高半乳糖基化抗體的制作方法【專利摘要】在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容涉及高半乳糖基化的抗體、這些抗體的生產(chǎn)方法和這些抗體的使用方法?！緦＠f明】高半乳糖基化抗體[0001]相關(guān)申請[0002]本申請依據(jù)35U.S.C.§119要求享有2011年8月10日提交的美國臨時(shí)申請61/521，996和2011年12月6日提交的61/567，364的權(quán)益，將每篇的完整內(nèi)容以引用方式并入本文中。發(fā)明領(lǐng)域[0003]本發(fā)明涉及高半乳糖基化抗體，其生產(chǎn)方法以及其使用方法。[0004]發(fā)明背景[0005]治療性抗體正用于多種疾病(包括癌癥)的治療。然而，對具有改善特性的治療性抗體存在需求。[0006]發(fā)明概述[0007]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包含高半乳糖基化的抗體群的組合物。在一些實(shí)施方案中，抗體通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體也是高巖藻糖基化的。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體顯示出高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性和高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性兩者。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)高半乳糖基化的抗體群的方法。[0008]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包含抗體群的組合物，其中所述抗體群是高半乳糖基化的。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體在乳腺上皮細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體針對相同的抗原表位。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體由相同的核酸序列編碼。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%。在一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體。[0009]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包含抗體群的組合物，其中群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%，其中抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體，并且其中群中的抗體由相同的核酸序列編碼。[0010]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平為至少80%。在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平為至少90%。在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少80%。在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少90%。[0011]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包含抗體群的組合物，其中群中的抗體的半乳糖基化水平與群中的抗體的巖藻糖基化水平的比例介于0.8和1.2之間，其中抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體，并且其中群中的抗體由相同的核酸序列編碼。[0012]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有雙半乳糖基化N-聚糖的抗體。在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖和雙半乳糖基化N-聚糖兩者的抗體。在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，群中至少35%的抗體包含雙半乳糖基化N-聚糖，且群中至少5%的抗體包含單半乳糖基化N-聚糖。[0013]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，在乳腺上皮細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因生成群中的抗體。在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，經(jīng)工程化改造以表達(dá)抗體的非人哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因生成抗體群。在一些實(shí)施方案中，非人哺乳動(dòng)物是山羊、綿羊、野牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝。在一些實(shí)施方案中，非人哺乳動(dòng)物是山羊。[0014]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包含乳。[0015]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群，所述抗體群的抗體具有升高的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性水平。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是低半乳糖抗體。在一些實(shí)施方案中，低半乳糖抗體是Rituxan。[0016]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群，所述抗體群的抗體具有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是低半乳糖抗體。在一些實(shí)施方案中，低半乳糖抗體是Rituxan。[0017]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，群中的抗體是嵌合的、人源化的或完全人的抗體。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體是全長抗體。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體包含重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體是抗⑶20抗體。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體的輕鏈和重鏈由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中所列的核酸序列編碼。[0018]在本文中提供的任一種組合物的一些實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)可接受載體。[0019]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了一種方法，包括將本文中提供的任一種組合物給藥于有此需要的受:試者。在一些實(shí)施方案中，受:試者患有癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是B細(xì)胞淋巴瘤。在一些實(shí)施方案中，受試者患有免疫疾病。[0020]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了用于生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群的方法，包括在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生抗體群，使得生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括收集生產(chǎn)的抗體群。[0021]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群的方法，包括收集經(jīng)工程化改造以表達(dá)抗體的乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的高半乳糖基化抗體群。[0022]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括測定抗體群的⑶C活性。[0023]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對所述抗體群與不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群比較CDC活性。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的。[0024]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括測定抗體群的ADCC活性。[0025]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對所述抗體群與不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群比較ADCC活性。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的。[0026]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括測定抗體群的半乳糖基化水平。[0027]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，乳腺上皮細(xì)胞是在培養(yǎng)物中，并且用包括編碼抗體的序列的核酸轉(zhuǎn)染。[0028]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述乳腺上皮細(xì)胞在非人哺乳動(dòng)物中，所述非人哺乳動(dòng)物經(jīng)工程化改造以在其乳腺中表達(dá)包含編碼所述抗體的序列的核酸。[0029]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，乳腺上皮細(xì)胞是山羊、綿羊、野牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝乳腺上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，乳腺上皮細(xì)胞是山羊乳腺上皮細(xì)胞。[0030]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平為至少80%。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平為至少90%。[0031]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少80%。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少90%。[0032]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平與群中的抗體的巖藻糖基化水平的比例介于0.8和1.2之間。[0033]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體。[0034]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有雙半乳糖基化N-聚糖的抗體。[0035]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖和雙半乳糖基化N-聚糖兩者的抗體。[0036]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，群中至少35%的抗體包含雙半乳糖基化N-聚糖，且群中至少5%的抗體包含單半乳糖基化N-聚糖。[0037]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化抗體群，使得群中抗體的半乳糖基化水平為至少70%。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化抗體群，使得群中抗體的半乳糖基化水平為至少80%。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化抗體群，使得群中抗體的半乳糖基化水平為至少90%。[0038]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化抗體群，使得群中抗體的巖藻糖基化水平為至少80%。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化抗體群，使得群中抗體的巖藻糖基化水平為至少90%。[0039]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括純化抗體群，使得群中的抗體的半乳糖基化水平與群中的抗體的巖藻糖基化水平的比例介于0.8和1.2之間。[0040]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體。[0041]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有雙半乳糖基化N-聚糖的抗體。[0042]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖和雙半乳糖基化N-聚糖兩者的抗體。[0043]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，群中至少35%的抗體包含雙半乳糖基化N-聚糖，且群中至少5%的抗體包含單半乳糖基化N-聚糖。[0044]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，群中的抗體針對相同的抗原表位。[0045]在本文中提供的任一種方法的一些實(shí)施方案中，群中的抗體是抗CD20抗體。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體的輕鏈和重鏈由SEQIDNO:1和SEQIDN0:2中所列的核酸序列編碼。[0046]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了表達(dá)本文中提供的任一種抗體群的乳腺上皮細(xì)胞。[0047]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包含本文中提供的任一種乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。[0048]本發(fā)明的每一個(gè)限定可以包括本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案。因此，預(yù)期涉及任一個(gè)要素或要素組合的本發(fā)明的每一個(gè)限定可以包括在本發(fā)明的每個(gè)方面中。本發(fā)明在其應(yīng)用上不限于以下描述中所列的或附圖中說明的構(gòu)造的詳細(xì)內(nèi)容和組件的重排。本發(fā)明能夠存在其他實(shí)施方案并且可以以各種方式來實(shí)施或進(jìn)行。此外，本文中所用的措辭和術(shù)語是用于描述的目的，并且不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限制。[0049]附圖簡述[0050]圖1顯示了Tg20的輕鏈(SEQIDNO:1;圖1A)和重鏈(SEQIDNO:2;圖1B)的序列。[0051]圖2顯示了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗⑶20抗體(TG20)的分子策略。[0052]圖3顯示了Tg20、低巖藻糖參照抗體和MW標(biāo)準(zhǔn)品(Std)在非還原或還原條件下的SDS-PAGE;經(jīng)考馬斯藍(lán)染色(左側(cè)小圖)和經(jīng)銀染色(右側(cè)小圖)；以kDa計(jì)的表觀分子量。[0053]圖4顯示了經(jīng)2-AB標(biāo)記的從Tg20用PNG酶F釋放的N-聚糖的NP-HPLC圖譜(profile)ο[0054]圖5顯示了Tg20的尺寸排阻圖譜。[0055]圖6顯示了全血測定法的實(shí)驗(yàn)條件。[0056]圖7顯示了用于產(chǎn)生TG20表達(dá)山羊的方法。[0057]圖8顯示了Tg20和Rituxan的功能性的比較。[0058]圖9顯示了用于Tg20和Rituxan(RTX)的ADCC/CDC16測定法的結(jié)果。[0059]圖10顯示了Tg20和RTX在獼猴中的藥動(dòng)學(xué)概況。[0060]圖11顯示了Tg20和RTX在獼猴中的藥理學(xué)活性。[0061]圖12A和12B顯示了血液中殘余淋巴B細(xì)胞(⑶45+/⑶3-/⑶4+)的百分比的單獨(dú)動(dòng)力學(xué)。[0062]圖13顯示了血液中殘余淋巴B細(xì)胞(⑶45+/⑶3-/⑶4+)的均值百分比的動(dòng)力學(xué)，針對所有研究動(dòng)物。[0063]圖14顯示了血液中殘余淋巴B細(xì)胞(⑶45+/⑶3-/⑶4+)的均值百分比的動(dòng)力學(xué)，只針對恢復(fù)動(dòng)物。[0064]圖15顯示了淋巴結(jié)中淋巴B細(xì)胞(⑶45+/⑶3-/⑶4+)的相對百分比的單獨(dú)動(dòng)力學(xué)。[0065]圖16顯示了淋巴結(jié)中淋巴B細(xì)胞(⑶45+/⑶3-/⑶4+)的均值相對百分比的動(dòng)力學(xué)，針對所有研究動(dòng)物。[0066]圖17顯示了與對照組均值相比較時(shí)，淋巴結(jié)中淋巴B細(xì)胞(⑶45+/⑶3-/⑶4+)的殘余百分比的單獨(dú)動(dòng)力學(xué)。[0067]圖18顯示了與對照組均值相比較時(shí)，淋巴結(jié)中淋巴B細(xì)胞(⑶45+/⑶3-/⑶4+)的平均殘余百分比的動(dòng)力學(xué)，針對所有研究動(dòng)物。[0068]發(fā)明詳述[0069]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了高半乳糖基化抗體群的組合物。在一些實(shí)施方案中，通過轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)抗體。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體也是高巖藻糖基化的。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體顯示出高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性和高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性兩者。在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了用于生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群的方法。[0070]糖基化[0071]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了高半乳糖基化抗體群的組合物。在一些實(shí)施方案中，在乳腺上皮細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群。在一些實(shí)施方案中，抗體群中的抗體針對相同抗原表位。在一些實(shí)施方案中，抗體群中的抗體由相同的核酸序列編碼。[0072]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包含高半乳糖基化抗體群的組合物，其中抗體群包含單半乳糖基化N-聚糖。在一些實(shí)施方案中，通過轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)抗體群。在一些實(shí)施方案中，抗體群中的抗體由相同的核酸序列編碼。[0073]抗體可以在Fe-Y糖基化位點(diǎn)(Fe區(qū)的Asn297)處被糖基化。在FeY糖基化位點(diǎn)處已經(jīng)觀察到多種糖基化模式，并且在該位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的寡糖包括半乳糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNac)、甘露糖、唾液酸或N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)和巖藻糖。在這些位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的寡糖(N-聚糖)全部具有共同的核心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由附接天冬酰胺的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)組成，所述天冬酰胺與第二個(gè)GIcNAc和三個(gè)甘露糖附接。該核心可以攜帶多個(gè)不同的聚糖基序。血漿蛋白質(zhì)的最常見類型的N-聚糖是復(fù)合型。在該N-聚糖型的生物合成途徑中，幾種GlcNAc轉(zhuǎn)移酶將GlcNAc殘基連接至聚糖核心的甘露糖,所述聚糖核心可以通過半乳糖、唾液酸和巖藻糖殘基進(jìn)一步延伸。N-聚糖的另一個(gè)基團(tuán)是高甘露糖糖蛋白，其特征在于附接于第二個(gè)GIcNAc的多個(gè)(五個(gè)或更多個(gè))甘露糖。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了混雜結(jié)構(gòu)，其中雙觸角臂之一是取代的甘露糖，而另一條臂是復(fù)合的。通常在雙-觸角結(jié)構(gòu)的“臂”中沒有發(fā)現(xiàn)巖藻糖殘基，而是附接于N-連接的GlcNAc。[0074]N-聚糖的生物合成不受模板調(diào)控，蛋白質(zhì)就是如此，而是主要依賴于細(xì)胞中特定糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和活性。因此，糖蛋白，如抗體Fe結(jié)構(gòu)域，通常作為在相同的蛋白質(zhì)主鏈上攜帶不同聚糖的異質(zhì)糖形群存在。[0075]可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法來測定糖基化模式。例如，美國專利申請US2006/0057638和US2006/0127950中已經(jīng)描述了分析蛋白質(zhì)上的碳水化合物的方法。分析蛋白質(zhì)上的碳水化合物的方法通過弓I用方式并入本文中。[0076]高半乳糖基化的抗體群是如下的抗體群，其中群中的抗體的半乳糖基化水平為至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%半乳糖基化。在高半乳糖基化的抗體群的一些實(shí)施方案中，群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%。[0077]通過以下公式來測定本文中所用的半乳糖基化水平:[0078]￡(GeI的數(shù)S)*(7r相對面積jM.100Y(.4的數(shù)_)相對《I軹I[0079]其中:[0080]-η表示色譜圖的分析的N-聚糖峰的數(shù)目，所述色譜例如正相高效液相色譜(NPHPLC)譜。[0081]-“Gal的數(shù)目”表示對應(yīng)于峰的聚糖觸角上的半乳糖基序的數(shù)目，和[0082]-“A的數(shù)目”對應(yīng)于與峰對應(yīng)的聚糖形式N-乙酰葡糖胺觸角的數(shù)量，以及[0083]-“％相對面積”對應(yīng)于相應(yīng)峰下的面積％。[0084]因此，可以通過從抗體釋放N-聚糖，在色譜圖上解析N-聚糖，鑒定對應(yīng)于特定峰的N-聚糖，測定峰強(qiáng)度，并將數(shù)據(jù)應(yīng)用于以上提供的公式中，從而測定群中的抗體的半乳糖基化水平(還可以參見本文中提供的實(shí)驗(yàn)部分)。[0085]半乳糖基化的抗體包括具有至少一個(gè)半乳糖單糖的任何抗體。這樣的抗體包括在“觸角”的兩條臂上具有復(fù)合聚糖基序的抗體和僅在一條臂上具有復(fù)合聚糖基序的抗體。包括至少一個(gè)半乳糖單糖的抗體包括具有如Gl(—個(gè)半乳糖)、GlF(—個(gè)半乳糖，一個(gè)巖藻糖)、G2(兩個(gè)半乳糖)和G2F(兩個(gè)半乳糖，一個(gè)巖藻糖)等N-聚糖的抗體。此外，包括至少一個(gè)半乳糖單糖的N-聚糖可以是唾液酸化的或不是唾液酸化的。[0086]在高半乳糖基化的抗體群的一些實(shí)施方案中，群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體，所述N-聚糖可以是或可以不是唾液酸化的，并且完全或部分對應(yīng)于A2G1F形式。在高半乳糖基化抗體群的一些實(shí)施方案中，至少1%，至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%的抗體N-聚糖包含單半乳糖基化N-聚糖。在高半乳糖基化抗體群的一些實(shí)施方案中，至少5%的抗體包含單半乳糖基化N-聚糖。[0087]在高半乳糖基化抗體群的一些實(shí)施方案中，所述群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體，所述N-聚糖可以是或可以不是唾液酸化的，并且完全或部分對應(yīng)于A2G1F形式，且包含含有雙半乳糖基化N-聚糖的抗體，所述N-聚糖可以是或不是唾液酸化的，并且完全或部分對應(yīng)于A2G2F形式。在高半乳糖基化抗體群的一些實(shí)施方案中，至少1%，至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至99%的抗體N-聚糖包含單半乳糖基化N-聚糖，并且至少1%，至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至99%的抗體N-聚糖包含雙半乳糖基化N-聚糖。在高半乳糖基化的抗體N-聚糖群的一些實(shí)施方案中，至少5%的抗體N-聚糖包括單半乳糖基化N-聚糖，而至少35%抗體包括雙半乳糖基化N-聚糖。[0088]在高半乳糖基化抗體群的一些實(shí)施方案中，所述群包含高巖藻糖基化的抗體。高巖藻糖基化的抗體群是如下的抗體群，其中群中的抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平為至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%的巖藻糖基化。在高半乳糖基化的抗體群的一些實(shí)施方案中，抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平為至少80%。[0089]通過以下公式來測定本文中所用的巖藻糖基化水平:[0090]￡m藻_-1iaj.(%相對而積j[0091]其中:[0092]-η表示色譜圖的分析N-聚糖峰的數(shù)目，如正相高效液相色譜(NPHPLC)0[0093]-“巖藻糖數(shù)目”表示對應(yīng)于峰的聚糖上的巖藻糖基序的數(shù)目，和[0094]-“％相對面積”對應(yīng)于含有巖藻糖基序的相應(yīng)峰下的面積％。[0095]巖藻糖基化抗體包括在其N-聚糖上具有至少一個(gè)巖藻糖單糖的任何抗體。[0096]在一些實(shí)施方案中，本文中公開的抗體群涉及如下的群，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平為至少50%，且群中抗體的巖藻糖基化水平為至少50%。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的抗體群涉及如下的群，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平為至少50%，且群中抗體的巖藻糖基化水平為至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的抗體群涉及如下的群，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平為至少60%，且群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平為至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的抗體群涉及如下的群，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平為至少70%，且群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平為至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的抗體群涉及如下的群，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平為至少80%，且群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平為至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的抗體群涉及如下的群，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平為至少90%，且群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平為至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%。在一些實(shí)施方案中，本文中公開的抗體群涉及如下的群，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平為高達(dá)100%，且群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平為至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%。[0097]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容涉及包含抗體群的組合物，在所述抗體群中，F(xiàn)c-Y糖基化位點(diǎn)處半乳糖基化的抗體N-聚糖的百分比與群中Fe-Y-糖基化位點(diǎn)處巖藻糖基化的抗體N-聚糖的百分比具有特定比例。在一些實(shí)施方案中，公開內(nèi)容涉及包含抗體群的組合物，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平與群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平具有特定的比例。在一些實(shí)施方案中，所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體N-聚糖，所述單半乳糖基化N-聚糖可以是或可以不是唾液酸化的，并且完全或部分對應(yīng)于A2G1F形式。在一些實(shí)施方案中，所述抗體群中的抗體針對相同抗原表位。在一些實(shí)施方案中，所述抗體群中的抗體由相同的核酸序列編碼。在一些實(shí)施方案中，公開內(nèi)容涉及包含抗體群的組合物，其中群中的抗體N-聚糖的半乳糖基化水平與群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平的比例介于0.5和2之間，0.6和1.8之間，0.7和1.5之間，0.8和1.2之間，或0.9和1.1之間。在一些實(shí)施方案中，公開內(nèi)容涉及包含抗體群的組合物，其中群中抗體N-聚糖的半乳糖基化水平與群中抗體N-聚糖的巖藻糖基化水平的比例介于0.8和1.2之間，例如為I。[0098]高半乳糖基化抗體的產(chǎn)生[0099]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包含高半乳糖基化的抗體群的組合物。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化的抗體群是通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，所述抗體群在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，對所述細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行過修飾，以提高抗體半乳糖基化的量，例如，通過將半乳糖基轉(zhuǎn)移酶加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，或通過將導(dǎo)致半乳糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)量升高的遺傳物質(zhì)加入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)所述抗體群，并且隨后通過體外生化反應(yīng)進(jìn)行修飾，以附接(額外)半乳糖。[0100]在一些實(shí)施方案中，通過轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)高半乳糖基化的抗體群。在一些實(shí)施方案中，在乳腺上皮細(xì)胞中生產(chǎn)抗體群。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)工程化改造以表達(dá)抗體的非人哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生抗體群。在一些實(shí)施方案中，非人哺乳動(dòng)物是山羊、綿羊、野牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝。在一些實(shí)施方案中，非人哺乳動(dòng)物是山羊。在一些實(shí)施方案中，包含高半乳糖基化抗體群的組合物進(jìn)一步包括乳。[0101]根據(jù)本文中公開的方法轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗體群是高半乳糖基化且高巖藻糖基化的。本領(lǐng)域提供高甘露糖抗體/低巖藻糖抗體已經(jīng)通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生(參見例如，W02007/048077)。[0102]CDC活性[0103]在一個(gè)方面中，包含高半乳糖基化的抗體群的組合物具有高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性。在一個(gè)方面中，包含高半乳糖基化的抗體群的組合物具有高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。在一些實(shí)施方案中，包含高半乳糖基化的抗體群的組合物具有高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性，并且具有高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。[0104]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化的抗體群在與低半乳糖的抗體群相比時(shí)具有升高的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性水平。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化的抗體群和低半乳糖的抗體群針對相同的抗原表位。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化的抗體群和低半乳糖的抗體群由相同核酸編碼。[0105]如本文中所用的低半乳糖的抗體群指的是如下的抗體群，其中群中的抗體半乳糖基化水平低于50%，低于40%，低于30%，低于20%，低于10%，低至0%。[0106]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化的抗體群的CDC活性在與低半乳糖的抗體群相比時(shí)，高至少1.1倍，高至少1.2倍，高至少1.3倍，高至少1.4倍，高至少1.5倍，高至少1.6倍，高至少1.7倍，高至少1.8倍，高至少1.9倍，高至少2倍，高至少3倍，高至少5倍，高至少10倍，直至高至少100倍或更高。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群的⑶C活性在與低半乳糖的抗體群相比時(shí)高至少1.5倍。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群的CDC活性在與低半乳糖抗體群相比時(shí)高至少3倍。[0107]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化的抗體群是高巖藻糖基化的。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群在與低半乳糖且低巖藻糖的抗體群相比時(shí)具有升高的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性水平。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群以及低半乳糖且低巖藻糖的抗體群針對相同的抗原表位。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群以及低半乳糖且低巖藻糖的抗體群由相同核酸編碼。[0108]如本文中所用的低巖藻糖的抗體群指的是如下的抗體群，其中群中抗體的巖藻糖基化水平低于50%，低于40%，低于30%，低于20%，低于10%，低至0%。[0109]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群的CDC活性在與低半乳糖且低巖藻糖相比時(shí)高至少1.1倍，高至少1.2倍，高至少1.3倍，高至少1.4倍，高至少1.5倍，高至少1.6倍，高至少1.7倍，高至少1.8倍，高至少1.9倍，高至少2倍，高至少3倍，高至少5倍，高至少10倍，直至高至少100倍或更高。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群的CDC活性在與低半乳糖且低巖藻糖的抗體群相比時(shí)高至少1.5倍。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群的CDC活性在與低半乳糖和低巖藻糖的抗體群相比時(shí)高至少3倍。[0110]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群具有升高的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性水平。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群是在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗體群是Rituxan。在一些實(shí)施方案中，在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的高半乳糖基化抗體群和不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群可以由相同核酸編碼。[0111]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的CDC活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群高至少1.1倍，高至少1.2倍，高至少1.3倍，高至少1.4倍，高至少1.5倍，高至少1.6倍，高至少1.7倍，高至少1.8倍，高至少1.9倍，高至少2倍，高至少3倍，高至少5倍，高至少10倍，直至高至少100倍或更高。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的CDC活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群高至少1.5倍。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的CDC活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群高至少3倍。[0112]在一個(gè)方面中，本文中公開的抗體群的組合物具有高(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)CDC活性?？贵w可以通過各種機(jī)制起到治療劑作用，其中一種機(jī)制是通過CDC活性。結(jié)合靶細(xì)胞受體(如CD20)的一些治療性抗體也可以結(jié)合補(bǔ)體途徑的蛋白質(zhì)。補(bǔ)體蛋白的結(jié)合導(dǎo)致補(bǔ)體級(jí)聯(lián)(通過Cl-復(fù)合物激活)，其最終導(dǎo)致形成“膜攻擊復(fù)合物”，其對與治療性抗體結(jié)合的細(xì)胞引起細(xì)胞裂解和死亡(參見例如ReffM.E.Bloodl994，83:435)。認(rèn)為至少部分通過誘導(dǎo)CDC活性發(fā)揮其治療作用的治療性抗體的一個(gè)實(shí)例是利妥昔單抗(Rituxan)，其可以結(jié)合⑶20(其在某些淋巴瘤細(xì)胞上過表達(dá))。[0113]在一些實(shí)施方案中，具有升高的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性水平的抗體群是與沒有升高的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性水平的抗體群相比誘導(dǎo)更大量細(xì)胞裂解的抗體群。用于測定CDC水平的方法是本領(lǐng)域已知的并且常常是基于測定細(xì)胞裂解的量。用于測定⑶C活性的商業(yè)試劑盒可以例如購自Genscript(Piscataway,NJ)。[0114]ADCC活性[0115]在一個(gè)方面中，包含高半乳糖基化抗體群的組合物具有高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性。在一個(gè)方面中，包含高半乳糖基化抗體群的組合物具有高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。在一些實(shí)施方案中，包含高半乳糖基化抗體群的組合物具有高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性并具有高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。[0116]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群在與低半乳糖抗體群相比時(shí)具有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)水平。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群的ADCC活性在與低半乳糖抗體群相比時(shí)高至少1.1倍，高至少1.2倍，高至少1.3倍，高至少1.4倍，高至少1.5倍，高至少1.6倍，高至少1.7倍，高至少1.8倍，高至少1.9倍，高至少2倍，高至少3倍，高至少5倍，高至少10倍，直至高至少100倍或更高。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群的ADCC活性在與低半乳糖抗體群相比時(shí)高至少2倍。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群的ADCC活性在與低半乳糖抗體群相比時(shí)高至少5倍。[0117]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群具有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的ADCC活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群高至少1.1倍，高至少1.2倍，高至少1.3倍，高至少1.4倍，高至少1.5倍，高至少1.6倍，高至少1.7倍，高至少1.8倍，高至少1.9倍，高至少2倍，高至少3倍，高至少5倍，高至少10倍，直至高至少100倍或更高。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的ADCC活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群高至少2倍。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的⑶C活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群高至少5倍。[0118]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群具有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群是在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗體群是Rituxan。[0119]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化的抗體群是高巖藻糖基化的。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群相對于低半乳糖且低巖藻糖的抗體群具有顯著百分比的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化抗體群的ADCC活性在與低半乳糖且低巖藻糖的抗體群相比時(shí)具有至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%或更高。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化且高巖藻糖基化的抗體群的ADCC活性在與低半乳糖且低巖藻糖抗體群相比時(shí)為至少40%。[0120]在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群相對于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群具有顯著百分比的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。在一些實(shí)施方案中，在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的高半乳糖基化抗體群和不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群可以由相同核酸編碼。在一些實(shí)施方案中，不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的ADCC活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群，為至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，直至100%或更高。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的ADCC活性相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群為至少40%。[0121]在一個(gè)方面中，本文中公開的抗體群的組合物具有高ADCC活性。抗體可以通過各種機(jī)制起治療劑作用，所述機(jī)制之一是通過ADCC活性。結(jié)合靶細(xì)胞上的細(xì)胞受體(如CD20)并且包括Fe糖基化位點(diǎn)的治療性抗體還可以結(jié)合Fe-受體(如⑶16),導(dǎo)致表達(dá)Fe受體的細(xì)胞錨定至靶細(xì)胞?？贵wFe區(qū)的結(jié)合親和性通常依賴于Fe糖基化位點(diǎn)的糖基化性質(zhì)。在多種免疫細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了Fe受體，所述免疫細(xì)胞包括天然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞。結(jié)合Fe受體產(chǎn)生免疫細(xì)胞誘導(dǎo)性細(xì)胞因子(如IL-2)和吞噬作用，以殺滅靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，具有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平的抗體群是與沒有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平的抗體群相比顯示出對CD16表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合增加的抗體群。在一些實(shí)施方案中，具有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平的抗體群是與沒有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平的抗體群相比顯示出誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)生增加(例如，在天然殺傷細(xì)胞中)的細(xì)胞群。用于測定ADCC活性的商業(yè)試劑盒可以購自例如Genscript(Piscataway,NJ)和Promega(Madison,WI)。[0122]B-細(xì)胞消減[0123]在一個(gè)方面中，包含高半乳糖基化的抗體群的組合物具有高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性。在一個(gè)方面中，包含高半乳糖基化的抗體群的組合物具有高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。在一些實(shí)施方案中，包含高半乳糖基化抗體群的組合物具有高補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性并且具有高抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。在一些實(shí)施方案中，包含高半乳糖基化抗體群的組合物具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)B細(xì)胞消減的能力(例如，在血液樣品或受試者中)。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化并且具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)B細(xì)胞消減的能力的抗體群中的抗體是抗CD20抗體。[0124]抗體[0125]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了高半乳糖基化抗體群。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群是通過轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體是嵌合的、人源化的或完全人的抗體。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體是全長抗體。在一些實(shí)施方案中，群中的抗體包含重鏈和輕鏈。[0126]在一些實(shí)施方案中，抗體群的抗體是抗CD20抗體?？笴D-20在本領(lǐng)域中有描述并且包括例如利妥昔單抗(利妥昔單抗)(Genentech)、奧法木單抗(ofatumumab)(GSK)和Ocrelizumab(Genentech)(參見例如Robak等，B1drugs2011,25:13-25)。在一些實(shí)施方案中，抗體群是抗CD20抗體的混合物。[0127]在一些實(shí)施方案中，抗體群的抗體是如下的抗體，其中群中的抗體的輕鏈和重鏈由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中所列的核酸序列編碼。[0128]如本文中所用的“抗體群”指的是一批針對相同抗原的抗體(例如，抗CD20抗體)。在一些實(shí)施方案中，抗體群的抗體針對相同抗原表位(例如，結(jié)合CD20的特定氨基酸序列的抗CD20抗體)。針對相同表位的抗體群包含具有相同CDR但具有不同非CDR區(qū)的抗體群，并且包括其中一些抗體具有一個(gè)或多個(gè)突變的抗體群，所述突變沒有改變與抗體針對的抗原表位結(jié)合的性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，抗體群的抗體可以由相同核酸來編碼。然而，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到即使抗體群中的抗體由相同核酸編碼，它們也不需要是相同的。例如，抗體可以具有不同的糖基化模式。[0129]在一些實(shí)施方案中，抗體群的抗體以相似的方式產(chǎn)生。例如，可以通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生抗體群。所述群可以源自轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗體的一次收獲物或多次收獲物。多次收獲物可以來自相同來源，例如，相同的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或可以從不同來源組合，例如，不同的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。[0130]在一些實(shí)施方案中，抗體是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗體。如本文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗體”指的是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生的抗體，即在其基因組中具有編碼待產(chǎn)生抗體的核酸序列的動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因抗體在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)器官中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因抗體在肝中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因抗體在乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)。[0131]如本文中所用的“分離的抗體”指的是基本上沒有其他具有不同抗原性特異性的抗體的抗體。然而，特異性結(jié)合抗原的表位、同種型或變體的分離抗體與其他相關(guān)抗原(例如來自其他物種的抗原)具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上沒有其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)物質(zhì)。如本文中所用的，“特異性結(jié)合”指的是結(jié)合預(yù)定抗原的抗體。通常，抗體以一定的親和力結(jié)合，該親和力比其結(jié)合預(yù)定抗原以外的非特異性抗原或密切相關(guān)抗原的親和性大至少兩倍。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中提供的抗原特異性結(jié)合靶抗原。[0132]如本文中所用的，術(shù)語“抗體”指的是包括通過二硫鍵互連的至少兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈的糖蛋白，S卩，由通過不同基因編碼的兩個(gè)相同IgH鏈和兩個(gè)相同L鏈組成的共價(jià)異四聚體。每個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為HCVR或Vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)域CH1、(^和^^組成。每個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為LCVR和')和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)域CL組成。V1^P'區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成超變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其散布有更保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。每個(gè)'由三個(gè)CR和四個(gè)FR組成，以以下順序從氨基端至羧基端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一種成分(Clq)。當(dāng)兩種蛋白質(zhì)以化學(xué)計(jì)量學(xué)量表達(dá)并且以正確的構(gòu)造自我裝配時(shí)，可以完成成熟功能性抗體分子的形成。[0133]術(shù)語“抗體”還包括其抗原結(jié)合片段。如本文中所用的，抗體的“抗原結(jié)合片段”指的是抗體中保持特異性結(jié)合抗原的能力的一個(gè)或多個(gè)部分并且包括Fe糖基化位點(diǎn)。[0134]在一些實(shí)施方案中，抗體是同種型IgG、IgA或IgD。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗體選自下組:IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAUIgA2、IgAsec、IgD、IgE或具有IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAUIgA2、IgAsec、IgD或IgE的免疫球蛋白恒定和/或可變域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是IgGl型的。在其他實(shí)施方案中，抗體是雙特異性或多特異性抗體。在再其他實(shí)施方案中，抗體是重組抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體或嵌合抗體，或這些的混合物。在一些實(shí)施方案中，嵌合抗體是非人(例如小鼠、大鼠或兔)抗體的部分與人抗體的部分的遺傳工程化融合。在一些實(shí)施方案中，嵌合抗體可以含有大約33%非人蛋白質(zhì)和67%人蛋白質(zhì)。特別關(guān)于小鼠嵌合體，它們可以經(jīng)研發(fā)用于降低由鼠抗體引發(fā)的HAMA應(yīng)答，因?yàn)樗鼈兛梢越M合鼠抗體的特異性與人抗體的有效人免疫系統(tǒng)相互作用。[0135]在一些實(shí)施方案中，抗體是嵌合或人源化抗體。如本文中所用的，術(shù)語“嵌合抗體”指的是組合鼠可變或超變區(qū)與人恒定區(qū)或恒定和可變框架區(qū)的抗體。如本文中所用的，術(shù)語“人源化抗體”指的是只保留結(jié)合人框架區(qū)的來自親本抗體的抗原結(jié)合CDR的抗體(參見ffaldmann,1991,Science252:1657)。預(yù)期這樣的保留鼠抗體結(jié)合特異性的嵌合或人源化抗體在根據(jù)本發(fā)明體外給藥用于診斷、預(yù)防或治療應(yīng)用時(shí)具有降低的免疫原性。人源化(也稱為改造(reshaping)或CDR接枝)是用于降低來自異種來源(如小鼠)的單克隆抗體的免疫原性的建立技術(shù)?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生人源化抗體。在一些實(shí)施方案中，這包括將嚙齒類互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)接枝至人框架中。然而，這種技術(shù)主要是一個(gè)重復(fù)過程并且在設(shè)計(jì)人源化抗體時(shí)多個(gè)要素起作用:CDR的長度、人框架和來自嚙齒動(dòng)物單抗的殘基取代至人框架區(qū)中(回復(fù)突變)。[0136]治療性小鼠單抗有時(shí)對于人使用不是理想的，因?yàn)镠AMA(人抗小鼠抗體)應(yīng)答中和抗體，并且將其從循環(huán)中快速清除，并且在最壞的情況中，誘導(dǎo)嚴(yán)重的變應(yīng)性超敏反應(yīng)。已經(jīng)研發(fā)了幾個(gè)策略來用人序列替代大多數(shù)鼠Ig序列，導(dǎo)致較少的副作用，同時(shí)保持功效。用于研發(fā)人治療性單抗的一種策略是用人區(qū)域替代鼠重鏈(H)和輕鏈(L)恒定區(qū)(分別SCh和CJ，或一般為非人鏈，使得所得到的嵌合抗體主要由人IgG蛋白序列組成，除了會(huì)保持非人的抗原結(jié)合域外。該策略用于Riiuxan?(利妥昔單抗抗人⑶20,Genentech)的研發(fā),其是美國批準(zhǔn)的第一種單克隆抗體，用于治療非霍奇金(non-Hodgkin)淋巴瘤。通過一些評(píng)估，提供具有人Ch和Q序列的治療性單抗應(yīng)當(dāng)消除鼠抗體蛋白質(zhì)的大約90%免疫原性。[0137]在某些實(shí)施方案中，抗體是人抗體。如本文中所用的，術(shù)語“人抗體”意圖包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過隨機(jī)或定點(diǎn)體外誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)。然而，如本文中所用的術(shù)語“人抗體”并不意圖包括其中源自另一種哺乳動(dòng)物物種(如小鼠)種系的CDR序列已經(jīng)接枝至人框架序列中的抗體(在本文中稱為“人源化抗體”)。使用攜帶人免疫系統(tǒng)部分而不是小鼠系統(tǒng)部分的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生人抗體。[0138]也可以通過對轉(zhuǎn)基因小鼠的人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座的較大部分進(jìn)行免疫來制備完全人單克隆抗體。參見例如美國專利5，591，669，5，598，369，5，545，806，5,545,807,6,150,584,以及其中引用的參考文獻(xiàn)，將其內(nèi)容通過提及并入本文中。這些動(dòng)物在遺傳上已經(jīng)經(jīng)過修飾，使得在內(nèi)源性(例如鼠)抗體的產(chǎn)生中存在功能性刪除。將動(dòng)物進(jìn)一步修飾，以含有整個(gè)或部分的人種系免疫球蛋白基因座，使得這些動(dòng)物的免疫導(dǎo)致產(chǎn)生針對目標(biāo)抗原的完全人抗體。這些小鼠(例如XenoMouse(Abgenix),HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))的免疫后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。這些單克隆抗體具有人免疫球蛋白氨基酸序列，并且因此在給藥于人時(shí)，將不會(huì)引發(fā)人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。人抗體，例如本文中提供的任一種抗體，可以是單克隆抗體、多克隆抗體或單克隆和多克隆抗體的混合物。[0139]高半乳糖基化抗體的來源[0140]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了高半乳糖基化的抗體群。在一些實(shí)施方案中，高半乳糖基化抗體群是通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的。[0141]在一些實(shí)施方案中，已經(jīng)將哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞工程化，以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠或山羊)乳中表達(dá)抗體。這種基因的表達(dá)例如在山羊β_酪蛋白調(diào)控元件的控制下。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過共轉(zhuǎn)染含有H和L鏈的分別的構(gòu)建體或同時(shí)含有這兩條鏈的一個(gè)構(gòu)建體來產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因整合至相同的染色體位點(diǎn)中，使得基因在一起傳遞給后代，并且聯(lián)合地調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，對產(chǎn)生乳蛋白的單獨(dú)乳導(dǎo)管上皮細(xì)胞優(yōu)化表達(dá)。[0142]用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建體[0143]在一些實(shí)施方案中，為了產(chǎn)生含有構(gòu)建體(例如編碼抗CD20抗體的構(gòu)建體)的原代細(xì)胞系以用于通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因山羊，可以將重鏈和輕鏈構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至原代山羊皮膚上皮細(xì)胞中，將其克隆擴(kuò)充，并且完全表征，以評(píng)估轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)完整性和染色體整合位點(diǎn)。如本文中所用的，“核轉(zhuǎn)移”指的是其中將來自供體細(xì)胞的核移植至去核卵母細(xì)胞中的克隆方法。[0144]目標(biāo)蛋白(例如抗體)的編碼序列可以如下獲得，即篩選源自所選動(dòng)物(如?；蛐∈?的基因組材料或逆翻譯的信使RNA的文庫，其獲自序列數(shù)據(jù)庫(如NCBI，Genbank)，或者獲得抗體序列，等等?？梢詫⑺鲂蛄锌寺≈梁线m的質(zhì)粒載體中，并且在合適的宿主生物體(如大腸桿菌)中擴(kuò)增。載體擴(kuò)增后，可以切出DNA構(gòu)建體，從載體的剩余部分中純化出來，并引入可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將具有整合至其基因組中的期望轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)。[0145]載體擴(kuò)增后，可以用合適的5’和3’控制序列切出DNA構(gòu)建體，從載體的剩余部位中純化出來，并且用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已經(jīng)將期望的非糖基化的相關(guān)轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)整合至其基因組中。相反，使用一些載體，如酵母人工染色體(YAC)，不必從載體取出裝配的構(gòu)建體；在這樣的情況中，可以將擴(kuò)增的載體直接用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？梢詫⒕幋a序列可操作地連接控制序列，其能夠使編碼序列在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)。[0146]適用于對轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳引導(dǎo)生成的DNA序列可以攜帶源自天然衍生的乳蛋白的5’-啟動(dòng)子區(qū)。因此，該啟動(dòng)子在激素和組織特異性因子的控制下并且在泌乳性乳腺組織中活性最大。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是山羊(caprine)β酪蛋白啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以可操作地連接指導(dǎo)蛋白質(zhì)前導(dǎo)序列生成的DNA序列，所述蛋白質(zhì)前導(dǎo)序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因蛋白通過乳腺上皮分泌至乳中。在一些實(shí)施方案中，可以添加3’-序列以提高mRNA的穩(wěn)定性，所述3’-序列可以源自天然分泌的乳蛋白。[0147]如本文中使用的，“前導(dǎo)序列”或“信號(hào)序列”是編碼蛋白質(zhì)分泌信號(hào)的核酸序列，并且在與編碼轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的下游核酸分子可操作連接時(shí)指導(dǎo)分泌。前導(dǎo)序列可以是天然的人前導(dǎo)序列，人工衍生的前導(dǎo)物，或者可以自與用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子相同的基因獲得，或者從通常自細(xì)胞(諸如哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞)分泌的另一種蛋白質(zhì)獲得。[0148]在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是乳特異性啟動(dòng)子。如本文中所用的，“乳特異性啟動(dòng)子”是天然指導(dǎo)將蛋白質(zhì)分泌至乳中的細(xì)胞(例如乳腺上皮細(xì)胞)中基因表達(dá)的啟動(dòng)子，并且包括例如酪蛋白啟動(dòng)子，例如，α-酪蛋白啟動(dòng)子(例如，aS-1酪蛋白啟動(dòng)子和aS2-酪蛋白啟動(dòng)子)、酪蛋白啟動(dòng)子(例如山羊酪蛋白啟動(dòng)子(DiTull1，B10TECHN0L0GY10:74-77，1992)、Y-酪蛋白啟動(dòng)子、κ-酪蛋白啟動(dòng)子、乳清酸性蛋白(WAP)啟動(dòng)子(Gordon等，B10TECHN0L0GY5:1183-1187，1987)、β-乳球蛋白啟動(dòng)子(Clark等，B10TECHN0L0GY7:487-492,1989)和α-乳球蛋白啟動(dòng)子(Soulier等，F(xiàn)EBSLETTS.297:13,1992)。該限定中還包括在乳腺組織中特異性激活的啟動(dòng)子，如例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)的長末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子。[0149]如本文中所用的，當(dāng)編碼序列和調(diào)控序列以如下的方式共價(jià)連接，使得將編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄置于調(diào)控序列的影響或控制下時(shí)，則將它們稱為是“可操作連接的”。為了使編碼序列翻譯成功能性蛋白質(zhì)，可以將編碼序列可操作地連接調(diào)控序列。如果誘導(dǎo)5’調(diào)控序列中的啟動(dòng)子導(dǎo)致編碼序列的轉(zhuǎn)錄并且如果兩個(gè)DNA序列之間的連接性質(zhì)沒有(I)導(dǎo)致移碼突變的引入，(2)干擾啟動(dòng)子區(qū)指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力或(3)干擾相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)的能力，則將兩個(gè)DNA序列稱為可操作連接的。因此，如果啟動(dòng)子區(qū)能夠?qū)崿F(xiàn)所述DNA序列的轉(zhuǎn)錄，使得所得到的轉(zhuǎn)錄物可以翻譯成期望的蛋白質(zhì)或多肽，則啟動(dòng)子序列可操作地連接編碼序列。[0150]如本文中所用的，“載體”可以是可以通過限制并連接插入期望序列的多種核酸中的任何一種，其用于在不同遺傳環(huán)境之間運(yùn)送或用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)。盡管RNA載體也是可利用的，但載體通常由DNA組成。載體包括但不限于質(zhì)粒和噬菌粒?？寺≥d體是如下的載體，其能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，并且還以一個(gè)或多個(gè)內(nèi)切核酸酶限制性位點(diǎn)為特征，在所述內(nèi)切核酸酶限制性位點(diǎn)處可以以可確定方式切割載體，并且可以使其連接至期望的DNA序列，使得新重組載體保持其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)粒的情況中，隨著質(zhì)粒在宿主細(xì)菌內(nèi)在拷貝數(shù)上增加，期望序列的復(fù)制可以發(fā)生多次，或隨著宿主通過有絲分裂而復(fù)制，每個(gè)宿主只發(fā)生一次。在噬菌體的情況中，復(fù)制可以在裂解期過程中主動(dòng)發(fā)生或在溶原期過程中被動(dòng)發(fā)生。表達(dá)載體是如下的載體，其可以通過限制和連接來接受期望的DNA序列的插入，使得其可操作地連接調(diào)控序列并且可以作為RNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。載體可以進(jìn)一步含有一個(gè)或多個(gè)適用于鑒定細(xì)胞的標(biāo)記物序列，所述細(xì)胞已經(jīng)或尚未用載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。標(biāo)記物包括例如編碼提高或降低對抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白質(zhì)的基因，編碼通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定法可檢測其活性的酶的基因(例如，β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶)和明顯影響經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、宿主、菌落或噬斑表型的基因。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制并且表達(dá)與其可操作連接的DNA區(qū)段中存在的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物的那些載體。[0151]轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[0152]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了表達(dá)本文中提供的任一種抗體群的乳腺上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，公開內(nèi)容提供了包括乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物，所述乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)本文中提供的任一種抗體群。[0153]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了一種用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗體及其變體和片段的方法，該方法包括在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)由核酸構(gòu)建體編碼的轉(zhuǎn)基因抗體。在一些實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的方法包括:[0154](a)用編碼期望轉(zhuǎn)基因抗體的轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞；[0155](b)選擇其中所述轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體已經(jīng)插入細(xì)胞基因組中的細(xì)胞；并[0156](c)進(jìn)行第一次核轉(zhuǎn)移程序，以產(chǎn)生在期望的轉(zhuǎn)基因抗體方面雜合的并且可以在其乳中表達(dá)該抗體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。[0157]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了以下的方法:[0158](a)提供經(jīng)工程化改造以表達(dá)抗體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，[0159](b)在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中表達(dá)抗體；并[0160](C)分離乳中表達(dá)的抗體。[0161]這樣的方法可以進(jìn)一步包括誘導(dǎo)泌乳的步驟以及測定所獲得抗體的CDC活性和/或ADCC活性的步驟。這樣的方法可以進(jìn)一步包括測定所獲得抗體的半乳糖基化和或巖藻糖基化的量或水平的步驟。該方法還可以進(jìn)一步包括其他分離和/或純化步驟。該方法還可以包括對獲得的抗體與不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生(例如在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生)的抗體比較⑶C活性和/或ADCC活性的步驟。[0162]還可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(參見例如美國專利N0.5,945,577)產(chǎn)生能夠表達(dá)重組抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。適用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的動(dòng)物包括但不限于山羊、綿羊、野牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝。合適的動(dòng)物還可以包括牛(bovine)、山羊(caprine)、綿羊(ovine)和豬(porcine),其分別涉及牛、山羊、綿羊和豬(pig或swine)的各種物種。合適的動(dòng)物還包括有蹄動(dòng)物。如本文中所用的，“有蹄動(dòng)物”是或指通常有蹄的食草四足哺乳動(dòng)物，包括但不限于綿羊、豬、山羊、牛和馬。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用含有重鏈和輕鏈的分別的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞來產(chǎn)生動(dòng)物。然后將這些細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移?；蛘?，如果使用微注射來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可以注射構(gòu)建體。[0163]克隆將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的多樣性，即每個(gè)所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠產(chǎn)生目標(biāo)抗體或其他基因構(gòu)建體。生產(chǎn)方法包括使用克隆的動(dòng)物和那些動(dòng)物的后代。在一些實(shí)施方案中，克隆的動(dòng)物是山羊、?；蛐∈蟆？寺∵€包括胎兒的核轉(zhuǎn)移、核轉(zhuǎn)移、組織和器官移植以及嵌合后代的創(chuàng)建。[0164]克隆方法的一個(gè)步驟包括將含有編碼抗體的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的基因組轉(zhuǎn)移至去核卵母細(xì)胞中。如本文中所用的，“轉(zhuǎn)基因”指的是核酸分子中通過人工插入細(xì)胞或其祖先中，并且變成從所述細(xì)胞形成的動(dòng)物的基因組的一部分的任何部分。這樣的轉(zhuǎn)基因可以包括對于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而言部分或完全外源(B卩外來)的基因，或可以表示與動(dòng)物的內(nèi)源基因具有同一性的基因。[0165]卵母細(xì)胞的合適的哺乳動(dòng)物來源包括山羊、綿羊、牛、豬、兔、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、非人靈長類動(dòng)物等。優(yōu)選地，卵母細(xì)胞獲自有蹄動(dòng)物，并且最優(yōu)選為山羊或牛。用于分離卵母細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。實(shí)質(zhì)上，所述方法包括從哺乳動(dòng)物(例如山羊)的卵巢或生殖道分離卵母細(xì)胞。容易獲得的有蹄動(dòng)物卵母細(xì)胞來源來自激素誘導(dǎo)的雌性動(dòng)物。對于成功使用技術(shù)，如遺傳工程、核轉(zhuǎn)移和克隆，優(yōu)選地，可以將卵母細(xì)胞在體內(nèi)成熟，之后可以使用這些細(xì)胞作為受體細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移，并且之后它們通過精子細(xì)胞受精以形成胚胎。已經(jīng)在體內(nèi)成熟的中期II階段卵母細(xì)胞已經(jīng)成功用于核轉(zhuǎn)移技術(shù)。實(shí)質(zhì)上，在動(dòng)情期開始后或注入人絨毛膜促性腺素(hCG)或相似激素后幾小時(shí)，通過外科手術(shù)從非超排卵或超排卵動(dòng)物收集成熟中期II卵母細(xì)胞。[0166]用于預(yù)測乳腺中表達(dá)的重組蛋白的量和質(zhì)量的工具之一是通過誘導(dǎo)泌乳(EbertKM，1994)。誘導(dǎo)的泌乳允許從轉(zhuǎn)基因生成的早期而不是從由懷孕引起的第一次自然泌乳(其至少要在一年后)起表達(dá)和分析蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^激素或手動(dòng)進(jìn)行泌乳的誘導(dǎo)。[0167]在一些實(shí)施方案中，本文中提供的高半乳糖基化抗體的組合物進(jìn)一步包括乳。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的方法包括從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中分離出抗體群的步驟。用于從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳中分離出抗體群的方法是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如Pollock等，JournalofImmunologicalMethods,第231卷，第1-2期，1999年12月10日，第147-157頁。[0168]疾病的治療[0169]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了將本文中提供的任一種組合物給藥于有此需要的受試者(如受到疾病、外傷或中毒影響的受試者)的方法。[0170]在一些實(shí)施方案中，受試者患有癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是B細(xì)胞淋巴瘤。[0171]如本文中所用的“癌癥”指的是細(xì)胞的不受控生長，其干擾身體器官和系統(tǒng)的正常功能發(fā)揮。從其最初位置轉(zhuǎn)移并且根植于(seed)重要器官的癌癥最終將通過受影響器官的功能惡化而導(dǎo)致受試者死亡。[0172]如本文中所用的癌癥包括以下類型的癌癥，B細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、蕈樣肉芽腫病(mycosisfungoides)/塞扎里綜合征(Sezarysyndrome)、組織細(xì)胞增多癥X(hist1cytosisX)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(chroniclymphocyticleukaemia)、毛細(xì)胞白血病(hairycellleukaemia)、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom’smacroglobulinaemia)、冷球蛋白血癥(cryoglobulinaemi)、重鏈病(heavychaindisease)、乳腺癌、膽管癌(biliarytractcancer);膀胱癌；腦癌，包括成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(gl1blastoma)和髓母細(xì)胞瘤(medul1blastoma);宮頸癌(cervicalcancer);絨毛膜癌(chor1carcinoma);結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌(endometrialcancer);食管癌(esophagealcancer);胃癌；白血??；血液學(xué)新生物，包括急性淋巴細(xì)胞性白血病和骨髓性白血病(myelogenousleukemia);T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞性白血病/淋巴瘤；毛細(xì)胞白血病(hairycellleukemia);慢性骨髓性白血病(chromicmyelogenousleukemia),多發(fā)性骨髓瘤；AIDS相關(guān)白血病和成年T細(xì)胞白血病淋巴瘤；上皮內(nèi)新生物，包括鮑恩(Bowen)氏病和匹克(Pager)氏?。桓伟?；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏病和淋巴細(xì)胞性淋巴瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤(neu1blastoma);口腔癌(oralcancer),包括鱗狀細(xì)胞癌(quamouscellcarcinoma);卵巢癌,包括由上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、生殖細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞引起的那些癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤(le1myosarcoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、脂肪肉瘤(Iiposarcoma)^rF維肉瘤(fibrosarcoma)和骨肉瘤(osteosarcoma);皮膚癌，包括黑素瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、基底細(xì)胞癌(basocellularcancer)和鱗狀細(xì)胞癌；睪丸癌，包括生殖細(xì)胞瘤(germinaltumor),如精原細(xì)胞瘤(seminoma)、非精原細(xì)胞瘤(畸胎瘤(teratoma)、絨毛膜癌)、基質(zhì)腫瘤和生殖細(xì)胞瘤；甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌和髓樣癌(medullarcarcinoma)；和腎癌，包括腺癌和維爾姆斯瘤(Wilmstumor)。其他癌癥會(huì)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的并且包括肥大細(xì)胞瘤(mastocytoma)、胸腺瘤(thymoma)、衆(zhòng)細(xì)胞瘤(plasmacytoma)和膠質(zhì)瘤(gl1ma)。[0173]治療方法還針對造血系統(tǒng)癌癥(hemopoieticcancer),如白血病，其能夠征服(outcompete)受試者中的正常造血區(qū)室，由此導(dǎo)致造血失敗(在貧血癥(anemia)、血小板減少(thrombocytopenia)和嗜中性白血球減少癥(neutropenia)的形式中),最終導(dǎo)致死亡。[0174]治療方法還針對對轉(zhuǎn)移的抑制。轉(zhuǎn)移是由癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤散布至身體的其他部位引起的與原發(fā)性腫瘤位置截然不同的癌細(xì)胞區(qū)域。在診斷原發(fā)性腫瘤塊時(shí)，可以對受試者監(jiān)控轉(zhuǎn)移的存在。除了監(jiān)控特定癥狀外，最常見的是通過磁共振成像(MRI)掃描、計(jì)算機(jī)斷層攝影法(computedtomography,CT)掃描、血液和血小板計(jì)數(shù)、肝功能研究、胸X-射線和骨掃描的單獨(dú)或聯(lián)合使用來檢測轉(zhuǎn)移。[0175]免疫疾病的治療[0176]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了將本文中所述的任一種組合物給藥于有此需要的受試者的方法。在一些實(shí)施方案中，受試者患有免疫疾病。[0177]本發(fā)明的組合物對于治療免疫疾病也是有用的，所述免疫疾病包括但不限于成年呼吸窘迫綜合征(adultrespiratorydistresssyndrome)、動(dòng)脈硬化(arter1sclerosis)、哮喘(asthma)、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)、膽囊炎(cholecystitis)、硬化(cirrhosis)、克羅恩(Crohn)氏病、糖尿病、肺氣腫、嗜伊紅細(xì)胞增多癥(hypereosinophilia)、炎癥(inflammat1n)、腸易激綜合征(irritablebowelsyndrome)、多發(fā)性硬化(multiplesclerosis)、重癥肌無力(myastheniagravis)、心肌或心包炎癥、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松(osteoporosis)、胰腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、硬皮病(scleroderma)、結(jié)腸炎(colitis)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus)、狼瘡腎炎(lupusnephritis)、糖尿病、炎性腸病(inflammatoryboweldisease)、乳糜灣(celiacdisease)、自體免疫性甲狀腺疾病(autoimmunethyroiddisease,)、艾迪生(Addison)氏病、舍格倫(Sjogren)氏綜合征、西德納姆氏舞蹈病(Sydenham’schorea)、高安氏動(dòng)脈炎(Takayasu'sarteritis)、韋格納氏肉芽腫病(Wegener'sgranulomatosis)>自體免疫性胃炎、自體免疫性肝炎、皮膚自體免疫性疾病、自體免疫性擴(kuò)張型心肌病、多發(fā)性硬化、心肌炎、重癥肌無力、惡性貧血、多肌痛、銀屑病、快速進(jìn)行性腎小球腎炎(rapidlyprogressiveglomerulonephritis)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎(vasculitis)、肌肉的自體免疫性疾病、睪丸的自體免疫性疾病、卵巢的自體免疫性疾病和眼的自體免疫性疾病。[0178]其他治療劑[0179]在一個(gè)方面中，將本文中提供的抗體組合物與其他治療劑一起給藥?？贵w組合物和其他治療劑可以同時(shí)或依次給藥。當(dāng)同時(shí)給藥其他治療劑時(shí)，它們可以在同一制劑或分開制劑中給藥，但同時(shí)給藥。當(dāng)其他治療劑和抗體的給藥在時(shí)間上分開時(shí)，則其他治療劑彼此及與抗體是依次給藥。這些化合物給藥之間的時(shí)間間隔可以是幾分鐘或它可以更長。[0180]其他治療劑包括例如但不限于抗癌療法?？拱﹦┓òò┌Y藥物、放射和外科手術(shù)程序。如本文中所用的，“癌癥藥物”指的是為了治療癌癥的目的而給藥于受試者的藥劑。[0181]如本文中所用的，“治療癌癥”包括預(yù)防癌癥的形成、減輕癌癥的癥狀和/或抑制已確定癌癥的生長。在其他方面中，為了降低形成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，將癌癥藥物給藥于有風(fēng)險(xiǎn)形成癌癥的受試者。本文中描述了各種類型的用于治療癌癥的藥物。為了本說明書的目的，將癌癥藥物分為化療劑、免疫治療劑、癌癥疫苗、激素治療和生物反應(yīng)修飾劑(b1logicalresponsemodifier)。[0182]化療劑可以選自下組:甲氨喋呤(methotrexate)、長春新堿(vincristine)、阿霉素(adriamycin)、順鉬(cisplatin)、非含糖氯乙基亞硝基脲類(non-sugarcontainingchloroethylnitrosoureas)、5_氟尿卩密唳、絲裂霉素C、博來霉素、多柔比星(doxorubicin)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、泰素(taxol)、fragyline、葡甲胺(Meglamine)GLA、戍柔比星(valrubicin)、卡莫司汀(carmustaine)和聚苯丙生(poliferposan)、MMI270、BAY12-9566、RAS法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(RASfamesyltransferaseinhibitor)、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(famesyltransferaseinhibitor)、MMP>MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索(Lometexol)、Glamolec,C1-994、TNP-470、和美新(Hycamtin)/托泊替康(Topotecan)、PKC412、伐司樸達(dá)(Valspodar)/PSC833、Novantrcme/米托蒽醌(Mitroxantrone)、Metaret/蘇拉明(Suramin)、巴馬司他(Batimastat)、E7070、BCH_4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZDOlOUISI641、0DN698、TA2516/馬米司他(Marmistat)、BB2516/Marmistat、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、LemonalDP2202、FK317、Picibanil/OK-432、AD32/戊柔比星、Metastron/鍶衍生物、Temodal/替莫唑胺(Temozolomide)、Evacet/脂質(zhì)體多柔比星(liposomaldoxorubicin)、Yewtaxan/帕利他塞(Paclitaxel)、泰素/帕利他塞、希羅達(dá)(Xeload)/卡培他濱(Capecitabine)、氟鐵龍(Furtulon)/去氧氟尿苷(Doxifluridine)、Cyclopax/口服帕利他塞、口服類紫杉醇(Taxoid)、SPU-077/順鉬、HMR1275/Flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制劑、BMS-182751/口服鉬、UFT(替加氟(Tegafur)/尿嘧P定)、Ergamisol/左旋咪唑、恩尿啼唳(Eniluracil)/776C85/5FU增強(qiáng)劑、Campto/左旋咪唑、Camptosar/伊立替康(Irinotecan)、Tumodex/Ralitrexed、Leustatin/克拉屈濱(Cladribine)、Paxex/帕利他塞、Doxil/脂質(zhì)體多柔比星、Caetyx/脂質(zhì)體多柔比星、Fludara/氣達(dá)拉濱(Fludarabine)ΛPharmarubicin/表柔t(yī)匕星(Epirubicin)、DepoCyt、ZD1839、LU79553/雙萘酰亞胺(Bis-Naphtalimide)、LU103793/多拉司他汀(Dolastain)、Caetyx/脂質(zhì)體多柔比星、Gemzar/吉西他濱(Gemcitabine)、ZD0473/Anormed、YM116、碘粒子(1dineseeds)、CDK4和CDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/異環(huán)憐酸胺(Ifosamide)、Vumon/替尼泊苷(Teniposide)、Paraplatin/卡鉬(Carboplatin)、Plantinol/順鉬、Vepeside/依托泊苷(Etoposide)、ZD9331、泰索帝/多西他塞(Docetaxel)、鳥^^票呤阿糖胞苷前藥(prodrugofguaninearabinoside)、紫杉焼(Taxane)類似物、亞硝基脲類(nitrosoureas)、焼化劑類，如美法侖(melphelan)和環(huán)磷酉先胺(cyclophosphamide)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、天冬酸胺酶(Asparaginase)、白消安(Busulfan)、卡鉬(Carboplatin)、氯丁酸氮芥(Chlorombucil)、鹽酸阿糖胞苷(CytarabineHCI)、更生霉素(Dactinomycin)、鹽酸柔紅霉素(DaunorubicinHCl)、雌氮芥憐酸鈉(Estramustinephosphatesodium)、依托泊苷(Etoposide)(VP16-213)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿啼卩定(5-FU)、氟他胺(Flutamide)、輕脲(Hydroxyurea)(輕基脲(hydroxycarbamide))、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)、干擾素a-2a、a-2b、醋酸亮丙瑞林(Leuprolideacetate)(LHRH釋放因子類似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、鹽酸雙氯乙基甲胺(MechlorethamineHCl)(氮芥)、巰基票呤(Mercaptopurine)、美司鈉(Mesna)、米托坦(Mitotane)(0.p’-DDD)、鹽酸米托蒽酉昆(MitoxantroneHCl)、奧曲肽(Octreotide)、普卡霉素(Plicamycin)、鹽酸丙卡巴肼(ProcarbazineHCl)、鏈佐星(Streptozocin)、他莫昔芬(TamoxifenCitrate)、硫鳥_呤(Th1guanine)、塞替派(Th1tepa)、硫酸長春減(Vinblastinesulfate)、安R丫卩定(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、促紅細(xì)胞生成素(Erthropoietin)、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)(HMM)、白介素2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG;甲基乙二醒雙丙咪腙(methylglyoxalbis-guanylhydrazone);MGBG)、噴司他丁(Pentostatin)(2’脫氧助間型霉素(2’deoxycoformycin))、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VM-26)和硫酸長春地辛(Vindesinesulfate)，但不限于此。[0183]癌癥疫苗可以選自下組:EGF、抗獨(dú)特型癌癥疫苗、Gp75抗原、GMK黑素瘤疫苗、MGV神經(jīng)節(jié)苷脂偶聯(lián)物疫苗(MGVgangl1sideconjugatevaccine)、Her2/neu、Ovarex、M-Vax>O-Vax>L-Vax>STn-KHLtheratope、BLP25(MUC-1)、脂質(zhì)體獨(dú)特型疫苗、Melacine、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基于MVA的疫苗、PACIS,BCG疫苗、TA-HPV,TA-CIN、DISC病毒和ImmuCyst/TheraCys,但不限于此。[0184]在一些實(shí)施方案中，其他治療劑是免疫治療劑。免疫治療劑包括但不限于Ributaxin、赫塞汀(Herceptin)、Quadramet>Panorex>IDEC-Y2B8、BEC2、C225、Oncolym、SMARTM195、ATRAGEN、Ovarex、Bexxar、LDP-03、1rt6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、0V103、3622W94、抗VEGF、Zenapax,MDX-220、MDX-447、MEUMMUNE-2、MELIMMUNE-UCEACIDE、Pretarget、NovoMAb_G2、TNT、Gl1mab-H、GN1-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA676、Monopharm-C、4B5、1regf.r3、1rc5、BABS,抗FLK-2、MDX-260、ANAAb、SMARTlDlOAb、SMARTABL364Ab和ImmuRAIT-CEA。[0185]藥物組合物和治療方法[0186]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了包括本文中所述的任一種高半乳糖基化抗體和藥學(xué)可接受載體的組合物。[0187]在一個(gè)方面中，公開內(nèi)容提供了將本文中所述的任一種組合物給藥于有此需要的受試者的方法。在一些實(shí)施方案中，所述受試者患有癌癥。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是B細(xì)胞淋巴瘤。在一些實(shí)施方案中，所述受試者患有免疫疾病。[0188]“受試者”應(yīng)當(dāng)指人或脊椎動(dòng)物哺乳動(dòng)物，包括但不限于犬、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊或靈長類，例如猴。[0189]本文中提供的組合物在有效量中是有用的。術(shù)語有效量指的是對于實(shí)現(xiàn)期望的生物效果必需或足夠的量。結(jié)合本文中提供的教導(dǎo)，通過在各種活性化合物和權(quán)重因子(如功效、相對生物利用率、患者體重、不利副作用的嚴(yán)重程度和優(yōu)選的給藥方式)中選擇，可以計(jì)劃有效的預(yù)防或治療處理方案，其不會(huì)引起持續(xù)的毒性而對治療特定的受試者仍然是有效的。對于任何特定應(yīng)用的有效量可以根據(jù)如待治療的疾病或病癥、待給藥的特定組合物、受試者體格或疾病或病癥嚴(yán)重程度等因素而改變。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過度實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定特定組合物的有效量。通常優(yōu)選可以使用最大劑量，即，根據(jù)合理的醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。可以考慮每天多劑來獲得合適的系統(tǒng)性化合物水平。例如，可以通過藥物的患者峰或持續(xù)血漿水平的測量來確定合適的系統(tǒng)性水平?！皠┝俊焙汀皠痹诒疚闹锌苫Q使用。[0190]如本文中所用的術(shù)語“治療”或“處理”包括防范性(例如預(yù)防性)和緩解性處理。[0191]具體地，確定治療有效量取決于如藥物的毒性和功效等因素?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法來測定毒性。可以利用相同的指導(dǎo)來測定功效。因此，藥學(xué)有效量是臨床醫(yī)生認(rèn)為毒物學(xué)可耐受的且仍然有效的量。例如，可以通過靶定組織的T-淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)或?qū)嵸|(zhì)性誘導(dǎo)或靶定組織質(zhì)量降低來測量功效。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，預(yù)期合適的劑量為約lmg/kg至10mg/kg。[0192]根據(jù)涉及將治療有效量的本文中提供的抗體組合物給藥于有此需要的受試者的實(shí)施方案，“治療有效”表示抑制或逆轉(zhuǎn)疾病狀況(例如，降低或抑制癌癥生長)需要的組合物量。一些方法涉及與已知癌癥藥物或療法(例如化療(優(yōu)選使用本文中所列種類的化合物進(jìn)行)或放療)的聯(lián)合治療。患者可以是人或非人動(dòng)物。在患有特征在于升高的促進(jìn)癌癥維持或增殖的受體水平的癌癥時(shí)，患者通常需要治療。[0193]通常，活性化合物的日口服劑量會(huì)為約0.01毫克/kg/天至1000毫克/kg/天。預(yù)期范圍為0.5至50毫克/kg的口服劑量(在每天一次或多個(gè)給藥中)將產(chǎn)生期望的結(jié)果?？梢赃m當(dāng)調(diào)節(jié)劑量，以獲得期望的藥物水平(局部或系統(tǒng)性的)，這取決于給藥方式。例如，預(yù)期靜脈內(nèi)給藥會(huì)是每天低一個(gè)數(shù)量級(jí)至幾個(gè)數(shù)量級(jí)。在受試者在這樣的劑量下應(yīng)答不足的情況下，可以以患者耐受性容許的程度使用甚至更高的劑量(或通過不同的、更局限的投遞途徑產(chǎn)生的更高的有效劑量)。在一些實(shí)施方案中，考慮每天多劑，以獲得合適的系統(tǒng)性抗體水平。[0194]在一些實(shí)施方案中，所提供的組合物用于體內(nèi)應(yīng)用。根據(jù)意圖的體內(nèi)給藥方式，所用的組合物可以是固體、半固體或液體的劑型，如例如片劑、丸劑、粉劑、膠囊、凝膠、膏劑、液體、懸浮液等，優(yōu)選，以適用于單次給藥精確劑量量的單位劑型來給藥組合物。根據(jù)期望的制劑，所述組合物還可以包括藥學(xué)可接受載體或稀釋劑，其定義為通常用于配制用于動(dòng)物或人給藥的藥物組合物的水基載體。稀釋劑選擇為使得不影響目標(biāo)人重組蛋白的生物活性。這樣的稀釋劑實(shí)例是蒸餾水、生理鹽水、林格(Ringer)氏溶液、右旋糖溶液和漢克(Hank)氏溶液?？梢允褂孟嗤南♂寗﹣碇亟▋龈傻哪繕?biāo)人重組蛋白。此外，藥物組合物還可以包括其他醫(yī)學(xué)藥劑，藥劑，載體，佐劑，無毒的、非治療性的、非免疫原性的穩(wěn)定劑等。這些稀釋劑或載體的有效量是就成分的溶解性、生物活性等而言能有效獲得藥學(xué)可接受制劑的量。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的組合物是無菌的。[0195]本文中的組合物可以通過口服、胃腸外或表面給藥以及在其它情況中系統(tǒng)性形式來給藥于人患者，用于抗黑素瘤、抗淋巴瘤、抗白血病和抗乳腺癌治療。本發(fā)明的組合物還可以在治療上用于一批自體免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化坐寸ο[0196]在體內(nèi)治療過程中的給藥可以通過多種途徑，包括胃腸外和口服，但優(yōu)選胃腸外進(jìn)行?？梢允褂媚覂?nèi)、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥途徑，通常優(yōu)選靜脈內(nèi)。熟練技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到給藥途徑根據(jù)待治療的疾病而改變。[0197]對于治療中的使用，可以通過任何將組合物投遞至期望表面的方式將有效量的組合物給藥于受試者。可以通過熟練技術(shù)人員已知的任何方式來完成給藥本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選的給藥途徑包括但不限于口服、胃腸外、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、舌下、氣管內(nèi)、吸入、眼、陰道和直腸。[0198]在期望將它們系統(tǒng)投遞時(shí)，組合物可以配制為通過注射進(jìn)行胃腸外給藥，例如，通過推注或連續(xù)輸注進(jìn)行。注射用制劑可以以單位劑型呈現(xiàn)，例如，在安瓿或在多劑容器中，含有添加的防腐劑。組合物可以采用如油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳劑等形式，并且可以含有制劑，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。[0199]用于胃腸外給藥的藥物制劑包括水溶形式的活性化合物的水溶液。此外，可以將活性化合物的懸浮液制成合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。含水注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選，懸浮液還可以含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解度的藥劑，以允許制備高度濃縮的溶液。[0200]或者，組合物可以為粉末形式，在使用前用合適的載體(如無菌無熱原水)重構(gòu)。[0201]對于口服給藥，藥物組合物可以采用例如通過常規(guī)方法使用藥學(xué)可接受賦形劑制得的片劑或膠囊的形式，所述賦形劑如粘合劑(例如，預(yù)糊化(pregelatinise)玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或硅土(silica));崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉(sodiumstarchglycolate));或潤濕劑(例如，月桂硫酸鈉(sodiumlaurylsulphate))。可以通過本領(lǐng)域公知的方法來覆蓋片劑。用于口服給藥的液體制劑可以采用例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或它們可以作為干產(chǎn)品呈現(xiàn)，在使用前用水或其他合適載體構(gòu)成?？梢允褂盟帉W(xué)可接受添加劑通過常規(guī)方法來制備這些液體制劑，所述添加劑如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非含水載體(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)；和防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。制劑按照需要還可以含有緩沖劑鹽、芳香劑、著色劑和甜味劑。[0202]可以合適地配置用于口服給藥的制劑，以獲得活性化合物的控制釋放。對于含服給藥，組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。[0203]對于口服給藥，例如，可以通過將活性抗體與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)可接受載體混合來容易地配制組合物。這樣的載體能夠使本發(fā)明的化合物配制成片劑、丸劑、糖錠劑(dragee)、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，用于待治療受試者的口服攝入?？梢园凑展腆w賦形劑來獲得用于口服使用的藥物制劑，任選研磨所得到的混合物，并且如果需要，在加入合適的助劑后，處理顆?；旌衔?，以獲得片劑或糖錠劑核心。合適的賦形劑特別為填充劑，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素制劑，如例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠(tragacanth)、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。任選，口服制劑還可以在鹽水或緩沖劑(例如，EDTA)中配制，用于中和內(nèi)部酸條件，或可以不用任何載體來給藥。[0204]還特意考慮了組合物的口服劑型?？梢詫M合物的一種或多種成分進(jìn)行化學(xué)修飾，使得抗體組合物的口服投遞是有效的。通常，所考慮的化學(xué)修飾是將至少一個(gè)部分連接抗體，其中所述部分允許(a)抑制蛋白質(zhì)水解；和6)從胃或腸吸收至血流中。還希望的是提高抗體的總體穩(wěn)定性和提高在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。這樣的部分的實(shí)例包括:聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖(dextran)、聚乙烯醇、聚乙烯批咯燒酮和聚腦氨酸。Abuchowski和Davis,1981,"SolublePolymer-EnzymeAdducts"見:EnzymesasDrugs,Hocenberg和Roberts編，Wiley-1nterscience,NewYork,NY,pp.367-383;Newmark,etal.,1982,J.App1.B1chem.4:185-189?？梢允褂玫钠渌酆衔锸蔷?1，3-二氧戍燒(d1xolane)和聚-1，3，6-三氧戍燒(t1xocane)。如上所示，對于藥物使用，優(yōu)選聚乙二醇部分。[0205]對于組合物，釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)或大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用將不會(huì)在胃中溶解而將在十二指腸或腸中其他位置釋放材料的制劑。優(yōu)選，釋放將避免胃環(huán)境的不利影響，通過保護(hù)抗體或通過超出胃環(huán)境，如在腸中釋放生物活性材料實(shí)現(xiàn)。[0206]為了確保完全的胃抵抗力，需要至少在ρΗ5.0不能透過的涂層材料(coating)。用作腸溶衣的更常見惰性成分的實(shí)例是偏苯三酸醋酸纖維素(celluloseacetatetrimellitate,CAT)、輕丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(hydroxypropylmethylcelIulosephthalate,HPMCP)>HPMCP50、HPMCP55、聚乙烯鄰苯二甲酸醋酸酯(polyvinylacetatephthalate,PVAP)>EudragitL30D、Aquateric、醋酸鄰苯二甲酸纖維素(celluloseacetatephthalate,CAP)、EudragitL、EudragitS和蟲膠(Shellac)。這些涂層材料可以用作混合膜。[0207]涂層材料或涂層材料混合物也可以用于片劑上，其不是打算用于針對胃提供保護(hù)。這可以包括糖涂層材料，或使得片劑更容易吞咽的涂層材料。膠囊可以由硬殼(如明膠)組成，用于投遞干的治療劑，即粉末；對于液體形式，可以使用軟明膠殼。扁囊劑(cachet)的殼材料可以是厚淀粉或其他可食用紙。對于丸劑、錠劑、模制片或模印片(tablettriturate),可以使用潤濕成塊技術(shù)(moistmassingtechnique)。[0208]組合物可以以約Imm顆粒大小的顆?；蛐∏?pellet)形式作為細(xì)的多顆粒包括在制劑中。用于膠囊給藥的材料的制劑也可以作為粉末、輕度壓制栓(lightlycompressedplug)或甚至作為片劑?？梢酝ㄟ^壓制來制備治療劑。[0209]著色劑和調(diào)味劑可以全部包括。例如，可以(如通過脂質(zhì)體或微球體包囊)配制組合物，然后將其進(jìn)一步包括在可食用產(chǎn)品內(nèi)，所述可食用產(chǎn)品如含有著色劑和調(diào)味劑的冷藏飲料。[0210]可以用惰性材料稀釋或增加治療劑的體積。這些稀釋劑可以包括碳水化合物，尤其是甘露糖醇、a-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。特定的無機(jī)鹽也可以用作填充劑，包括三磷酸I丐、碳酸鎂和氯化鈉。一些可購得的稀釋劑是Fast-Flo、Emdex、STA-RxI500>Emcompress和Avicell。[0211]崩解劑可以包括在固體劑型的組合物制劑中。用作崩解劑的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商業(yè)崩解劑。淀粉輕乙酸鈉(sodiumstarchglycolate)、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、海藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和膨潤土都可以使用。崩解劑的另一種形式是不溶性陽離子型交換樹脂。粉末狀樹膠可以用作崩解劑和粘合劑，并且這些可以包括粉末狀樹膠，如瓊脂、梧桐膠(Karaya)或西黃蓍膠。海藻酸及其鈉鹽也可以用作崩解劑。[0212]粘合劑可以用于將組合物保持在一起來形成硬片劑并且包括來自天然產(chǎn)物的材料，如阿拉伯膠(acacia)、西黃蓍膠、淀粉和明膠。其他包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)0聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可以用于醇性溶液中，以將治療劑造粒。[0213]抗摩擦劑(ant1-frict1nalagent)可以包括在組合物的制劑中，以防止配制處理過程中的粘著。潤滑劑可以用作治療劑和模壁之間的層，并且這些可以包括但不限于:硬脂酸，包括其鎂和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。還可以使用可溶性潤滑齊U，如月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉鎂、各種分子量的聚乙二醇、Carbowax4000和6000。[0214]可以加入提高配制過程中藥物流動(dòng)特性和幫助壓制過程中重排的助流齊Li。助流劑可以包括淀粉、滑石、熱解娃土(pyrogenicsilica)和水合娃招化合物(siIicoaluminate)。[0215]為了幫助組合物溶解至含水環(huán)境中，可以加入表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可以包括陰離子型去污劑，如月桂基硫酸鈉、丁二酸二辛酯磺酸鈉(d1ctylsodiumsulfosuccinate)和二辛基橫酸鈉(d1ctylsodiumsulfonate)。可以使用陽離子型去污劑并且可以包括苯扎氯銨或節(jié)索氯銨(benzethomiumchloride)?？梢园ㄔ谥苿┲凶鳛楸砻婊钚詣┑囊慌鷿撛诜请x子型去污劑是聚桂醇400(lauromacrogol400)、聚氧乙烯40硬脂酸酯(polyoxyl40stearate),聚氧乙烯氫化蓖麻油(polyoxyethylenehydrogenatedcastoroil)10、50和60,甘油單硬酯酸酯,聚山梨酯40、60、65和80,鹿糖脂肪酸酯，甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨(dú)或以不同比例作為混合物存在于制劑中。[0216]可以口服使用的藥物制劑包括明膠制備的推入式(push-fit)膠囊，以及軟的、由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)制備的密封膠囊。推入式膠囊可以含有活性成分，其混有填充劑，如乳糖、粘合劑，如淀粉和/或潤滑劑，如滑石或硬脂酸鎂，以及任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，組合物可以溶解或懸浮于合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙二醇中。另外，可以加入穩(wěn)定劑。也可以使用為口服配制的微球體。這樣的微球體在本領(lǐng)域已經(jīng)被明確定義。所有口服給藥的制劑都應(yīng)當(dāng)為適于這樣給藥的劑量。[0217]對于含服給藥，組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。[0218]對于吸入給藥，組合物可以方便地以從壓縮包裝或噴霧器中呈遞的氣霧劑噴霧形式投遞，其中使用合適的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在壓縮的氣霧劑的情況中，劑量單位可以通過閥確定圖提供投遞計(jì)算量。例如用于吸入器或吹入器中的明膠的膠囊和藥筒，可以配制成含有化合物和合適粉末基(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。[0219]本文中還考慮了肺投遞。在吸入并穿過肺上皮襯層到血液中時(shí)，組合物被投遞給哺乳動(dòng)物的肺。吸入分子的其他報(bào)道包括Adjei等，1990,PharmaceuticalResearch,7:565-569;Aajei等，1990，Internat1nalJournalofPnarmaceutics,63:135-144(醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate))；Braquet等，I989，JournalofCard1vascularPharmacology,13(增補(bǔ)5):143-146(內(nèi)皮縮血管妝-1);Hubbard等，1989，AnnalsofInternalMedicine,Vol.1ll,pp.206—212(a1-抗膜蛋白SI)；Smith等，1989,J.Clin.1nvest.84:1145-1146(a-1-蛋白酶)；0swein等，1990,^Aerosolizat1nofProteins",ProceedingsofSymposiumonRespiratoryDrugDeliveryII,Keystone,Colorado,March,(重組人生長激素)；Debs等，1988,J.1mmunol.140:3482-3488(干擾素_g和腫瘤壞死因子α)和Platz等，美國專利N0.5，284，656(粒細(xì)胞集落刺激因子)。用于全身作用的肺投遞藥物的方法和組合物描述于1995年9月19日公告的Wong等的美國專利N0.5，451，569中。[0220]考慮了一大批機(jī)械裝置都可以用于實(shí)施本發(fā)明，所述裝置設(shè)計(jì)用于肺投遞治療產(chǎn)品，包括但不限于噴霧器、定量劑量吸入器和粉末吸入器，所有都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。[0221]適于組合物投遞的可購得裝置的一些特定實(shí)例是Ultravent噴霧器，由Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Missouri制造；AcornII噴霧器，由MarquestMedicalProducts,Englewood,Colorado制造；Ventolin定量劑量吸入器，由GlaxoInc.,ResearchTrianglePark,NorthCarolina制造；Spinhaler粉末吸入器，由FisonsCorp.,Bedford,Massachusetts制造。[0222]所有這樣的裝置都需要使用適于分散的制劑。通常，每種制劑對所用裝置類型是特定的，并且除了治療中可用的常見稀釋劑、佐劑和/或載體之外，還可以涉及合適的推進(jìn)劑材料的使用。此外，考慮使用脂質(zhì)體，微囊或微球體，包合復(fù)合物(inclus1ncomplex),或其他類型的載體。依據(jù)化學(xué)修飾的類型或所用裝置類型，化學(xué)修飾的抗體也可制備成不同的制劑。[0223]適于與噴射或超聲噴霧器一起使用的制劑通常將包括溶于水的治療劑，濃度為約0.1至25mg生物活性治療劑/mL溶液。此制劑還可以包括緩沖劑和單糖(例如，用于抗體穩(wěn)定和調(diào)節(jié)滲透壓)。噴霧器制劑還可以含有表面活性劑，以減少或防止由溶液霧化形成氣溶膠引起的表面誘導(dǎo)的治療劑聚集。[0224]用于與定量劑量吸入器裝置一起使用的制劑通常將包括含治療劑的精細(xì)分開粉末，所述治療劑在表面活性劑的幫助下懸浮于推進(jìn)劑中。推進(jìn)劑可以是任何常規(guī)的用于此目的的物質(zhì)，如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙烷和1，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。合適的表面活性劑包括脫水山梨醇三油酸酯(sorbitantr1leate)和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性劑。[0225]從粉末吸入器裝置分散的制劑將包括精細(xì)分開的含治療劑的干粉，并且還可以包括膨脹劑(bulkingagent)，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇，其量有助于粉末從裝置中分散出來，例如制劑重量的50-90%。為了最有效遞送給遠(yuǎn)端肺，治療劑可以制成平均粒徑小于1mm(或微米)的顆粒形式，最優(yōu)選0.5至5mm。[0226]還考慮了本發(fā)明的藥物組合物的經(jīng)鼻投遞。經(jīng)鼻投遞允許在將治療產(chǎn)物施用于鼻子之后使本發(fā)明藥用組合物直接傳到血流中，而不必需將產(chǎn)物沉積在肺中。經(jīng)鼻投遞的制劑包括含有葡聚糖或環(huán)葡聚糖(cyclodextran)的那些。[0227]對于鼻給藥，可用的裝置是小的、硬的瓶，其連接有定量劑量噴霧器。在一個(gè)實(shí)施方案中，定量劑量是通過將本發(fā)明的藥物組合物溶液吸取到確定體積的室內(nèi)，該室具有適于霧化的孔和氣霧劑制劑，其通過在將室中的液體壓縮時(shí)形成噴霧進(jìn)行。將所述室壓縮以施用本發(fā)明的藥物組合物。在特定的實(shí)施方案中，該室是活塞裝置。這樣的裝置可市售購得。[0228]或者，可以使用具有孔或開口的塑料擠瓶，所述孔或開口尺寸為當(dāng)擠壓時(shí)通過形成噴霧而使氣霧劑制劑霧化。開口通常在瓶子的頂部，并且頂部通常逐漸變細(xì)，以部分適合放入鼻腔，來有效地施用氣霧劑制劑。優(yōu)選，鼻吸入器提供定量的氣霧劑制劑，用于施用測定劑量的藥物。[0229]組合物還可以配制成直腸或陰道組合物，如栓劑或保留灌腸劑，例如，含有常規(guī)栓劑基料，如可可脂或其他甘油三酯。[0230]除了之前所述的制劑，組合物還可以配制成貯存制劑(cbpotpr印arat1n)?？梢杂煤线m的聚合或疏水性材料(例如，作為可接受油中的乳液)或離子交換樹脂來配制這樣的長效制劑，或作為略溶性衍生物，例如，作為略溶性鹽來配制。[0231]藥物組合物還可以包括合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這樣的載體或賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物，如聚乙二醇。[0232]合適的液體或固體藥物制劑形式是例如水性或鹽水溶液(用于吸入、微囊化、包囊(encochleate)、覆蓋在顯微金顆粒上、包括在脂質(zhì)體中、霧化)、氣霧劑、丸劑,用于植入皮膚中、或干燥到刮蹭入皮膚中的尖銳物體上。藥物組合物還可以包括顆粒、粉劑、片劑、包衣片劑、膠囊(微膠囊)、栓劑、糖衆(zhòng)、乳劑、懸浮液、霜?jiǎng)?cream)、滴劑(drop)或延遲釋放活性化合物的制劑，在這些制劑中，如上所述常規(guī)地使用賦性劑和添加劑和/或助劑，如崩解齊IJ、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、潤滑劑、調(diào)味劑、甜味劑或增溶劑。所述藥物組合物適合用于多種藥物傳送系統(tǒng)。對于藥物投遞方法的簡短評(píng)述，參見Langer,Science249:1527-1533,1990，將其按引用并入本文中。[0233]其他治療劑可以本身(純的)或以其藥學(xué)可接受鹽的形式來給藥。當(dāng)用于藥物中時(shí)，鹽應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)可接受的，但非藥學(xué)可接受鹽可以方便地用于制備其藥學(xué)可接受鹽。這樣的鹽包括但不限于，從以下酸制得的那些:鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、醋酸、水楊酸、對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。此外，這樣的鹽可以作為堿金屬或堿土金屬鹽來制備，如羧酸根的鈉、鉀或鈣鹽。[0234]合適的緩沖劑包括:醋酸和鹽(l-2%w/v);檸檬酸和鹽(l-3%w/v);硼酸和鹽(0.5-2.5%w/v);以及磷酸和鹽(0.8-2%w/v)。合適的防腐劑包括苯扎氯銨(0.003-0.03%w/V);氯丁醇(chlorobutanol)(0.3-0.9%w/v);對輕基苯酸酯類(parabens)(0.01-0.25%w/V)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)o[0235]本發(fā)明的藥物組合物包含含有在藥學(xué)可接受載體中的有效量的抗體和任選地治療劑。術(shù)語藥上可接的載體意思是一種或多種相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或包囊物質(zhì)，其適用于給藥于人或其他脊椎動(dòng)物。術(shù)語載體表示有機(jī)或無機(jī)成分(天然或合成的)，活性成分與其組合，以促進(jìn)應(yīng)用。藥物組合物的成分還能夠與本發(fā)明的化合物混合，并且彼此混合，以使得不存在會(huì)實(shí)質(zhì)性損害期望藥物功效的相互作用的方式來混合。[0236]可以在顆粒中提供特意包括但不限于抗體的組合物。本文中所用的顆粒是指納米顆?；蛭⒘?或在一些情況下更大)，其可以全部或部分由抗體組成。所述顆?？梢栽趪@有涂層材料，包括不限于腸溶衣的核心中含有所述治療劑。所述治療劑也可以分散在整個(gè)的顆粒中。治療劑也可被吸附至顆粒中。顆?？梢跃哂腥魏渭?jí)別的釋放動(dòng)力學(xué)，包括零級(jí)釋放、一級(jí)釋放、二級(jí)釋放、延遲釋放、持續(xù)釋放、立即釋放及其任意組合等等。除了治療劑以外，顆?？梢园ㄈ魏纬Ｒ?guī)用于藥學(xué)和醫(yī)學(xué)中的那些材料，包括但不限于可蝕性(erodible)、非可蝕性、生物可降解性、或非生物可降解性材料或其組合。顆?？梢允呛腥芤夯虬牍腆w狀態(tài)抗體的微囊。顆粒實(shí)質(zhì)上可以是任何形狀。[0237]非生物可降解性和生物可降解性聚合材料都可以用于制備投遞治療劑的顆粒。這樣的聚合物可以是天然的或是合成的聚合物。聚合物的選擇是基于釋放所期望的時(shí)段。特別感興趣的生物粘性聚合物包括生物可蝕性水凝膠，其描述于H.S.Sawhney,C.P.Pathak和J.A.Hubell，Macromolecules,(1993)26:581-587，將其教導(dǎo)并入本文中。這些包括聚透明質(zhì)酸(polyhyaluronicacids)、酪蛋白、明膠、明膠蛋白(glutin)、聚酐、聚丙烯酸、海藻酸鹽、殼聚糖(chitosan)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(poly(methylmethacrylates))、聚(甲基丙烯酸乙酯)(poly(ethylmethacrylates))、聚(甲基丙烯酸丁酯)(poly(butylmethacrylate))、聚(甲基丙烯酸異丁酯)(poly(isobutylmethacrylate))>聚(甲基丙烯酸己酯)(poly(hexylmethacrylate))、聚(甲基丙烯酸異癸酯)(poly(isodecylmethacrylate))>聚(甲基丙烯酸月桂基酯)(poly(Iaurylmethacrylate))、聚(甲基丙烯酸苯酯)(poly(phenylmethacrylate))、聚(丙烯酸甲酯)(poly(methylacrylate))、聚(丙烯酸異丙基酯)(poly(isopropylacrylate))、聚(丙烯酸異丁基酯)(poly(isobutylacrylate))和聚(丙烯酸十八燒基酯)(poly(octadecylacrylate))。[0238]組合物可以包括在控制釋放系統(tǒng)中。術(shù)語“控制釋放”意圖指的是任何含藥制劑，其中藥物從制劑中釋放的方式和概況是受控制的。這涉及立即和非立即釋放制劑，非立即釋放制劑包括但不限于持續(xù)釋放和延遲釋放制劑。術(shù)語“持續(xù)釋放”(也稱“延長釋放”)以其常規(guī)含義來使用，指的是能夠在延長的時(shí)間段里逐漸釋放藥物，并且優(yōu)選地，盡管不是必需地，導(dǎo)致藥物在延長的時(shí)間段里基本保持恒定的藥物血液水平的藥物制劑。術(shù)語“延遲釋放”以其常規(guī)含義來使用，指的是在施用制劑和自其釋放藥物之間有時(shí)間延遲的藥物制劑?！把舆t釋放”可以或可以不包括在延長的時(shí)間段里逐漸釋放藥物，因而其可以是或不是“持續(xù)釋放”。[0239]使用長期持續(xù)釋放植入物可以特別適用于治療慢性狀況。在此所用的“長期釋放”，指的是植入物被構(gòu)造和安排成投遞治療水平的活性組分至少達(dá)7天，優(yōu)選30-60天。長期持續(xù)釋放植入物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且包括上述的一些釋放系統(tǒng)。[0240]本文中還提供了含有抗體組合物的試劑盒。所述試劑盒包括抗體組合物，并且還可以含有一個(gè)或多個(gè)小瓶或容器。所述試劑盒還可以包括用于將成分給藥于患有本文中所述疾病(如癌癥)或具有這些疾病癥狀的受試者的說明書。[0241]在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括藥物制劑小瓶、藥物制劑稀釋劑小瓶和抗體。含有用于藥物制劑的稀釋劑的小瓶是任選的。稀釋劑小瓶含有稀釋劑，如生理鹽水，用于稀釋抗體的濃縮溶液或凍干粉。說明書可以包括混合特定量的稀釋劑和特定量的濃縮藥物制劑，以制備用于注射或輸注的最終制劑的說明書。說明書可以包括關(guān)于用于注射器或其他給藥裝置的說明書。說明書20可以包括用于用有效量的抗體治療患者的說明書。還將理解，無論容器是瓶、帶隔膜的小瓶、帶隔膜的安瓿瓶、輸注袋等等，含制劑的容器可以含有標(biāo)記，如常規(guī)記號(hào)，當(dāng)制劑被高壓滅菌或其他方式滅菌時(shí)所述標(biāo)記改變顏色。[0242]通過以下實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，其決不應(yīng)當(dāng)解釋為進(jìn)一步限制。在整個(gè)本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)(包括文獻(xiàn)參考、公告專利、公開的專利申請和共同懸而未決的專利申請)的全部內(nèi)容特意以引用方式并入本文中，特別是對于以上提及的教導(dǎo)。然而，任選參考文獻(xiàn)的引用不是用來承認(rèn)參考文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)。實(shí)施例[0243]1.表達(dá)高半乳糖基化抗體的轉(zhuǎn)基因山羊的產(chǎn)生[0244]⑶20抗體構(gòu)建體的產(chǎn)生[0245]圖1中提供了用于轉(zhuǎn)基因CD20抗體(Tg20)的氨基酸序列:輕鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1,重鏈?zhǔn)荢EQIDNO:2。將編碼用于轉(zhuǎn)基因⑶20抗體的氨基酸序列的核酸序列用于產(chǎn)生表達(dá)轉(zhuǎn)基因CD20抗體(Tg20)的轉(zhuǎn)基因山羊。將酪蛋白啟動(dòng)子與編碼用于轉(zhuǎn)基因CD20抗體的氨基酸序列的核酸序列可操作地連接，以促進(jìn)核酸序列在山羊乳腺中的表達(dá)。[0246]使用以下添加/改變來合成編碼抗CD20抗體的輕鏈和重鏈的核酸序列:[0247]I)添加側(cè)翼XhoI位點(diǎn)，以促進(jìn)亞克隆至表達(dá)載體BcSOO中。[0248]2)就在兩個(gè)構(gòu)建體上的啟動(dòng)物ATG上游添加Kozak共有序列(GCCACC)。[0249]3)在重鏈的終止密碼子附近引入沉默突變以破壞潛在的剪接位點(diǎn):GGGTAAATGA(SEQIDNO:3)至GGGAAAATGA(SEQIDNO:4)。[0250]將輕鏈和重鏈序列都亞克隆至表達(dá)載體Bc800的XhoI克隆位點(diǎn)中，所述載體在SuperCos主鏈中含有禽β球蛋白絕緣子序列，6.2kb的5’β酪蛋白啟動(dòng)子序列，XhoI克隆位點(diǎn)，7.1kb的3’β酪蛋白下游序列，另一個(gè)絕緣子序列，G418抗性標(biāo)記物和最終的絕緣子序列。(參見圖2)。通過氯化銫離心來制備質(zhì)粒DNA。使用側(cè)翼NotI位點(diǎn)來釋放SuperCos主鏈，并且通過電泳通過瓊脂糖凝膠與轉(zhuǎn)基因片段分離。然后將所得到的純化核酸片段用于體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。將編碼TG20的重鏈和輕鏈的cDNA片段插入乳腺特異性表達(dá)載體中，以獲得2個(gè)轉(zhuǎn)基因，將其共轉(zhuǎn)染至雌山羊胎細(xì)胞中(LipofectAMINE，Gibco)。按照之前所述的進(jìn)行核轉(zhuǎn)移(Melican等，2005；Ther1genology63:1549)。[0251]皮膚成纖維細(xì)胞系的產(chǎn)生[0252]將來自新鮮山羊皮膚活檢樣品的成纖維細(xì)胞在體外在原代培養(yǎng)物中維持。簡而言之，將皮膚樣品在無Ca++和無Mg++的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中切碎，用EDTA中的稀胰蛋白酶收集，以回收單細(xì)胞懸浮液，并且在37°C培養(yǎng)。將匯合的細(xì)胞用胰蛋白酶處理并且傳代培養(yǎng)。將等份的細(xì)胞在液氮中冷凍保存，供未來使用。[0253]轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的分析[0254]通過使用對轉(zhuǎn)基因特異性的探針進(jìn)行的Southern印跡分析來表征轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以確定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)并鑒定潛在的重排。還通過FISH分析了每個(gè)細(xì)胞系，以證實(shí)單個(gè)整合并確定染色體位置。進(jìn)行細(xì)胞遺傳分析，以證實(shí)細(xì)胞系的核型。PCR、southern印跡和FISH分析證實(shí)了重鏈和輕鏈Ig鏈轉(zhuǎn)基因兩者的存在。[0255]FISH[0256]對于分裂間期FISH，將來自每個(gè)擴(kuò)大菌落的幾百個(gè)細(xì)胞固定在濾器上并且與經(jīng)洋地黃毒苷(digoxigenin)標(biāo)記的擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因特異性探針雜交。對于中期FISH，將細(xì)胞在LabTekChamber載玻片(Nunc,Rochester,NY)上培養(yǎng),并且用5_溴_2’脫氧尿卩密唳(BrdU)脈沖，以允許進(jìn)行復(fù)制顯帶(replicat1nbanding)。使用偶聯(lián)有FITC的抗洋地黃毒苷檢測探針結(jié)合，并且用4’，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染。使用ZeissAx1skop顯微鏡(ZeissImaging,Thornwood,NY)、Hamamatsu數(shù)石馬相機(jī)(Hamamatsu,Bridgewater,NJ)和ImagePro-Plus軟件(MediaCybernetics,SilverSprings,MD)來捕獲圖像。[0257]細(xì)胞遺傳分析[0258]對供體轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞系進(jìn)行了細(xì)胞遺傳分析。通過切口平移，用洋地黃毒苷-dUTP標(biāo)記轉(zhuǎn)基因探針。用綴合有FITC的抗洋地黃毒苷或用綴合有辣根過氧化物酶的抗洋地黃毒苷，接著用綴合有FITC的Tyramide檢測探針對變性染色體的結(jié)合。用DAPI顯現(xiàn)染色體顯帶模式。山羊具有60條染色體，所有都是具近端著絲點(diǎn)的(在一端而不是在中間或靠近中間具有著絲點(diǎn))。對中期擴(kuò)散(metaphasespread)檢查大體異常(grossabnormality)的證據(jù)，如染色體丟失、復(fù)制或大體重排(grossrearrangement)。[0259]表達(dá)⑶20抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生[0260]將用于⑶20抗體的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因山羊。通過引入1:1的重鏈和輕鏈構(gòu)建體混合物來生成產(chǎn)生成熟抗體的轉(zhuǎn)基因山羊。[0261]使用本領(lǐng)域常規(guī)的核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生具有預(yù)定遺傳學(xué)的轉(zhuǎn)基因山羊。通過標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染，將上述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體引入皮膚成纖維細(xì)胞系中。針對轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)、完整性和整合位點(diǎn)，在體外篩選重組原代細(xì)胞系，之后將它們用于生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。[0262]在USDA登記的、FDA和EMA檢查的機(jī)構(gòu)飼養(yǎng)山羊。使用從血液和組織樣品分離的基因組DNA進(jìn)行了后代的轉(zhuǎn)基因分析(FISH、PCR和Southern印跡)。使用從血液和組織樣品分離的基因組DNA進(jìn)行后代轉(zhuǎn)基因分析(FISH、PCR和Southern印跡)(參見圖7)。[0263]抗體的純化[0264]從轉(zhuǎn)基因山羊的乳中收集抗體。山羊乳來自激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因山羊的泌乳(參見例如Ebert等，1994，B1techl2:699-712)。通過離心，將乳澄清以除去大部分酪蛋白和脂肪。然后通過蛋白A色譜,接著通過QSepharoseFastFlow上的陰離子交換色譜來純化抗體。將最終產(chǎn)物配制在朽1檬酸鈉/氯化鈉+聚山梨酯80(polysorbate80)中。[0265]2.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗體的分析[0266]A.材料和方法[0267]糖基化序型分析(profiling)[0268]使用ProzymeN-去糖基化試劑盒(SanLeandro,CA,USA),根據(jù)制造商的程序,進(jìn)行了抗體樣品的N-去糖基化。簡而言之，將300μg干燥的抗體樣品在135μL10-mM含水Tris-HCl緩沖液pH8.0中恢復(fù)，并且加入4.5μL10%(ν/ν)β-巰基乙醇水溶液，以減少抗體二硫橋鍵。通過加入7.5mU肽酰-N-糖苷酶(PNG酶)F，接著在37°C孵育過夜來進(jìn)行N-去糖基化。[0269]在這個(gè)階段，在緩慢水解成還原性聚糖之前，許多N-聚糖作為葡基胺(glycosylamine)釋放出來。通過將5%(ν/ν)終濃度的冰醋酸加入經(jīng)PNG酶F-消化的抗體樣品中，接著在室溫孵育一小時(shí)來進(jìn)行還原性聚糖的完全再生。通過固相提取(SPE)Jf新鮮再生的還原性N-聚糖混合物純化至50-mgHypersepHypercarb多孔石墨化碳(PGC)柱(ThermofischerScientific,Bremen,德國)上(Packer等，1998)。用ImL甲醇和2XImL0.1%(ν/ν)三氟乙酸水溶液(TFA)依次洗滌PGCSPE柱。將寡糖溶解于200μL0.1%(v/v)TFA水溶液中，施加于柱上并且用2XlmL0.1%(v/v)TFA水溶液洗滌。通過施加含有0.1%(v/v)TFA的2X400μL25%(ν/ν)乙腈水溶液來進(jìn)行聚糖的洗脫，并將洗脫液真空干燥。[0270]通過含有0.35Μ2-氨基苯甲酰胺(2_ΑΒ)和IM氰基硼氫化鈉(sodiumcyanoborohydride)的DMSO中的10μL33%(ν/ν)醋酸，通過回收干燥的聚糖，用2-ΑΒ將PGC純化的聚糖還原氨基化，并且將反應(yīng)在37°C保持16小時(shí)。將2-AB-標(biāo)記的N-聚糖純化至50-mgOasis聚合HLBSPE柱上,用于親水性相互作用色譜(HILIC)模式中(Waters,Milfors，MA，USA)。用lmL20%(ν/ν)乙腈水溶液依次潤濕HILICSPE柱，并用2XlmL乙腈平衡，然后將溶解于乙腈中的2-AB衍生物裝載于SPE柱上。用2XImL乙腈洗滌柱后，接著通過施加2X500μL20%(ν/ν)乙腈水溶液來進(jìn)行2-ΑΒ衍生物的洗脫。將l_mL洗脫液真空濃縮至50μL。[0271]使用含有3μηι填充微粒(packingparticule)的150x4.6mmIDTSK-凝膠酰胺-80HILICHPLC柱(T0S0HB1science,KingofPrussia,PA,USA)，通過正相高效液相色譜(NP-HPLC)來最終對純化的2-AB衍生物確定序型(Guile等，1996)。流動(dòng)相由調(diào)節(jié)為PH4.4的50-mM甲酸銨水溶液(A)和乙腈(B)的混合物組成。運(yùn)行流速和溫度分別為ImL/min和30°C。使用80%(ν/ν)乙腈水溶液將5μL純化的2-ΑΒ衍生物稀釋40倍，并且將50μL新鮮振蕩的有機(jī)混合物注入用80%(ν/ν)Β平衡的HILIC柱中。一旦注入樣品，如下進(jìn)行N-聚糖的分離:15min內(nèi)從80%至70%(v/v)B；150min內(nèi)從70%至55%(v/v)B；5min內(nèi)從55%至10%(ν/ν)B;10min過程中10%(ν/ν)B;lmin內(nèi)從10%至80%(v/v);45分鐘過程中80%(ν/ν)B(再次平衡)。用330mm的激發(fā)波長和420nm的發(fā)射波長通過熒光檢測(FD)進(jìn)行突光衍生物的檢測。[0272]參考文獻(xiàn):GuileGR,RuddPM,WingDR,PrimeSB,DwekRA.Arapidhigh-resolut1nhigh-performanceliquidchromatographicmethodforseparatingglycanmixturesandanalyzingoligosaccharideprofiles.AnalB1chem.1996Sep5;240(2):210-26;PackerNH,LawsonMA,JardineDR,RedmondJff.Ageneralapproachtodesaltingoligosaccharidesreleasedfromglycoproteins.GlycoconjJ.1998Aug;15(8):737-47。[0273]與人CD16a的結(jié)合[0274]在Biacore系統(tǒng)(X100,GEHealthcare)上使用表面等離子共振(SPR)進(jìn)行了與人⑶16a的結(jié)合。在該測定法中，使用2183RU水平的胺化學(xué)，將⑶16a固定于SPR芯片上。將待測試的抗體在PBS緩沖液中稀釋成不同濃度(50、100和200nM)，并且在相同緩沖液的情況中依次在固定化CD16a上注射。在芯片上，將一個(gè)流動(dòng)池用作對照，以減去由非特異性相互作用產(chǎn)生的背景。在每次注射之間，用3.75nMNaOH溶液進(jìn)行芯片的再生。[0275]CD16測定法[0276]簡而言之，NK效應(yīng)細(xì)胞已經(jīng)被永生化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞性細(xì)胞(表達(dá)人⑶16a的Jurkat細(xì)胞)替代，以允許實(shí)驗(yàn)的高再現(xiàn)性。將Jurkat⑶16a細(xì)胞、WIL2-S細(xì)胞和PMA(佛波醇-醋酸肉豆蘧酸酯(Phorbol-MyristateAcetate))分別用作效應(yīng)細(xì)胞、祀細(xì)胞和非特異性激活齊U，并且用一定劑量范圍的待測試抗體孵育。孵育后，Jurkat細(xì)胞激活導(dǎo)致了IL-2細(xì)胞因子釋放，通過特異性ELISA來定量(VivierE等，Int.1mmunol.1992,4(11):1313-1323)。上清液細(xì)胞培養(yǎng)物中的IL-2量與要作為測試的免疫復(fù)合物的WIL2-S/抗體結(jié)合并激活CD16a的能力直接相關(guān)。[0277]ADCC測定法[0278]通過乳酸脫氫酶釋放測定法來實(shí)現(xiàn)用于測試待測試抗體的藥理活性的ADCC(抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性)。使用NK細(xì)胞分離試劑盒和AutoMacs自動(dòng)裝置(Miltenyib1tec),使用免疫磁性細(xì)胞分選，來純化用作效應(yīng)細(xì)胞的來自健康供體的人NK細(xì)胞。將維持于含有10%FCS的IMDM(PAAThecellculturecompany,Lesmureaux,法國)中的培養(yǎng)物中的伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤Raji細(xì)胞系(ATCCCCL86)用作靶細(xì)胞。在微板中不同濃度抗體的存在下，以效應(yīng)物/靶物比例R=10/l共同孵育細(xì)胞，并且在含有5%C02的潮濕氣氛中，在37°C孵育4小時(shí)。在測試中包括陰性對照孔，其包括僅含有靶細(xì)胞的孔和另一僅含有效應(yīng)細(xì)胞的孔，以實(shí)現(xiàn)區(qū)分自發(fā)效應(yīng)細(xì)胞死亡對效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡。還運(yùn)行了“抗體對照”孔(其通過共同孵育靶細(xì)胞和抗體來制備)以測試在效應(yīng)細(xì)胞不存在下抗體對靶細(xì)胞的內(nèi)在細(xì)胞毒性特性。最后，通過在抗體不存在下共同孵育靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞來制備對照孔，以評(píng)價(jià)潛在的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性。離心后，使用細(xì)胞毒性檢測試劑盒(RocheAppliedScience,德國)來測試上清液的LDH釋放。[0279]融化后，洗滌PBMC并且懸浮于補(bǔ)充了10%FCS的RPMI中。在4°C將MEC-1或SUDHL-8細(xì)胞系與20微克/ml的人單抗一起孵育30分鐘。洗滌后，用羧基熒光素雙乙酸酯琥珀酰亞胺酯(CFSE)將細(xì)胞系標(biāo)記10分鐘。將標(biāo)記的靶細(xì)胞懸浮于RPMI1640(+10%FCS)中，并且以不同的效應(yīng)物/靶物(E/T)比例與PBMC混合。將細(xì)胞在37°C孵育4小時(shí)，并在用PI染色后通過FC分析。使用來自Miltenyi的試劑盒從來自CLL病人或健康志愿者的PBMC富集人B-CLL或人淋巴B細(xì)胞。[0280]根據(jù)式[(抗體+靶物+NK)-(抗體+革巴物)]/[100_(抗體+革巴物)]_[(NK+靶物)_(抗體+靶物)]/[100-(抗體+靶物)]，計(jì)算每個(gè)抗體濃度的ADCC活性(％)。使用Prism軟件(GraphpasSoftwareInc.，LaJolla,CA,USA)獲取實(shí)驗(yàn)值并且與S形劑量應(yīng)答曲線擬合，并且測定E(最大細(xì)胞毒性)和EC5tl(為了獲得50%￡^±需要的抗體濃度)。[0281]CDC測定法[0282]在人血清的存在下，將待測試的抗體以一個(gè)濃度與表達(dá)⑶20抗原的WIL2-S細(xì)胞混合。在每個(gè)測試中，獨(dú)立制備八個(gè)樣品。在37°C用10微克/mL的人單抗和不同濃度的Clq摻入人Clq消減的血清中的細(xì)胞10分鐘。通過插入DNA染料碘化丙啶(PI)，通過熒光來確定細(xì)胞死亡。熒光水平與細(xì)胞培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)量成比例(O’Brien，J.等(2000)Eur.J.B1chem.267,5421-5426)。[0283]獼猴藥動(dòng)學(xué)研究[0284]稱猴(Macacafascicularis)重量范圍為3.1至4.4kg。在給藥開始前，將所有動(dòng)物稱重并且使用計(jì)算機(jī)化隨機(jī)化程序分配給處理組。IV施用定量給藥制劑。在給藥開始之前采集兩次血樣(包括備用動(dòng)物)，第二次取樣在給藥前I至4天之間收集，然后在第I天(給藥后4小時(shí))，并且在第2至8天、第15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85和92天收集。在第92天將動(dòng)物實(shí)施安樂死。使用認(rèn)證的分析方法來分析血樣。使用針對細(xì)胞表面標(biāo)記物的特異性抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)定量淋巴細(xì)胞群。通過切除活檢收集淋巴結(jié)(LN)，使用針對細(xì)胞表面標(biāo)記物的特異性抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)，作為CD45+淋巴細(xì)胞的相對比例來定量淋巴細(xì)胞群。使用WinNonlin藥動(dòng)學(xué)軟件(PharsightCorp.,MountainView,加利福尼亞)來估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。將非隔室(non-compartmental)方法用于參數(shù)估計(jì)(參見圖10和圖11)。[0285]全血實(shí)驗(yàn)[0286]根據(jù)圖6，進(jìn)行該測試以評(píng)價(jià)Tg20通過所有自然免疫現(xiàn)象(特別是⑶C和ADCCHS導(dǎo)人供體的全血中淋巴B細(xì)胞消減的能力。[0287]通過靜脈內(nèi)途徑給藥兩個(gè)不同劑量時(shí)，針對獼猴中不同的抗-CD20抗體:RTX和TG20，監(jiān)測抗體在B細(xì)胞消減(在外周血中和一些淋巴器官中)中的活性和藥動(dòng)學(xué)特征。[0288]研究設(shè)計(jì)如下:[0289]-劑量水平:0.03mg/kg/天(低)和0.3mg/kg/天(高)[0290]-三只動(dòng)物/劑量/抗體[0291]血液表型確定[0292]在給藥開始之前采集兩次血樣(包括備用動(dòng)物)，第二次采樣在給藥前I至4天之間，然后在第I天(給藥后4小時(shí))，并且在第2至8天、第15、22、29、36、43、50、57、64、71、78、85和92天采樣。在第2至92天過程中，在大致相同的時(shí)間采集血樣。從股靜脈采集ImL體積的血液至含有K2EDTA作為抗凝劑的試管中，用于淋巴細(xì)胞子集的分析。第22天后的預(yù)定終止時(shí)沒有從動(dòng)物采集血樣。將樣品溫和混合并且保持在環(huán)境條件下直至轉(zhuǎn)移至測試機(jī)構(gòu)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室用于處理。[0293]使用認(rèn)證的分析方法來分析血樣。使用針對細(xì)胞表面標(biāo)記物的特異性抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)，將下表中鑒定的淋巴細(xì)胞群進(jìn)行定量(相對百分比和絕對數(shù)量)。使用以下抗體組處理樣品:CD45/CD3/CD8/CD4、CD45/CD3/CD8/CD16和CD45/CD3/CD20/CD40，直至第22天。然后從第29天至第92天，只評(píng)價(jià)了淋巴B細(xì)胞抗體組(⑶45/⑶3/⑶20/⑶40)。使用BDTruCount試管，針對每個(gè)抗體組試管測定了總淋巴細(xì)胞數(shù)，并且報(bào)告為每個(gè)樣品的平均⑶45+淋巴細(xì)胞/μL全血。沒有使用同種型對照，并且將DPBS試管用作負(fù)對照。[0294]淋巴結(jié)免疫表型確定[0295]在第8天時(shí)，通過切除活檢從動(dòng)物收集右腹股溝淋巴結(jié)(LN)，并且在第22天通過切除活檢收集左腹股溝淋巴結(jié)。在第92天(驗(yàn)尸時(shí))通過完全去除收集右腋下淋巴結(jié)。在預(yù)定外科手術(shù)之前，使動(dòng)物禁食過夜。在外科手術(shù)之前至少30分鐘，給每只動(dòng)物皮下給予卡洛芬(Carprofen)(4mg/kg)。在外科手術(shù)之前和2天后，每只動(dòng)物接受了肌內(nèi)注射DuploeillilV?(lmL)。用肌內(nèi)注射氯胺酮(ketamine)、賽拉嗪(xylazine)和格隆溴銨(glycopyrrolate)使每只動(dòng)物預(yù)麻醉，以在術(shù)前準(zhǔn)備之前獲得充分鎮(zhèn)靜。動(dòng)物經(jīng)受了氣管插管，并且此后按照SOP預(yù)麻醉和麻醉(SOPPre-anesthesiaandAnesthesia),使用異氟烷和氧氣維持麻醉。使用脈搏氧飽和度儀(pulseoximeter)來監(jiān)控心率和02飽和度。在外科手術(shù)之前，將溫和的眼潤滑劑給予每只眼睛。一旦動(dòng)物充分麻醉，修剪右或左腹股溝區(qū)域，并且按照SOP關(guān)于手術(shù)部位準(zhǔn)備進(jìn)行準(zhǔn)備。在右或左腹股溝區(qū)域形成大約2-3cm的切口。小心地解剖周圍的組織，以觀察右或左腹股溝淋巴結(jié)。使用剪刀和鑷子，收集淋巴結(jié)。在傷口閉合之前，給予1mL溫鹽水的鹽水沖洗。收集后，使用可吸收縫合線閉合皮下組織和皮膚。將淋巴結(jié)在環(huán)境室溫下保持在大約5mL測定培養(yǎng)基(含有5%(v/v)FBS的RPM1-1640)中并且轉(zhuǎn)移至免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，直至處理/分析。使用針對細(xì)胞表面標(biāo)記物的特異性抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)，作為CD45+淋巴細(xì)胞的相對百分比來定量以上文本表中鑒定的群。使用以下抗體組來處理樣品:⑶45/⑶3/⑶8/⑶4、⑶45/⑶3/⑶8/⑶16和⑶45/⑶3/⑶20/⑶40。沒有使用同種型對照，并且將DPBS試管用作陰性對照。[0296]B:結(jié)果[0297]SDSPAGE:[0298]在非還原條件下進(jìn)行了SDS-PAGE分析，并且在考馬斯藍(lán)染色后(參見圖3)，對Tg20和低巖藻糖參照抗體(對應(yīng)于完整抗體)都顯示出168kDa的主條帶。對參照抗體檢測到了高分子量(HMW)條帶，而對Tg20沒有觀察到它。銀染后，對Tg20也檢測了該HMW條帶以及幾個(gè)通常對參照抗體檢測到的其他次要條帶。這些次要條帶可以對應(yīng)于抗體的部分還原形式:針對HC-HC-LC的147kDa，針對HC-HC的IlOkDa和針對HC-LC的71kDa。168kDa的主條帶估計(jì)為95%的總蛋白含量，而產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的其他條帶僅占5%，表明Tg20的低水平降解。在還原條件下進(jìn)行的SDS-PAGE分析(參見圖3)顯示出54和28kDa處的兩條主條帶，分別對應(yīng)于抗體的重鏈和輕鏈。這兩個(gè)抗體呈現(xiàn)出相同的表觀分子量。[0299]糖基化序型分析[0300]圖4顯示了通過PNG酶F處理從Tg20釋放的2_AB衍生的N-聚糖的熒光測定檢測獲得的NP-HPLC序型。在47.49,59.35和78.38檢測的主峰分別對應(yīng)于A2G1F、A2G2F和A2G2FNeuGcl0還檢測了多種較低豐度的峰。表I中呈現(xiàn)了檢測形式的相對摩爾比(參見以下)。[0301]在該實(shí)驗(yàn)中，唾液酸化結(jié)構(gòu)的水平估算為43%。對于復(fù)合結(jié)構(gòu)，高甘露糖-雜合結(jié)構(gòu)的水平估算為15%對85%。整體的半乳糖基化水平為91%，而巖藻糖基化水平估算為92%。[0302]表1:從TG20釋放并通過NP-HPLC-FD分析的主要N-聚糖的相對摩爾比[0303]名稱RT面積相對面積GOF-Gn32?33725250?3GO33?212674407?GOB36?341050070GOF39?24045579?θMan54025501400?4A2G142?2104687708A2G14^521027802Man4AlGl45?03754610?3A2G1F47?510693605T~9A2G1F49Γ01621545~L2Man4AlGlFδ?Γδ31492702A2G253Γθ32355482ΛMan5AlGl55?7102631908A2G2F59?45119267137Γ9Man5AlGlF62?01949522~Man4AlGlFNeuGcl~TL!7515884δΓθA2G2FNeuAcl73?851742883?8Man5AlGlNeuGcl76?540471053?0A2G2FNeuGcl78?43633746726.9【權(quán)利要求】1.一種組合物，其包含:抗體群，其中所述抗體群是高半乳糖基化的。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述群中的抗體是在乳腺上皮細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的。3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述群中的抗體針對相同的抗原表位。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體由相同的核酸序列編碼。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體。7.一種組合物，其包含:抗體群，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體，和其中所述群中的抗體由相同的核酸序列編碼。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少80%。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少90%。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少80%。11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少90%。12.—種組合物，其包含:抗體群；其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平與所述群中的抗體的巖藻糖基化水平的比例介于0.8和1.2之間，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體，且其中所述群中的抗體由相同的核酸序列編碼。13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體群包含含有雙半乳糖基化N-聚糖的抗體。14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖和雙半乳糖基化N-聚糖兩者的抗體。15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中至少35%的抗體包含雙半乳糖基化N-聚糖，且所述群中至少5%的抗體包含單半乳糖基化N-聚糖。16.權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體是在乳腺上皮細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的。17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體群是經(jīng)工程化改造以表達(dá)所述抗體的非人哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的。18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述非人哺乳動(dòng)物是山羊、綿羊、野牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝。19.權(quán)利要求17的組合物，其中所述非人哺乳動(dòng)物是山羊。20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包括乳。21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體群的抗體相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群具有升高的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性水平。22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。23.權(quán)利要求21或22的組合物，其中所述不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是低半乳糖抗體。24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述低半乳糖抗體是Rituxan。25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的組合物，其中所述抗體群的抗體相比于不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群具有升高的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(ADCC)活性水平。26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。27.權(quán)利要求25或26的組合物，其中所述不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體是低半乳糖抗體。28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述低半乳糖抗體是Rituxan。29.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體是嵌合的、人源化的或完全人的抗體。30.權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體是全長抗體。31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體包含重鏈和輕鏈。32.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的組合物，其中所述群中的抗體是抗-⑶20抗體。33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述群中的抗體的輕鏈和重鏈由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中所示的核酸序列編碼。34.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)可接受載體。35.一種方法,其包括:將權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的組合物給藥于有此需要的受試者。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述受試者患有癌癥。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述癌癥是B-細(xì)胞淋巴瘤。38.權(quán)利要求35的方法，其中所述受試者患有免疫病癥。39.一種用于生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群的方法，其包括:在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生所述抗體群，使得生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群。40.權(quán)利要求39的方法，其中該方法進(jìn)一步包括收集所生產(chǎn)的所述抗體群。41.一種用于生產(chǎn)高半乳糖基化抗體群的方法，其包括:收集經(jīng)工程化改造以表達(dá)抗體的乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的高半乳糖基化抗體群。42.權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包括測定所述抗體群的CDC活性。43.權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包括對所述抗體群與不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群比較⑶C活性。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述不在乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體群的抗體在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。45.權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包括測定所述抗體群的半乳糖基化水平。46.權(quán)利要求39-45中任一項(xiàng)的方法，其中所述乳腺上皮細(xì)胞在培養(yǎng)物中并且用包含編碼所述抗體的序列的核酸轉(zhuǎn)染。47.權(quán)利要求39-46中任一項(xiàng)的方法，其中所述乳腺上皮細(xì)胞在非人哺乳動(dòng)物中，所述非人哺乳動(dòng)物經(jīng)工程化改造以在其乳腺中表達(dá)包含編碼所述抗體的序列的核酸。48.權(quán)利要求39-47中任一項(xiàng)的方法，其中所述乳腺上皮細(xì)胞是山羊、綿羊、水牛、駱駝、牛、豬、兔、水牛、馬、大鼠、小鼠或美洲駝乳腺上皮細(xì)胞。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述乳腺上皮細(xì)胞是山羊乳腺上皮細(xì)胞。50.權(quán)利要求39-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少80%。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少90%。53.權(quán)利要求39-52中任一項(xiàng)的方法，其中所述群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少80%。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少90%。55.權(quán)利要求39-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述群中的抗體的半乳糖基化水平與所述群中的抗體的巖藻糖基化水平的比例介于0.8和1.2之間。56.權(quán)利要求39-55中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體。57.權(quán)利要求39-56中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體群包含含有雙半乳糖基化N-聚糖的抗體。58.權(quán)利要求39-57中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖和雙半乳糖基化N-聚糖兩者的抗體。59.權(quán)利要求39-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述群中至少35%的抗體包含雙半乳糖基化N-聚糖，且所述群中至少5%的抗體包含單半乳糖基化N-聚糖。60.權(quán)利要求39-49中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括純化所述抗體群，使得所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少70%。61.權(quán)利要求60的方法，其進(jìn)一步包括純化所述抗體群，使得所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少80%。62.權(quán)利要求61的方法，其進(jìn)一步包括純化所述抗體群，使得所述群中的抗體的半乳糖基化水平為至少90%。63.權(quán)利要求39-49和60-62中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括純化所述抗體群，使得所述群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少80%。64.權(quán)利要求63的方法，其進(jìn)一步包括純化所述抗體群，使得所述群中的抗體的巖藻糖基化水平為至少90%。65.權(quán)利要求39-49中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括純化所述抗體群，使得所述群中的抗體的半乳糖基化水平與所述群中的抗體的巖藻糖基化水平的比例介于0.8和1.2之間。66.權(quán)利要求60-65中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖的抗體。67.權(quán)利要求60-66中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體群包含含有雙半乳糖基化N-聚糖的抗體。68.權(quán)利要求60-67中任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體群包含含有單半乳糖基化N-聚糖和雙半乳糖基化N-聚糖兩者的抗體。69.權(quán)利要求60-68中任一項(xiàng)的方法，其中所述群中至少35%的抗體包含雙半乳糖基化N-聚糖，且所述群中至少5%的抗體包含單半乳糖基化N-聚糖。70.權(quán)利要求39-69中任一項(xiàng)的方法，其中所述群中的抗體針對相同抗原表位。71.權(quán)利要求39-70中任一項(xiàng)的方法，其中所述群中的抗體是抗-⑶20抗體。72.權(quán)利要求71的方法，其中所述群中的抗體的輕鏈和重鏈由SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中所示的核酸序列編碼。73.表達(dá)權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的抗體群的乳腺上皮細(xì)胞。74.包含權(quán)利要求73的乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。【文檔編號(hào)】C07K16/04GK104168913SQ201280049783【公開日】2014年11月26日申請日期:2012年8月10日優(yōu)先權(quán)日:2011年8月10日【發(fā)明者】V.法伊德,G.切夫雷克斯申請人:法國化學(xué)與生物科技實(shí)驗(yàn)室