本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中，檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑與方法。

背景技術(shù)：

禽流感(Avian influenza，AI)是正黏病毒科A類禽流感病毒，根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原關(guān)系差異，可將其分為18種HA亞型和11種NA亞型；根據(jù)禽流感致病性的不同，可分為高致病性禽流感(HPAI)和低致病性禽流感(LPAI)。其中H5亞型AIV屬于LPAIV，可引起家禽全身出血性癥狀的烈性傳染病，1997年香港H5N1亞型AIV到2014年四川H5N6亞型AIV，提示該病毒不僅會(huì)在家禽中迅速傳播，造成極高的死亡率，還會(huì)跨越物種傳染屏障，從禽類直接傳染到了人類進(jìn)而危害人類健康。雞細(xì)小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是一種線性單鏈DNA病毒。Goodwin M A等研究發(fā)現(xiàn)ChPV臨床癥狀類似于(runting-stunting syndrome，RRS)綜合征，表現(xiàn)為骨骼脆弱、腹瀉、免疫功能障礙、飼料報(bào)酬率低以及后續(xù)發(fā)病率和死亡率增高，增加生產(chǎn)成本和治療費(fèi)用。

病原分離是檢測(cè)病毒的常見方法，但是該方法耗時(shí)長(zhǎng)，針對(duì)多種病毒混合感染時(shí)難以分離辨別，尤其是ChPV在細(xì)胞和雞胚中難以增值?？梢姡⒁环N能快速檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的方法對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生事業(yè)健康發(fā)展具有重要指導(dǎo)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何同時(shí)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑，包括名稱為M-P的引物對(duì)和名稱為ChPV-P的引物對(duì)；

所述M-P由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的兩條單鏈DNA組成；所述ChPV-P由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的兩條單鏈DNA組成。

上述成套試劑中，所述禽流感病毒可為H5亞型禽流感病毒，所述成套試劑還可包括名稱為H5-P的引物對(duì)；所述H5-P由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的兩條單鏈DNA組成。

上述成套試劑可由所述M-P與所述ChPV-P組成，還可由所述M-P、所述H5-P與所述ChPV-P組成。

上述成套試劑中，所述M-P、所述H5-P與所述ChPV-P均可獨(dú)立包裝。所述M-P的兩條單鏈DNA均可獨(dú)立包裝。所述M-P的兩條單鏈DNA的摩爾比可為1:1。所述H5-P的兩條單鏈DNA均可獨(dú)立包裝。所述H5-P的兩條單鏈DNA的摩爾比可為1:1。所述ChPV-P的兩條單鏈DNA均可獨(dú)立包裝。所述ChPV-P的兩條單鏈DNA的摩爾比可為1:1。

上述成套試劑中，所述M-P與所述ChPV-P可以單獨(dú)使用分別進(jìn)行單獨(dú)的PCR，也可以組合使用進(jìn)行二重PCR。這兩種引物對(duì)單獨(dú)使用時(shí)，本申請(qǐng)的檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑中這兩種引物對(duì)的配比沒有要求。這兩種引物對(duì)組合使用時(shí)，所述M-P與所述ChPV-P的摩爾比為2：5。

所述M-P、所述H5-P與所述ChPV-P可以單獨(dú)使用分別進(jìn)行單獨(dú)的PCR，也可以組合使用進(jìn)行三重PCR。這三種引物對(duì)單獨(dú)使用時(shí)，本申請(qǐng)的檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑中這三種引物對(duì)的配比沒有要求。這三種引物對(duì)組合使用時(shí)，所述M-P、所述H5-P與所述ChPV-P的摩爾比為2：2：5。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒的成套試劑。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒的成套試劑，由所述M-P和所述H5-P組成。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了PCR引物對(duì)。

本發(fā)明所提供的PCR引物對(duì)，為所述M-P或所述H5-P或所述ChPV-P。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述R1-R5中的任一系統(tǒng)：

R1、檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的系統(tǒng)，包括所述M-P和所述ChPV-P；

R2、檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的系統(tǒng)，包括所述M-P、所述H5-P和所述ChPV-P；

R3、檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒的系統(tǒng)，包括所述M-P；

R4、檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的系統(tǒng)，包括所述M-P和所述H5-P；

R5、檢測(cè)或輔助檢測(cè)雞細(xì)小病毒的系統(tǒng)，包括所述ChPV-P。

上述各系統(tǒng)還均可包括DNA聚合酶。所述DNA聚合酶具體可為北京全式金生物技術(shù)有限公司的2×Easy Taq PCR Super Mix中DNA聚合酶。

上述各系統(tǒng)還均可包括進(jìn)行PCR擴(kuò)增的儀器。

上述系統(tǒng)中，R1所述系統(tǒng)可由所述M-P和所述ChPV-P與所述DNA聚合酶組成。R2所述系統(tǒng)可由所述M-P、所述H5-P和所述ChPV-P與所述DNA聚合酶組成。R3所述系統(tǒng)可由所述M-P與所述DNA聚合酶組成。R4所述系統(tǒng)可由所述M-P和所述H5-P與所述DNA聚合酶組成。R5所述系統(tǒng)可由所述ChPV-P與所述DNA聚合酶組成。

上述各系統(tǒng)均可為試劑或試劑盒。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述X1-X5中任一方法：

X1、非診斷目的的檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的方法，包括利用所述M-P和所述ChPV-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)樣品是否含有禽流感病毒和雞細(xì)小病毒：所述PCR產(chǎn)物含有655bp和225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有禽流感病毒和雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物含有655bp的DNA片段且不含225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有禽流感病毒且不含或候選不含雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物不含655bp的DNA片段且含有225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品不含或候選不含禽流感病毒且含有或候選含有雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物不含655bp和225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品不含或候選不含禽流感病毒和雞細(xì)小病毒；

X2、非診斷目的的檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的方法，包括利用所述M-P、所述H5-P和所述ChPV-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)樣品是否含有H5亞型禽流感病毒和雞細(xì)小病毒：所述PCR產(chǎn)物含有655bp、327bp和225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有H5亞型禽流感病毒和雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物含有655bp和327bp的DNA片段且不含225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有H5亞型禽流感病毒且不含或候選不含雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物含有655bp和225bp的DNA片段且不含327bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有非H5亞型禽流感病毒和雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物含有655bp的DNA片段且不含327bp和225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有非H5亞型禽流感病毒且不含或候選不含雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物含有225bp的DNA片段且不含655bp和225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有雞細(xì)小病毒且不含或候選不含禽流感病毒；所述PCR產(chǎn)物不含655bp、327bp和225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品不含或候選不含禽流感病毒和雞細(xì)小病毒；

X3、非診斷目的的檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的方法，包括利用所述M-P和所述H5-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)樣品是否含有禽流感病毒：所述PCR產(chǎn)物含有655bp和327bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有H5亞型禽流感病毒；所述PCR產(chǎn)物含有655bp的DNA片段且不含327bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有非H5亞型禽流感病毒；所述PCR產(chǎn)物不含655bp和327bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品不含或候選不含禽流感病毒；

X4、非診斷目的的檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒的方法的方法，包括利用所述M-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)樣品是否含有禽流感病毒：所述PCR產(chǎn)物含有655bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有禽流感病毒；所述PCR產(chǎn)物不含655bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品不含或候選不含禽流感病毒；

X5、非診斷目的的檢測(cè)或輔助檢測(cè)雞細(xì)小病毒的方法，包括利用所述ChPV-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)樣品是否含有雞細(xì)小病毒：所述PCR產(chǎn)物含有225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品含有或候選含有雞細(xì)小病毒；所述PCR產(chǎn)物不含225bp的DNA片段，所述待測(cè)樣品不含或候選不含雞細(xì)小病毒。

所述PCR擴(kuò)增的退火溫度均可為55-58℃。所述PCR擴(kuò)增的退火溫度具體均可為55℃。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件具體均可為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃-58℃退火30s,72℃延伸1min，共32-35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃結(jié)束擴(kuò)增。所述32-35個(gè)循環(huán)具體可為35、32、33或34個(gè)循環(huán)。所述退火溫度可為55℃、56℃、57℃或58℃。

上述X1的方法中，所述利用所述M-P和所述ChPV-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增可為在同一個(gè)PCR擴(kuò)增體系中，以所述待測(cè)樣品的核酸(RNA或DNA)為模板，用所述M-P和所述ChPV-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。所述PCR擴(kuò)增體系中，所述M-P的兩條單鏈DNA的濃度均可為0.1-0.5pmol/μL，如0.2pmol/μL。所述ChPV-P的兩條單鏈DNA的濃度均可為0.3-0.7pmol/μL。所述ChPV-P的兩條單鏈DNA的濃度具體均可為0.2-0.5pmol/μL，如0.5pmol/μL、0.4pmol/μL或0.3pmol/μL。所述PCR擴(kuò)增體系具體可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；所述M-P的兩條單鏈DNA；所述ChPV-P的兩條單鏈DNA；所述待測(cè)樣品，超純水。

上述X2的方法中，所述利用所述M-P、所述H5-P和所述ChPV-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增可為在同一個(gè)PCR擴(kuò)增體系中，以所述待測(cè)樣品的核酸(RNA或DNA)為模板，用所述M-P、所述H5-P和所述ChPV-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。所述PCR擴(kuò)增體系中，所述M-P的兩條單鏈DNA的濃度均可為0.1-0.5pmol/μL，如0.2pmol/μL。所述H5-P的兩條單鏈DNA的濃度均可為0.1-0.5pmol/μL，如0.2pmol/μL。所述ChPV-P的兩條單鏈DNA的濃度具體均可為0.2-0.5pmol/μL，如0.5pmol/μL、0.4pmol/μL或0.3pmol/μL。所述PCR擴(kuò)增體系具體可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；所述M-P的兩條單鏈DNA；所述H5-P的兩條單鏈DNA；所述ChPV-P的兩條單鏈DNA；所述待測(cè)樣品，超純水。

上述X3的方法中，所述利用所述M-P和所述H5-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增可為在同一個(gè)PCR擴(kuò)增體系中，以所述待測(cè)樣品的核酸(RNA或DNA)為模板，用所述M-P和所述H5-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。所述PCR擴(kuò)增體系中，所述M-P的兩條單鏈DNA的濃度均可為0.1-0.5pmol/μL，如0.2pmol/μL。所述H5-P的兩條單鏈DNA的濃度均可為0.1-0.5pmol/μL，如0.2pmol/μL。所述PCR擴(kuò)增體系具體可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；所述M-P的兩條單鏈DNA；所述H5-P的兩條單鏈DNA；所述待測(cè)樣品，超純水。

上述X4的方法中，所述利用所述M-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增可為以所述待測(cè)樣品的核酸(RNA或DNA)為模板，用所述M-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。所述PCR擴(kuò)增體系中，所述M-P的兩條單鏈DNA的濃度均可為0.1-0.5pmol/μL，如0.2pmol/μL。所述PCR擴(kuò)增體系具體可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；所述M-P的兩條單鏈DNA；所述待測(cè)樣品，超純水。

上述X5的方法中，所述利用所述ChPV-P對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增可為以所述待測(cè)樣品的核酸(RNA或DNA)為模板，用所述ChPV-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物。所述PCR擴(kuò)增體系中，所述ChPV-P的兩條單鏈DNA的濃度具體均可為0.2-0.5pmol/μL，如0.5pmol/μL、0.4pmol/μL或0.3pmol/μL。所述PCR擴(kuò)增體系具體可含有：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；所述ChPV-P的兩條單鏈DNA；所述待測(cè)樣品，超純水。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述成套試劑或所述PCR引物對(duì)的制備方法。

本發(fā)明所提供的所述成套試劑或所述PCR引物對(duì)的制備方法，包括將各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述系統(tǒng)的制備方法。

本發(fā)明所提供的所述系統(tǒng)的制備方法，包括將各PCR引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝。

本發(fā)明中，655bp的DNA片段、327bp的DNA片段和225bp的DNA片段均可通過電泳進(jìn)行檢測(cè)。在電泳中，655bp的DNA片段可體現(xiàn)為在600-700bp間有一條帶，327bp的DNA片段可體現(xiàn)為在300-400bp間有一條帶，225bp的DNA片段可體現(xiàn)為在200-300bp間有一條帶。

本發(fā)明提供了檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑，并通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了能同時(shí)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒二重PCR檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑與方法特異性好，既能夠同時(shí)檢測(cè)H5亞型AIV和ChPV，又能檢測(cè)AIV、H5亞型AIV、ChPV，對(duì)其它常見的禽病病原體均未擴(kuò)增出目的片段；敏感性高，檢測(cè)AIV和H5亞型AIV的敏感性均為10pg，檢測(cè)ChPV的敏感性為100fg；準(zhǔn)確性好，對(duì)178份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果與利用現(xiàn)有技術(shù)中的方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果一致。本發(fā)明建立的檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑與方法具有特異性好、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠快速、便捷、直觀地檢測(cè)H5亞型禽流感病毒、禽流感病毒與雞細(xì)小病毒，為同時(shí)檢測(cè)這些病毒具有重要的臨床意義，對(duì)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒以及H5亞型禽流感病毒的防制具有重大意義。

附圖說明

圖1為三重PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為特異性檢測(cè)結(jié)果。

圖3為敏感性檢測(cè)結(jié)果。

圖4為臨床樣品檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的H1N1亞型、H3N2亞型、H4N6亞型、H6N6亞型、H9N2亞型和H11亞型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)和雞細(xì)小病毒(ChPV)公眾可從申請(qǐng)人處獲得；H5N2、H5N3、H5N7、H5N9、H7N2、H9N6、H14N5、H15N9和H16N3亞型禽流感病毒AIV滅活抗原經(jīng)美國(guó)康涅狄格州大學(xué)禽病診斷研究室同意后，公眾可從申請(qǐng)人處獲得；H2N3、H8N4、H10N3、H12N5和H13N6亞型禽流感病毒AIV經(jīng)香港大學(xué)同意后，公眾可從申請(qǐng)人處獲得。以上生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

H1N1亞型AIV:參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H1N1亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)”。

H2N3亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H2N3亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Mallard/Alberta/77(H2N3)”。

H3N2亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H3N2亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Duck/Guangxi/N42/2009(H3N2)”。

H4N6亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H4N6亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Duck/Guangxi/070D/2010(H4N6)”。

H5N2亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H5N2亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Turkey/GA/209092/02(H5N2)”。

H5N3亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H5N3亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Turkey/CA/35621/84(H5N3)”。

H5N7亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H5N7亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/waterfowl/GA/269452-56/03(H5N7)”。

H5N9亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H5N9亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Turkey/WI/68(H5N9)”。

H6N6亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H6N6亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/duck/Guangxi/GXd-4/2009(H6N6)”。

H7N2亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H7N2亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Chicken/NY/273874/03(H7N2)”。

H8N4亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H8N4亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Turkey/Ontario/6118/67(H8N4)”。

H9N2亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H9N2亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Duck/Guangxi/RX/09(H9N2)”。

H10N3亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Xie Z，Pang Y S，Liu J,et al.A multiplex RT-PCR for detection of type a influenza virus and differentiation of avian H5,H7and H9hemagglutinin subtypes[J].Mol Cell Probes，2006，20(3-4)：245-249.，H10N3亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/duck/HK/876/80(H10N3)”。

H11亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H11亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Chicken/Guangxi/43C/09(H11)”。

H12N5亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H12N5亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Duck/Alberta/60/76(H12N5)”。

H13N6亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，H13N6亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/Gull/MD/704/77(H13N6)”。

H14N5亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H14N5亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/mallard duck/Astrakhan/263/1982(H14N5)”。

H15N9亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H15N9亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“A/wedge-tailed shearwater/Western Australia/2576/1979(H15N9)”。

H16N3亞型AIV：參考文獻(xiàn)：Luo S,Xie Z,Xie L,et al.Reverse-transcription,loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J].Virology Journal,2014,12(12):1-7.，H16N3亞型AIV在該參考文獻(xiàn)中的名稱為"A/shorebird/Delaware/168/2006(H16N3)”。

新城疫病毒(NDV)：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，新城疫病毒(NDV)在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“Newcastle disease virus(Lasota)”。

傳染性支氣管炎病毒(IBV)：參考文獻(xiàn)：Yi P,Xie Z,Liu J,et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J].Virology Journal,2011,8(1):1-10.，傳染性支氣管炎病毒(IBV)在該參考文獻(xiàn)中的名稱為“Infectious bronchitis virus(M41)”。

雞細(xì)小病毒(ChPV)GX-CH-PV-7和GX-Tu-PV-2：參考文獻(xiàn)：Genetic and phylogenetic analysis of a novel parvovirus isolated from chickens in Guangxi,China[J].Arch Virol(2016)161:3285–3289.。

實(shí)施例1、檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑的制備

本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑，由檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒的引物對(duì)M-P、檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的引物對(duì)H5-P和檢測(cè)或輔助檢測(cè)雞細(xì)小病毒的引物對(duì)ChPV-P組成；M-P由序列表中SEQ ID No.1所示的單鏈DNA(M-F)和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA(M-R)組成，M-P可從禽流感病毒中擴(kuò)增出大小為655bp的條帶；H5-P由序列表中SEQ ID No.3所示的單鏈DNA(H5-F)和SEQ ID No.4所示的單鏈DNA(H5-R)組成，H5-P可從H5亞型禽流感病毒中擴(kuò)增出大小為327bp的條帶；ChPV-P由序列表中SEQ ID No.5所示的單鏈DNA(ChPV-F)和SEQ ID No.6所示的單鏈DNA(ChPV-R)組成，ChPV-P可從雞細(xì)小病毒中擴(kuò)增出大小為225bp的條帶。SEQ ID No.5中，Y為C或T，S為C或G。

上述成套試劑中，M-P、H5-P和ChPV-P均獨(dú)立包裝。每種引物對(duì)中的兩條單鏈DNA的摩爾比均為1：1。

實(shí)施例2、檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑檢測(cè)條件的優(yōu)化

提取H5N2亞型AIV與H1N1亞型AIV的基因組RNA和雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA，并將對(duì)H5N2亞型AIV的基因組RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，檢測(cè)或輔助檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑的檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

25μL三重PCR擴(kuò)增體系：2×Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)12.5μL；M-F和M-R；H5-F和H5-R；ChPV-F和ChPV-R；模板(H5N2亞型AIV的基因組cDNA 1μL，雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA等體積混合)2μL，以超純水補(bǔ)足25μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火溫度退火30s,72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃結(jié)束擴(kuò)增。

1、引物濃度的優(yōu)化

按照上述反應(yīng)體系，調(diào)整H5-F和H5-R、M-F和M-R以及ChPV-F和ChPV-R在反應(yīng)體系中的濃度，共有以下濃度：M-F和M-R濃度均為0.2pmol/μL、H5-F和H5-R濃度均為0.2pmol/μL、ChPV-F和ChPV-R濃度均為0.5pmol/μL；

M-F和M-R濃度均為0.2pmol/μL、H5-F和H5-R濃度均為0.2pmol/μL、ChPV-F和ChPV-R濃度均為0.2pmol/μL；

M-F和M-R濃度均為0.2pmol/μL、H5-F和H5-R濃度均為0.2pmol/μL、ChPV-F和ChPV-R濃度均為0.3pmol/μL；

M-F和M-R濃度均為0.2pmol/μL、H5-F和H5-R濃度均為0.2pmol/μL、ChPV-F和ChPV-R濃度均為0.4pmol/μL。

結(jié)果：當(dāng)M-F和M-R濃度均為0.2pmol/μL、H5-F和H5-R濃度均為0.2pmol/μL、ChPV-F和ChPV-R濃度均為0.2pmol/μL時(shí)，AIV及H5亞型AIV出現(xiàn)兩條清晰的目的條帶，但ChPV的目的條帶亮度比較暗，進(jìn)一步推斷ChPV-F和ChPV-R濃度低，因此逐步增加ChPV-F和ChPV-R濃度；當(dāng)M-F和M-R濃度均為0.2pmol/μL、H5-F和H5-R濃度均為0.2pmol/μL、ChPV-F和ChPV-R濃度均為0.5pmol/μL時(shí)，出現(xiàn)三條清晰的目的條帶。

2、退火溫度的優(yōu)化

按照上述反應(yīng)程序，調(diào)整退火溫度，共有以下退火溫度：52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃。

結(jié)果：當(dāng)退火溫度為52℃、53℃、54℃時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性低、背景深；當(dāng)退火溫度為56℃、57℃、58℃時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶亮度較暗；當(dāng)退火溫度為55℃時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶清晰、特異性強(qiáng)。

3、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

按照上述反應(yīng)程序，調(diào)整擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，共有以下擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：32、33、34、35、36。

結(jié)果：當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在32、33、34時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的條帶亮度較暗；當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在36時(shí)，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在35時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶清晰，且無(wú)非特異性擴(kuò)增。

通過對(duì)引物濃度、擴(kuò)增溫度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化，最終確定三重PCR中最佳反應(yīng)體系(25μL)為：2×Easy Taq PCR 12.5μL；M-F和M-R(25pmol/μL)各0.2μL；H5-F和H5-R(25pmol/μL)各0.2μL；ChPV-F和ChPV-R(25pmol/μL)各0.5μL；模板(H5N2亞型AIV的基因組cDNA和雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA等體積混合)2μL，以超純水補(bǔ)足25μL。

三重PCR最佳擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s,72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃結(jié)束擴(kuò)增。

利用最佳反應(yīng)體系與最佳擴(kuò)增反應(yīng)程序?qū)5N2亞型AIV、H1N1亞型AIV和ChPV基因組核酸擴(kuò)增，所用模板分別為H5N2亞型AIV的基因組cDNA和雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA等體積混合(圖1中泳道1)、H5N2亞型AIV的基因組cDNA(圖1中泳道2)、H1N1亞型AIV的基因組cDNA和雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA等體積混合(圖1中泳道3)、H1N1亞型AIV的基因組cDNA(圖1中泳道4)，其結(jié)果與大小均與預(yù)期一致(圖1)。圖1中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N為陰性對(duì)照(以水代替模板)。

實(shí)施例3、檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑的特異性

提取H1-H16AIV(H1N1亞型AIV、H2N3亞型AIV、H3N2亞型AIV、H4N6亞型AIV、H5N2亞型AIV、H5N3亞型AIV、H5N7亞型AIV、H5N9亞型AIV、H6N6亞型AIV、H7N2亞型AIV、H8N4亞型AIV、H9N2亞型AIV、H10N3亞型AIV、H11亞型AIV、H12N5亞型AIV、H13N6亞型AIV、H14N5亞型AIV、H15N9亞型AIV和H16N3亞型AIV)、新城疫病毒(NDV)以及傳染性支氣管炎病毒(IBV)的基因組RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，提取雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA，檢測(cè)實(shí)施例1的成套試劑的特異性。

按照實(shí)施例2的最佳反應(yīng)體系，將模板分別替換為模板1、模板2、模板3、模板4、H5N3亞型AIV、H5N9亞型AIV、H1N1亞型AIV、H2N3亞型AIV、H3N2亞型AIV、H4N6亞型AIV、H6N6亞型AIV、H7N2亞型AIV、H8N4亞型AIV、H9N2亞型AIV、H10N3亞型AIV、H11亞型AIV、H12N5亞型AIV、H13N6亞型AIV、H14N5亞型AIV、H15N9亞型AIV和H16N3亞型AIV基因組cDNA以及IBV基因組cDNA和NDV基因組cDNA，按照實(shí)施例2的最佳擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3所示。其中，模板1為H5N2亞型AIV基因組cDNA與ChPV基因組DNA 1等體積混合物，模板2為H5N7亞型AIV基因組cDNA與ChPV基因組DNA 1等體積混合物，模板3為H1N1亞型AIV基因組cDNA與ChPV基因組DNA 1等體積混合物，模板4為H1N1亞型AIV基因組cDNA與ChPV基因組DNA 2等體積混合物，ChPV基因組DNA 1為ChPV GX-CH-PV-7的基因組DNA，ChPV基因組DNA 2為ChPV GX-Tu-PV-2的基因組DNA。

圖2中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1-4分別為模板1-4；泳道5-21分別為H5N3亞型AIV、H5N9亞型AIV、H1N1亞型AIV、H2N3亞型AIV、H3N2亞型AIV、H4N6亞型AIV、H6N6亞型AIV、H7N2亞型AIV、H8N4亞型AIV、H9N2亞型AIV、H10N3亞型AIV、H11亞型AIV、H12N5亞型AIV、H13N6亞型AIV、H14N5亞型AIV、H15N9亞型AIV和H16N3亞型AIV；泳道22為IBV；泳道23為NDV；泳道24為陰性對(duì)照(以水代替模板)。

結(jié)果顯示，泳道1和2均含有大小分別為655bp、327bp和225bp的三條帶；泳道3和4均含有大小分別為655bp和225bp的兩條帶；泳道5和6均含有大小分別為655bp和327bp的三條帶；泳道7-21均只含有大小為655bp的條帶；泳道22、23和24均不含有任何條帶。表明本發(fā)明的成套試劑可用來(lái)檢測(cè)禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒：PCR產(chǎn)物中若有655bp、327bp和225bp的條帶，表明待測(cè)樣品中含有H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒；PCR產(chǎn)物中若有655bp和225bp的條帶且不含327bp的條帶，表明待測(cè)樣品中含有禽流感病毒與雞細(xì)小病毒，且該禽流感病毒不為H5亞型；PCR產(chǎn)物中若有655bp和327bp的條帶且不含225bp的條帶，表明待測(cè)樣品中含有H5亞型禽流感病毒、不含有雞細(xì)小病毒；PCR產(chǎn)物中若含有655bp的條帶且不含327bp和225bp的條帶，表明待測(cè)樣品中含有禽流感病毒、不含有雞細(xì)小病毒，且該禽流感病毒不為H5亞型；PCR產(chǎn)物中若含有225bp的條帶且不含655bp和327bp的條帶，表明待測(cè)樣品中含有雞細(xì)小病毒、不含有禽流感病毒；PCR產(chǎn)物中若無(wú)655bp、327bp和225bp的任何條帶，表明待測(cè)樣品中不含有禽流感病毒與雞細(xì)小病毒。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明實(shí)施例1的成套試劑能特異性地檢測(cè)禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒。

實(shí)施例4、檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑的敏感性

提取H5N2亞型AIV的基因組RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，提取雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA，將H5N2亞型AIV的基因組cDNA與雞細(xì)小病毒(ChPV)的基因組DNA等量混合，得到H5N2亞型AIV cDNA與ChPV DNA濃度相同的混合物，將該混合用去離子水按10倍倍比稀釋后作為模板，模板為以下模板A-F：模板A中H5N2亞型AIV cDNA與ChPV DNA濃度均為10ng/2μL，模板B中H5N2亞型AIV cDNA與ChPV DNA濃度均為1ng/2μL，模板C中H5N2亞型AIV cDNA與ChPV DNA濃度均為100pg/2μL，模板D中H5N2亞型AIV cDNA與ChPV DNA濃度均為10pg/2μL，模板E中H5N2亞型AIV cDNA與ChPV DNA濃度均為1pg/2μL，模板F中H5N2亞型AIV cDNA與ChPV DNA濃度均為100fg/2μL，檢測(cè)實(shí)施例1的成套試劑的敏感性。其中，模板A中每微升H5N2亞型AIV cDNA的含量相當(dāng)于5.24×10⁶拷貝H5N2亞型AIV，ChPV DNA的含量相當(dāng)于5.24×10⁶拷貝ChPV；模板B中每微升H5N2亞型AIV cDNA的含量相當(dāng)于5.24×10⁵拷貝H5N2亞型AIV，ChPV DNA的含量相當(dāng)于5.24×10⁵拷貝ChPV；模板C中每微升H5N2亞型AIV cDNA的含量相當(dāng)于5.24×10⁴拷貝H5N2亞型AIV，ChPV DNA的含量相當(dāng)于5.24×10⁴拷貝ChPV；模板D中每微升H5N2亞型AIV cDNA的含量相當(dāng)于5.24×10³拷貝H5N2亞型AIV，ChPV DNA的含量相當(dāng)于5.24×10³拷貝ChPV；模板E中每微升H5N2亞型AIV cDNA的含量相當(dāng)于5.24×10²拷貝H5N2亞型AIV，ChPV DNA的含量相當(dāng)于5.24×10²拷貝ChPV；模板F中每微升H5N2亞型AIV cDNA的含量相當(dāng)于52.4拷貝H5N2亞型AIV，ChPV DNA的含量相當(dāng)于52.4拷貝ChPV。

按照實(shí)施例2的最佳反應(yīng)體系，將模板分別替換為模板A-F，按照實(shí)施例2的最佳擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖3所示。圖3中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1-6分別為模板A-F；泳道7為陰性對(duì)照(以水代替模板)。

結(jié)果顯示，對(duì)模板A-D進(jìn)行擴(kuò)增均可以擴(kuò)增出大小分別為655bp、327bp和225bp的目的條帶，對(duì)模板E和模板F進(jìn)行擴(kuò)增均可以擴(kuò)增出大小為225bp的目的條帶、不能得到655bp和327bp的目的條帶，表明，實(shí)施例1的成套試劑檢測(cè)H5亞型AIV的敏感性為10pg/25μL的AIV基因組cDNA，檢測(cè)ChPV的敏感性為100fg/25μL的ChPV基因組DNA。

實(shí)施例5、利用檢測(cè)或輔助檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑檢測(cè)實(shí)際樣品

1、樣品采集

從活禽市場(chǎng)采集雞口腔和泄殖腔棉拭子178份，分別用含有抗生素的PBS溶液(PBS溶液中青霉素的濃度為0.8萬(wàn)單位/mL，硫酸鏈霉素的濃度為1.0萬(wàn)單位/mL，慶大霉素的濃度為0.5mg/mL，制霉菌素的濃度為0.5mg/mL)充分浸泡棉拭子(約4小時(shí))，反復(fù)擠壓和清洗棉拭子，8000rpm/min離心5min，得到178份棉拭子的上清液。

2、三重PCR檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒

取步驟1的178份棉拭子的上清液(樣品1-178)，按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction試劑盒說明書，分別提取并得到178份樣品的核酸，對(duì)178份樣品的核酸消化DNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到178份樣品的cDNA，分別調(diào)整每份樣品cDNA的濃度，使這178份樣品的cDNA的濃度均為50ng/μL。對(duì)178份樣品的核酸消化RNA后得到178份樣品的基因組DNA，調(diào)整每份樣品基因組DNA的濃度，使這178份樣品的基因組DNA的濃度均為50ng/μL。

將同一樣品編號(hào)的cDNA與基因組DNA等體積混合，作為模板，按照實(shí)施例2的最佳反應(yīng)體系與最佳擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并將178份樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。重復(fù)檢測(cè)3次以確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。利用實(shí)施例2中H5N2亞型AIV的基因組cDNA和ChPV的基因組DNA1等體積混合液及H5N7亞型AIV的基因組cDNA和ChPV的基因組DNA1等體積混合液作為陽(yáng)性對(duì)照。

根據(jù)電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)，178份臨床樣品中，3份樣品(標(biāo)注樣品1-3)均含有655bp與225bp的條帶且不含有327bp的條帶，表明樣品1-3為非H5亞型AIV與ChPV混合感染樣品，28份樣品(標(biāo)注樣品4-31)含有655bp的條帶、不含有327bp和225bp的條帶，表明樣品4-31為AIV感染樣品，9份樣品(標(biāo)注樣品32-40)不含有655bp和327bp的條帶、含有225bp的條帶，表明樣品32-40為ChPV感染樣品，剩余138份樣品(標(biāo)注樣品41-178)不含有655bp、327bp與225bp的條帶，表明樣品41-178既不含禽流感病毒，也不含雞細(xì)小病毒(表1)；測(cè)序結(jié)果顯示，上述樣品的655bp的DNA片段的序列與AIV的目的片段的同源性均高達(dá)99％以上，上述樣品的225bp的DNA片段的序列與ChPV的目的片段的同源性高達(dá)98％以上，表明所建立三重PCR具有較好的臨床實(shí)用性。

部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。圖4中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為陰性對(duì)照(以水代替模板)；2、10為陽(yáng)性對(duì)照；泳道3、4、6、9、11、13、15和17為不含AIV和ChPV的樣品的結(jié)果；泳道5、8、12和16為只含有AIV的樣品的結(jié)果，且AIV均不為H5亞型；泳道7和14為只含有ChPV的樣品的結(jié)果。

3、常規(guī)方法檢測(cè)禽流感病毒與雞細(xì)小病毒

按照如下病毒分離方法檢測(cè)棉拭子的上清液中AIV：取步驟1的178份棉拭子的上清液(樣品1-178)分別接種SPF雞胚，收集24-96h致死的雞胚尿囊液和96h以上未致死的雞胚尿囊液，取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)。結(jié)果顯示(表1)，樣品1-31具有血凝性，表明樣品1-31含有禽流感病毒。

取有血凝價(jià)的樣品(樣品1-31)進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，確定感染的AIV的HA亞型(表1)。結(jié)果顯示，樣品1-31中的禽流感病毒的HA亞型均不為H5亞型。

同時(shí)對(duì)相同178份樣品用L.Zsak等人《Partial genome sequence analysis of parvoviruses associated with enteric disease in poultry》文中引物(NS1F:5’-TATGATCTGTCAATGATTGACCAGCTGA-3’；NS2R:5’-GTACCACTCGAGAGGGTTCAGGGAGAT-3’)及反應(yīng)條件(94℃預(yù)變性15min；94℃變性30s，55℃退火1min,68℃延伸3min，共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃結(jié)束擴(kuò)增)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送去上海Invitrogen公司進(jìn)行序列鑒定。

結(jié)果顯示，樣品1-3與樣品32-40均含有目的條帶，用本發(fā)明的成套試劑進(jìn)行檢測(cè)ChPV結(jié)果與L.Zsak等人文獻(xiàn)中檢測(cè)ChPV的結(jié)果完全一致。

結(jié)果表明，用實(shí)施例1的成套試劑檢測(cè)H5亞型禽流感病毒、禽流感病毒與雞細(xì)小病毒結(jié)果與利用現(xiàn)有技術(shù)中的方法確定的H5亞型禽流感病毒、禽流感病毒與雞細(xì)小病毒結(jié)果是完全一致的。因此，實(shí)施例1的成套試劑可以用來(lái)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒、禽流感病毒與雞細(xì)小病毒。

表1、178份棉拭子中H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的檢測(cè)

對(duì)比例1、利用AIV對(duì)比引物和ChPV對(duì)比引物檢測(cè)AIV和ChPV

利用表2中的引物對(duì)檢測(cè)AIV和ChPV，模板均為實(shí)施例3中H1-H16AIV(H1N1亞型AIV、H2N3亞型AIV、H3N2亞型AIV、H4N6亞型AIV、H5N2亞型AIV、H6N6亞型AIV、H7N2亞型AIV、H8N4亞型AIV、H9N2亞型AIV、H10N3亞型AIV、H11亞型AIV、H12N5亞型AIV、H13N6亞型AIV、H14N5亞型AIV、H15N9亞型AIV和H16N3亞型AIV)，ChPV基因組DNA 1、ChPV基因組DNA 2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行1.5％凝膠電泳。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃結(jié)束擴(kuò)增。

表2、AIV對(duì)比引物和ChPV對(duì)比引物

結(jié)果顯示，引物對(duì)ChPV-F1與ChPV-R1以及引物對(duì)ChPV-F2與ChPV-R2對(duì)ChPV基因組DNA 1和ChPV基因組DNA 2進(jìn)行擴(kuò)增均未擴(kuò)增出目的條帶；引物對(duì)AIV-F1與AIV-R1對(duì)H8N4亞型AIV、H12N5亞型AIV、H13N6亞型AIV、H14N5亞型AIV、H15N9亞型AIV和H16N3亞型AIV進(jìn)行擴(kuò)增均未擴(kuò)增出目的條帶；引物對(duì)AIV-F2與AIV-R2只能對(duì)H1N1亞型AIV、H3N2亞型AIV、H4N6亞型AIV、H6N6亞型AIV和H9N2亞型AIV擴(kuò)增出目的條帶；引物對(duì)H5-F1與H5-R1對(duì)H5N2亞型AIV的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)1條清晰的非目的條帶；引物對(duì)H5-F2與H5-R2對(duì)H9N2亞型AIV的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)1條清晰的目的條帶。

<110> 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120> 檢測(cè)H5亞型禽流感病毒與雞細(xì)小病毒的成套試劑與方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 1

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