全部受測試內(nèi)皮和腫瘤細胞系的結(jié)合作用，除了已知為(x5-鏈陰性的HT29wt細胞外。與參考抗體IIA1相比，前導(dǎo)候選抗體同等地充分接合于全部受測試細胞系并且所得的熒光遷移對于全部抗體是相似的。同種型對照抗體不結(jié)合?？偠灾?，抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體在FACS細胞結(jié)合實驗中顯示與IIA1同等的反應(yīng)性。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>抗抗體在正常組織切片和腫瘤組織切片上的反應(yīng)性-免疫組織化學(xué)在免疫組織化學(xué)實驗中在不同組織上分析了親和力優(yōu)化的抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體并且所述抗整聯(lián)蛋白抗體在相應(yīng)組織上的特異反應(yīng)性與IIA1的染色極為相似。總而言之，可得出結(jié)論我們的抗a5(31整聯(lián)蛋白抗體顯示與IIA1可比較的染色模式(圖16)。親和力優(yōu)化的抗a5pi整聯(lián)蛋白IgG抗體的體內(nèi)表征體內(nèi)靶向作用在異種移植的裸鼠中的證實與IIA1相比，在攜帶HT29a5細胞的異種移植物的裸鼠中比較優(yōu)化的抗a5(31整聯(lián)蛋白抗體的體內(nèi)靶向特性。優(yōu)化的抗a5|31整聯(lián)蛋白抗體(IgG4-Pro)的放射性標(biāo)記根據(jù)四氯二苯基苷脲法用碘-125依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進行1分鐘。在細胞結(jié)合測定法("Lindmo測定法")中測量免疫反應(yīng)性。50ng放射性標(biāo)記的抗體與遞增數(shù)目(0.25-10Mio)的a5(31整聯(lián)蛋白陽性細胞在4°C孵育2小時。隨后洗滌細胞并在閃爍計數(shù)儀中確定結(jié)合的放射性活性。將總計數(shù)/結(jié)合計數(shù)的商對細胞數(shù)目的倒數(shù)作圖并且數(shù)據(jù)用非線形回歸模型擬合。從與Y軸的交叉中計算在無限抗原密度下的剩余免疫反應(yīng)性并且發(fā)現(xiàn)它對于全部抗a5(31整聯(lián)蛋白抗體是75-80%。除MOR04975之外，對于全部所分析抗體而言，人抗a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白抗體從24小時范圍內(nèi)以H(P/。ID/g聚集至HT29a5異種移植物，持續(xù)96小時，其中所述的MOR04975在48小時后迅速下降至72小時后小于5%ID/g。MOR04974在48小時后以18%ID/g達到其峰值并且MOR04977在72小時后以18%ID/g達到其峰。相比之下，小鼠IIA1抗體從24小時范圍內(nèi)以>10%ID/g聚集在HT29a5異種移植物處，持續(xù)至多到96小時。對于非特異性抗溶菌酶抗體MOR03207，在任何時間點上存在小于3。/。ID/g。從這些結(jié)果中，可以得出結(jié)論對a5!31陽性HT29a5異種移植物存在特異性靶向作用?？筧5pl整聯(lián)蛋白抗體MOR04974和MOR04977的體內(nèi)靶向作用與IIA1相似并且在單個時間點上甚至優(yōu)于IIA1。來自血管生成替代動物模型的抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體的體內(nèi)效力作為參考抗體IIA1，抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體不與小鼠及大鼠的a5pi整聯(lián)蛋白交叉反應(yīng)。因此，在動物模型中分析體內(nèi)治療效力和證實特異性體27內(nèi)血管生成效果是困難的并且這些分析不得不在血管生成的替代模型中進行?？筧5(31整聯(lián)蛋白IgG抗體與IIAl的體內(nèi)比較已經(jīng)在血管生成作用3D體內(nèi)球狀體替代模型中進行(圖18)。對于此模型，限定內(nèi)皮細胞數(shù)目的球狀體與膠原混合，其中使所述的膠原在24孔平板中聚合。位于含有VEGF和FGF2的基質(zhì)膠塞中的EC球狀體隨后皮下置入SCID小鼠，在此處受刺激的EC形成人毛細血管的復(fù)雜三維網(wǎng)絡(luò)，其與小鼠脈管系統(tǒng)吻合。每周給予抗a5pi整聯(lián)蛋白抗體(200嗎)兩次，持續(xù)3周。在第21日終止該研究，取出基質(zhì)膠塞并檢驗血管密度。就參考抗體IIA1而言，用優(yōu)化的抗a5pl整聯(lián)蛋白IgG抗體MOR04974和MOR04975的處理降低基質(zhì)膠塞中微血管密度達系數(shù)每平方毫米2至大約20條微血管，而用無關(guān)人抗溶菌酶抗體MOR03277的處理導(dǎo)致每平方毫米約40條微血管。基于這個結(jié)果，可以得出結(jié)論即優(yōu)化的人抗a5(31整聯(lián)蛋白抗體MOR04974和MOR04975在血管生成作用3D體內(nèi)球狀體替代模型中具有與IIA1可比較的體內(nèi)抗血管生成效力。結(jié)論在體外實驗中，對MOR4974、-75、-77始終發(fā)現(xiàn)了在Fab形式以及IgGl形式下的最佳抑制特性。全部三種IgG與參考mAbIIAl是可比較的。這些結(jié)合物是MOR04624的衍生物。在體內(nèi)實驗中，證實全人的且優(yōu)化的IgGMOR04974、-75、-77高效地靶向裸鼠中及血管生成作用3D球狀體模型中的腫瘤異種移植物。MOR04974和MOR04975與參考抗體IIA1—樣有效。28以上抗體的V鏈的氨基酸序列示于表4親代MOR04624最終WgGlKVH-h-IgGl-載體VL-h-K-載體MOR04990MOR04991MOR04989MOR04624MOR04974MOR04985MOR04975MOR04985MOR04977MOR04987MOR04985MOR04985MOR04624VLk(SEQIDNO:1)diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapk出yaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfavyycqqysdqsytfgqgtkveikrtVH(SEQIDNO:2)qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvssisysdsntyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghfihglsgifdywgqgtlvtvssMOR04055VL入3(SEQIDNO:3)dieltqppsvsvapgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedeadyycgs"ltntasvfgggtkltvlgVH3(SEQIDNO:4)qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsrisysgsdtyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvssMOR04971VL入3(SEQIDNO:5)dieltqppsvsv3pgqtariscsgdsigeqyahwyqqkpgqapvlviyddnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqaedeadyycss^tyssdasvfgggtkltvlgVH3(SEQIDNO:6)qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnyamnwvrqapgkglewvsaihdnghtyypdsvkgrftisrdnskntiylqmnslraedtavyycaregefgfmystlvfdswgqgtlvtvssWIOR04974VLk(SEQIDNO:7)diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyasprqtfgqgtkveikrtVH(SEQIDNO:8)qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvssVLk(SEQIDNO:9)pedfatyycqqyefgiqtfgqgtkveikrtVH(SEQIDNO:10)qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvr卩apgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvssMOR04977VLk(SEQIDNO:11)diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnfnwyqqkpgkapkfliyaasnlqsgpsrfsgsgsgWftlti'sslqpedfatyycqqyss叩qtfgqgtkveikrtVH(SEQIDNO:12)qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsfiepkwrggathyaasvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgi,dywgqgtlvtvssMOR04985VLk(SEQIDNO:13)diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgissnlnwyqqkpgkapklliyaasnlqsgpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfavyycqqysdqsytfgqgtkveikrtVH(SEQIDNO:14)qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssygmswvrqapgkglewvsgirakqsgyatdyaapvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarglgdyghhhglsgifdywgqgtlvtvss2.結(jié)論抗a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白功能阻斷性抗體僅在嵌合抗體形式下可獲得。用于完全人源化的方法目前不成功。此類抗體在臨床環(huán)境下的應(yīng)用可以誘導(dǎo)人患者中的免疫應(yīng)答。尤其對于長期使用的抗血管生成性化合物，這可以導(dǎo)致劑量增加或甚至導(dǎo)致可以造成治療早期終止的副作用。我們鑒定了具有優(yōu)異生物學(xué)特圖譜的完全人的(x5pi整聯(lián)蛋白功能阻斷性抗體。其優(yōu)于現(xiàn)存的小鼠抗體和嵌合抗體，原因在于完全人類本質(zhì)，這將確保在臨床環(huán)境下盡可能地不存在副作用。預(yù)期誘導(dǎo)針對這種分子的免疫應(yīng)答及具有嚴重副作用和/或劑量增加的概率大大降低。因此，這些分子更合適人類醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，例如用于治療實體腫瘤。參考文獻1)CarmelietP和JainRK(2000)Nature407:249-2572)KimS等(2002)JClinInvest110:933-9413)KimS等(2002)AmJPathol156:1345-13624)KimS等(2002)JBiolChem275:33920-339285)ChereshDA和StupackDG(2002)NatMed8:193-1946)GeorgeEL等(1993)Development119:1079-10917)GeorgeEL等(1997)Blood90:3073-30818)Yang等(1993)Development119:1093-11059)GohKL等(1997)Development124:4309-431910)TavemaD禾QHynesRO(2001)CancerRes61:5255-52611l)FrancisSE等(2002)ArtheriosclerThrombVaseBiol22:927-93312)McDonaldD和ChoykePL(2003)NatMed9:713-72513)BakreMM等(2002)NatMed8:995-100314)FinckB(2004)SRIconference"Angiogenesis:NewOpportunitiesAndSolutionsForDrugDevelopment"，Cambridge，MA15)SymingtonBE(1989)JBiolChem264:13258-1326616)KnappikA等(2000)JMolBiol296:57-8617)KrebsB等(2001)JImmunolMethods254:67-8418)RauchenbergerR等(2003)JBiolChem278:38194-3820519)LohningC，美國專利6，753，13620)Magrmssen等(2005)CancerResearch65:2712-272121)Yao等(2006)CancerResearch66:2639-2649權(quán)利要求1.人抗體或人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其以≤100nM的親和力結(jié)合于α5β1整聯(lián)蛋白并且體外和體內(nèi)抑制表達α5β1整聯(lián)蛋白的細胞與其受體粘著。2.權(quán)利要求1所述的抗體或片段，其以《10nM的親和力結(jié)合于oc5pi整聯(lián)蛋白。3.權(quán)利要求1或2所述的抗體或抗體片段，其體外抑制K562細胞系的粘著。4.權(quán)利要求1-3任一項中所述的抗體或抗體片段，其包含(a)VH區(qū)，其選自(i)氨基酸序列SEQIDNO:l(MOR04624)、SEQIDNO:3(MOR04055)或所述VH區(qū)之一的至少一個H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3區(qū)，或(ii)通過改變至少一個H-CDR區(qū)而從(i)的序列衍生的氨基酸序列，和/或(b)VL區(qū)，其選自(i)氨基酸序列SEQIDNO:2(MOR04624)、SEQIDNO:4(MOR04055)或所述VL區(qū)之一的至少一個L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3區(qū)，或(ii)通過改變至少一個L-CDR區(qū)而從(i)的序列衍生的氨基酸序列。5.權(quán)利要求4所述的抗體或抗體片段，包含通過H-CDR2區(qū)的隨機化而從(a乂i)的VH區(qū)衍生的VH區(qū)。6.權(quán)利要求4或5所述的抗體或抗體片段，包含通過L-CDR3區(qū)的隨機化而從(b)(i)的VL區(qū)衍生的VL區(qū)。7.權(quán)利要求4-6任一項中所述的抗體或抗體片段，包含通過抗體鏈的改組作用而從(a)(i)的VH區(qū)或和/或從(b)(i)的VL區(qū)衍生的VH區(qū)和/或VL區(qū)。8.權(quán)利要求4-7任一項中所述的抗體或抗體片段，包含(a)VH區(qū)，其選自氨基酸序列SEQIDNO:5(MOR04971)、SEQIDNO:7(MO謝974)、SEQIDNO:9(MO腿975)、SEQIDNO:l1(MO謝977)和SEQIDNO.11(MOR04985)，或所述VH區(qū)的至少一個H-CDR1、H-CDR2禾口/或H-CDR3區(qū)，禾口/或(b)VL區(qū)，其選自氨基酸序列SEQIDNO:6(MOR04971)、SEQIDNO:8(MOR04974)、SEQIDNO:10(MO腿975)、SEQIDNO:12(MO腿977)和SEQIDNO:14(MOR04985)，或所述VL區(qū)的至少一個L-CDRl、L-CDR2和/或L-CDR3區(qū)。9.抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:l的VH區(qū)和SEQIDNO:2的VL區(qū)(MOR04624)或其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。10.抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:3的VH區(qū)和SEQIDNO:4的VL區(qū)(MOR04055)或其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。11.抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:5的VH區(qū)和SEQIDNO:6的VL區(qū)(MOR04971)或其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。12.抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:7的VH區(qū)和SEQIDNO:8的VL區(qū)(MOR04974)或其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。13.抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:9的VH區(qū)和SEQIDNO:10的VL區(qū)(MOR04975)或其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。14.抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:ll的VH區(qū)和SEQIDNO:12的VL區(qū)(MOR04977)或其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。15.抗體或抗體片段，包含SEQIDNO:13的VH區(qū)和SEQIDNO:14的VL區(qū)(MOR04985)或其至少一個H-CDRl、H-CDR2、H-CDR3、L-CDRl、L-CDR2或L-CDR3區(qū)。16.權(quán)利要求1-15任一項中所述的抗體或抗體片段，其是IgG抗體，例如人或人源化IgGl、IgG2、IgG3或lgG4抗體或其片段，例如Fab、Fab'或F(ab)2片段。17.權(quán)利要求1-15任一項中所述的抗體或抗體片段，其是重組抗體，例如單鏈(sc)抗體或其片段，例如scFv片段。18.權(quán)利要求1-17任一項中所述的抗體或抗體片段，其形式為帶有治療劑的綴合物。19.權(quán)利要求18所述的抗體或抗體片段，其中所述的治療劑選自放療劑和化療藥。20.權(quán)利要求19所述的抗體或抗體片段，其中所述的放療劑是I125、I131或Y90。21.權(quán)利要求1-17任一項中所述的抗體或抗體片段，其形式為融合多肽。22.權(quán)利要求21所述的抗體或抗體片段，其是與細胞因子融合的融合多肽或是雙特異性抗體。23.權(quán)利要求1-17任一項中所述的抗體或抗體片段，其形式為帶有可檢測標(biāo)記基團的綴合物。24.權(quán)利要求23所述的抗體或抗體片段，其中所述的可檢測標(biāo)記基團選自放射性標(biāo)記基團、NMR、染料、酶和熒光標(biāo)記基團。25.權(quán)利要求24所述的抗體或抗體片段，其中所述的可檢測放射性標(biāo)記基團選自I125、W或Y90。26.藥物組合物，包含權(quán)利要求1-25任一項中所述的抗體或抗體片段作為活性成分。27.權(quán)利要求26所述的組合物，用于預(yù)防或治療過度增殖性疾病。28.權(quán)利要求26或27所述的組合物，用于預(yù)防或治療癌癥。29.權(quán)利要求26或27所述的組合物，用于預(yù)防或治療結(jié)腸癌。30.權(quán)利要求26或27所述的組合物，用于預(yù)防或治療腫瘤。31.診斷組合物，包含權(quán)利要求1-17或23-24任一項中所述的抗體或抗體片段作為診斷試劑。32.權(quán)利要求32所述的組合物，用于診斷過度增殖性疾病或其易感性。33.權(quán)利要求32所述的組合物，用于診斷癌癥或其易感性。34.權(quán)利要求26-33任一項中所述的組合物，用于人類醫(yī)學(xué)中。35.核酸，其編碼權(quán)利要求1-17或21-22任一項中所述的抗體或抗體片段。36.權(quán)利要求35所述的核酸，其有效連接于表達控制序列。37.載體或載體系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求35或37所述的核酸。38.細胞，其用權(quán)利要求35或36所述的核酸或用權(quán)利要求37所述的載體轉(zhuǎn)化。39.非人生物體，其用權(quán)利要求35或36所述的核酸或用權(quán)利要求37所述的載體轉(zhuǎn)化。40.用于制備權(quán)利要求1-17或21-22任一項中所述多肽的方法，其中在所述多肽被表達并且所表達的多肽被回收的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求38的細胞或權(quán)利要求39的非人生物體。41.權(quán)利要求1-25任一項中所述多肽用于制造用以預(yù)防或治療(x5(31整聯(lián)蛋白相關(guān)性病癥或其易感性的藥物的用途。42.權(quán)利要求41的用途，用于制造用以預(yù)防或治療癌癥的藥物。43.權(quán)利要求1-25任一項中所述多肽用于制造用以診斷a5pi整聯(lián)蛋白相關(guān)性病癥或其易感性的試劑的用途。44.權(quán)利要求43的用途，用于制造用以診斷癌癥的試劑。全文摘要本發(fā)明涉及以高親和力結(jié)合于α5β1整聯(lián)蛋白并阻斷其功能的重組人多肽或人源化多肽。此外，本發(fā)明披露了所述多肽的診斷及藥物用途。文檔編號C07K16/28GK101495515SQ200780026517公開日2009年7月29日申請日期2007年5月21日優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日發(fā)明者A·門拉德,C·珀蒂-弗雷爾,D·措普夫,H·彼得魯爾,J·普拉斯勒,J·維魯達,K·博斯勒特,S·施泰德爾申請人:拜耳先靈醫(yī)藥股份有限公司;莫弗西斯股份公司