專利名稱：糖工程化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
制藥工業(yè)越來越面臨對成本有效的大規(guī)模替代性生物藥物生產(chǎn)系統(tǒng)的需求。同時，基于植物的表達(dá)系統(tǒng)已顯露出其適于作為動物細(xì)胞工廠的替代品。尤其是其低生產(chǎn)成本和無受人致病原污染的危險最小
化所致的異常安全性(Raskin, I. et al" Trends Biotechnol 20， 522-531(2002); Fischer, R. et al" Curr Opin Plant Biol 7,152-158 (2004))是最重要的。植物能夠進(jìn)行大多數(shù)較高級的真核生物的翻譯后修飾(Gomord， V. & Faye， L.， Curr Opin Plant Biol 7， 171-181 (2004))。這些包括復(fù)合物糖基化、蛋白質(zhì)加工和折疊，以及復(fù)合物多聚體蛋白質(zhì)的組裝，對有活性的治療性抗體的生物活性和藥物動力學(xué)有作用。因此，各種重組蛋白質(zhì)，包括人抗體已成功地在植物宿主表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)(Hiatt， A. et al" Nature 342， 76-78 (1989); Ma, J. K. et al" NatRev Genet 4， 794-805 (2003))。
然而，植物來源的N-聯(lián)寡糖與人中發(fā)現(xiàn)的那些相當(dāng)?shù)夭煌３嗽谥参镏型ǔoal，6-巖藻糖殘基，在翻譯后的修飾(如糖基化)的不同已顯示能影響植物來源的蛋白質(zhì)的特性(Daniell et al.， supra;Conrad et al. (1998) Plant MoL Biol. 38:101-109; Mann et al (2003)Nat. Biotechnol. 21:255-261 )。在植物中，N-聯(lián)聚糖可含有附著于聚糖核心的N-聯(lián)甘露糖的抗原性(Faye et al. (1993) Anal. Biochem.109:104-108)和/或過敏原性(van Ree et al. (2000) J. Biol. Chem，275:11451-11458) p(l，2)-木糖(Xyl)殘基和與不存在于哺乳動物聚糖上的近端GlcNAc連接的a(l，3)-巖藻糖(Fuc)殘基。相反，唾液酸殘在成功的局部被動免疫 中不需要這些殘基(Ma et al. ， supra )。
幾乎在所有物種中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的糖基化加工都是保守的， 且局限于寡甘露糖(ManS-9GlcNAc2)型N-聚糖，然而經(jīng)高爾基加工 成雜交體和復(fù)合型聚糖則非常多樣(Helenius et al. (2001) Science 291:2364-2369)。轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的ER滯留通常能提高生 產(chǎn)水平(Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109; Sharp et al. (2001)Biotechnol.Bioeng. 73:338-346)。但是，由于聚糖加工可影響 抗體的穩(wěn)定性(Rudd et al. (2001) Science 291:2370- 2376 )，還不清 楚是否來源于具有修飾的聚糖結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)系統(tǒng)的抗體是有活性的 并且能給予有效的系統(tǒng)性暴露后預(yù)防。
至于在所被含的懸浮液的培養(yǎng)物中的重組蛋白質(zhì)的大規(guī)?？蛇m合 的生產(chǎn)平臺，粗壯的蘚類小立碗蘚通過將幾個有利的品質(zhì)與-不僅在土 壤植物之間-允許有效地定點敲除基因的特別高速的同源的核DNA重 組結(jié)合，提供了絕對無動物成分的下一代生產(chǎn)技術(shù)(Gorr， G. & Wagner, S.， Modern Biopharmaceuticals 3， 919-929 (2005); Girke, T. et al" Plant J 15， 39-48 (1998); Schaefer， D. G. & Zyrd， J. P; Plant J 11,1195-1206 (1997))。在試圖"人化，，N-聯(lián)寡糖結(jié)構(gòu)的努力中，根據(jù) WO 04/057002，最近已產(chǎn)生了 pi，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和al，3-巖藻糖基轉(zhuǎn) 移酶基因(Axyl-t/Afuc-t)的雙敲除變體。這些蘚類變體合成了完全缺 乏這兩個植物特異性糖殘基的總糖蛋白，但它們?nèi)圆挥绊懶螒B(tài)、生長、 發(fā)育和分泌重組糖蛋白的能力(Koprivova, A. et al.; Plant Biotechnol J 2, 517-523 (2004); Huether, CM. et al. Plant Biol 7， 292-299 (2005))。 同時還顯示末端的，類人的1，4聯(lián)半乳糖成功地附著于來自蘚類的1\-聚糖(Huether, CM. et al. Plant Biol 7， 292-299 (2005); Gorr and Jost Bioprocess J 4， 26-30 (2005))。其中未公開抗體的功能特征如ADCC (抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和CDC (補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性) 活性。
雖然已有人試圖通過植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗體，但也描述了變化的
7糖基化模式和對效應(yīng)子功能的負(fù)面影響和這些抗體的Fc區(qū)和Fc受體 之間的相互作用所致的這些抗體的穩(wěn)定性。已有報道，免疫球蛋白的 Fc部分介導(dǎo)的功能與它們的N-聯(lián)寡糖結(jié)構(gòu)有強(qiáng)烈的相關(guān)性(Jefferis， R. et al,， Immunol Rev 163， 59-76 (1998))。
核心巖藻糖基化寡糖尤其顯示出與在效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)的FcyRIIIa 受體(CD16 )有較微弱的結(jié)合，導(dǎo)致了溶解潛能的降低(Shields, R. L. et al.， J Biol Chem 277， 26733-26740 (2002); Shinkawa， T. et al" J Biol Chem 278， 3466-3473 (2003))。相反，在N-聚糖模式中酵母產(chǎn)生缺乏 核心巖藻糖的抗體顯示了在B細(xì)胞剝奪實驗中的微弱的潛能。只有高 濃度的該抗體才導(dǎo)致來自健康供體的B細(xì)胞衰竭。其中未公開如 ADCC和CDC活性的抗體特征。
但是，在體內(nèi)生產(chǎn)該抗體之后，在本研究中出現(xiàn)的大多數(shù)N-聚糖 結(jié)構(gòu)在接下來的步驟中在體外通過利用特定酶加工達(dá)到最后的N-聚 糖模式(Li et al., Nat Biotechnol， doi: 10.1038/nbtll78 (2006))。
US 6,602,684敘述了通過修飾復(fù)合物聚糖結(jié)構(gòu)，如經(jīng)GnTIII修飾 的對切N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)提高抗體的效應(yīng)子功能的方法。
WO 2005/000225 A2敘述了抗狂犬病的單克隆抗體。這些抗體是 IgG、 IgA、 IgM、 IgD和IgE類，是在缺乏具有a-l，3-巖藻糖殘基的 N-聚糖結(jié)構(gòu)的植物中產(chǎn)生的，且少有過敏原性植物表位。
WO 2004/050838 A2敘迷了在無巖藻糖殘基但可含有木糖的植物 中產(chǎn)生了抗單純皰滲病毒的免疫球蛋白。
WO 01/31045 Al公開物涉及在植物中生產(chǎn)具有類哺乳動物糖結(jié) 構(gòu)的蛋白質(zhì)的方法。這些植物優(yōu)選無有活性的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶或木糖 基轉(zhuǎn)移酶。
US 2006/0034829 Al描述了具有通式Man3GlcNAc2的N-聚糖結(jié) 構(gòu)的免疫球蛋白。
US2006/0029604 Al描述了具有通式GlcNac2Man3GlcNac2的N-聚糖結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白。這些結(jié)構(gòu)是經(jīng)p半乳糖酶處理產(chǎn)生的。
WO 01/55434 Al涉及在植物中抑制碳水化合物修飾酶，尤其是GBSS和GnTI。
甚至在對抗體的開發(fā)的長期和深入的研究的觀察中，仍存在對具 有改進(jìn)的特征如效應(yīng)子功能提高的抗體的高度需求。 本發(fā)明的目的是提供具有改進(jìn)特性的抗體。
根據(jù)本發(fā)明，這一 目的是通過權(quán)利要求書要求保護(hù)的主題達(dá)到的。
發(fā)明概述
的抗體制劑，其特征在于，
* 所述抗體或其衍生物或片段包含無巖藻糖和木糖的N-聚糖 結(jié)構(gòu)，且
相比未經(jīng)修飾的特異于同一抗原的動物抗體制劑，在含有非 特異性動物抗體的至少10%的血清溶液(100%是未稀釋的 血清)中的所述制劑的ADCC活性被少抑制至少10%，和/ 或至少90%、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99%、最優(yōu)選至 少100%的經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段缺乏C-末端賴氨 酸殘基。
已發(fā)現(xiàn)，所述治療性抗體的效應(yīng)子功能通常受到體液中正常發(fā)現(xiàn) 的正?？贵w背景的抑制。在天然血清中，高濃度的治療性IgG(例如， 人IgGl或IgG3 ，或小鼠Ig-G2a )抗體是補(bǔ)償過量的內(nèi)源免疫球蛋白 G對抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的抑制所需要的。人血清具有平 均抗體濃度約11.7mg/ml，其中大部分是IgGl和IgG3 (合起來是 7.7mg/ml)。正常的血清IgG水平是阻礙治療性IgG抗體與存在于 NK細(xì)胞上的低親和力IgG受體(FcyRIHa，CD16)的結(jié)合的。與CD64 一起，這兩個Fcy受體是介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞受體。可通過不同的 糖基化結(jié)構(gòu)提高ADCC溶解(例如，WO2006/005367 )。但是，這些 抗體仍可被非特異性血清抗體抑制(Preitner et al" Mol. Immunol. 43， 1183-1193(2003))。驚人的是，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，具有無巖藻糖和木糖， 尤其是缺乏C-末端賴氨酸，優(yōu)選無半乳糖的N-聚糖結(jié)構(gòu)的抗體制劑正逐漸對這一抑制有明顯程度的抗性。
之所以參照特異于同一抗原的未經(jīng)修飾的動物(尤其是哺乳動物)
抗體制劑是為助理解，通過使用本發(fā)明的抗體可改變該抗體的c-末端
部分的效應(yīng)子功能。當(dāng)然，溶解活性(ADCC)還依賴于抗體與其Fc 部分介導(dǎo)的溶解效應(yīng)子功能(應(yīng)該考慮為獨立的)的靶的親和力的。 未經(jīng)修飾的抗體通常具有帶有半乳糖，巖藻糖(尤其是(xl，3-巖藻糖) 和/或木糖(尤其是pi，2-木糖)的N-聚糖結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗 體和未修飾(即親本的)抗體優(yōu)選均為單克隆抗體并且更優(yōu)選在細(xì)胞 表達(dá)系統(tǒng)(例如植物細(xì)胞)中重組表達(dá)(或為重組表達(dá)設(shè)計的)。
作為比較血清溶液(可例如，稀釋到約10%的血清)的替代品， 可使用非特異性抗體的抗體組合物。這樣的比較抗體組合物可含有動 物的生理抗體，或它可以是本發(fā)明的(修飾)抗體的親本(未修飾) 的抗體制劑。比較抗體可與血清抗體濃度接近，例如
0.5mg/ml畫15mg/ml，優(yōu)選lmg/ml-5mg/ml，更優(yōu)選3mg/ml。所述比較 抗體優(yōu)選是IgGl和IgG3。假設(shè)血清中大約的血清IgGl和IgG3水平 為7.7mg/ml， 10%的血清中將是0.77mg/ml的量，40%的血清中將是 3.08mg/ml的IgGl和IgG3。
具有這一抗性的新抗體，以及其衍生物、片段或制劑可在缺失 |51，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和al，3-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的重組細(xì)胞(優(yōu)選植物細(xì)胞) 中產(chǎn)生。
所述抗體或其衍生物或片段的N-聚糖結(jié)構(gòu)優(yōu)選也是無半乳糖的。 缺乏半乳糖可通過在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)(如特定植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))中 表達(dá)，或通過用半乳糖苷酶處理，或通過在缺乏1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 活性的細(xì)胞(例如動物細(xì)胞)中表達(dá)來實現(xiàn)。
未經(jīng)修飾的抗體制劑優(yōu)選與經(jīng)修飾的抗體或其衍生物或片段具有 相同的抗原親和力。
在所述制劑中，優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少99 %、最優(yōu)選100%的經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段中缺乏C-末端賴 氨酸殘基，尤其通過重鏈(通?？珊匈嚢彼?總量確定。由于抗體可具有更多潛在含有c-末端賴氨酸的鏈，可理解，賴氨酸缺乏的量的 百分?jǐn)?shù)是指潛在含有c-末端賴氨酸的所有鏈。在c-末端賴氨酸存在
的情況下，單克隆抗體是異源的(Lazar et al. ， Rapid Communications in Mass Spectrometry (18)， 3， 239 - 244， 2004 )。驚人的是已發(fā)現(xiàn)，含 有定量除去(或不表達(dá))的C-末端賴氨酸的抗體比其他抗體具有明顯 有利的效應(yīng)子功能。本文顯示，生理存在的抗體可抑制血清稀釋液中 的ADCC。本發(fā)明的此實施方案中的所述缺乏C-末端賴氨酸的抗體中 不存在所述抑制效果(或明顯降低)。
另外，所述抗體或其衍生物或片段的N-聚糖結(jié)構(gòu)優(yōu)選選自 GlcNAc2Man3，GkNAc2Man3GlcNAc 或 GlcNAc2Man3GlcNAc2 。 GlcNAc2Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)優(yōu)選由至少50% 、更優(yōu)選由至少70%、最 優(yōu)選至少90%的抗體、其片段或衍生物構(gòu)成。在其他實施方案中，優(yōu) 選的結(jié)構(gòu)是GlcNAc2Man3和/或GlcNAc2Man3GlcNAc ， 其中 GlcNAc2Man3和GlcNAc2Man3GlcNAc結(jié)構(gòu)尤其存在于至少30% 、優(yōu) 選至少50%、更優(yōu)選至少70%的經(jīng)修飾的抗體或其衍生物或片段的 N-聚糖結(jié)構(gòu)中。
在制備所述抗體的特別實施方案中，少于50%、優(yōu)選少于30%、 更優(yōu)選少于10%的抗體、其衍生物或片段缺乏N-聚糖結(jié)構(gòu)。人IgG 抗體中的與Asn297結(jié)合的N-聚糖結(jié)構(gòu)優(yōu)選存在于大多數(shù)所述抗體制劑 中。
雖然抗體可重組地在其他有機(jī)體如植物細(xì)胞中表達(dá)，作為經(jīng)修飾 的抗體(以及其片段和衍生物)的來源的動物優(yōu)選是哺乳動物，特別 的實施方案中是人或小鼠，或爬行動物，特別的實施方案中是鱷魚。
相比特異于同一抗原的未經(jīng)修飾的動物抗體制劑，在含有該非特 異性動物抗體的至少10%、優(yōu)選至少40%的血清溶液中的所述制劑的 ADCC活性被少抑制至少10%、尤其優(yōu)選至少15%、 20%、 25%、 或甚至30%。本發(fā)明的抗體具有此對動物體液(例如血清)中發(fā)現(xiàn)的 其他抗體的掩蔽效應(yīng)的罕見的抗性。在非特異性抗體溶液中的所述制 劑的ADCC活性優(yōu)選被少抑制至少20% 、優(yōu)選至少30% 。在所述抗體的優(yōu)選形式中有嵌合抗體、人源化抗體或人抗體，優(yōu)
選IgG抗體。
在本發(fā)明的一個特別的實施方案中，所述抗體制劑的優(yōu)選的特征 是，相比特異于同一抗原的未經(jīng)修飾的抗體制劑，CDC活性至少降低 10%。在另一個實施方案中，相比特異于同一抗原的未經(jīng)修飾的動物 抗體制劑，所述制劑的ADCC活性提高至少10倍。
在優(yōu)選的實施方案中，相比特異于同一抗原的未經(jīng)修飾的動物抗 體制劑，在含有非特異性動物抗體的至少10%、優(yōu)選至少40%的血清 溶液中的經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段與CD16^，的結(jié)合被少抑 制至少10%。
相比特異于同一抗原的未經(jīng)修飾的動物抗體制劑，在含有非特異 性動物抗體的至少10%、優(yōu)選至少40%的血清溶液中的經(jīng)修飾的抗 體、其衍生物或片段的靶的受基因型為任一 CD16^的效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo) 的細(xì)胞溶解優(yōu)選被少抑制至少10%。
在另 一方面，本發(fā)明提供了通過在缺乏pi，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和al，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞(優(yōu)選植物細(xì)胞)中表達(dá)編碼抗體、其片 段或衍生物的核酸可得到的抗體制劑。所述抗體制劑優(yōu)選還具有的特 征是具有上面所述的功能和結(jié)構(gòu)優(yōu)點。可理解，抗體、其片段或衍生 物可由表達(dá)所必需的一種以上的氨基酸鏈及一種以上的核酸分子(如， 每種鏈一種)構(gòu)成。當(dāng)然， 一種核酸分子(例如，在載體上的)可編 碼一種以上的鏈。
也可優(yōu)選在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷型細(xì)胞中得到所述抗體制劑，所 述細(xì)胞優(yōu)選完全缺乏半乳糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶或任何半乳糖基轉(zhuǎn) 移酶。
在特定的實施方案中，可在能將1，4鍵中的半乳糖殘基附著于N-聚糖的末端GlcNAc殘基的表達(dá)系統(tǒng)中得到所述抗體制劑。所述表達(dá) 系統(tǒng)可具有天然的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性，或可進(jìn)行遺傳工程獲得特異 的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
優(yōu)選在具有GnTIII活性的細(xì)胞中表達(dá)所述抗體制劑，尤其如US6，602，684或WO 99/54342中所公開。GnTIII活性導(dǎo)致進(jìn)一步提高 了溶解的效應(yīng)子功能(例如引入對切結(jié)構(gòu))。例如，用導(dǎo)致比未轉(zhuǎn)染 或未經(jīng)修飾的細(xì)胞有提高的GnTIII的表達(dá)的GnTIII基因轉(zhuǎn)染所述細(xì) 胞。
本發(fā)明另一方面提供了經(jīng)修飾的抗體或其衍生物或片段，其特征 在于，所述抗體的聚糖結(jié)構(gòu)無巖藻糖和木糖，優(yōu)選無半乳糖，且N-聚糖結(jié)構(gòu)是 GlcNAc2Man3 ， 或 GlcNAc2Man3GlcNAc 或 GlcNAc2Man3GlcNAc2 。 N-聚糖結(jié)構(gòu)通式優(yōu)選是 -P-l,4-GlcNAc-p-l，4-GlcNAc-(p-l，4-Man)(a-l，6-Man)(a-l，3-Man)，其 中一個(或兩個)a-甘露糖殘基可結(jié)合另外一個P-l，4-GlcNAc(圖4)。 核心糖基化通常是發(fā)現(xiàn)于IgG抗體中的Asn297上。
在一個特定的方面，本發(fā)明涉及識別Lewis Y抗原，且源自識別 Lewis Y抗原且含有半乳糖，巖藻糖或木糖的親本(即未經(jīng)修飾的抗 體)單克隆抗體的單克隆抗體或其衍生物或片段，其中所述單克隆抗 體的聚糖結(jié)構(gòu)無巖藻糖和木糖，也優(yōu)選無半乳糖，ADCC效應(yīng)子功能 提高至少IO倍，所述抗體的抗原結(jié)合特異性和親和力與所述未經(jīng)修飾 的親本批體相同或相似。對于這一實施方案，任何識別Lewis-Y的抗
體都可用作親本抗體。
優(yōu)選的親本單克隆抗體是含有人化輕鏈可變區(qū)、人輕鏈恒定區(qū)、 人化重鏈可變區(qū)和人重鏈恒定區(qū)的抗體，其中所述人化輕鏈可變區(qū)可 具有如

圖1所示的至少部分氨基酸序列，所述人化重鏈可變區(qū)可具有 如圖2所示的至少部分氨基酸序列。發(fā)明的抗體的氨基酸序列優(yōu)選與 親本抗體相同。例如，抗體衍生物可以是EP 0 528 767中的嵌合抗體 之一。在特別的實施方案中，所述抗體衍生物是單鏈抗體(SCA)。 SCA是例如US4， 946,778中公開的。相比由相同的DNA編碼，但在 動物(例如哺乳動物)宿主中表達(dá)的未修飾親本抗體，本發(fā)明的抗體 可顯示出相同或相似的裝配，折疊，特異性和二價體，優(yōu)選不顯示更
高程度的降解或聚集。
所述抗體衍生物可選自重組抗體或人工抗體，包括單鏈抗體，抗體，尤其是來自動物的人源化抗體。尤其優(yōu)選來自駱駝或爬行動物(如 鱷魚)的抗體，它們對人有最小程度的抗原性。所述抗體片段可包含
或選自抗體的恒定和/或可變部分，尤其選自Fc、類Fc、 Fv、 Fab、 F(ab)2、 Fab，、 F(ab，)2、 scFv、 scfc、 VHH。所述抗體片段最優(yōu)選是具 有本發(fā)明的糖基化結(jié)構(gòu)的類Fc或Fc片段。
所述親本抗體的臨床效果與人IgGl分子的Fc部分的生物學(xué)活性 相關(guān)，是由其誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC )的效率決定的。ADCC 功能依賴于與粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的FqRIII相互作用的Fc部分的糖 基化作用(Lifely et al'， 1995， Glycobiology， 5(8)， 813-822 )。
相比所述親本抗體的ADCC活性，即相比所述特異于同一抗原的 未經(jīng)修飾的抗體制劑，本發(fā)明的抗體和/或制劑的ADCC效應(yīng)子功能 提高至少5倍、優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少20倍、甚至至少30倍、 再更優(yōu)選至少40倍、最優(yōu)選甚至提高50倍。ADCC效應(yīng)子功能最好 地由表達(dá)抗體所抗的抗原的細(xì)胞的細(xì)胞溶解(溶解的EC50值)決定。 已知抗體通常能抗的抗原化合物(例如，任何蛋白質(zhì)、糖蛋白、核酸 等)。所述抗原可具有一個表位或一個以上的表位。所述抗體優(yōu)選直 接抗如在單克隆抗體中的相同表位。
在細(xì)胞溶解實驗中，利用具有靶抗原的細(xì)胞可測量相比親本抗體 的本發(fā)明抗體的ADCC溶解活性。在抗Lewis-Y抗原的抗體的情況中， 可將Lewis-Y陽性靶癌細(xì)胞系(例如SKBR5、 SKBR3、 LoVo、 MCF7、 OVCAR3和Kato III)用作耙。
效應(yīng)子細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶解可強(qiáng)烈依賴于效應(yīng)子細(xì)胞上的免 疫球蛋白Fc區(qū)和Fc受體之間的相互作用。已有報道，NK細(xì)胞上表 達(dá)的CD16受體根據(jù)其基因型，以不同的親和力與IgG結(jié)合(Niwaet al., Cancer Res 64， 2127-2133 )。所以，分析了 PBMC供體的CD16 基因型，發(fā)現(xiàn)只有約50% (10中5)表達(dá)高親和力基因型(CD16,s8v,v)。 用這樣的PBMC供體進(jìn)行的ADCC實驗顯示，相比表達(dá)低親和力受 體(CD16158F/F)的NK細(xì)胞，親本抗體制劑和本發(fā)明的抗體有強(qiáng)烈增 強(qiáng)的溶解活性。對Ovcar-3細(xì)胞的并列比較表明，本發(fā)明的抗體的溶解潛能增強(qiáng)了約40倍，不依賴于所選CD16表現(xiàn)型。
本發(fā)明的抗體可以是鼠抗體，嵌合抗體，人抗體或人源化抗體，所述抗體優(yōu)選是人源化抗體。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是IgG或其片段或衍生物，優(yōu)選是IgGl或其片段或衍生物。在另一實施方案中，本發(fā)明的抗體是包括相當(dāng)于人IgG的Fc區(qū)的區(qū)域的融合蛋白。
因此，在一方面，本發(fā)明也涉及在藥物可接受載體或稀釋液中含有本發(fā)明的抗體的藥物制劑。
另外，本發(fā)明涉及所述抗體作為藥物的用途。
所述藥物可用作預(yù)防和/或治療性處理的藥劑，分別用于減弱或抑制患者的腫瘤細(xì)胞的生長，尤其是固體癌癥的治療，例如用于已轉(zhuǎn)移的腫瘤或上皮來源的彌漫性腫瘤細(xì)胞的治療。另外，本發(fā)明的抗體可用于治療最少殘留疾病。
本發(fā)明的抗體在給定的濃度能溶解較寬范圍抗原密度的靶細(xì)胞。這一現(xiàn)象可能在腫瘤的治療中有關(guān)聯(lián)，尤其是因為靶抗原密度在上皮腫瘤上不能認(rèn)為是恒定的，并且在初級腫瘤中和在衍生的轉(zhuǎn)移腫瘤上可能是不同的?？傊?，由糖最佳化生產(chǎn)菌株表達(dá)的有活性的治療抗體(如蘚類生產(chǎn)抗體IGN314)顯示出溶解活性增強(qiáng)，并可降低治療劑量，或在給定濃度溶解較寬范圍的不同抗原密度的腫瘤細(xì)胞。特別地，低抗原密度的細(xì)胞會逃過標(biāo)準(zhǔn)治療抗體，但可被所述糖工程化抗體靶獲且破壞。另外，在所有研究的細(xì)胞系上和在顯示與CD16158F/F、CD16^v/v表現(xiàn)型都有較高親和力的兩個CD16,s8表現(xiàn)型上，糖最佳化抗體顯示出較低的EC50值。這一較強(qiáng)的相互作用降低了 EC50濃度，并且降低了啟動兩個表現(xiàn)型的靶細(xì)胞溶解必需的閾值濃度。這一現(xiàn)象尤其對當(dāng)用經(jīng)典的抗體制劑治療時將需要較高的抗體濃度才得到同樣的治療效果的具有低親和力表現(xiàn)型的患者有治療益處。
在本發(fā)明的另 一方面，提供了用于制備抗體或抗體混合物的方法，其中抗體是在缺乏pi，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和al，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性，優(yōu)選完全缺乏pi，2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和al，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞(優(yōu)選植物細(xì)胞)中表達(dá)的，以及所述抗體可通過所述表達(dá)得到。例如，可用至少一個含有編碼抗體鏈的核酸的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物細(xì)胞，再擴(kuò)增所述細(xì)胞，并用于生產(chǎn)所述經(jīng)修飾的抗體。
所述細(xì)胞還優(yōu)選缺乏1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的。在優(yōu)選的實施方案中，所述用于表達(dá)抗體、其片段或衍生物的編碼抗體、其片段或衍生物的DNA缺乏C-末端賴氨酸的密碼子。
在其他實施方案中，優(yōu)選利用羧肽酶(例如羧肽酶B)或在體內(nèi)通過選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)條件，優(yōu)選通過選擇動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)除去抗體、片段或衍生物的C-末端賴氨酸。優(yōu)選在BY2細(xì)胞、胡蘿卜細(xì)胞、酵母(例如，畢赤酵母或酵母)、纖毛蟲、藻類或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。
附圖簡述
圖1:靶定Lewis Y的單克隆抗體IGN314的人化輕鏈可變區(qū)的序列。
圖2:靶定Lewis Y的單克隆抗體IGN314的人化重鏈可變區(qū)的序列。序列1或2都可使用。
圖3:純化抗體IGN314的特征
(a) 純化的IGN314與親本抗體IGN311的比較銀染SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。IGN311是人化的單克隆IgG抗-Lewis Y抗體。在非還原條件下(左)，兩個樣品都準(zhǔn)確地顯示了相同的蛋白質(zhì)帶，落在約150kDa的范圍內(nèi)，對應(yīng)于完整的，準(zhǔn)確組裝的IgG的預(yù)期分子量。(-)同時純化的模擬轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)上清液。在還原條件下(右)，可檢測到約50和25kDa的唯一的蛋白質(zhì)帶，分別對應(yīng)于IgG重鏈和輕鏈。
(b) IGN314的大小排阻HPLC分析。將滯留時間8，6min時洗脫為尖峰的表達(dá)產(chǎn)物鑒定為IgG。在更短的滯留時間7J和7"min出現(xiàn)低豐度(低于10% )的不能完全分辨的峰，可能對應(yīng)于少量聚集抗體結(jié)構(gòu)，如IgG多體。
(c) 通過抗獨特型夾心ELISA (Runs檢測)檢測結(jié)合抗原的活性而證明IGN314的特異性。在圖象上顯示了與IGN311對比的稀釋曲線。利用S型四參數(shù)擬合法繪制擬合曲線(擬合度R2>0.99)。圖4: IGN311和IGN314的N糖基化
給出了通過質(zhì)鐠分析得到的各聚糖的結(jié)構(gòu)表。通過HPLC分離從抗體IGN311 (親本)和IGN314 (糖修飾)的重鏈的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶得到的經(jīng)胰蛋白酶消化的肽，并且用電噴射離子化質(zhì)譜分析法分析。相對于序列TKPREEQYN297STYR (具有一個未使用的經(jīng)胰蛋白酶溶解的位點)或EEQYN297STYR的糖肽的檢測到的質(zhì)量計算多糖質(zhì)量。從各自的質(zhì)量增長量演繹聚糖結(jié)構(gòu)。GlcNAc-N-乙?；咸前罚琈an-甘露糖，F(xiàn)uc-1，6連接的巖藻糖，和Gal=l，4連接的半乳糖殘基。GlcNAc殘基可附著于兩個天線中的一個。GlcNAc殘基可附著于兩個天線中的一個。Fuc殘基附著于近側(cè)的GlcNAc殘基。
圖5:人IgGl-Fc的結(jié)構(gòu)和與FcyRIII ( CD16 )的相互作用。A組IgG抗體的一般結(jié)構(gòu)。小鼠IgG2a抗體通過Harris等人20(Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編碼1IGT)結(jié)晶。兩條重鏈分別顯示黑色和淡藍(lán)色。兩條輕鏈分別顯示綠色和黃色。在紅色中，顯示了附著于重鏈的Asn297的碳水化合物成分。B組人IgGl-Fc與Fc/RHI(CD16)的相互作用。結(jié)晶該復(fù)合物并公開在Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編碼1T89。兩條重鏈成分分別以淡藍(lán)和紫色顯示人Fc (包括CH1和CH2)的帶狀模型。附著于細(xì)胞表面(灰色盒子)的CD16的細(xì)胞外區(qū)顯示綠色。不連續(xù)的線表示了兩個CD16作為信號感受態(tài)分子或作為GPI連接的(非信號感受態(tài))分子存在。在糖工程化IGN311變體中不存在的巖藻糖殘基的位置劃了圓圏(橘色)。
圖6:通過親本抗體IGN311 (灰線)和蘚類來源的脫巖藻糖基化變體IGN314 (黑線)介導(dǎo)的人PBMC的ADCC介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞溶解的比較人血清對不同血清基質(zhì)中的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(ADCC)的影響。用恒定基質(zhì)(分別10%FCS或40 % NHS )中的RPMI 1640稀釋樣品，并且在三份中測定人PBMC的ADCC介導(dǎo)的SK-BR-3紳瘤細(xì)胞的溶解。用四參數(shù)S型配合擬合數(shù)據(jù)(在所有情況中，適合度R2>0.92)。評估溶解潛能，EQ。為:在10%的FCS中，對親本IGN311野生型和糖修飾IGN314分別為0.301ng/ml ( 95%CI:0.169-0.537 )和0.052pg/ml ( 95%CI:0.028-0.094 )，和在40 % NHS中，對親本IGN311和糖修飾的IGN314分另'J 1.558ng/ml ( 95%CI:0.989-2.457 )和0.126ng/ml ( 95%CI:0.065-0.244 )。
圖7: (A)IGN311， IGN314和人多克隆IgG的C-末端抗體肽SLSLSPG的C18層析圖。(B ) IGN311的C-末端抗體肽SLSLSPGK的C18層析圖；在樣品IGN314和人多克隆IgG中無檢測到SLSLSPGK。
發(fā)明詳述
本發(fā)明所用的術(shù)語通常是本技術(shù)領(lǐng)域所使用的，除非另外如下定義。
術(shù)語抗體包括抗體或其抗體衍生物或片段并且這些抗體的說明書也應(yīng)用于本發(fā)明的抗體制備。在這些抗體片段中，抗體的功能等當(dāng)物或同源物包括含有免疫球蛋白結(jié)合區(qū)的任何多體或模擬這一結(jié)合區(qū)以及Fc區(qū)或與Fc區(qū)同源的區(qū)或至少其一部分的肽。含有與另一個多體融合的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)或等當(dāng)物的嵌合分子包括在內(nèi)。
作為例子，抗體分子是完整的免疫球蛋白分子和含有包括已知為Fab、 Fab，、 F ( ab， ) 2、 Fc和F ( v )以及N-聚糖結(jié)構(gòu)這些部分的抗原互補(bǔ)位的免疫球蛋白的那些部分。
驚人地，已發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的藥物動力學(xué)提高?？贵w分子上缺乏末端半乳糖殘基可減少網(wǎng)狀的內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞(如肝中的肝巨噬細(xì)胞)對所述的抗體分子的不需要的吸收以及經(jīng)由肝細(xì)胞中脫唾液酸糖受體的吸收。這可導(dǎo)致抗體更少的不需要的副作用和提高的藥物動力學(xué)以及增長的半衰期，導(dǎo)致針對表達(dá)耙細(xì)胞的抗原(例如，Lewis Y、 CD20、 Ep-CAM、 HER-2、 Erbl受體，Erb2受體)的循環(huán)抗體的有效濃度延長和更長的效應(yīng)子功能。
如本文所用，本發(fā)明的抗體可在包括任何種類的可修改以表達(dá)該抗體的細(xì)胞系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中表達(dá)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語"細(xì)胞，，指表達(dá)本發(fā)明的糖基化抗體的個別細(xì)胞，組織，器官，昆蟲細(xì)胞，鳥類細(xì)胞，爬行動物細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞，初級細(xì)胞，傳代細(xì)胞系，干細(xì)胞和/或遺傳工程細(xì)胞，如重組細(xì)胞的培養(yǎng)物。
用于重組表達(dá)本發(fā)明的抗體的細(xì)胞系統(tǒng)可是任何細(xì)胞，組織，來
自動物王國，例如轉(zhuǎn)基因山羊的有機(jī)體，CHO細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，人細(xì)胞系。
優(yōu)選，細(xì)胞是動物細(xì)胞，例如BSC-1細(xì)胞，LLC-MK細(xì)胞，CV-1細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，小鼠細(xì)胞，人細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，293細(xì)胞，VERO細(xì)胞，MDBK細(xì)胞，MDCK細(xì)胞，MDOK細(xì)胞，CRFK細(xì)胞，RAF細(xì)胞，TCMK細(xì)胞，LLC-PK細(xì)胞，PK15細(xì)胞，WI-38細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞，T-FLY細(xì)胞，BHK細(xì)胞，SP2/0， NS0細(xì)胞或它們的衍生物。
可替換地，細(xì)胞，組織，有機(jī)體也可來自真菌王國，或植物王國如酵母，煙草，水稻，苜蓿或玉米。可替換地，苜蘚植物細(xì)胞可選自例i口 Physcomitrella、 Funaria， Sphagnum 、 Ceratodon、 Marchantia和Sphaerocarpos。例如苔蘚植物細(xì)胞是WO04/057002中所用的Physcomitrella園片。
可替換地，可使用具有功能異?；驘o核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和/或功能異常或無木糖基轉(zhuǎn)移酶，和/或功能異?；驘o1、 4-半乳糖基轉(zhuǎn)移喊的表達(dá)系統(tǒng)。
可替換地，可通過用除去殘基的酶除去本發(fā)明的抗體中的半乳糖，巖藻糖和/或木糖。可使用本領(lǐng)域已知的導(dǎo)致從N-聚糖釋放半乳糖，巖藻糖和/或木糖殘基的任何酶，例如，a-半乳糖苷酶，p-木糖苷酶，a-巖藻糖苷酶。
或者，可使用，合成不能用作l、 3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和/或1、 2木糖基轉(zhuǎn)移酶，和/或l、 4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的底物的經(jīng)修飾的N-聚糖的表達(dá)系統(tǒng)。
或者，可使用，協(xié)同表達(dá)負(fù)責(zé)C-末端賴氨酸殘基的溶解的堿性羧肽酶的表達(dá)系統(tǒng)，導(dǎo)致溶解速度提高。
或者，使用含有靶向最佳定位的堿性羧肽酶的表達(dá)系統(tǒng)，達(dá)到增
進(jìn)c-末端賴氨酸殘基的溶解。
或者，可利用缺乏編碼重鏈的核酸上的c-末端賴氨酸的密碼子的 載體構(gòu)建體達(dá)到除去c-末端賴氨酸殘基。
或者，可通過利用具有需要的堿性羧肽酶活性的酶體內(nèi)加工除去 c-末端賴氨酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明，通過將與c-末端需要的溶解相關(guān)的細(xì)胞，組織或有 機(jī)體的培養(yǎng)條件最佳化可改進(jìn)c-末端賴氨酸殘基的溶解。
本文所用的術(shù)語抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC )指，通過將抗體 的Fc區(qū)與效應(yīng)子細(xì)胞如殺傷細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞，被激活的巨噬細(xì)胞 或諸如此類的表面上存在的Fc受體結(jié)合，激活效應(yīng)子細(xì)胞損傷胂瘤細(xì) 胞或諸如此類的任何活性。
可通過技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法確定ADCC活性增強(qiáng)的抗 體。實施例中敘述了一個被接受的實驗方法。
提高的ADCC可通過在表示特異地溶解半最大量的靶細(xì)胞所需 要的抗體濃度的EC50降低的抗體濃度時測量的溶解潛能提高來測 定。
術(shù)語補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)定義為結(jié)合或激活補(bǔ)體的直接的 細(xì)胞毒性?？贵w結(jié)合它在例如腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上的乾，并且啟動 補(bǔ)體系統(tǒng)，已知稱為"補(bǔ)體級聯(lián)"，產(chǎn)生確確實實地在細(xì)胞膜內(nèi)制備洞 的膜侵蝕復(fù)合體，引起細(xì)胞溶解和死亡。
可通過技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ù_定CDC活性降低的抗 體。實施例中敘述了一個被接受的實驗方法。
可在使半最大量的靶細(xì)胞溶解的EC50增高的抗體濃度時確定降 低的CDC活性。本發(fā)明的抗體的CDC活性可達(dá)到降低10% 、或達(dá)到 降低20%、或達(dá)到降低30%。在其他實施方案中，CDC活性未改變。
與親本抗體相比，本發(fā)明的抗體與靶抗原例如，Lewis Y抗原， CD20， Ep-CAM或Her-2的結(jié)合活性至少80% 、優(yōu)先地至少90% 、更優(yōu)先地至少100%。
可能的治療目的是有效地結(jié)合和減少肺瘤細(xì)胞，即胂瘤組織或腫 瘤的轉(zhuǎn)移，或特別地是彌漫性腫瘤細(xì)胞。血液，骨髄或器官中可檢測 的腫瘤細(xì)胞或微量轉(zhuǎn)移的數(shù)目應(yīng)該明顯減少。轉(zhuǎn)移的形成將延后，它 們的生長至少將慢下來。所以，通過特異的靶向免疫治療可延長患者 的無復(fù)發(fā)壽命，所以也是總體的生存時間。
在本發(fā)明的使用范圍內(nèi)，尤其是分別減少，或抑制癌癥患者中腫 瘤細(xì)胞的生長的治療，也是血液透析是可能的。
根據(jù)本發(fā)明，含有藥物栽體或稀釋液中的本發(fā)明的抗體的藥物制 劑被覆蓋了。該制劑可用于制備分別用于降低或抑制患者的腫瘤細(xì)胞 的生長的預(yù)防性和/或治療性處理的藥物。與特異于同一抗原的未經(jīng)修
飾的抗體相比，腫瘤細(xì)胞生長的減弱至少可提高5%。
含有本發(fā)明的抗體的制劑也可用于生產(chǎn)治療優(yōu)選內(nèi)皮來源的固體
癌癥或極微的疾病殘留的藥物。
本發(fā)明的抗體可用于被動免疫治療。
同時提供的是本發(fā)明的抗體或它們的制劑用于篩選方法(優(yōu)選在 體外)，包括提供患者，優(yōu)選是人的樣品，并且檢測這些抗體與樣品 中的抗原的結(jié)合事件的用途。相似地，提供的篩選方法包括提供患者 (例如人)的樣品，把該樣品與抗體接觸，檢測結(jié)合事件。有了這一 方法，就可鑒定可用本發(fā)明的抗體治療的患者。同時，可鑒定治療特 定疾病或患者的最佳抗體/制劑。同時提供的是診斷特定疾病的方法， 包括提供患者(可能患病)的樣品，將該樣品與特異于該疾病的特征 性抗原的本發(fā)明的抗體接觸，檢測樣品中抗體與抗原的結(jié)合事件，如 果檢測到結(jié)合事件診斷該疾病。
對于完全結(jié)合腫瘤細(xì)胞的特異受體(經(jīng)修飾的抗體/制劑的抗原)， 通常的給藥劑量每病人至少lmg/劑量，優(yōu)選至少10mg/劑量，最優(yōu)選 至少50mg/劑量。最大劑量將取決于最好地耐受的抗體，人源化抗體， 和人抗體的可耐受性。劑量高達(dá)每患者lg或在某些情況中高達(dá)2g的， 治 療可能非常好地有利。驚人地i在本發(fā)明中已顯示，由于ADCC活性提高，當(dāng)用于治療 和/或預(yù)防目的時抗體的量可能減少，即使劑量減少，仍產(chǎn)生正的治療 效果。由于ADCC效應(yīng)子功能增強(qiáng)，與親本抗體的劑量方案相比，所 用的抗體的量可至少減少10%、優(yōu)選至少20%、更優(yōu)選至少30。/o、 再更優(yōu)選至少40%、最優(yōu)選至少50%。
根據(jù)所用抗體的半衰期，通常是在3-30天的范圍內(nèi)，治療優(yōu)選在 一定的時間間隔中重復(fù)。通過特別地衍生化抗體，將半衰期提高到幾 個月是可能的，從而延長治療間隔。
根據(jù)本發(fā)明所用的藥物優(yōu)選提供在適當(dāng)?shù)呐浞街小?yōu)選這樣的配 方含有藥物可接受的載體。后者包括例如，輔助試劑，緩沖液，鹽和 防腐劑。優(yōu)選提供準(zhǔn)備好使用的浸劑溶液。由于抗體是相對穩(wěn)定的， 基于抗體或它們的衍生物的藥物具有基本的優(yōu)點，它們能作為儲存穩(wěn) 定的溶液或作為準(zhǔn)備好使用的形式的配方投放市場。前者優(yōu)選是冷藏 拒溫度到室溫中的穩(wěn)定儲存配方。但是，根據(jù)本發(fā)明使用的藥物也可 提供為冷凍或凍干形式，可在需要時凍融或再構(gòu)成。
該藥物的活性物質(zhì)的濃度將取決于其可耐受性。基于人源化抗體 的特別好耐受的制劑可高濃度地，不進(jìn)一步稀釋直接對患者給藥。在 優(yōu)選的濃度范圍0.1%-10%，優(yōu)選1%-5%中，保持低的給藥體積和相 應(yīng)的注入時間是可能的。
通常，該藥物將靜脈內(nèi)給藥，但是，同樣地也可選擇另一個腸胃 外或粘膜的給藥方式，將活性物質(zhì)在腫瘤或轉(zhuǎn)移的位點系統(tǒng)地或局部 地應(yīng)用。
實施例
下面的實施例將更詳細(xì)地但不限制地解釋本發(fā)明。 實施例1:材料和方法 哺乳動物細(xì)胞系和蘚類生產(chǎn)菌林
腫瘤細(xì)胞系TF-l( Kitamura、 T.等人，細(xì)胞生理雜志140， 323-334 (1989) ) ， Ovcar畫3 (Hamilton、 T.C.等人，癌癥研究43， 5379-5389(1983 ) ) ， SK-BR-3 ( Trempe、 G丄.、癌癥研究最新結(jié)果57， 33-41 (1976))是從美國典型培養(yǎng)物收藏中心(Manassas、 CA)購買的。 利用lng/ml-100嗎/ml的系列稀釋中的人化的，Lewis Y特異抗體 IGN311，經(jīng)由FACS分析測定粑抗原的密度(Lewis Y)。在10jig/ml 時測得的平均熒光強(qiáng)度(MFI)據(jù)報道可用于進(jìn)一步的分析。
按照Koprivova、 A.等人(植物生物技術(shù)雜志2， 517曙523( 2004 ))、 使用Phys畫itrella圓片(Hedw.) B.S.G.Axyl曙t/Muc-t雙敲除系。為 了產(chǎn)生蘚類原生質(zhì)體，如已有的敘述(Hohe、 A.和Reski、 R.、植物 科學(xué)163， 69-74( 2002 ))，在光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)選定的Axyl-t/Muc-t 雙敲除系。
生產(chǎn)重組抗體
利用包括中空纖維生產(chǎn)過程和包括蛋白質(zhì)A捕獲步驟的經(jīng)典的降 低流過程的FCS,在SP2.0細(xì)胞中表達(dá)臨床級的IGN311對照抗體。
Axyl-t/Afuc-t雙敲除蘚類表達(dá)的，糖工程化IGN311變體稱為 IGN314。 IGN311重和輕鏈的編碼區(qū)-除了它們各自的信號肽-被PCR 擴(kuò)增(pfu聚合酶)和鈍克隆進(jìn)設(shè)計為利用植物信號肽分泌對應(yīng)的基 因產(chǎn)物的蘚類表達(dá)載體p127( Gorr、 G.和Jost、 W.，生物加工雜志4, 26-30 ( 2005) , Weise等人，應(yīng)用孩丈生物生物技術(shù)70， 337-345 ))。 通過限制消化和測序檢定了得到的構(gòu)建體(分別是pl27-IGN-HC和 pl27-IGN-LC)。如Jost等人，現(xiàn)代遺傳學(xué)47, 111-120 ( 2005)中 已有的敘述，同時使用45fig的兩個構(gòu)建體中的進(jìn)行蘚類原生質(zhì)體的 轉(zhuǎn)化，其中有如下的修改使用三倍的原生質(zhì)體數(shù)和6倍的PEG溶液 量(加到原生質(zhì)體/DNA混合物中，接著12分鐘的溫育)，和標(biāo)準(zhǔn)培 養(yǎng)基(3M;480mOsm;Jost、 W.等人、現(xiàn)代遺傳學(xué)47， 111-120(2005))。 因為在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的IgG效價相當(dāng)?shù)停栽诓煌?天中， 在總共167次轉(zhuǎn)化作用中質(zhì)量生產(chǎn)是在最佳化的培養(yǎng)基條件(標(biāo)準(zhǔn)培 養(yǎng)基與W5培養(yǎng)基的1:1混合物，Baur、 A.等人，生物技術(shù)雜志119， 332-342 ( 2005))下進(jìn)行的。用0.01% (w/v) BSA補(bǔ)充所有培養(yǎng)基。 在轉(zhuǎn)化后，將生產(chǎn)細(xì)胞保持在400nl培養(yǎng)基中，隨后，每周用新鮮，其他相同的培養(yǎng)基替代300nl的培養(yǎng)基。模擬轉(zhuǎn)化可作為(非和共純 化)陰性對照。每周，將一天進(jìn)行的所有轉(zhuǎn)化的上清液合并，并且通 過直接加載到平衡過的lml的HiTrap蛋白質(zhì)A柱(Amersham )上 純化。通過抗獨特型夾心ELISA和銀染SDS-PAGE分析粗培養(yǎng)上清 液以及純化的抗體。
為了生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，如已有的敘述(Jost等人，現(xiàn)代遺傳 學(xué)47， 111-120 ( 2005 ))進(jìn)行PEG-介導(dǎo)的直接DNA轉(zhuǎn)移。該DNA 是通過用限制酶Xho I、 HindIII和Seal消化pl27-IGN-HC和 pl27-IGN-LC制備的。通過凝膠電泳，切下，和從凝膠基質(zhì)中洗脫分 離相對于Xhol/Hindlll消化的，含有表達(dá)促進(jìn)序列，與植物信號肽融 合的輕鏈或重鏈的編碼肽和終止信號的DNA帶。從Axyl-t/Afuc-t雙 敲除系分離和用5fig已線性化和已洗脫的DNA構(gòu)建體中的共轉(zhuǎn)化原 生質(zhì)體。在轉(zhuǎn)化過程和隨后的稀釋和洗滌步驟之后，將原生質(zhì)體在再 生培養(yǎng)基(含有6%葡萄糖，和3.6%的甘露醇的Knop培養(yǎng)基， pH5.6、 580mOsm)中，以5jimo1 m-2s-l溫育過夜，接著以40-50nmol m-2s-l光溫育7-10天。
用抗獨特型夾心ELISA篩選抗體生產(chǎn)來分離含有兩種構(gòu)建體和 生產(chǎn)組裝的IGN314的轉(zhuǎn)基因系。在Knop培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)已鑒 定的轉(zhuǎn)基因系。
確定N-聯(lián)寡糖分布圖
如Kolarich 、 D.和Altmann 、 Anal Biochem 285 、 64-75 ( 2000 ) 中所述通過還原SDS-PAGE分離樣品IGN311和IGN314的重鏈。如 Kolarich、 D.出處同上所述切下考馬斯染色帶，脫色，脲基曱基化， 用胰蛋白酶消化和從凝膠片段中提取。在Speed Vac concentrator中 將提取物干燥，用含有0.1%甲酸的水重構(gòu)。在裝備標(biāo)準(zhǔn)電噴射元件， Cap-LC系統(tǒng)(水微質(zhì)量)和10 口溶劑開關(guān)組件(Rheodyne)的Q-TOF Ultima Global進(jìn)行質(zhì)傳分析。首先通過Aquasil C18 precolumn (30x0.32mm、熱電子)，利用水作為溶劑捕獲樣品。在溶劑轉(zhuǎn)換之 前將分析柱保持在5%乙腈中，然后，以2jd/min的流速施加5-50%的線性梯度。所有洗脫物含有0.1%的甲酸。用倍[Glull-血纖肽B,以 串聯(lián)MS方式進(jìn)行TOF分析儀的質(zhì)量調(diào)整。以MS方式分析樣品。因 為進(jìn)行了 MS和串聯(lián)MS之間的無轉(zhuǎn)換，特別地對糖肽的分析，無信 號丟失。用MassLynx4.0 SP4軟件(水微質(zhì)量)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 分析方法
根據(jù)制造商的說明，利用NuPAGE4-12。/。雙Tris凝膠上的Novex 電泳系統(tǒng)(Invitrogen)，通過SDS-PAGE分析純化的表達(dá)產(chǎn)物的完 整性，分子量和潛在的降解產(chǎn)物。凝膠被銀染了 (SilverQuest;Invitrogen )。進(jìn)行大小排阻HPLC，分析抗體的純度， 完整性和潛在的降解。利用在Dionex HPLC系統(tǒng)中的ZORBAX G-250 (Agilent-技術(shù))柱分析樣品。為了分解潛在的集合物，和為了抑制潛 在的沉淀，將含有10 0/。乙腈(CH3CN)的220mM NaH2P04 ( pH=7.0 ) 用作流動緩沖液(流速lml/min)。在214nm和280nm在線檢測流出 物。通過峰整合，在多克隆人IgG (Pentaglobin 、 Biotest)上的標(biāo)準(zhǔn) 化計算產(chǎn)物濃度。
根據(jù)制造商的說明，利用市場可得到的LAL檢測試劑盒(Charles River實驗室)確定內(nèi)毒素的濃度。
在FACS-CALIBUR儀器(Becton Dickinson )上收集流動細(xì)胞計 量術(shù)數(shù)據(jù)。利用人Lewis-Y特異抗體IGN311，在濃度范圍 100ng/ml-1.6ng/ml，定量研究的細(xì)胞系上的抗原表達(dá)。在10mg/ml進(jìn) 行評估。
確定結(jié)合特異性
在用單克隆抗獨特型抗體MMA383包被的微滴孔中，溫育系列 稀釋(100pg-ljig/ml)的抗體樣品，在特異的夾心ELISA中分析表達(dá) 產(chǎn)物的結(jié)合活性(Perkins、M.等人，藥物研究17， 1110-1117( 2000 ))。 在用5 % FCS封閉和洗滌后，通過與特異于人IgG 、 IgM和IgA( Zymed 、 CA)的山羊-免疫球蛋白過氧化物酶綴合物反應(yīng)和用鄰苯二胺/過氧化 氬染色測定結(jié)合的表達(dá)產(chǎn)物。將光密度(492nm )對抗體濃度(ng/ml) 的對數(shù)做圖，利用GraphPad Prism 4軟件，利用S型4參數(shù)配合擬合。計算EC50值，用于定量。
測定補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC )
利用Lewis Y-陽性SK-BR-3胸癌細(xì)胞系作為耙，在510-釋放測 試實驗中，以三份測定補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解活性。將靶細(xì)胞用lOOjiCi 的"Cr溫育一小時，用培養(yǎng)基洗滌兩次，以每孔20xl()S個細(xì)胞的密度， 以及待分析的樣品的系列稀釋(72ng-75jig/ml)和來自志愿者供體的 補(bǔ)體活性血清一起平鋪在96孔的微滴板中。在C02溫育器中，在37。C 溫育平板l小時。收集上清液，計算釋放的51Cr ("Cs")。在溫育各 自含有單獨的培養(yǎng)基和含有去垢劑(SDS)的代表樣品后，測定自發(fā) 釋放("Sr，，)和最大釋放("Mr")的值。通過通式100x ( Cs-Sr ) / (Mr-Sr)計算補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作為細(xì)胞溶解的百分?jǐn)?shù)，對抗體 濃度(ng/ml)的對數(shù)畫圖，利用GraphPad Prism 4軟件，利用S型 四參數(shù)配合擬合。計算EC50值，用于定量。將陰性溶解數(shù)據(jù)的樣品 設(shè)定為0%。
測定抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)
利用各種Lewis Y-陽性癌細(xì)胞系作為靶細(xì)胞(SK-BR-3、 TF-1、 Kato-III和Ovcar3 )，在51Cr釋放測試實驗中以三份測定ADCC。 將耙細(xì)胞與100nCi的51Cr溫育1小時，洗滌，以每孔25xl(^個細(xì)胞 的密度鋪在96孔微滴板中。結(jié)果物或細(xì)胞(來自健康的志愿者供體的 PBMC)是新鮮制備的，加到靶細(xì)胞中，直到E: T比例為40: 1，同 時加入待分析的抗體的系列稀釋液(100pg-10pg/ml)。在C02溫育器 中，在37。C溫育16小時后，收集細(xì)胞上清液，計算釋放的MCr( "Cs")。 在溫育各自含有單獨的培養(yǎng)基和去垢劑(SDS)的代表樣品后，測定 自發(fā)釋放("Sr，，)和最大釋放("Mr")值。通過公式100X ( Cs-Sr ) /(Mr-Sr)計算細(xì)胞毒性為細(xì)胞溶解的百分?jǐn)?shù)。將細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)對 抗體濃度(ng/ml)的對數(shù)畫圖，用GraphPad Prism 4軟件，利用S 型四參數(shù)配合擬合。計算EC50值，用于定量。
PBMC供體的CD16基因型
通過從Koene、 H.R.等人，血液90, 1109-1114 ( 1997 )所述的方法稍微修改的基于PCR的等位基因特異限制分析實驗分析CD16 ( Fc yRHIa) -158V/F)多態(tài)現(xiàn)象。 結(jié)果表達(dá)和鑒定IGN314
用重鏈和輕鏈表達(dá)構(gòu)建體(pl27-IGN-HC、 pl27-IGN-LC)瞬時 轉(zhuǎn)染蘚類Axyl-t/Afuc-t原生質(zhì)體，通過抗獨特型夾心酶聯(lián)免疫吸收測 試實驗(ELISA)，每周估計培養(yǎng)上清液的集合物中的IgGl效價。 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)IgGl效價相對低(0.1-0.5fig/ml)。但是， 在最佳化培養(yǎng)基條件下，IGN314分泌明顯提高時期超過3個月。具 體地說，這在總共進(jìn)行的167次轉(zhuǎn)化中，在14個星期內(nèi)產(chǎn)生了 3.8mglGN314 (總體平均6.1jig/ml)，而在樣品收獲5星期后已得 到2.0mg。發(fā)現(xiàn)粗培養(yǎng)物上清液的銀染十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙 烯酰胺凝膠-除了蘚類培養(yǎng)物中的污染蛋白質(zhì)的一般性低背景-無對應(yīng) 于蛋白質(zhì)水解加工的或損傷的重鏈或輕鏈或更小的抗體片段的補(bǔ)充 帶，證明完整的IgGl組裝速度很高。合并培養(yǎng)上清液，進(jìn)行蛋白質(zhì)A 純化，為了測定抗原結(jié)合特異性，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)，大小排阻高效液相層析(HPLC)，以及抗獨特型夾心 ELISA中分析純化的IGN314。結(jié)果給出在圖3中，證明了與IgGl 組裝相關(guān)的IGN314完整性，純度和耙抗原親和性。另外，進(jìn)行重鏈 和輕鏈的肽圖鐠定位，在兩個情況中都證實了植物信號肽以及IGN311 和IGN314的相同的初始氨基酸序列有準(zhǔn)確的切割-包括除去兩個重鏈 中的C-末端賴氨酸。
液體層析質(zhì)量光譜分析儀(LC-MS )分析發(fā)現(xiàn)IGN311和IGN314 重鏈分別有不同的N糖基化圖譜(圖4)。最值得注意的是，這些樣 品的核心巖藻糖基化的量，終端半乳糖基化和整體糖基化的程度是不 同的。正如可對哺乳動物宿主細(xì)胞中表達(dá)的IgG分子可預(yù)期的， IGN311差不多完全巖藻糖基化了，并且含有基本程度的終端半乳糖 基化。在這一研究中利用的糖工程化蘚類菌林生產(chǎn)的IGN314的情況 中，未檢測到含有半乳糖-或巖藻糖的聚糖結(jié)構(gòu)，小量的IGN314 N-聚糖終端有甘露糖。與IGN311相反，IGN314含有相當(dāng)量的非糖基化重鏈，而IGN311完全糖基化。兩個樣品中不含木糖殘基。 效應(yīng)子功能
比較糖工程化IGN314與IGN311的溶解潛能，并且試圖覆蓋可 能在癌癥免疫治療中出現(xiàn)的生物多樣性方面。這一多樣性涉及耙和效 應(yīng)子細(xì)胞兩者，因為在各個胂瘤靶細(xì)胞上表達(dá)的耙抗原密度不同，并 且由于遺傳多態(tài)現(xiàn)象影響氨基酸位置158 (CD16158V/F)，患者中發(fā)現(xiàn) 與天然殺傷(NK)效應(yīng)子細(xì)胞上表達(dá)的CD16受體的不同的等位基因 相關(guān)的IgG親和性不同。所以，我們在一方面分析了以不同密度表達(dá) 膜Lewis Y抗原的三個不同的腫瘤細(xì)胞系(Ovcar-3、 SK-BR-3和 TF-1)。在ADCC實驗之前，通過熒光輔助細(xì)胞分揀(FACS)分析 這些耙細(xì)胞系的Lewis Y密度。Ovcar-3顯示最高的抗原密度，接著 是SK-BR-3和TF-1 (平均熒光強(qiáng)度值參見表l)。在另一方面，為了 利用確定的效應(yīng)子細(xì)胞制劑，分析了外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的 CD16^多態(tài)現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)約50% (10中5)表達(dá)了高親和力CD161S8V/V 表現(xiàn)型(無顯示)。對所有的ADCC測試都制備了來自兩個表現(xiàn)型， 即158v/y和158f,f的供體的PBMC制劑。在測定之前證明所有樣品都 無內(nèi)毒素。同時也研究了模擬轉(zhuǎn)化的純化的培養(yǎng)上清液，無顯示任何 與背景不同的溶解活性。表i概括了 ADCC實驗的結(jié)果(計算的50 %有效濃度(EC50 )值)。對IGN314測定的EC50值比IGN311明 顯更低，意味著與親本抗體IGN311相比，IGN314的細(xì)胞的細(xì)胞毒性 介導(dǎo)的溶解潛能增強(qiáng)7-40倍。另外，對兩個抗體都觀察了靶細(xì)胞上的 Lewis Y密度和EC50濃度之間的倒置相關(guān)性。與具有低Lewis Y靶抗 原密度的細(xì)胞系(TF-1)相比，靶抗原密度升高的細(xì)胞系(Ovcar-3) 誘導(dǎo)同樣的溶解需要的抗體濃度低得多。在具有中度抗原密度的細(xì)胞 系(SK-BR-3)上測定的EC50值，如預(yù)期的，在對高和低抗原密度 的細(xì)胞系計算的那些之間。
在CD16表現(xiàn)型水平，從高親和力受體供體(158wv)制備的效應(yīng) 子細(xì)胞顯示比，從與IgG的親和力據(jù)報道較低的158f,f供體中得到的 細(xì)胞溶解活性更高(Shields、 R.等人，生物化學(xué)雜志277， 267"-26740(2002) ; Niwa、 R.等人，臨床癌癥研究10， 6248-6255 (2004))。 在Ovcar-3靶細(xì)胞上，利用從CD16!5swv供體派生的PBMC，在溶解 實驗中對兩個抗體計算的EC50值比利用來自CD16158F/F供體的 PBMC,在相同的設(shè)置下得到的值低3倍?？偠灾?，當(dāng)與IGN311 比較時，IGN314濃度最大40倍的降低能產(chǎn)生相同的ADCC溶解效應(yīng)
(EC50) (Ovcar-3、比較表1)。并且這一降低與效應(yīng)細(xì)胞CD16 的表現(xiàn)型(158wv或158F/F)無關(guān)。
乾細(xì)胞系Le Y密度 (MFI)效應(yīng)子細(xì) 胞CD16158 表現(xiàn)型EC50 IGN311 (ng/ml-l)EC50 IGN3" (ng/ml-l )增強(qiáng)
OVCAR-3435V/V0.315 ± 0. 20.008 ± 0. 00539
OVCAR-3435F/F0. 993 ± 0. 30.025 ± 0. 0140
SK-BR-3213V/V1. 040 ± 0. 10.144 士 0. 027
TF-1109V/V5. 318 ± 3. 20.366 ± 0. 0615
表l:利用兩個CD16^表現(xiàn)型的效應(yīng)子細(xì)胞(NK)，比較不同 Lewis Y耙密度的細(xì)胞系上的IGN311和IGN314的溶解潛能(MFI: 平均熒光強(qiáng)度；EC50: 50%有效濃度)。
在第二套溶解實驗中，利用SK-BR-3靶細(xì)胞，將激活補(bǔ)體(CDC) 的IGN314的溶解潛能與IGN311和脫糖基化IGN311的比較。IGN311 顯示了預(yù)期的溶解曲線(EC50值19.6±1.5ng/ml)，而考慮頂上的值 以及EC50濃度，IGN314的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶解活性劇烈降低。脫糖基化 IGN311完全無顯示任何溶解活性。
血清效應(yīng)
在天然的血清中，需要高濃度的治療性IgGl抗體，由過量的內(nèi) 源免疫球蛋白G補(bǔ)償抗體依賴性細(xì)胞毒性的抑制。正常的血清IgG水 平正在阻止治療性IgGl抗體與存在于NK細(xì)胞上的低親和力IgG受 體(CD16)的結(jié)合。與CD64 —起，這兩個Fq受體是主要的介導(dǎo) ADCC的細(xì)胞受體?？朔錓gG的抑制影響的可能性是應(yīng)用高量的 治療性抗體。但是，這一途徑耗價高，并且可能與增強(qiáng)的與正常組織的交叉反應(yīng)，增強(qiáng)的補(bǔ)體激活引起的劑量相關(guān)的副作用，嚴(yán)重的第一
劑量副作用，人抗人抗體(HAHA)應(yīng)答的誘導(dǎo)或免疫復(fù)合物的產(chǎn)生 有關(guān)。另 一個途徑是利用已工程化提高對Fq受體的親和力的治療性 抗體。對于抗體與FqrR的結(jié)合，共價地附著于抗體重鏈的CH2區(qū)中 的保守Asn297殘基的寡糖的存在是必要的(圖5，圖A )，這暗示了 ， 碳水化合物結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定簡化結(jié)合的構(gòu)象。如圖5，圖B圖解，Asn297 定位于受體結(jié)合位點的下一個；但是，碳水化合物成分顯示取向偏離 界面，與受體有非特異接觸。
關(guān)于糖基修飾途徑，可通過將糖基化從核心巖藻糖基化的典型復(fù) 合物類型改變成缺乏這一核心巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)抗體的ADCC 活性。通過產(chǎn)生糖基化裝置基因的共轉(zhuǎn)染，通過在缺乏特異的糖基化 酶的生產(chǎn)宿主中表達(dá)，或通過改變相關(guān)的酶的表達(dá)可產(chǎn)生這樣的脫巖 藻糖基化的抗體。
先前已有展示，與攜帶特征性核心巖藻糖基化N-聯(lián)寡糖模式的野 生型抗體相比，缺乏核心巖藻糖殘基的Lewis Y特異性人源化抗體 IGN311的糖基工程化變體展示了在Lewis-Y陽性SK-BR-5腫瘤細(xì)胞 上有提高29倍的ADCC反應(yīng)性(WO2004/062556 )。通過將乙酰葡 糖胺基轉(zhuǎn)移酶III基因和IGN311重鏈和輕鏈瞬時共轉(zhuǎn)染進(jìn)人胚腎 -EBV核抗原細(xì)胞，通過抗體生產(chǎn)宿主的糖基化機(jī)器的遺傳工程生成 脫巖藻糖基化IGN311，命名為IGN312。在本發(fā)明中，通過在可替換 的糖最佳化植物表達(dá)系統(tǒng)中，即pi、 2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和al、 3-巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶敲除蘚類Physcomitrella圓片中表達(dá)重鏈和輕鏈的IGN311 基因，顯示了 ADCC活性有高達(dá)40倍的增加?？偠灾?，利用兩條 途徑-巖藻糖基缺陷的哺乳動物和植物表達(dá)系統(tǒng)-證實治療性人化單克 隆抗體IGN314的ADCC潛能有明顯的最高，但允許需要的治療劑量 最小。提高的糖工程化抗體的ADCC活性至少部分是因為Fc部分與 治療性抗體的ADCC活性的主要作用者效應(yīng)子細(xì)胞，即NK細(xì)胞上的 Fc"RIII受體的結(jié)合增加。
與內(nèi)源IgG相比，脫巖藻糖基化IGN314介導(dǎo)的親和力提高可由
30與效應(yīng)子細(xì)胞上Fqr-RIII受體的結(jié)合相關(guān)的有利的熱動力學(xué)行為來解 釋。還研究了是否人正常血清(NHS)影響IGN311和脫巖藻糖基化 IGN314分別實現(xiàn)ADCC的能力。首先，我們發(fā)現(xiàn)，將IGN311稀釋 成正常人血清(NHS)的10%或40%顯示比10%的胎牛血清(FCS) 有明顯更低的ADCC活性，表明NHS明顯降低IGN311的效應(yīng)子功 能(圖6，灰線)。相反，脫巖藻糖基化變體不受NHS影響(圖6， 黑線)，另外與FCS以及NHS中野生型IGN311相比有一個有利的 ECs。值。另外，數(shù)據(jù)表明，治療性抗體的糖基工程化可補(bǔ)償內(nèi)源IgG 介導(dǎo)的體內(nèi)的抗體依賴性細(xì)胞毒性的抑制。
裂解潛能是在EC5():在10。/。FCS中，對親本IGN311野生型和糖 修飾IG腿4分別0.301jig/ml (95%CI:0.169-0.537)和0.052ng/ml
(95%CI:0.028-0.094 )，和在40%的NHS中，親本IGN311和糖修 飾IGN314分別為1.558ng/ml ( 95%CI:0.989-2.457)和0.126ng/ml
(95%CI:0.065-0.244 )時評估的。利用GraphPad Prism軟件計算EC50 值。
另外，經(jīng)典的基于抗體的治療的局限性是效應(yīng)子細(xì)胞上的 Fcy-RIII受體有功能多態(tài)現(xiàn)象。在人群中出現(xiàn)頻率低的FcyRIII-158v 同工型顯示與天然和糖工程化抗體有高親和力，而占優(yōu)勢的同工型 FcyRIII-158F與糖工程化抗體只有低親和力。所以，糖工程化在人血 清中溶解效應(yīng)子功能增強(qiáng)的基礎(chǔ)上，劇烈地增加了對被動抗體治療的 臨床應(yīng)答子的數(shù)目。這些數(shù)據(jù)一起很強(qiáng)烈地暗示，治療性抗體的糖修 飾預(yù)期在人中轉(zhuǎn)化成較多的ADCC活性。
C-末端賴氨酸
血清來源的，以及重組生成的IgGl分子顯示了與它們的C，末端 Lys殘基的出現(xiàn)相關(guān)的微異質(zhì)性。保守的C-末端Lys殘基的(部分) 切割是細(xì)胞中的堿性羧肽酶的作用催化的翻譯后事件(Lazar等人， 質(zhì)"i普快報(18) ， 3， 239-244， 2004)。
對于兩個C-末端經(jīng)胰蛋白酶肽變體("SLSLSPGK"和 "SLSLSPG-")相關(guān)的人多克隆IgG的分析顯示在樣品中只存在加工過的變體("SLSLSPG-")。相似地，Lys缺乏變體發(fā)現(xiàn)唯一地存在于rAb IGN314 (在蘚類細(xì)胞中表達(dá))的樣品中。與這些結(jié)果相反的是，在樣 品IGN311中檢測到兩個肽變體(圖7)。
權(quán)利要求
1.包含經(jīng)修飾的抗原特異性動物抗體或其衍生物或片段的抗體制劑，其特征在于，●所述抗體或其衍生物或片段包含無巖藻糖和木糖的N-聚糖結(jié)構(gòu)，且●至少90％、優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少100％的所述經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段缺乏C-末端賴氨酸殘基。
2. 權(quán)利要求l的抗體制劑，其特征在于，所述抗體或其衍生物或 片段的N-聚糖結(jié)構(gòu)也無半乳糖。
3. 權(quán)利要求1或2的抗體制劑，其特征在于，所述未經(jīng)修飾的抗 體制劑與所述經(jīng)修飾的抗體或其衍生物或片段的制劑具有相同的抗原 親和力。
4. 權(quán)利要求l-3中任一項的抗體制劑，其特征在于，相比未經(jīng)修 飾的特異于同一抗原的動物抗體制劑，在含有非特異性動物抗體的至少 10%的血清溶液中所述制劑的ADCC活性被少抑制至少10%，其中所 述動物優(yōu)選是哺乳動物。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項的抗體制劑，其特征在于，所述N-聚糖 結(jié)構(gòu)選 自 GlcNAc2Man3 、 GlcNAc2Man3GlcNAc 或 GlcN Ac2Man3GlcNAc2 。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項的抗體制劑，其特征在于，所迷ADCC 效應(yīng)子功能相比未經(jīng)修飾的動物抗體制劑提高至少5倍、優(yōu)選至少10 倍、特別優(yōu)選至少20倍、更優(yōu)選至少30倍，再更優(yōu)選至少40倍，最 優(yōu)選至少50倍，其中所述未經(jīng)修飾的動物抗體優(yōu)選特異于同一抗原。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項的抗體制劑，其特征在于，不到50%、 優(yōu)選不到30%、更優(yōu)選不到10%的所述抗體、其衍生物或片段缺乏N-聚糖結(jié)構(gòu)。
8. 權(quán)利要求l-7中任一項的抗體制劑，其特征在于，所述動物是哺乳動物，優(yōu)選是人或駱駝或小鼠。
9. 權(quán)利要求1-8中任一項的抗體制劑，其特征在于，相比特異于 同一抗原的未經(jīng)修飾的動物抗體制劑，在含有非特異性動物抗體的至少 10%、優(yōu)選至少40%的血清溶液中所述制劑的ADCC活性被少抑制至 少15% 、優(yōu)選至少20%。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項的抗體制劑，其特征在于，在非特異性 抗體溶液中所述制劑的ADCC活性被少抑制至少20% 、優(yōu)選至少30% 。
11. 權(quán)利要求1-11中任一項的抗體制劑，其特征在于，所述經(jīng)修 飾的動物抗體或其衍生物或片段是嵌合抗體，人源化抗體或人抗體。
12. 權(quán)利要求1-11中任一項的抗體制劑，其特征在于，相比特異 于同一抗原的未經(jīng)修飾的抗體制劑，CDC活性降低至少10%。
13. 權(quán)利要求1-12中任一項的抗體制劑，其特征在于，所述制劑 是IgG抗體或其片段或衍生物的制劑。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項的抗體制劑，其特征在于，所述制劑 是單克隆抗體、其片段或衍生物的制劑。
15. 權(quán)利要求1-14中任一項的抗體制劑，其特征在于，相比特異 于同一抗原的未經(jīng)修飾的動物抗體制劑，在含有非特異性動物抗體的至 少10%、優(yōu)選至少40%的血清溶液中經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段 與CD16^!^的結(jié)合被少抑制至少10%。
16. 權(quán)利要求1-15中任一項的抗體制劑，其特征在于，相比特異 于同一抗原的未經(jīng)修飾的動物抗體制劑，在含有非特異性動物抗體的至 少10%、優(yōu)選至少40%的血清溶液中經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段 的靶的受具有任一 CD16is8基因型的效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解被少抑制 至少10%。
17. 可通過在缺失p-l、 2-木糖基轉(zhuǎn)移酶和a-l、 3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 活性的細(xì)胞中表達(dá)編碼抗體、其片段或衍生物的核酸而得到的抗體制 劑，其中所述細(xì)胞優(yōu)選是植物細(xì)胞。
18. 權(quán)利要求17的抗體制劑，其特征在于，所述細(xì)胞缺失半乳糖 基轉(zhuǎn)移酶。
19. 權(quán)利要求17或18的抗體制劑，其特征在于，將所述細(xì)胞修飾 為具有GnTIII活性。
20. 權(quán)利要求1-19中任一項的抗體制劑，其特征在于，所述制劑 的經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段是爬行動物的，優(yōu)選是聘魚的。
21. 于藥物載體或稀釋劑中含有權(quán)利要求1-20中任一項的抗體制 劑的藥物制劑。
22. 權(quán)利要求1-21中任一項的抗體制劑在制備用于為了分別降低 或抑制患者腫瘤細(xì)胞生長而進(jìn)行預(yù)防和/或治療性處理的藥劑中的用 途，其中所述患者優(yōu)選是人或哺乳動物。
23. 權(quán)利要求22的制劑的用途，其中相比使用特異于同一抗原的 未經(jīng)修飾的抗體，腫瘤細(xì)胞的生長降低提高至少5%、優(yōu)選至少10%、 更優(yōu)選至少20%、再更優(yōu)選超過30。/。、最優(yōu)選超過50%。
24. 權(quán)利要求1-21中任一項的制劑在制備用于治療實體癌癥的藥 劑中的用途。
25. 權(quán)利要求24的用途，其用于治療上皮來源的實體癌癥。
26. 權(quán)利要求1-21中任一項的制劑在最少殘留疾病的治療中的用途。
27. 權(quán)利要求22-26中任一項的用途，用于被動免疫治療。
28. 權(quán)利要求22-27中任一項的用途，其中所述抗體或抗體混合物 的使用劑量為至少lmg/劑、優(yōu)選至少10mg/劑，更優(yōu)選至少50mg/劑。
29. 權(quán)利要求1-21中任一項的抗體制劑在體外篩選方法中的用途， 所述方法包括提供受試者樣品和檢測所述抗體與所述樣品中的抗原的 結(jié)合事件，其中所述受試者優(yōu)選是人。
30. 制備權(quán)利要求1-20中任一項的抗體制劑的方法，其特征在于， 在缺失pi、 2-木糖基轉(zhuǎn)移酶活性和al、 3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的細(xì)胞中 表達(dá)所述抗體、片段或衍生物，其中所述細(xì)胞優(yōu)選是植物細(xì)胞。
31. 權(quán)利要求30的方法，其特征在于，所述細(xì)胞缺失l、 4-半乳糖 基轉(zhuǎn)移酶活性。
32. 權(quán)利要求30或31的方法，其特征在于，用于表達(dá)所迷抗體、片段或衍生物的編碼所述抗體、片段或衍生物的DNA缺乏C-末端賴氨 酸的密碼子。
33.權(quán)利要求30或31的方法，其特征在于，優(yōu)選通過羧肽酶，或 在體內(nèi)通過選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)條件，優(yōu)選通過選擇動物細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)，來除去所述抗體、片段或衍生物的所述C-末端賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有經(jīng)修飾的抗原特異性動物抗體或其衍生物或片段的抗體制劑，其特征在于抗體或其衍生物或片段包含無巖藻糖和木糖的N-聚糖結(jié)構(gòu)，且至少90％、優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少100％的經(jīng)修飾的抗體、其衍生物或片段缺乏C-末端賴氨酸殘基。
文檔編號C07K16/28GK101495514SQ200780026174
公開日2009年7月29日 申請日期2007年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月11日
發(fā)明者A·內(nèi)徹斯蓋, G·戈爾, M·斯庫斯特, R·基歇斯, W·約斯特 申請人:格里革新生物技術(shù)有限公司