一株抗b亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一株抗B亞群禽白血病病毒(ALV?B)的細(xì)胞系及其應(yīng)用。將ALV?B env基因插入表達(dá)載體，將構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體在雞胚成纖維細(xì)胞系DF?1中表達(dá)，通過Zeocin藥物篩選獲得有Zeocin抗性、穩(wěn)定表達(dá)ALV?B env基因的雞胚成纖維細(xì)胞系DF?1/B，該細(xì)胞系保藏編號為CCTCC No.C201609。對DF?1/B細(xì)胞系進(jìn)行檢測和抗病毒感染分析，發(fā)現(xiàn)DF?1細(xì)胞系中表達(dá)的ALV?B env蛋白對ALV?B病毒具有超感染抗性，能抵抗滴度為104TCID50的病毒感染復(fù)制量，本發(fā)明的DF?1/B細(xì)胞系可用于不同亞群禽白血病病毒感染的鑒別診斷，臨床診斷價值顯著，應(yīng)用前景廣闊。CCTCC NO:C20160920160121
【專利說明】
一株抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一株抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽白血病病毒(ALV)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科禽α型反轉(zhuǎn)錄病毒群。禽白血病病毒與肉瘤 病毒緊密相關(guān)，常統(tǒng)稱為禽白血病/肉瘤病毒。根據(jù)細(xì)胞感染范圍、干擾譜和囊膜抗原特征， 可將禽白血病/肉瘤病毒群進(jìn)一步區(qū)分為A到J等10個亞群，其中六3、(：、04、1亞群見于雞 等。A、B、J亞群是常見的外源性病毒，C、D亞群是極少報道的外源性病毒，其中E亞群為內(nèi)源 性病毒。禽白血病病毒囊膜蛋白（env基因編碼的病毒糖基化蛋白）是該類病毒的主要表面 蛋白，它決定病毒感染的宿主范圍，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。該蛋白與靶細(xì)胞表面特異性受體 識別、結(jié)合，是病毒進(jìn)入細(xì)胞，復(fù)制所必需的。感染特定亞群ALV后，細(xì)胞表面病毒受體能被 該病毒產(chǎn)生的env基因編碼的病毒糖基化蛋白封閉，表現(xiàn)出強(qiáng)大的超感染抗性，能限制相應(yīng) 病毒的再次感染。
[0003] 目前禽白血病對我國養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重，并出現(xiàn)了髓細(xì)胞瘤型和血管瘤型等多種病 理表現(xiàn)型，在臨床表現(xiàn)上還容易與網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、馬立克氏病等腫瘤性疾病相混淆。 該病主要為垂直傳播，控制本病有效的措施是降低種雞群的感染率和建立無外源性禽白血 病病毒感染的種雞群，其主要手段是通過對雞群定期進(jìn)行外源性ALV檢測，及時淘汰帶毒陽 性雞，以凈化和消除雞群中的ALV。在外源性ALV中，以J亞群、A亞群和B亞群禽白血病病毒對 雞有明顯的致病性，對養(yǎng)禽生產(chǎn)的危害也大。
[0004] 國內(nèi)外對于禽白血病病毒的檢測和鑒定方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)、ELISA、間接免疫熒 光試驗、PCR等，其中ELI SA在臨床上應(yīng)用最廣，其優(yōu)點(diǎn)是該法操作相對簡便，有商品化的檢 測試劑盒可以利用，其不足之處是不能區(qū)分內(nèi)源性和外源性ALV;間接免疫熒光試驗比較直 觀，但是往往需要用到特異性抗體(單抗）。能夠區(qū)分不同ALV亞群的PCR引物及其工作體系 已經(jīng)有報道。
[0005] 在外源性禽白血病病毒的分離上，目前常用的細(xì)胞有雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和源 于0系雞的成纖維細(xì)胞系DF-I。美國ADOL實(shí)驗室基于DFl細(xì)胞系，建立了抗J亞群禽白血病病 毒的DF-1/J細(xì)胞系。盡管美國ADOL實(shí)驗室有一些特定的雞品系，其產(chǎn)生的原代細(xì)胞可以分 別限制特定外源性禽白血病病毒生長，但是這些品系雞的稀有性限制了其效能的發(fā)揮。目 前還沒有可特異性地限制B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一株特異性的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的抗B亞群禽白血病病毒細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0009] (1)利用帶KpnI和Not頂每切位點(diǎn)的引物從ALV-B(CD08毒株)基因組PCR擴(kuò)增env片 段，用限制性內(nèi)切酶KpnI和No11分別對擴(kuò)增的env基因及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo(+)進(jìn) 行雙酶切，分別純化后將B亞群禽白血病病毒env基因片段連接到pcDNA3.1/Ze〇( + )真核表 達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA-env-B;
[0010] (2)轉(zhuǎn)移載體pcDNA-env-B在DF-I雞胚成纖維細(xì)胞系表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過Zeocin藥 物多次篩選，得到具有Zeocin抗性、可穩(wěn)定表達(dá)ALV-B env蛋白的雞胚成纖維細(xì)胞系DF-I/ B，即抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系。
[0011] 本發(fā)明篩選得到的抗B亞群禽白血病病毒雞胚成纖維細(xì)胞命名為DF-1/B，于2016 年1月21日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學(xué)，中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，簡稱CCTCC，郵編430072)保藏，保藏編號CCTCC No. C201609。
[0012] 本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No.C201609的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在 制備B亞群禽白血病病毒診斷試劑中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No.C201609的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在 制備B亞群禽白血病病毒抗體檢測試劑中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明保藏編號為CCTCC No.C201609的細(xì)胞系可用于制備ALV-B單克隆抗體。 [0015]進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種ALV-B單克隆抗體，其由保藏編號為CCTCC No.C201609的 細(xì)胞系制備得到。本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No. C201609的抗B亞群禽白血病病毒的 細(xì)胞系在制備B亞群禽白血病病毒生物制品中的應(yīng)用。
[0016] 所述生物制品為疫苗。
[0017] 本發(fā)明提供了保藏編號為CCTCC No.C201609的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在 制備抗B亞群禽白血病轉(zhuǎn)基因雞中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測B亞群禽白血病病毒的試劑，含有保藏編號為CCTCC NO.C201609的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系。
[0019] 本發(fā)明的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系可應(yīng)用于B亞群禽白血病病毒的診斷。
[0020] 本發(fā)明提供了一種用于檢測抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系的特異性引物對，其 上下游引物序列為：
[0021 ]上游引物：CGGGGTACCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGATGAGGCGAGCCCTCTTTTTGC;
[0022]下游引物：AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATACTGCTCTTTCGGGCTGCTTA。
[0023]目標(biāo)片段大小約1845bp。
[0024]含有上述特異性引物對的試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]本發(fā)明從env蛋白超感染抗性出發(fā)，將B亞群禽白血病病毒env基因插入pcDNA3.1/ Zeo ( + )真核表達(dá)載體構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pcDNA-env-B，然后將載體pcDNA-env-B轉(zhuǎn)染雞胚成纖 維細(xì)胞系DF-I，通過藥物Zeocin篩選，獲得抗Zeocin、穩(wěn)定表達(dá)ALV-B env蛋白的抗B亞群禽 白血病病毒的細(xì)胞系。所得到的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代，長期保存； 能抵抗滴度為10 4TCID5q的病毒感染復(fù)制量，特異性強(qiáng)，本發(fā)明的DF-1/B細(xì)胞系可用于B亞 群禽白血病病毒的診斷。
【附圖說明】
[0026]圖1為抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系構(gòu)建的技術(shù)路線 [0027]圖2為正常DF-I細(xì)胞狀態(tài):纖維狀，梭形，貼壁生長。
[0028]圖3為PCR檢測DF-1/B中env基因結(jié)果，用本發(fā)明設(shè)計的引物在DF-1/B中成功檢測 到1845bp的env基因，而DF-I中沒有。
[0029]圖4為間接免疫熒光（IFA)檢測env基因表達(dá)情況結(jié)果，其中圖4A為DF-I細(xì)胞（陰性 對照)無綠色熒光，圖4B為DF-1/B細(xì)胞有綠色熒光，說明外源env基因片段在DF-1/B中成功 表達(dá)。
[0030] 圖5為Western-blot檢測env基因的表達(dá)結(jié)果，DF-1/B中有env蛋白表達(dá)，而DF-I中 沒有，說明外源env片段在DF-1/B中成功表達(dá)。Actin為內(nèi)參蛋白，env蛋白為目的蛋白。 [0031]圖6為抗B亞群禽白血病病毒(ALV-B)實(shí)驗結(jié)果，CD08能在DF-I上正常繁殖，但在 DF-1/B上，⑶08不能正常繁殖，只有在病毒滴度為IO5TCID5q時出現(xiàn)復(fù)制，但病毒復(fù)制明顯受 到抑制，顯著低于在DF-I上的復(fù)制。結(jié)果說明，DF-1/B具有很強(qiáng)的抗ALV-B侵染細(xì)胞的能力。 [0032] 圖7為抗J亞群禽白血病病毒(ALV-J CHN06)實(shí)驗結(jié)果，ALV-J在DF-1/B和DF-I上都 能正常繁殖，繁殖情況沒有顯著差別，說明DF-1/B對ALV-J沒有抗性。
[0033]圖8為臨床病毒分群診斷實(shí)例結(jié)果，DF-1/B的S/P值顯著低于DF-1，說明DF-1/B對 該ALV有抗性。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0035]本發(fā)明的DF-I細(xì)胞系為0系雞胚成纖維細(xì)胞，CD08為B亞群禽白血病病毒，均來自 依托華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗室。本發(fā)明所用的限制性內(nèi)切酶Kpn I 和Not I購自NEB公司。pMD18-T載體購自TaKaRa公司、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo( + )購自 Invitrogen公司。ALV-A/B特異性單克隆抗體，美國ADOL實(shí)驗室饋贈。FITC標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG抗體均購自Simga公司。SQ Tissue組織DNA提取試劑盒， 膠回收試劑盒DNA Gel Extraction Kit，去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒Plasmid Miniprep Kit 為OMEGA公司產(chǎn)品。ALV抗原檢測試劑盒(Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit)為美 國IDEXX公司產(chǎn)品。高糖DMEM培養(yǎng)基粉、0.25 %胰酶(含EDTA)、胎牛血清為美國GIBCO公司產(chǎn) 品；二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品。P0L0deliverer3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海銳賽生 物技術(shù)有限公司。
[0036] 實(shí)施例1抗B群禽白血病病毒(ALV-B)細(xì)胞系DF-1/B的建立
[0037] 本發(fā)明擴(kuò)增ALV-B env基因的引物由發(fā)明人自行設(shè)計：
[0038] 上游引物：CGGGGTACCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGATGAGGCGAGCCCTCTTTTTGC
[0039] 下游引物：AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATACTGCTCTTTCGGGCTGCTTA
[0040]反應(yīng)體系（50yL):LA Taq 25yL、上下游引物各lyL、ddH2021yL、模板2yL。
[0041 ] 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性3min; 94°C變性30s，55 °C退火Imin，72 °C延伸2min，30個循 環(huán);72°C后延伸8min。
[0042]用自行設(shè)計的上述引物從ALV-B(CD08毒株)基因組中擴(kuò)增出env片段，按照膠回收 試劑盒DNA Gel Extraction Kit說明書進(jìn)行回收;按照NEB公司限制性內(nèi)切酶KpnI、NotI說 明書分別對真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo( + )及pMD18-T-env片段進(jìn)行雙酶切;分別回收酶切 產(chǎn)物，并按照NEB公司T4連接酶說明書對回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-env-B;轉(zhuǎn) 化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，按照OMEGA公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒說明書，進(jìn)行重組質(zhì)粒pcDNA-env-B抽提。質(zhì)粒送廣州英濰捷基(Inv i trogen)公司測序。
[0043]測序正確的質(zhì)粒按照上海銳賽生物技術(shù)有限公司POLOdelivererfOOO轉(zhuǎn)染試劑盒 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0044] 消化前期準(zhǔn)備的DF-I細(xì)胞，鋪六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，10 % FBS，5 %⑶2、37 °C培養(yǎng)。24h內(nèi) 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Corning公司六孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔轉(zhuǎn)染體系為：2yg pcDNA-env-B質(zhì)粒和IOyL脂 質(zhì)體分別用100gLOpti-METVl?稀釋并孵育5min，然后再混合，共同孵育15min，將200yL 質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物加入到準(zhǔn)備好的六孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染后5h換細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM+ 10%FBS)，24h后將六孔板的一個孔的細(xì)胞消化下來，鋪24孔板，每孔500yL細(xì)胞培養(yǎng)液 (DMEM+15%FBS+200yg/mL zeocin)，每隔3-4天換一次同樣體系的細(xì)胞培養(yǎng)液，10-15d形成 單細(xì)胞集落，三周左右，單細(xì)胞集落長大，消化下來置于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，貼壁長滿之后轉(zhuǎn)入 25cm 2細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，此時細(xì)胞培養(yǎng)物為(DMEM+10%FBS+200yg/mL zeocin)。用藥物zeocin 對細(xì)胞連續(xù)篩選30代，從核酸及蛋白水平對細(xì)胞內(nèi)的env進(jìn)行檢測，并進(jìn)行抗病毒實(shí)驗以及 病毒類型的應(yīng)用。
[0045]細(xì)胞狀態(tài):纖維狀，梭形，貼壁生長。（如圖2所示）
[0046] PCR檢測DF-1/B中env基因：抽提DF-1/B的DNA，按照前述擴(kuò)增env基因的引物、體系 及反應(yīng)程序擴(kuò)增env基因，結(jié)果如圖3所示，env基因擴(kuò)增片段大小為1845bp。
[0047]間接免疫熒光（IFA)檢測env基因表達(dá)情況:鋪滿單層DF-1/B細(xì)胞的24孔板內(nèi)，培 養(yǎng)5d后，底層細(xì)胞用PBS洗3次，用4 %多聚甲醛固定20min。再用PBS洗滌3次，加入1:100稀釋 的ALV-B單抗，4 °C孵育過夜。PBS洗滌3次，加上1:200稀釋的羊抗鼠 IgG-FI TC熒光抗體，37 °C 作用Ih，PBS洗滌3次后，加1滴體積分?jǐn)?shù)50 %甘油覆蓋細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗結(jié)果。 設(shè)立一個DMEM陰性對照。結(jié)果如圖4所示，在熒光顯微鏡下可觀察到DF-1/B細(xì)胞的胞漿和表 面有特異熒光，DF-I細(xì)胞沒有綠色熒光。說明外源env片段在DF-1/B中成功表達(dá)。
[0048] Western-blot檢測env基因的表達(dá):DF-1/B和對照DF-I培養(yǎng)5d后提細(xì)胞總蛋白，用 Bio-Rad垂直電泳儀進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電泳電壓為100V，電泳緩沖液為1 XTris-甘氨酸電泳緩沖液，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到分離膠底部后停止電泳。切膠轉(zhuǎn)膜后，將 NC膜用I X TBS洗滌3次，每次5min。將NC膜置于含5 %的脫脂奶粉的TBS中，室溫封閉2h，I X TBST洗滌3次，每次5min。加蛋白和Act in單抗，4 °C孵育12h?？贵w稀釋濃度為env(l: 500)， Actin(l: 1000)。一抗孵育之后，將膜用TBST洗滌3次，每次5min，將NC膜置于1:10000HRP標(biāo) 記的山羊抗鼠 IgG二抗中，37 °C孵育Ih，I X TBST洗滌3次，每次5min。在暗室中，向NC膜上加 入ECL免疫化學(xué)發(fā)光液孵育5min，用保鮮膜包好NC膜置于感光膠片上，顯影，定影，晾干之后 圖片掃描，保存。結(jié)果如圖5所示，DF-1/B中有env蛋白表達(dá)，而DF-I中沒有。說明外源env片 段在DF-I/B中成功表達(dá)。
[0049]本發(fā)明篩選得到的抗B亞群禽白血病病毒雞胚成纖維細(xì)胞命名為DF-1/B，于2016 年1月21日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學(xué)，中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，簡稱CCTCC，郵編430072)保藏，保藏編號CCTCC No. C201609。
[0050]實(shí)施例2抗B群禽白血病病毒(ALV-B)細(xì)胞系DF-1/B的生物學(xué)活性實(shí)驗
[0051 ] 抗病毒實(shí)驗:分別用DMEM將ALV-B毒株CD08從IOt3到IO5進(jìn)行倍比稀釋。分別消化DF- I/B細(xì)胞和DF-I細(xì)胞，各接種于一塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種ImL細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為 1.7X IO5CelWmL0
[0052]將CD08各病毒稀釋梯度的毒液分別接種于兩板細(xì)胞懸液中，每孔接種IOOyL毒液， 每個病毒稀釋梯度做三個重復(fù)，并做一個已知陽性毒株的對照和DMEM陰性對照，5%⑶2、 10%FBS、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待接種毒液后第二天，細(xì)胞長滿單層后，換為1%FBS的細(xì)胞維 持液進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)6d，期間持續(xù)監(jiān)測細(xì)胞的生長情況，并在第6天收集細(xì)胞培養(yǎng)物，凍 融三次后離心收集細(xì)胞上清。收集的細(xì)胞上清液用同一個批次的ELISA試劑盒進(jìn)行p27抗原 ELISA檢測。結(jié)果如圖6所示，CD08能在DF-I上正常繁殖，但在DF-1/B上，CD08不能正常繁殖， 只有在病毒滴度為IO 5TCID5q時出現(xiàn)復(fù)制，但病毒復(fù)制明顯受到抑制，顯著低于在DF-I上的 復(fù)制。結(jié)果說明，DF-1/B具有很強(qiáng)的抗ALV-B侵染細(xì)胞的能力。
[0053] 用同樣的方法將ALV-J毒株CHN06接種DF-1/B細(xì)胞和DF-I細(xì)胞。結(jié)果如圖7顯示， ALV-J在DF-1/B和DF-I上都能正常繁殖，繁殖情況沒有顯著差別，說明DF-1/B對ALV-J沒有 抗性。
[0054]臨床病毒分群鑒別診斷實(shí)例:如圖8所示，將臨床分離的ALV同時接種DF-I和DF-I/ B，培養(yǎng)7天后，凍融三次后離心收集細(xì)胞上清，ELISA檢測，DF-1/B的S/P值明顯低于DF-U 明DF-1/B對該ALV有抗性，初步判斷該ALV為ALV-B。抽提接種該ALV的DF-I細(xì)胞DNA，擴(kuò)增 gp85，回收后送測序，證明該毒株確為ALV-B。
[0055]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一株抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系，其為雞胚成纖維細(xì)胞，名為DF-l/B，其保藏編 號為CCTCC N〇.C201609。2. 權(quán)利要求1所述的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在制備B亞群禽白血病病毒診斷試 劑中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在制備B亞群禽白血病病毒抗體檢 測試劑中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在制備B亞群禽白血病病毒單克隆 抗體中的應(yīng)用。5. -種B亞群禽白血病病毒單克隆抗體，其特征在于，由保藏編號為CCTCC No. C201609 的抗K亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系制備得到。6. 權(quán)利要求1所述的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在制備B亞群禽白血病病毒生物制 品中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所的應(yīng)用，其特征在于，所述生物制品為疫苗。8. 權(quán)利要求1所述的抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系在制備抗B亞群禽白血病轉(zhuǎn)基因雞 中的應(yīng)用。9. 一種用于檢測B亞群禽白血病病毒的試劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述抗B亞群 禽白血病病毒的細(xì)胞系。10. -種用于檢測抗B亞群禽白血病病毒的細(xì)胞系的特異性引物對，其特征在于，其上 下游引物序列為： 上游引物：CGGGGTACCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGATGAGGCGAGCCCTCTTTTTGC; 下游引物:AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATACTGCTCTTTCGGGCTGCTTA。
【文檔編號】G01N33/569GK105861444SQ201610219254
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】曹偉勝, 饒明章, 廖明, 袁麗霞
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)